CN108374001A - 提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因，涉及基因工程领域。本发明采用定点突变技术和易错PCR方法将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行定点突变，所述突变位点包括：第10位、第20位、第34位、第70位、第106位、第110位、第167位、第257、第305位、第362位和第517位；本发明获得的突变体的比活较原始菌株高，能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

Description

提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高比活的的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。由于GOD具有特殊的酶学特性使其广泛应用于食品、饲料、医药等领域。GOD广泛分布于动植物和微生物体内，相对于动植物，微生物具有生长繁殖快、来源广等优势，因此GOD主要来源于微生物。
微生物来源的GOD主要以黑曲霉和青霉为主，相对于青霉，黑曲霉产的GOD具有热稳定性好，底物特异性强等优点。野生型黑曲霉GOD比活力低，生产成本高，限制了其产业化应用。CN 105002147 A公开了表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，通过定点突变，使葡萄糖氧化酶的氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K，提高了表达量，且稳定性好。CN 101348794A公开了一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用，通过在黑曲霉GOD结构基因的1752位和2272位通过重叠PCR引入两处突变，连接于表达载体，提高了突变酶的酶活。
发明内容
本发明对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，通过定点饱和突变技术和易错PCR方法提高了黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的比活，降低生产成本，为葡萄糖氧化酶的工业化应用奠定基础。
黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452的葡萄糖氧化酶基因的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，核苷酸序列如下所示：
agcaatggcatcgaagccagcctcctgactgaccccaaggaggttgccggccgcactgtcgactacatcatcgctggtggaggtctgactggactcaccactgctgcccgtctgacggagaaccccgatatcactgtgcttgtcatcgaaagtggctcctacgagtctgacagaggtcctatcattgaggacctgaacgcttacggtgacatttttggcagcagtgtggaccacgcctacgagactgtcgagctcgccaccaacaatcagactgcgctgatccgctccggaaatggtctcggtggctctaccctcgtcaacggtggcacctggactcgcccccacaaggcacaagttgactcatgggagaccgtcttcggaaatgagggctggaactgggacagcgtggccgcctactccctccaggctgagcgtgctcgcgcaccaaatgccaaacagattgctgctggccactactttaatgcatcctgccatggtatcaatggtactgtccacgccggaccccgcgataccggtgatgactactcccccatcgtcaaggctctcatgagcgctgtcgaagacaggggcgttcccaccaagaaggacttgggatgcggtgacccccatggtgtgtccatgttccccaacaccttgcacgaagaccaagtgcgctctgatgccgctcgcgaatggctcctccccaactaccagcgtcccaacctgcaagtcctcactggacagtatgttggaaaggtcctgctcagccagaacgctaccacacctcgtgccgttggcgtggaattcggcacccacaagggcaacacccacaacgtctacgctaagcacgaggtcctcctggccgctggatccgctgtctctcccaccatcctcgaatattccggtatcggaatgaagtccattctagagcctcttggaattgacaccgtcgttgacctgcccgttggtctcaaccttcaggaccagaccacctctaccgtccgctcacgcattacctccgccggtgccggacagggacaggccgcttggttcgctaccttcaacgagacctttggcgactacgccgaaaaggctcacgagctgctcaacaccaagctggagcagtgggccgaagaggccgtcgcccgtggcggattccacaacaccaccgctttgctcatccagtacgagaactaccgcgactggatcgtcaaggacaatgtcgcatactcggaactcttcctcgacacggccggagtggccagtttcgatgtgtgggatcttctgcccttcactagaggatacgtacacatcctcgacaaggacccctacctccgccatttcgcatacgaccctcagtactttctcaacgagcttgacctgctcggccaggctgccgccactcagctggcccgcaacatctccaactccggtgccatgcaaacttatttcgctggagagactattcccggtgacaacctcgcgtatgatgccgacttgagcgcctgggttgagtatatcccgtacaacttccgccctaactaccatggtgtgggtacttgctccatgatgccgaaggagatgggcggtgttgtcgacaatgctgcccgtgtgtatggtgtgcagggactgcgagtcatcgatggttctattccccctacgcaaatgtcgtcccatgttatgacggtcttttatgccatggccttgaagattgcggatgccatcttggcggattatgcttccatgcagtga。
本发明的目的是提供提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQID NO.7所示。更优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的再一目的是提供提高比活的葡萄糖氧化酶突变体的编码基因，为编码上述葡萄糖氧化酶突变体的基因。优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示；或为与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的序列。
