KR101319368B1 - 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소 및 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는 박테리아 피타제 및 그의 변이체를 암호화하는 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포가 기술되어 있다.

부티옥셀라, 피타제, 식품, 사료, 아미노산, 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드

Description

효소{Enzymes}

본 발명은 사료 첨가제용 효소 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 식품 및 사료 내 인산염 분해를 증가시키는데 사용될 수 있는 피타제(phytase)에 관한 것이다.

피트산염(phytate)은 곡류 및 콩류 내 인의 주요 저장 형태이다. 그러나 돼지, 가금류 및 어류와 같은 단일 위장 동물은 피트산염(또는 피트산)을 대사하거나 흡수할 수 없고 따라서 배설되어 강한 가축 사육 지역 내 인 오염을 유발한다. 더욱이 피트산은 칼슘, 구리 및 아연과 같은 금속 작용제를 킬레이트시킴으로서 단일 위장 동물에서 항영양소(antinutritional) 작용제로도 작용한다.

이들 동물의 생장 및 건강을 위한 충분한 인산염을 제공하기 위해 무기 인산염이 그들 식이에 첨가된다. 이러한 첨가는 고비용이 될 수 있고 또한 오염 문제를 증가시킨다.

피타제의 작용을 통해 피트산염은 일반적으로 가수분해되어 저급 이노시톨-인산염 및 무기 인산염을 제공한다. 피타제는 동물의 유기 인의 유용성을 증가시키고 환경의 인산염 오염을 감소시키므로 동물 사료 첨가제로서 유용하다(Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

많은 진균(Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) 및 박테리아(Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H.W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)) 기원의 피타제가 문헌 내에 기술되어 있다.

그러나 현재까지 이들 피타제는 동물 사료 보충제로서 유용한 사용에 필요한 특성을 나타내지 않는다. 특히 진균 피타제는 단백질 가수분해적으로 불안정한 경향이 있고(Igbasan F.A. et al. Arch. Anim. Nutr. 53,353-373 (2000)) 따라서 분 해되기 쉽고, 박테리아 피타제는 피트산염에 대한 협소한 기질 특이성을 지니고 중간급 인산화의 이노시톨 인산염을 불충분하게 분해한다(Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo J et al. Biochem. J. 352, 623-628 (2000)).

따라서 개선된 피타제에 대한 요구가 존재한다.

발명의 요약

광범위한 관점에서 본 발명은 박테리아 유래의 피타제 및 그의 변형형에 관한 것이다. 특히 본 발명은 박테리아, 부티옥셀라종(Buttiauxella sp.) 유래의 피타제 및 야생형(모) 효소와 비교시 개선된 특성에 대해 선택되거나 설계된 그의 변형형에 관한 것이다.

본 발명은 사료 효소로서 특히 유용하고 유효하게 하는 특성을 지닌 신규한 피타제를 제공하므로 유익하다. 특히 본 발명은 여기서 기술된 분리되고 또는 정제된 신규한 피타제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체 또는 변형형에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 피타제를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

식품 또는 동물 사료의 효소 첨가제로서 유효하기 위해서 피타제는 많은 다 른 특성을 결합시켜야 한다. 동물 위장의 산성 환경 하에서 피트산을 분해할 수 있기 위해서는 낮은 pH, 바람직하게는 광범위한 pH 수치에서 활성적이어야 한다. 더욱이 높은 특이 활성 및 바람직하게는 단백질이 사료 펠렛과 같은 사료 제제에 일반적으로 사용되는 고온에 견딜 수 있는 높은 열안정성을 지녀야 한다.

또한 효소가 피트산염뿐만 아니라 이노시톨 펜타포스페이트, 테트라포스페이트 및 트리포스페이트와 같은 피트산염 분해 중간 산물도 가수분해시키는 광범위한 기질 특이성을 지니는 것이 중요하다. 돼지의 피트산염 분해 연구는 이들 이노시톨 올리고포스페이트 소장 및 대장 내에서 대부분 불용성으로 잔존하고 따라서 동물 및 창자 미소식물상에 의해 생성되는 알칼리성 인산염에 비친화적이 됨을 나타낸다(Schlemmer U. et al. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001)). 다른 효소의 기질 특이성 프로파일의 변이는 확인되었다. 예를 들어 바실러스 섭틸리스(B. subtilis) 유래의 피타제에 의해 생성된 이노시톨-트리포스페이트는 이러한 효소에 의한 또다른 가수분해에 본질적으로 저항적이다[Kerovuo J. et al. Biochem J. 352, 623-628 (2000)].

본 발명의 또다른 관점에서 여기서 기술된 신규한 피타제 또는 그의 변형형을 포함한 플라스미드 또는 벡터 시스템 또는 형질전환 또는 유전자이식 생물이 제공된다.

본 발명의 관점은 청구범위 및 하기 설명에 나타나 있다.

참고를 용이하게 하기 위해 본 발명의 이들 및 또다른 관점은 적당한 섹션 표제 하에서 논의된다. 그러나 각 섹션 하의 지침은 각각의 특정 섹션에 한정적인 것은 아니다.

본 발명에 참고로 사용된 "생산한다", "생산하는", "생산된", "생산 가능한", "생성"이라는 용어는 각각 "제조한다", "제조하는", "제조된", "제조 가능한", "제조", "생성하는", "생성된", "생성 가능한" 및 "생성"이라는 용어와 동의어이다.

본 발명에 참고로 사용된 "발현", "발현한다", "발현된" 및 "발현 가능한"이라는 용어는 각각 "전사", "전사하다", "전사된" 및 "전사 가능한"이라는 용어와 동의어이다.

본 발명에 참고로 사용된 "형질전환" 및 "트랜스펙션"이라는 용어는 숙주, 숙주 세포, 조직 또는 기관 내로 핵산 서열을 도입시키는 방법을 나타낸다.

