CN108048424B - 一种耐酸性提高的植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种耐酸性提高的植酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耐酸性提高的植酸酶突变体Pyt193，所述植酸酶突变体在pH＝1的强酸环境下，植酸酶活性可稳定保持1小时以上，与野生型植酸酶相比，对强酸的耐受性在很大程度上得到了提高，提高了植酸酶在饲料领域的应用广度和深度。

Description

一种耐酸性提高的植酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐酸性提高的植酸酶突变体。
背景技术
植酸又称六磷酸肌醇，可与金属离子结合，以复合盐类或单盐的形式存在。谷物、豆类和油料等作物中的磷大部分以植酸的形式存在。但是，单胃动物的消化道内缺乏植酸酶，不能很好地利用植物中的植酸磷。因此，植酸磷大部分难以被猪和禽所利用而随粪便排出体外，污染环境。
植酸酶能够将植酸分解为肌醇和磷酸，在动物饲料中添加植酸酶可使饲料中磷的利用率提高40-60％，从而可以减少饲料中磷酸氢钙等无机磷的添加量。另外，研究结果还发现了植酸酶的潜在营养价值，在饲料中添加一定量的植酸酶,能促进仔猪生长,提高日增重和饲料转化率,而且能显著提高饲料中粗蛋白、灰分、钙和磷的消化率。
但是，动物的胃肠道属于强酸环境，植酸酶作为饲料在饲喂到动物体内时要应对强酸环境，因此，植酸酶对强酸的耐受性直接关系到酶功效的发挥和利用；本发明通过对植酸酶基因进行定向改造，获得了一种耐酸性提高的植酸酶突变体，提高了植酸酶在饲料领域的应用广度和深度。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐酸性提高的植酸酶突变体Pyt193，所述植酸酶突变体在pH＝1的强酸环境下，植酸酶活性可稳定保持1小时以上，与野生型植酸酶相比，对强酸的耐受性在很大程度上得到了提高。
具体而言，本发明从土壤样品中克隆得到一种具有植酸酶活性的蛋白，将其命名为植酸酶Pyt，其最适反应pH为3-5，在pH为1的环境下，30分钟之内蛋白的活性会降低到10％以下，在实际应用时不足以应对动物胃肠道的强酸环境。
为了提高植酸酶Pyt的强酸耐受性，发明人对植酸酶Phy的三维结构进行了模拟，找到可能会影响植酸酶活性的关键氨基酸位点，并通过对氨基酸位点的定点突变获得蛋白突变体，进而对蛋白突变体的性质进行了检测，从而得到了耐酸性提高的植酸酶突变体。
一方面，本发明提供了一种耐酸性提高的植酸酶突变体Pyt193，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
另一方面，本发明还提供了所述突变体的编码基因，以及含有编码基因的重组载体，含有重组载体的宿主细胞。
在一个实施方式中，所述重组载体为pET系列的载体，优选，pET-22b、pET21a、pET28a、pET29a。在另一个实施方式中，所述宿主细胞优选大肠杆菌，更优选，大肠杆菌BL21。
另一方面，本发明还提供了植酸酶突变体Pyt193在强酸环境下降解植酸或植酸盐的应用；优选的，所述强酸环境为pH＝1-3，优选pH＝1；优选的，植酸盐为植酸钙、植酸镁、植酸钾、植酸钠、植酸铁、植酸磷。
另一方面，本发明还提供了所述植酸酶突变体的应用，所述应用为在制备饲料添加剂中的用途。
另一方面，本发明还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包括植酸酶突变体。
另一方面，本发明还提供了一种饲料，所述饲料包括所述饲料添加剂。
附图说明
图1：植酸酶Pyt最适pH测定曲线图。
图2：植酸酶Pyt最适温度测定曲线图。
图3：植酸酶Pyt在pH＝1的条件下酶活稳定曲线图。
图4：植酸酶Pyt三级结构预测图。
图5：植酸酶Pyt及各突变体蛋白酶活对照图。
图6：植酸酶突变体Pyt263在pH＝1的条件下酶活稳定曲线图。
图7：植酸酶突变体Pyt193在pH＝1的条件下30分钟内酶活稳定曲线图。
图8：植酸酶突变体Pyt193在pH＝1的条件下120分钟内酶活稳定曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法可按常规技术进行操作。本领域技术人员可以借助实施例更好的理解本发明；但是，本发明的保护范围不局限于所提供的实施例。
实施例1：植酸酶Pyt的获得
利用基因组提取试剂盒提取土壤基因组DNA，参照GenBank公开的植酸酶基因设计简并引物(5'-CTKMTKAWHTGCGYCGCTA-3'，5'-CAWTGCMAKYTHRGAAGGC-3')从土壤基因组DNA中进行植酸酶基因的扩增。
由于简并引物扩增效率不高，经过大量的条件优化和摸索，获得一条特异性的目的条带，将特异性的条带连接pMD19-T载体，挑选单克隆，测序，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，BLAST结果显示，该序列与植酸酶基因具有较高的同源性，将其命名为植酸酶Pyt。
实施例2：植酸酶Pyt的活性检测
设计引物从T载体上扩增Pyt基因，通过BamHI和XhoI双酶切连接到表达质粒pET-22b上，得到重组表达载体pET-pyt。
将重组载体pET-pyt转化到E.coli BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达重组蛋白，并采用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组Pyt蛋白。
重组Pyt蛋白的纯化步骤如下：用10ml Tris buffer与镍柱轻轻轻混后匀，离心，弃上清。重复以上步骤2次，将蛋白样品与镍柱结合，离心，弃上清。10ml Wash buffer与镍柱混匀，轻轻震荡10min，离心，弃上清。重复以上步骤2次。用1ml Elution buffer冲洗镍柱，收集样品。