本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶的第20位、第34位、第70位、第106位、第257位和第517位进行分子改造，经过高通量筛选确定了第20位、第34位、第70位、第106位、第257位和第517位这6个位点的最优突变氨基酸，具体包括：第20位由V突变为Y，即V20Y；第34位则是T突变为V，即T34V；第70位则是D突变为Q，即D70Q；第106位则是V突变为I，即V106I；第257位则是Q突变为K，即Q257K；第517位则是G突变为A，即G517A。同时采用易错PCR技术对上述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列进行改造，从而获得一系列的突变位点。经过高通量筛选获得了5个有效突变体，分别为T10K，T110N，I167L，M305L，和A362T。
在上述两种不同技术获得的有效突变位点的基础上，进一步进行组合和筛选，最终得到了三个显著提高比活的葡萄糖氧化酶突变体分别命名为GOD-1、GOD-2和GOD-3，同时应用了定点饱和突变和易错PCR技术。三个葡萄糖氧化酶突变体的相对比活分别是原始GOD的167％，162％和186％。GOD-1、GOD-2和GOD-3突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2到SEQID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5到SEQ ID NO.7所示。
其中，GOD-1包含的突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，Q257K，M305L，G517A；GOD-2包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，Q257K，G517A；GOD-3包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，V106I，I167L，Q257K，A362T，G517A。
本发明还提供了提高葡萄糖氧化酶比活的方法，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶突变，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。
本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的宿主细胞。
此外，本发明还提供了提高比活的葡萄糖氧化酶突变体在饲料添加剂、食品添加剂、葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。本发明的突变体葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖所生成的H2O2能使面筋中的-SH氧化成-S-S，有助于面筋蛋白之间形成较好的蛋白质网络结构，用于面包制造，可显著改善口感，应用效果良好。
与现有技术相比，本发明带来的有益效果包括：本发明通过蛋白理性改造和高通量筛选技术对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，得到系列位点突变的突变体，提高了比活，并进一步结合定点饱和突变和易错PCR两种突变技术，筛选得到了三个比活显著提高的突变体GOD-1、GOD-2和GOD-3，为黑曲霉的葡萄糖氧化酶在饲料添加剂、食品添加剂、葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙等的工业化应用奠定基础。
附图说明
图1为GOD-1、GOD-2和GOD-3的部分序列测序结果图。
图2为GOD-1、GOD-2和GOD-3的部分序列测序结果图。
图3为GOD-1、GOD-2和GOD-3的部分序列测序结果图。
图4为GOD-1、GOD-2和GOD-3的部分序列测序结果图。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、载体pGAPzαA、抗生素Zeocin购自Invitrogen公司。PCR酶、质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒购于上海生工公司，限制性内切酶购于NEB公司。葡萄糖氧化酶标准品、邻联茴香胺盐酸盐及辣根过氧化物购于Sigma公司，葡萄糖购于OXIOD公司，其他试剂购于广州化学试剂厂。
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCL，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素。LB-Zeocin为LB培养基加25μg/ml Zeocin。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100μg/mlZeocin)。酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(v/v))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同)。重组酵母发酵基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35mlPTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％。一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、流水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。
葡萄糖氧化酶活性测定采用邻—联茴香胺分光光度法。在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在540nm下测定反应液吸光值，依据标准曲线计算葡萄糖氧化酶的酶活。
实施例1、黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆
将黑曲霉接入LB培养基，培养24小时后，提取其基因组DNA。根据已报道黑曲霉葡萄糖氧化酶的序列(Genebank:FJ979866.1)设计两条引物(GODF:5'-cggaattcagcaatggcatcgaagccagcctc-3'和GODR:5'–atagtttagcggccgctcactgcatggaagcataatc-3')用于扩增黑曲霉葡萄糖氧化酶基因。将扩增的PCR产物纯化回收，分别连接到表达载体pPICzαA和pPGAPzαA，得到表达载体pPICzαA-GOD和pGAPzαA-GOD。
实施例2、理性定点突变
以上述pPICzαA-GOD为模板，以表中的引物进行PCR扩增，具体地扩增反应体系如下：
Q5高保真Taq酶MIX 23uL
对应突变体引物1(50uM) 1uL
对应突变体引物2(50uM) 1uL
pPICzαA-GOD(20ng) 2uL
加水至 50uL