본 발명에서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명의 서열을 포함한 컨스트럭트; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 벡터; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 플라스미드; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 형질전환 세포; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 형질전환 조직; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 형질전환 기관; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 형질전환 숙주; 본 발명에 사용되는 서열을 포함한 형질전환 생물. 또한 본 발명은 형질도입 방법을 포함한 숙주 세포 내 발현과 같은 본 발명에 사용되는 서열을 사용한 이의 발현 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 숙주 세포로부터의 분리와 같은 뉴클레오타이드 서열의 분리 방법을 포함한다.

본 발명에 사용되는 아미노산 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 암호화하는 컨스트럭트; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 암호화하는 벡터; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 세포; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 조직; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 기관; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 숙주; 본 발명에 사용되는 아미노산 서열을 발현하는 형질전환 생물. 또한 본 발명은 본 발명에 사용되는 서열을 형질도입시킨 후 정제하는 방법을 포함한 숙주 세포 내 발현과 같은 본 발명에 사용되는 서열을 사용한 이의 정제 방법을 포함한다.

본 발명은 부티옥셀라종에 대응하는 아미노산 서열, 그의 변형된 형태, 상동체, 변이체, 기능적 동등체 또는 유효 단편을 포함한 효소를 특징으로 한다.

"피타제"라는 용어는 피트산염을 포함한 인산의 에스테르 가수분해를 촉매하고 무기 인산염을 유리시키는 것이 가능한 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 피타제는 피트산염 외에 적어도 일부의 중간급 인산화의 이노시톨-인산염을 가수분해하는 것이 가능하다.

"부티옥셀라종 피타제에 대응하는"이라는 용어는 효소가 부티옥셀라종의 원천으로부터 수득될 필요는 없음을 의미한다. 대신에 효소는 바람직하게는 부티옥셀라종 피타제와 동일한 기능적 특성 또는 서열을 지녀야 한다. 예를 들어 부티옥셀라종 피타제는 부티옥셀라종으로부터 유래하나 부티옥셀라종에 본래 존재하지 않는 변이체도 된다.

부티옥셀라종은 부티옥셀라 아그레티스(Buttiauxella agrestis), 부티옥셀라 브렌네레(Buttiauxella brennerae), 부티옥셀라 페라구티에(Buttiauxella ferragutiae), 부티옥셀라 가비니에(Buttiauxella gaviniae), 부티옥셀라 이자르디(Buttiauxella izardii), 부티옥셀라 노아키에(Buttiauxella noackiae), 부티옥셀라 와름볼디에(Buttiauxella warmboldiae)를 포함한다. 부티옥셀라종의 균주는 DSMZ, German National Resource Centre for Biological Material로부터 입수 가능하다. 피타제는 바람직하게는 여기서 기술된 방법 예를 들어 서열번호 2로의 혼성화에 의해 부티옥셀라종으로부터 확인된다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 분리하기 위한 바람직한 부티옥셀라종 균주는 실시예에 나타나 있다.

본 발명에 따른 "야생형 피타제" 또는 "야생형"이라는 용어는 자연 내에서 발견되는 아미노산 서열을 지닌 피타제 효소를 나타낸다.

본 발명에 따른 "피타제 효소 변이체" 또는 "피타제 변이체" 또는 "변이체"라는 용어는 모피타제(parent phytase)의 아미노산 서열로부터 유래되나 "돌연변이"로 표기되는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 달라지는 아미노산 서열을 지닌 피타제 효소를 나타낸다. 피타제 효소 변이체도 분자 진화와 같은 피트산염 변이체의 제조 방법의 또다른 라운드를 위한 모피타제 효소도 되는 것으로 판단된다.

여기서 "상동체"로도 기재된 본 발명에 따른 "상동적 폴리펩타이드(들)"이라는 용어는 첫 번째 폴리펩타이드/피타제/효소 아미노산 서열과 비교시 75% 이상, 바람직하게는 80%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 지닌 폴리펩타이드, 바람직하게는 피타제 효소(즉, "상동적 피타제" 또는 "상동적 효소")를 나타낸다.

"그의 기능적 동등체"라는 용어는 효소가 부티옥셀라종 피타제와 동일한 기능적 특성을 지녀야 함을 의미한다. "변형형" 또는 "변이체"라는 용어는 효소가 그의 원형으로부터 변형되었으나 부티옥셀라종 피타제와 동일한 효소적 기능적 특성을 보유함을 의미한다. 특히 "변이체" 또는 "변형형"라는 용어는 모/야생형 피타제의 아미노산 서열로부터 유래되고 돌연변이로 표기되는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 지닌 아미노산 서열을 지닌 피타제 효소를 포함한다. 변형형 또는 변이체는 모효소와 비교시 변경된 효소 특성을 나타낸다. 바람직하게는 변형형 또는 변이체는 하나 이상의 하기 증가된 표현형을 지닌다: 증가된 열안정성 및/또는; 증가된 단백질가수분해(예를 들면 펩신) 안정성 및/또는; 증가된 특이 활성 및/또는; 더욱 광범위한 기질 특이성 및/또는; 더욱 광범위한 pH 범위에 대한 활성. "기능적" 또는 "유효" 단편이라는 용어는 부티옥셀라종의 단편 또는 일부가 거의 동일한 효소 기능 또는 효과를 보유함을 의미한다.

바람직하게는 본 발명의 이러한 관점의 피타제 효소는 부티옥셀라종 피타제와 동일한 서열 또는 적어도 75% 이상 동일한(상동적) 서열을 지닌다.

적당하게는 효소는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 적어도 75% 이상 동일성(상동성)을 지닌 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 바람직한 실시태양에서 본 발명은 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 적어도 75% 이상 동일성(상동성)을 지닌 서열 또는 그의 기능적 단편을 지닌 분리되고 또는 정제된 폴리펩타이드를 제공한다. 서열번호: 3 및 서열번호: 3을 포함한 폴리펩타이드의 표기시 이는 발현 동안 예를 들어 신호 펩타이드 분열에 의해 동시 또는 후-번역적으로 처리된 폴리펩타이드도 나타내는 것으로 판단된다. 또한 후-번역 분열은 C-말단에서 발생한다. 따라서 바람직한 실시태양에서 그의 유효 단편(그의 기능적 단편으로도 표기됨)은 고유 숙주 또는 적당한 발현 숙주에 의해 생성된 성숙 폴리펩타이드이다.