植酸酶活性的测定方法如下：取酶液50μl，加入950μl 5mM植酸钠溶液，37℃水浴反应30分钟，加1ml 10％三氯乙酸(TCA)终止反应，再加2ml显色液显色5分钟，测定A700nm光吸收值。显色液组分：1％钼酸铵、3.2％硫酸亚铁和7.2％硫酸。对照组在水浴反应前以TCA终止反应。酶活单位(U)定义为37℃下每分钟释放1μmol无机磷所需要的酶量。
酶活最适pH是在35℃，pH 3-12范围内测定；最适温度在最适pH条件下，20-70℃范围内检测。
如图1和图2所示，植酸酶Pyt的最适反应pH为3-5，最适反应温度为30-50℃。
另外，在40℃、pH＝1的环境下，检测Pyt对强酸的耐受性，如图3所示，随着孵育时间的延长，Pyt的活性会逐渐降低，30分钟之内Pyt的活性会降低到10％以下，在实际应用时不足以应对动物胃肠道的强酸环境，作为饲料添加剂用于动物饲养受限。
实施例3：Pyt突变体的获得及活性测定
为了提高植酸酶Pyt对强酸的耐受性，通过SWISS-MODEL软件预测Pyt的关键氨基酸位点，如图4所示，在预测的Pyt三级结构中有若干个loop环，loop环对蛋白活性的发挥有重要的作用，其可能会影响Pyt酶活性以及酸耐受性。
选取了loop环区域的Thr37、Lys109、Asn193、Thr263以及Arg300位的氨基酸位点进行了定点突变，采用常规的操作方法将上述氨基酸位点分别突变为Ala，得到了5个植酸酶Pyt的突变体，突变后的蛋白如表1所示。
表1Pyt突变体蛋白及突变的位点
突变体蛋白 突变位点
Pyt37 Thr-Ala
Pyt109 Lys-Ala
Pyt193 Asn-Ala
Pyt263 Thr-Ala
Pyt300 Arg-Ala
通过融合PCR的方式获得表1的突变体蛋白基因，将获得的突变体蛋白基因按照实施例2的方法进行异源表达、纯化以及活性检测。
在pH＝4、温度40℃的条件下，检测各突变体蛋白的活性，如图5所示，由于关键氨基酸位点的突变，Pyt37、Pyt109和Pyt300与野生型Pyt蛋白相比，植酸酶活性显著降低，而Pyt193和Pyt263的活性则与野生型Pyt的活性相当。
另外，对Pyt193和Pyt263的强酸耐受性进行检测，如图6-7所示，在40℃、pH＝1的条件下，Pyt263的活性显著降低，在30分钟内活性降低到10％以下，与野生型Pyt相比没有明显的改观(图6)；但是，Pyt193的活性在30分钟内能够维持在70％以上(图7)。
对Pyt193的强酸耐受性做进一步检测，在40℃、pH＝1的条件下，如图8所示，Pyt193酶活性在1小时之内都能保证较高的稳定性，在1小时之内酶活性都可以保持在50％以上，直到2小时左右，Pyt193的酶活才降低到10％左右；与野生型Pyt相比，Pyt193在很大程度上提高了植酸酶的强酸耐受性，在作为饲料添加剂时具有更广阔的应用空间。
序列表
<110>菏泽学院
<120>一种耐酸性提高的植酸酶突变体及其应用
<130> CP11703278C
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atgaatcatt caaaaacgct tttgttaacc gcggcggccg gactgatgct cacatgcggt 60
gcggtgtctt cccaggcaaa gcataagctg tccgatcctt atcattttac cgtgaatgca 120
gcggcggaaa cggacccggt tgatacggcc ggtgacgcgg ctgctgatcc tgagatttgg 180
ctcgacccca agactcctca gaacagcaaa ttgattacga gcaataaaaa atcaggttta 240
gtcgtttaca gccttgatgg taagatgctt cgttcctata ataccgggaa gctgaacaat 300
gtcgatatcc gttatgattt tccgttgaac ggcaaaaaag tcgatatcgc ggcagcatcc 360
aatcgatctg aaggaaaaaa taccattgag atttacgcta ttgatggaaa gaacggcaca 420
ttacaaagca tgacagatcc agaccatccg attgcaacag caattaatga ggtatacggt 480
tttaccttat accacagtca aaaaacagga aaatattaca cgatggtgac aggaaaagag 540
ggtgaatttg cacaatacga attaaatccg gaccaaaatg gatacatatc cggcaaaaag 600
gtacgggcgt ttaaaatgaa ttcccagacg gaagggatgg cagcagacga tgaatacggc 660
aggcgttatc tcgcagatga agatgaggcc atttggaagt tcagcgccga gccggacggc 720
ggcagtaacg gaacggttat cgaacgtgcc gacggcaggc atttaactcg tgatattgaa 780
ggattgacga tttactacgc tgctgacggg aaaggctatc tgatggcatc aagccaggga 840
aacagcagct acgccattta tgacagacaa ggaaagaact catatgttgc ggattttcgc 900
ataacagacg gtcctgaaac agacgggaca agcgagacag acggaattga cgttctgggt 960
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tatcacggcc aaaaggccaa tcaaaatttt aaaatcgtgc catgtgaaag aatagctgat 1080
caaatcggtt tccgcccgct ggcaaatgaa cagtttgacc cgagaaaact gaccgacaga 1140