突变位点为V20Y时，对应突变体引物1：5'-gttgccggccgcacttacgactacatcatcgct-3'；对应突变体引物2：5'-agcgatgatgtagtcgtaagtgcggccggcaac-3'。突变位点为T34V时，对应突变体引物1：5'-tctgactggactcaccgtcgctgcccgtctgacgg-3'；对应突变体引物2：5'-ccgtcagacgggcagcgacggtgagtccagtcaga-3'。突变位点为D70Q时，对应突变体引物1：5'-gacctgaacgcttacggtcagatttttggcagcagtgtg-3'；对应突变体引物2：5'-cacactgctgccaaaaatctgaccgtaagcgttcaggtc-3'。突变位点为V106I时，对应突变体引物1：5'-ggctctaccctcatcaacggtggcacc-3'；对应突变体引物2：5'-ggtgccaccgttgatgagggtagagcc-3'。突变位点为Q257K时，对应突变体引物1：5'-aggtcctgctcagcaaaaacgctaccacacc-3'；对应突变体引物2：5'-ggtgtggtagcgtttttgctgagcaggacct-3'。突变位点为G517A时，对应突变体引物1：5'-aacttccgccctaactaccatgcagtgggtacttgc-3'；对应突变体引物2：5'-gcaagtacccactgcatggtagttagggcggaagtt-3'。反应程序如下：
琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物再用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用PmeI线性化，转入毕赤酵母X33。
实施例3、高通量筛选高比活突变菌株
将实施例2得到的酵母重组转化子用牙签逐个挑至24孔板，每个孔中加入1mL含有BMGY培养基，30℃，220rpm培养24h左右，离心去上清。再分别加入1.6mL BMMY培养基进行诱导培养。培养24h后，离心取上清，将上述上清液分别取出200μL至96孔板，进行葡萄糖氧化酶酶活测定。经过高通量筛选得6个有效突变位点分别为：V20Y，T34V，D70Q，V106I，Q257K，G517A。这6个突变体的相对比活如表1所示。
表1原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶相对比活
编号 相对比活(％)
原始葡萄糖氧化酶 100
V20Y 115
T34V 120
D70Q 125
V106I 131
Q257K 119
G517A 128
从表1可知，上述6个突变位点均能提高比活，其中以V106I的提高幅度最大。
实施例4、易错PCR非理性改造
以上述pGAPzαA-GOD为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：
第一轮扩增：以载体启动子引物1(AOX5-F)：5'-gactggttccaattgacaagc-3'和引物2(AOX3-R)：:5'-ggcaaatggcattctgacat-3'为引物进行PCR扩增，反应体系如下：
反应程序如下：
回收第一轮PCR产物，取1μL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板；第二、第三轮易错PCR以葡萄糖氧化酶特异性引物F及R分别替代引物AOX5-F和AOX3-R作为反应引物，第二轮易错PCR的引物为：PCR2F：5'-gaattcagcaatggcatcgaagccag-3'；PCR2R：5'-tctagatcactgcatggaagcataatc-3'；第三轮易错PCR的引物为：PCR3F:5'-gaattcagcaatggcatcgaagccag-3'；PCR3R：5'-tctagatcactgcatggaagcataatc-3'；重复PCR反应。取第二、三轮的PCR产物用EcoRI和XbaI进行酶切，连接至pGAPzαA载体上的EcoRI和XbaI位点之间。连接产物转化毕赤酵母X33，在YPDZ平板培养筛选突变菌株。经过高通量筛选获得了5个有效突变体分别为T10K，T110N，I167L，M305L和A362T。这5个突变体的相对比活如表2所示。
表2原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶相对比活
编号 相对比活(％)
原始葡萄糖氧化酶 100
T10K 121
T110N 130
I167L 126
M305L 131
A362T 123
从表2可知，上述5个突变位点均能提高比活，其中以M305L的提高幅度最大。
实施例5、组合突变及比活检测分析
在表1和表2结果的基础上，进行组合突变，分别将原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶进行纯化，纯化方法为镍离子柱纯化。将纯化好的葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶分别测定相应的酶活性并计算出比活。以突变体比活除以原始葡萄糖氧化酶比活，来计算突变体的相对比活。通过实验最终得到3个组合突变分别命名为GOD-1、GOD-2、GOD-3，相关测序结果图如图1至图4所示，相对比活分别为167％，162％，186％。
其中GOD-1包含的突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，Q257K，M305L，G517A；GOD-2包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，Q257K，G517A；GOD-3包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，V106I，I167L，Q257K，A362T，G517A。
GOD-4(与GOD-3相比，362位不突变)包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，V106I，I167L，Q257K，G517A，相对比活为141％，明显低于GOD-3的相对比活。
序列表
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> Aspergillus niger GIM 3.452
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 2
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
agcaatggca tcgaagccag cctcctgaag gaccccaagg aggttgccgg ccgcacttac 60
gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcaccg tcgctgcccg tctgacggag 120
aaccccgata tcactgtgct tgtcatcgaa agtggctcct acgagtctga cagaggtcct 180
atcattgagg acctgaacgc ttacggtcag atttttggca gcagtgtgga ccacgcctac 240
gagactgtcg agctcgccac caacaatcag actgcgctga tccgctccgg aaatggtctc 300
ggtggctcta ccctcatcaa cggtggcacc tggactcgcc cccacaaggc acaagttgac 360