또다른 실시태양에서 피타제는 수탁번호 NCIMB 41248로 기탁된 부티옥셀라종 균주 P1-29로부터 유래된다.

바람직한 실시태양에서 본 발명은 하기 위치(서열번호: 3 내의 번호에 따른 번호)에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한 본 발명의 첫 번째 관점의 어떠한 실시태양에도 따른 피타제에 관한 것이다:

59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351.

이들 위치는 이들 위치에서의 효소 돌연변이유발이 원하는 효소 특성의 개선을 유도함을 특징으로 한다.

하기 치환이 바람직한 변이체이다:

K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

N 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y

A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y

H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y

T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y

A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

I 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

G 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y

K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y

A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y

N 351. A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y.

"보존적 돌연변이"는 나타난 아미노산 잔기와 비교시 아미노산 특성 측면에서 보존적인 아미노산 잔기로의 돌연변이를 의미한다. 아미노산 특성은 잔기의 크기, 소수성, 극성, 전하, pK-수치 및 당분야에 알려진 다른 아미노산 특성을 포함한다. 바람직한 보존적 돌연변이는 하기에 보존적 치환으로 기입된다.

특히 바람직한 실시태양에서 돌연변이는 하나 이상의 하기 위치에서 존재한다: K59; T167; K240; T167; K240; D244; Q289; T209 및 F197.

이들 특정 위치에서의 바람직한 돌연변이는 상기 기입되어 있고, 더욱 바람직한 돌연변이는 포함한다: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K 및 F197S.

또다른 바람직한 실시태양에서 하기로 구성된 군에서 선택된 돌연변이의 조합을 포함한 피타제가 제공된다:

D125E/H193R;

A294E/N303K;

T167I/K240T;

D223E/K240E/N351D;

T167I/K240T/A294E/N303K;

T167I/K240E/A242S/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K;

A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K;

D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/ N303K;

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/ N303K/I336F 및

N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/

A294E/N303K.

따라서 본 발명에 따른 바람직한 피타제는 상기 기입된 하나 이상의 아미노산 돌연변이 또는 상기 기입난 돌연변이의 하나 이상의 조합을 지니는 것을 제외하고는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 유효 단편(또는 그의 상동체, 바람직하게는 피타제는 수탁번호 NCIMB 41248로 기탁된 부티옥셀라종 균주 P1-29로부터 유래되고, 또는 그의 상동체)을 포함한 변이체이다.

이들 실시태양에서 명명법은 서열번호: 3의 아미노산 위치를 참고로 나타난 돌연변이를 지닌 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열을 포함한 피타제를 나타낸다. 명명법은 하기 더욱 상세히 설명된다.

적당하게는 이들 변이체는 하기의 어느 하나에 대한 개선된 특성을 나타낸다: 온도 안정성, pH 범위, 펩신 안정성, 특이 활성, 기재 특이성 및 광범위한 기재 특이성. 이들 특성의 적당한 측정 방법은 여기서 개시된다.

특히 피타제 특성의 개선은 개선된 변이체를 사료 보충제로 사용하기에 특히 적당하게 하는 식품 및 사료 처리 조건 하에서의 효소 안정성, 위장 통과시 효소 안정성 및 인간 또는 동물 위장 및/또는 창자 내 효소 활성 및 안정성을 나타낸다. 따라서 이러한 개선은 다른 파라미터들 중 증가된 온도, 바람직하게는 65℃ 이상의 온도에서의 안정성 증가, 단백질 가수분해성 분해, 바람직하게는 펩신과 같은 소화관의 프로테아제에 대한 안정성 증가, 낮은 pH에서의 에서의 촉매 활성, 바람직하게는 pH 5.5 이하에서의 촉매 활성 증가 및 바람직하게는 이노시톨 인삼염 이외에 피트산염으로부터 인산기를 유리시키는 일반적 효율을 포함한다.

명명법

본 명세서 및 청구범위에 있어서 아미노산 잔기에 대한 통상의 1-문자 및 3-문자 코드가 사용된다. 표기를 용이하게 하기 위해 효소 변이체 내 돌연변이는 하기 명명법을 이용하여 기재된다: 모효소내 아미노산 잔기; 위치; 치환된 아미노산 잔기(들). 이러한 명명법에 따라 예를 들어 위치 20에서의 글리신 잔기로의 알라닌 잔기의 치환은 Ala20Gly 또는 A20G로 나타난다. 동일한 위치에서의 알라닌 결실은 Ala20* 또는 A20*로 나타난다. 추가 아미노산 잔기(즉, 글리신)의 삽입은 Ala20AlaGly 또는 A20AG로 나타난다. 아미노산 잔기의 연속 스트레치의 결실(위치 20의 알라닌과 위치 21의 글리신 사이)은 Δ(Ala20-Gly21) 또는 Δ(A20-G21)로 나타난다. 모효소 서열이 번호에 사용된 효소 서열과 비교시 결실을 포함하는 경우 이러한 위치에서의 삽입(결실된 위치 20 내의 알라닌)은 *20Ala 또는 *20A로 나타난다. 다수의 돌연변이는 플러스 기호 또는 슬래쉬로 구분된다. 예를 들어 위치 20 및 21에서 각각 알라닌과 글루탐산을 글리신과 세린으로 치환시키는 2개의 돌연변이는 A20G+E21S 또는 A20G/E21S로 나타난다. 주어진 위치에서의 아미노산 잔기가 2 이상의 대체 아미노산 잔디로 치환되는 경우 이들 잔기는 쉼표 또는 슬래쉬로 구분된다. 예를 들어 위치 30에서 알라닌을 글리신 또는 글루탐산으로의 치환은 A20G,E 또는 A20G/E 또는 A20G, A20E로 나타난다. 변형에 적당한 위치가 제안되는 특정 변형 없이 여기서 확인되는 경우 어떠한 아미노산 잔기도 그 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 대해 치환됨이 이해되어야 한다. 따라서 예를 들어 위치 20 내 알라닌의 변형이 기술되나 한정되지 않은 경우 알라닌은 결실되거나 어떠한 다른 아미노산 잔기(즉, R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V 중 어느 하나)로도 치환됨이 이해되어야 한다.