agcggaaaat aa 1152
<210> 2
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met
1 5 10 15
Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp
20 25 30
Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Asp Pro Val Asp
35 40 45
Thr Ala Gly Asp Ala Ala Ala Asp Pro Glu Ile Trp Leu Asp Pro Lys
50 55 60
Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile Thr Ser Asn Lys Lys Ser Gly Leu
65 70 75 80
Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Met Leu Arg Ser Tyr Asn Thr Gly
85 90 95
Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys
100 105 110
Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr
115 120 125
Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met
130 135 140
Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly
145 150 155 160
Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Thr Met Val
165 170 175
Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Ala Gln Tyr Glu Leu Asn Pro Asp Gln
180 185 190
Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser
195 200 205
Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Arg Tyr Leu
210 215 220
Ala Asp Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Glu Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr
245 250 255
Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly
260 265 270
Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp
275 280 285
Arg Gln Gly Lys Asn Ser Tyr Val Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly
290 295 300
Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Glu Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly
305 310 315 320
Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp
325 330 335
Gly Glu Asn Ile Tyr His Gly Gln Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile
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Asn Glu Gln Phe Asp Pro Arg Lys Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys
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Claims (13)

1.一种耐酸性提高的植酸酶突变体Pyt193，其特征在于，所述Pyt193的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.编码权利要求1所述的植酸酶突变体Pyt193的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体选自pET22b、pET21a、pET28a或pET29a。
5.包含权利要求3或4所述重组载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
8.权利要求1所述植酸酶突变体Pyt193或权利要求2所述基因在强酸环境下降解植酸或植酸盐的应用，所述强酸环境为pH＝1-3。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述强酸环境为pH＝1。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述植酸盐选自植酸钙、植酸镁、植酸钾、植酸钠、植酸铁、植酸磷或其任意组合。
11.权利要求1所述植酸酶突变体Pyt193在制备饲料添加剂中的应用。
12.一种饲料添加剂，包含权利要求1所述的植酸酶突变体Pyt193。
13.一种饲料，包含权利要求12所述的饲料添加剂。
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