tcatgggaga ccgtcttcgg aaatgagggc tggaactggg acagcgtggc cgcctactcc 420
ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga ttgctgctgg ccactacttt 480
aatgcatcct gccatggtat caatggtact gtccacgccg gaccccgcga taccggtgat 540
gactactccc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagacagggg cgttcccacc 600
aagaaggact tgggatgcgg tgacccccat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac 660
gaagaccaag tgcgctctga tgccgctcgc gaatggctcc tccccaacta ccagcgtccc 720
aacctgcaag tcctcactgg acagtatgtt ggaaaggtcc tgctcagcca gaacgctacc 780
acacctcgtg ccgttggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtctac 840
gctaagcacg aggtcctcct ggccgctgga tccgctgtct ctcccaccat cctcgaatat 900
tccggtatcg gattaaagtc cattctagag cctcttggaa ttgacaccgt cgttgacctg 960
cccgttggtc tcaaccttca ggaccagacc acctctaccg tccgctcacg cattacctcc 1020
gccggtgccg gacagggaca ggccgcttgg ttcgctacct tcaacgagac ctttggcgac 1080
tacgccgaaa aggctcacga gctgctcaac accaagctgg agcagtgggc cgaagaggcc 1140
gtcgcccgtg gcggattcca caacaccacc gctttgctca tccagtacga gaactaccgc 1200
gactggatcg tcaaggacaa tgtcgcatac tcggaactct tcctcgacac ggccggagtg 1260
gccagtttcg atgtgtggga tcttctgccc ttcactagag gatacgtaca catcctcgac 1320
aaggacccct acctccgcca tttcgcatac gaccctcagt actttctcaa cgagcttgac 1380
ctgctcggcc aggctgccgc cactcagctg gcccgcaaca tctccaactc cggtgccatg 1440
caaacttatt tcgctggaga gactattccc ggtgacaacc tcgcgtatga tgccgacttg 1500
agcgcctggg ttgagtatat cccgtacaac ttccgcccta actaccatgc tgtgggtact 1560
tgctccatga tgccgaagga gatgggcggt gttgtcgaca atgctgcccg tgtgtatggt 1620
gtgcagggac tgcgagtcat cgatggttct attcccccta cgcaaatgtc gtcccatgtt 1680
atgacggtct tttatgccat ggccttgaag attgcggatg ccatcttggc ggattatgct 1740
tccatgcagt ga 1752
<210> 3
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
agcaatggca tcgaagccag cctcctgact gaccccaagg aggttgccgg ccgcacttac 60
gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcaccg tcgctgcccg tctgacggag 120
aaccccgata tcactgtgct tgtcatcgaa agtggctcct acgagtctga cagaggtcct 180
atcattgagg acctgaacgc ttacggtcag atttttggca gcagtgtgga ccacgcctac 240
gagactgtcg agctcgccac caacaatcag actgcgctga tccgctccgg aaatggtctc 300
ggtggctcta ccctcatcaa cggtggcaac tggactcgcc cccacaaggc acaagttgac 360
tcatgggaga ccgtcttcgg aaatgagggc tggaactggg acagcgtggc cgcctactcc 420
ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga ttgctgctgg ccactacttt 480
aatgcatcct gccatggtat caatggtact gtccacgccg gaccccgcga taccggtgat 540
gactactccc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagacagggg cgttcccacc 600
aagaaggact tgggatgcgg tgacccccat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac 660
gaagaccaag tgcgctctga tgccgctcgc gaatggctcc tccccaacta ccagcgtccc 720
aacctgcaag tcctcactgg acagtatgtt ggaaaggtcc tgctcagcca gaacgctacc 780
acacctcgtg ccgttggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtctac 840
gctaagcacg aggtcctcct ggccgctgga tccgctgtct ctcccaccat cctcgaatat 900
tccggtatcg gaatgaagtc cattctagag cctcttggaa ttgacaccgt cgttgacctg 960
cccgttggtc tcaaccttca ggaccagacc acctctaccg tccgctcacg cattacctcc 1020
gccggtgccg gacagggaca ggccgcttgg ttcgctacct tcaacgagac ctttggcgac 1080
tacgccgaaa aggctcacga gctgctcaac accaagctgg agcagtgggc cgaagaggcc 1140