적당하게는 본 발명의 피타제 또는 기능적 동등체는 상기 피타제가 적어도 100 U/mg 또는 200 U/mg 이상, 바람직하게는 적어도 300 U/mg 이상의 특이 활성을 지님을 특징으로 하고, 상기 특이 활성은 실시예 1에 기술된 바와 같이 pH 3.5에서 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내에 2 mM 피트산염, 0.8 mM CaCl₂를 함유한 용액 내에서 상기 피타제를 인큐베이트시킴으로서 측정된다. 또한 본 발명의 피타제 또는 그의 기능적 동등체는 적당하게는 상기 피타제가 약 pH 4∼4.5에서 최대 활성을 지님을 특징으로 하고, 상기 활성은 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내에 2 mM 피트산염, 0.8 mM CaCl₂를 함유한 용액 내에서 상기 피타제를 인큐베이트시킴으로서 측정된다. 또한 본 발명의 피타제는 적당하게는 pH 2.5 및 .5에서 관찰되는 최대 활성의 40% 이상을 지님을 특징으로 하고, 글리신 염산염 완충액이 pH 2.5에서 활성을 측정하는데 사용된다.

적당하게는 하나의 실시태양에서 본 발명의 피타제 또는 그의 기능적 동등체는 300 U/mg 이상의 특이 활성을 지님을 특징으로 하고, 상기 특이 활성은 pH 3.5에서 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내에 2 mM 피트산염, 0.8 mM CaCl₂를 함유한 용액 내에서 상기 피타제를 인큐베이트시킴으로서 측정된다. 또다른 실시태양에서 본 발명의 피타제 또는 그의 기능적 동등체는 적당하게는 상기 피타제가 약 pH 4∼4.5에서 최대 활성을 지님을 특징으로 하고, 상기 활성은 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내에 2 mM 피트산염, 0.8 mM CaCl₂를 함유한 용액 내에서 상기 피타제를 인큐베이트시킴으로서 측정된다.

또다른 관점에서 본 발명은 부티옥셀라종 피타제에 대응하는 아미노산 서열 또는 그의 상동체를 포함한 효소를 암호화하는 분리되고 또는 정제된 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 적당하게는 상기 분리되고 또는 정제된 핵산 분자는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 75% 이상 동일성(상동성)을 지닌 서열 또는 그의 유효 단편을 포함한 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 실시태양에서 핵산 분자는 서열번호: 3을 포함하고 여기서 기입된 바람직한 위치에서의 돌연변이 또는 어떠한 특정 돌연변이 또는 여기서 기입된 돌연변이의 조합을 포함한 폴리펩타이드를 암호화한다. 또다른 실시태양에서 본 발명은 서열번호: 2과 동일하거나 이에 상보적이거나 이에 대한 어떠한 적당한 코돈 치환을 포함거나 서열번호: 2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 뉴클레오타이드 서열을 포함한 분리되고 또는 정제된 핵산 분자를 제공한다.

또다른 관점에서 본 발명은 하기에 나타난 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 이용에 관한 것이다:

(a) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열;

(b) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편인 뉴클레오타이드 서열;

(c) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 상보체인 뉴클레오타이드 서열;

(d) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편인 상보체의 뉴클레오타이드 서열;

(e) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열;

(f) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열;

(g) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 상보체인 뉴클레오타이드 서열;

(h) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 상보체인 뉴클레오타이드 서열;

(i) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 상보체에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열;

(j) 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편의 상보체에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열.

뉴클레오타이드는 중간 스트린전시, 더욱 바람직하게는 높은 스트린전시, 더욱 더 바람직하게는 매우 높은 스트린전시 조건 하에서 혼성화하는 것이 가능한 경우 상기 뉴클레오타이드 (e), (f), (g), (h), (i) 또는 (j)의 어느 하나에 혼성화하는 것으로 고려된다.

혼성화를 준비하기 위해 블럿팅용 블럿 표준 분자 생물학 프로토콜이 이용된다(즉, DNA 혼성화용 서던 블럿). 타겟 DNA의 양은 타겟 서열의 상대적 양에 따라 달라진다. 순수 타겟 서열이 사용되는 경우 폴리뉴클레오타이드의 킬로베이스 당 1∼5 피코그램의 DNA가 바람직하다. 일반적으로 검출 한계는 10⁹ dpm/mg의 특이 활성을 지닌 방사성 프로브에 대해 약 0.5 pg DNA이고, 이는 복합 게놈(즉, 인간)의 3.3 mg 게놈 DNA 내 500 bp 길이의 단일-카피 유전자와 동등하다. 실제로 약 10 mg의 게놈 DNA를 사용한다 - 예를 들어 미생물과 같은 생물에 대해 선별하기 위해 이는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 피타제를 포함함. 타겟 DNA가 박테리아성 예를 들어 플라스미드인 경우 DNA를 희석시켜 노출을 방지해야 한다. 타겟 DNA는 도트 블럿팅에 의해 또는 전기영동 겔로부터의 블럿팅을 통해 블럿된다. 바람직한 조건은 'Membrane Transfer and Detection Methods, Amersham International plc, UK .- PI/162/85/1)에 기술되어 있다. 하이본드 N+ 양으로 하전된 나일론 멤브레인이 바람직하게 사용된다(Amersham Life Science). 프로브는 바람직하게는 > 1×10⁹ dpm/mg의 프로브를 제조하기 위해 Pharmacia사의 Ready to Go DNA^TM 표지 키트에 따라 제조된다. 프로브는 밀리리터 혼성화 완충액 당 1×10⁶ dpm의 농도로 혼성화 완충액에서 사용된다. 블럿은 바람직하게는 65℃에서 1시간 동안 혼성화 완충액(DNA 100 mg/ml 완충액이 되는 6 x SSC, 5 x denhardt's 용액 및 0.5% SDS 및 변성 연어 정자) 내에서 예비 혼성화된 후 65℃에서 12시간 동안 진탕하면서 변성 표지된 프로브를 함유한 혼성화 완충액 내에서 혼성화된다. 이후 블럿(들)은 65℃에서 30분간 2 x ssc, 0.1% SDS 내의 적당한 부피의 세척 완충액으로 세척된 후 중간 스트린전시 세척용 동일 세척 완충액 또는 65℃에서 10분간 0.1% x SSC, 0.1% SDS 내(높은 스트린전시 세척)의 적당한 부피의 세척 완충액으로 두 번째 세척되고, 두 번째 세척은 매우 높은 스트린전시 세척을 위해 70℃에서 반복될 수 있다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 3 또는 그의 유효 단편 또는 변이체 또는 변형형 또는 상동체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함한다.

특히 본 발명은 여기서 기술된 피타제 또는 그의 상동체 또는 유도체를 포함한 플라스미드 또는 벡터 시스템을 제공한다. 바람직하게는 본 플라스미드 또는 벡터 시스템은 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 75% 이상 상동적인 서열 또는 그의 유효 단편을 포함한다. 적당하게는 플라스미드 또는 벡터 시스템은 미생물 내에서 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 75% 이상 상동적인 서열에 의해 암호화된 어떠한 효소의 발현을 위한 발현 벡터이다. 적당한 발현 벡터는 여기서 기술되어 있다. 더욱이 본 발명은 변형 효소 또는 여기서 기술된 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 위한 플라스미드 또는 벡터 시스템을 제공한다. 적당한 발현 벡터는 여기서 기술되어 있다.

피타제 변이체

본 발명은 모피타제의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형에 의한 모피타제 특성의 개선에 관한 것이다.

본 발명에 따른 모효소로 사용된 피타제 효소는 박테리아 유래의 야생형 피타제, 특히 바람직하게는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 및 그의 유효 단편 또는 서열번호: 3과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열 또는 그의 유효 단편을 지닌 부티옥셀라종으로부터 수득 가능하거나 그로부터 유래된 피타제를 포함한다.

본 발명의 개선된 피타제 효소 변이체는 바람직하게는 서열번호: 3 또는 그의 유효 단편과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 지닌다. 그러나 상기 변이체는 서열번호: 3에 이형적임(즉, 상동적이지 않음)도 역시 고려된다. 예를 들어 본 발명에 따른 모피타제를 사용하여 제조되나 변이체를 유발하는 엑소-매개 재조합 또는 패밀리 셔플링(family shuffling)과 같은 재조합 기술에 의해 생성된 변이체는 75% 이하 상동성을 지닌다.

서열 동일성의 측정뿐만 아니라 서열 정렬도 GCG 프로그램 패키지(Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453)에서 제공된 GAP과 같은 당분야에 알려진 컴퓨터 프로그램에 의해 적당히 수행된다. GAP은 하기 폴리펩타이드 서열 비교용 셋팅으로 이용된다: 3.0의 GAP 생성 패널티(penalty) 및 0.1의 GAP 연장 패널티. 예를 들어 서열 정렬은 상동적 폴리펩타이드 내 대응 위치를 측정하는데 이용된다.

피타제 효소는 하나 이상의 하기 발현 숙주 내에서의 이형적 발현 후 특성화되었다: 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) K12; 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis); 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae). 다른 발현 숙주도 사용된다.

본 발명에 따른 피타제 특성의 개선은 식품 및 사료 제품의 첨가제로서의 사용뿐만 아니라 식품 및 사료 처리시 사용에 관한 것이다. 특히 개선은 식품 및 사료 처리 조건 하에서의 안정성, 위장 통과시 안정성 및 인간 또는 동물 위장 및/또는 창자 내 활성 및 안정성에 관한 것이다. 이러한 개선은 다른 파라미터들 중 증가된 온도, 바람직하게는 65℃ 이상의 온도에서의 안정성 증가, 단백질 가수분해성 분해, 바람직하게는 펩신과 같은 소화관의 프로테아제에 대한 안정성 증가, 낮은 pH에서의 에서의 촉매 활성, 바람직하게는 pH 5.5 이하에서의 촉매 활성 증가 및 피트산염으로부터 인산기를 유리시키는 일반적 효율을 포함한다.

증가된 온도에서의 안정성 증가는 효소의 불활성화 온도에 의해 정량화된다. 불활성화 온도는 특정 기간 동안의 인큐베이트시켜 실온으로 냉각시킨 후 피타제 효소의 잔여 활성이 실온에서 동일한 조건 하에 동일한 기간 동안 인큐베이트된 동일한 피타제 효소의 잔여 활성의 50%인 온도로 정의된다. 열안정성 차이는 2 효소의 불활성화 온도 사이의 ℃ 차이이다.

개선된 특성을 획득하기 위해 돌연변이되는 위치 및/또는 영역은 야생형 피타제의 서열 및 구조의 분석뿐만 아니라 모효소의 돌연변이유발 특히 서열번호: 3에 나타난 야생형 아미노산 서열 내로의 돌연변이를 도입시켜 개선된 특성을 지닌 효소 변이체를 선별하는 것에 의해서도 발견되었다. 이에 따라 모효소 내의 위치뿐만 아니라 특정 영역이 피타제 효소의 특성을 개선시키는데 유의적인 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명은 모피타제와 비교시 하나 이상의 하기 위치(서열번호: 3의 번호에 따른 번호) 및/또는 서열번호: 3의 아미노산 서열에 나타난 피타제에 상보적인 피타제 내의 대응 위치에서의 돌연변이 또는 각 위치에서의 보존적 돌연변이를 포함한 개선된 특성을 지닌 피타제 변이체에 관한 것이다:

59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351. 이들 위치는 이들 위치가 효소 특성의 개선을 유도함을 특징으로 한다.