gtcgcccgtg gcggattcca caacaccacc gctttgctca tccagtacga gaactaccgc 1200
gactggatcg tcaaggacaa tgtcgcatac tcggaactct tcctcgacac ggccggagtg 1260
gccagtttcg atgtgtggga tcttctgccc ttcactagag gatacgtaca catcctcgac 1320
aaggacccct acctccgcca tttcgcatac gaccctcagt actttctcaa cgagcttgac 1380
ctgctcggcc aggctgccgc cactcagctg gcccgcaaca tctccaactc cggtgccatg 1440
caaacttatt tcgctggaga gactattccc ggtgacaacc tcgcgtatga tgccgacttg 1500
agcgcctggg ttgagtatat cccgtacaac ttccgcccta actaccatgc tgtgggtact 1560
tgctccatga tgccgaagga gatgggcggt gttgtcgaca atgctgcccg tgtgtatggt 1620
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tccatgcagt ga 1752
<210> 4
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
agcaatggca tcgaagccag cctcctgact gaccccaagg aggttgccgg ccgcacttac 60
gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcaccg tcgctgcccg tctgacggag 120
aaccccgata tcactgtgct tgtcatcgaa agtggctcct acgagtctga cagaggtcct 180
atcattgagg acctgaacgc ttacggtcag atttttggca gcagtgtgga ccacgcctac 240
gagactgtcg agctcgccac caacaatcag actgcgctga tccgctccgg aaatggtctc 300
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tcatgggaga ccgtcttcgg aaatgagggc tggaactggg acagcgtggc cgcctactcc 420
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tccatgcagt ga 1752
<210> 5
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Lys Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Leu Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Ala Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 6
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Asn Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Lys Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Ala Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 7
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
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145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Leu Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Lys Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
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355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
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420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
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515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580

Claims (9)

1.提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。
2.根据权利要求1所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.提高比活的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1至3中任一项所述的葡萄糖氧化酶突变体的基因。
5.根据权利要求4所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；或为与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的序列。
6.提高葡萄糖氧化酶比活的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶突变，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第257由Q突变为K、第305位由M突变为L、第362位由A突变为T和第517位由G突变为A。
7.包含权利要求4或5所述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。
8.包含权利要求4或5所述葡萄糖氧化酶突变体基因的宿主细胞。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的提高比活的葡萄糖氧化酶突变体在饲料添加剂、食品添加剂、葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。
CN201810298371.0A 2018-03-30 2018-03-30 提高比活的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 Active CN108374001B (zh)

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