K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K 및 F197S

특히 바람직한 돌연변이 조합은 하기를 포함한다:

D125E/H193R;

A294E/N303K;

T167I/K240T;

D223E/K240E/N351D;

T167I/K240T/A294E/N303K;

T167I/K240E/A242S/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K;

A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/ N303K;

D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/ N303K;

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/ N303K/I336F 및

N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/

N303K.

피타제 변이체의 제조 방법

광범위한 실시태양에서 본 발명은 피타제 효소 변이체(들)의 제조 방법을 제공한다.

바람직한 실시태양에서 피타제 효소 변이체의 제조 방법은 하기 연속 단계를 포함한다:

a) ⅰ) 여기서 기술된 부티옥셀라종 피타제에 대응하는 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드 또는 그의 변형형, 상동적 폴리펩타이드, 변이체, 기능적 동등체 또는 유효 단편 또는 ⅱ) 여기서 기술된 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체를로부터 적어도 하나 이상의 모효소를 선택하는 단계;

b) 삽입, 결실, 치환 또는 이의 결합인 상기 모피타제 효소의 적어도 하나 이상의 변경을 도입시킴으로서 적어도 하나 이상의 피타제 변이체를 생성하여 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체를 수득하는 단계;

c) 모피타제 효소와 비교시

ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

ⅱ) 특이 활성 및/또는

ⅲ) 단백질 가수분해 안정성에서 선택된 개선된 특성/특성들을 지닌 개선된 피타제 효소 변이체를 확인하기 위해 상기 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체를 선별하는 단계

d) 상기 개선된 피타제 효소 변이체를 제조하여 분리되고 또는 정제된 피타제 효소 변이체를 생성하는 단계.

바람직한 실시태양에서 단계 b) 동안 피타제 효소 변이체 집단이 생성되고 단계 c)에서 상기 피타제 효소 변이체 집단의 적어도 일부가 선별된다.

바람직한 실시태양에서 단계 a)는 모피타제 효소를 암호화하는 청구항 11 내지 13에 따른 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이유발시키는 단계를 포함하고, 단계 b)는 숙주 세포 내에서 단계 a)에서 수득된 돌연변이 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계를 포함하고, 단계 c)는 상기 개선된 특성/특성들을 지닌 개선된 피타제 효소 변이체에 대해 숙주 세포 또는 그의 추출물(들)을 선별하는 단계를 포함한다.

또다른 실시태양에서 단계 c) 및 선택적으로는 단계 d)후 단계 a) 내지 c) 및 선택적으로는 d)를 반복하는 적어도 하나 이상의 연속 라운드를 포함하고, 상기 연속 라운드(들)에서 단계 a)의 적어도 하나 이상의 모피타제 효소는 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체 및/또는 본 방법에 따라 제조된 개선된 피타제 변이체에서 선택됨을 특징으로 한다.

또다른 바람직한 실시태양에서 단계 c)는 ⅰ) 상기 모피타제 효소 및/또는 ⅱ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편을 포함한 폴리펩타이드와 비교시 적어도 2.5 이상의 열안정성 차이를 지닌 개선된 피타제 효소 변이체를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함한다.

또다른 실시태양에서 단계 c)는 ⅰ) 상기 모피타제 효소 및/또는 ⅱ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편을 포함한 폴리펩타이드와 비교시 적어도 30 이상의 펩신 안정성을 지닌 개선된 피타제 효소 변이체를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함한다.

또다른 실시태양에서 단계 c)는 ⅰ) 상기 모피타제 효소 및/또는 ⅱ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편을 포함한 폴리펩타이드와 비교시 서열번호: 3에 의해 암호화된 피타제 대비 적어도 110 이상의 특이 활성 비율을 지닌 개선된 피타제 효소 변이체를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은

a) ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

ⅱ) 부티옥셀라종 유래의 모피타제 효소,

ⅲ) 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체에서 모피타제 효소를 선택하는 단계;

b) 모피타제 효소 내 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환인 적어도 하나 이상의 변경을 생성하여 피타제 효소 변이체를 수득하는 단계;

c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

ⅱ) 특이 활성 및/또는

ⅲ) 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 효소 변이체를 선별하는 단계;

d) 상기 피타제 효소 변이체를 제조하는 단계를 포함한

피타제 효소 변이체의 제조 방법을 제공한다.

선택적으로는 적어도 단계 a) 내지 c)는 하나 이상의 연속(반복) 라운드로 반복된다. 따라서 모피타제 효소는 상기 방법 a) 내지 (c)의 이전 라운드에 의해 제조된 피타제 효소 변이체인 것으로 고려된다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 하기 단계를 포함한 피타제 변이체의 제조 방법을 제공한다:

(a) (ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

(ⅱ) 부티옥셀라종 유래의 모피타제 효소,

(ⅲ) 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체에서 선택된 모피타제 효소를 제조하는 단계;

(b) 모피타제 내 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 또는 그의 결합을 통해 수득되는 모피타제의 변경에 의해 피타제 변이체 집단을 생성하는 단계;

(c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

(ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

(ⅱ) 더 높은 특이 활성 및/또는

(ⅲ) 더 높은 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 변이체 집단을 선별하는 단계;

(d) 상기 피타제 집단에서 하나 이상의 피타제 변이체를 선택하는 단계;

(e) 선택적으로는 하나의 사이클에서 선택된 피타제 변이체가 다음 사이클에서 첫 번째 피타제로 사용되도록 단계 (a) 내지 (c)를 순환적으로 반복하는 단계.

또다른 실시태양에서 본 발명은

a) ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

ⅱ) 부티옥셀라종 유래의 모피타제 효소,

ⅲ) 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체에서 선택된 모피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이유발시키는 단계;

b) 숙주 세포 내에서 단계 a)에서 수득된 돌연변이 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계;

c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

ⅱ) 더 높은 특이 활성 및/또는

ⅲ) 더 높은 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 효소를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 단계;

d) 상기 숙주 세포에 의해 발현된 피타제 효소 변이체를 제조하는 단계를 포함한 피타제 효소 변이체의 제조방법을 제공한다.

선택적으로는, 선택적으로 d)를 포함하여 단계 a) 내지 c)는 하나 이상의 연속(반복) 라운드로 반복된다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 하기 단계를 포함한 피타제 변이체의 제조 방법을 제공한다:

(a) (ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

(ⅱ) 부티옥셀라종 유래의 모피타제 효소,

(ⅲ) 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체에서 선택된 모피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이유발시켜 모피타제 내 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 또는 그의 결합을 통해 수득되는 변경에 의해 변경된 뉴클레오타이드 변이체 집단을 생성하는 단계;

(b) 대응 숙주 세포 집단 내에서 단계 a)에서 수득된 뉴클레오타이드 변이체 집단을 발현시키는 단계;

(c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

(ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

(ⅱ) 더 높은 특이 활성 및/또는

(ⅲ) 더 높은 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 변이체 집단을 선별하는 단계;

(d) 상기 피타제 집단에서 하나 이상의 피타제 변이체를 선택하는 단계;

(e) 선택적으로는 하나의 사이클에서 선택된 피타제 변이체가 다음 사이클에서 첫 번째 피타제로 사용되도록 단계 (a) 내지 (c)를 순환적으로 반복하는 단계.

상기 피타제 효소 변이체의 제조 방법에서 적당하게는 상기 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 DNA 서열이다.

뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 여기서 기술된 부티옥셀라종 피타제에 대응하는 아미노산 서열을 포함한 효소를 암호화하는 분리되고 또는 정제된 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 또는 그의 상동체이다.

피타제 효소는 여기서 기술된 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편 또는 서열번호: 3에 개시된 부티옥셀라종 피타제의 상동체에서 선택된다.

피타제 효소 변이체의 제조 방법에 관한 본 발명의 상기 실시태양에서 모피타제 효소/모피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드/뉴클레오타이드는 바람직하게는 야생형 피타제이다.

그러나 또다른 실시태양에서 모효소는 이전 라운드 돌연변이유발에 의해 제조된 변이체도 된다. 즉, 하나의 실시태양에서 피타제 효소 변이체의 제조 방법은 반복적이고 단계 a) 내지 c)(선택적으로는 단계 d) 포함)는 적어도 1회 이상 반복됨을 특징으로 한다. 이러한 실시태양에서 첫 번째 라운드 돌연변이유발에 사용된 돌연변이유발 방법은 바람직하게는 오류 빈발 PCR, 더욱 바람직하게는 오류 역치 PCR이다. 연속 라운드도 오류 빈발 PCR, 더욱 바람직하게는 오류 역치 PCR이나 대안으로 돌여변이유발의 첫 번째 라운드에서 확인된 적어도 2 이상의 독립된 개선 변이체 그룹이 두 번째 또는 이후 라운드 돌연변이유발 동안 재조합되어 적어도 하나 이상의 재조합 변이체를 제공하는 재조합 기반 돌연변이유발(즉, 패밀리 셔플링 또는 재조합효소 연쇄 반응법을 이용)이다.

래셔날 디자인(rational design), 사이트 스캐닝 돌연변이유발 또는 화학적/방사선 유도 돌연변이유발을 포함한 대안적 돌연변이유발 방법도 사용될 수 있음이 당업자에게 명백해질 것이다.

피타제 효소 변이체의 제조 방법에 관한 본 발명의 상기 실시태양에서 피타제 효소 변이체는 바람직하게는 더 높은 열안정성에 대해 선별된다.

피타제 효소 변이체의 제조 방법에 관한 본 발명의 상기 실시태양에서 피타제 효소 변이체는 바람직하게는 더 높은 열안정성, 더 높은 단백질 가수분해 안정성 또는 더 높은 특이 활성에서 선택된 적어도 단일 파라미터, 가장 바람직하게는 더 높은 열안정성에 대해 선별된다.

바람직하게는 상기 첫 번째 파라미터에 대한 선별은 적어도 단계 a) 내지 c)를 포함한 첫 번째 라운드 돌연변이유발에서 수행되고, 단계 c)는 적어도 상기 첫 번째 파라미터에 대한 선별을 포함함을 특징으로 한다. 이후, 이러한 첫 번째 라운드 돌연변이유발은 단계 a) 내지 c)(선택적으로는 d) 포함)를 포함한 또다른 라운드의 돌연변이유발 및 선택이 뒤따를 수 있고, 상기 또다른 라운드 내의 선택은 상기 첫 번째 라운드의 단계 c)에서 사용된 동일한 선택 파라미터 또는 대안적으로 다른 파라미터에서 선택될 수 있다.

상기 피타제 효소 변이체의 제조 방법의 반복 라운드 동안 바라직하게는 상기 첫 번째 파라미터는 더 높은 열안정성, 더 높은 단백질 가수분해 안정성 또는 더 높은 특이 활성, 가장 바람직하게는 더 높은 열안정성에서 선택된다. 바람직하게는 첫 번째 라운드 돌연변이유발이 더 높은 열안정성을 지닌 변이체를 선택하기 위해 수행된 경우 단계 a) 내지 c)를 포함한 연속(반복) 라운드(들) 동안 상기 파라미터는 더 높은 열안정성, 더 높은 단백질 가수분해 안정성 또는 더 높은 특이 활성, 가장 바람직하게는 더 높은 단백질 가수분해 안정성 또는 더 높은 특이 활성에서 선택된다.

피타제 효소 변이체의 제조 방법에 관한 본 발명의 상기 실시태양에서 피타제 효소 변이체는 바람직하게는 적어도 하나 이상의 라운드의 돌연변이유발(단계 a) 내지 c), 바람직하게는 하나 이상의 라운드 즉, 선택의 반복 라운드 내에서 더 높은 열안정성, 더 높은 단백질 가수분해 안정성 또는 더 높은 특이 활성에 대해 선별된다.

모피타제 효소는 바람직하게는 부티옥셀라 P1-29로부터 유래된다.

모피타제 효소를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이유발시키는 단계를 포함한 피타제 효소 변이체의 제조 방법에 있어서 모피타제 효소를 암호화하는 DNA 서열은 바람직하게는 무작위 돌연변이유발, 더욱 바람직하게는 오류 빈발 PCR, 더욱 더 바람직하게는 오류 역치 PCR이 수행된다.

바람직한 모피타제 효소를 암호화하는 DNA 서열의 돌연변이유발 방법은 오류 빈발 PCR, 더욱 더 바람직하게는 오류 역치 PCR이고, 다른 돌연변이유발 방법이 오류 빈발/역치 PCR 대신 또는 오류 빈발/역치 PCR과 결합하여 이용된다. 적당한 오류 빈발 PCR 및 오류 역치 PCR 방법에 대한 참고를 제공하는 실시예 12 참조. 또다른 적당한 돌연변이유발성 PCR 방법은 Cadwell and Joyce(PCR Methods Appl. 3(1994), 136-140)에 의해 개시되어 있다.

'피타제 효소 변이체의 제조 방법'에 관한 실시태양 내에서 사용된 '숙주 세포 내 발현"이라는 용어는 바람직하게는 여기서 정의된 생체 생물, 기관 또는 세포 내에서의 피타제 효소 변이체의 생성으로 정의된다. 바람직한 숙주는 에스케리키아 콜리 K12; 바실러스 섭틸리스; 사카로마이세스 세레비시에이다. 여기서 상세히 설명된 피타제 효소는 하나 이상의 하기 발현 숙주 내에서의 이형적 발현 후 특성화되었다: 에스케리키아 콜리 K12; 바실러스 섭틸리스; 사카로마이세스 세레비시에

그러나 여기서 기술된 피타제 효소 변이체의 선택 목적으로 이러한 방법은 바람직하게는 상기 방법의 단계 (c)에 사용하기 위해 하나 이상의 생체 생물 또는 바이러스에서 분리된 하나 이상의 세포로부터 분리된 전사 및 번역 기구류를 이용하는 피타제 효소 변이체의 시험관 내 발현 방법을 이용하는 것이 고려된다. 또한 이러한 본 발명의 변이체 피타제의 시험관 내 생성은 바람직한 변이체 피타제를 선택하는데 이용될 수 있다. 시험관 내 발현은 표준 기술을 이용하여 적당히 수행될 수 있다. 참고로 Promega Inc (Part# BR053)사에서 구입 가능한 'In vitro Expression Guide' 참조.

변이체 표현형의 정의

더 높은 열안정성(열안정성 차이)을 지닌 변이체는 바람직하게는 실시예 12에서 개시된 방법을 이용하여 측정된다.

피타제 효소 변이체의 제조 방법에 의해 제조된 변이 피타제 효소는 바람직하게는 적어도 1.5 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 이상, 가장 바람직하게는 적어도 20 이상의 열안정성 차이(T.D)를 지닌다.

더 높은 단백질 가수분해 안정성을 지닌 변이체는 바람직하게는 실시예 12에 개시된 방법에 의해 측정된다.

바람직하게는 본 발명의 피타제 효소 변이체는 적어도 45% 이상, 바람직하게는 적어도 50%, 55% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 또는 65% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 70% 이상의 단백질 가수분해 안정성(잔여 활성)을 지닌다.

바람직하게는 본 발명의 피타제 변이체는 pH 4.0에서 100% 이상, 바람직하게는 105%, 110% 이상, 더욱 바람직하게는 114% 이상의 특이 활성을 지닌다.

또다른 변이체 실시태양

또다른 실시태양에서 본 발명은 ⅰ) 상기 하나 이상의 피타제 효소 변이체의 제조 방법을 수행하고 ⅱ) 제조된 피타제 효소 변이체를 동물 사료에 첨가하는 연속 단계를 포함한 피타제 효소 변이체를 포함한 동물 사료의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시태양에서 본 발명은

a) ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

ⅱ) 부티옥셀라종, 바람직하게는 부티옥셀라 P1-29 유래의 모피타제 효소,

ⅲ) 적어도 하나 이상의 피타제 효소 변이체에서 선택된 모피타제 효소를 선택하는 단계;

b) 모피타제 효소 내 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환인 적어도 하나 이상의 변경을 생성하여 피타제 효소 변이체를 수득하는 단계;

c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

ⅱ) 특이 활성 및/또는

ⅲ) 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 효소 변이체를 선별하는 단계;

d) 상기 피타제 효소 변이체를 제조하는 단계;

e) 상기 제조된 피타제 효소 변이체를 동물 사료에 첨가하는 단계를 포함한 동물 사료의 제조 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서 본 발명은 피타제 효소 변이체를 포함한 동물 사료의 제조 방법을 제공한다.

a) ⅰ) 서열번호: 3 또는 그의 기능적 단편과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 모피타제 효소,

ⅱ) 부티옥셀라종, 바람직하게는 부티옥셀라 P1-29 유래의 모피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드에서 선택된 모피타제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드(바람직하게는 DNA)를 돌연변이유발시키는 단계;

b) 단계 a)에서 수득된 돌연변이 뉴클레오타이드(바람직하게는 DNA) 서열을 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계;

c) 모피타제 효소와 비교시 바람직하게는 여기서 기술된

ⅰ) 더 높은 열안정성 및/또는

ⅱ) 더 높은 특이 활성 및/또는

ⅲ) 더 높은 단백질 가수분해 안정성의 하나 이상에서 선택된 개선된 특성을 지닌 피타제 효소 변이체를 발현하는 숙주 세포를 선별하는 단계;

d) 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 피타제 효소 변이체를 제조하는 단계;

e) 상기 제조된 피타제 효소 변이체를 동물 사료에 첨가하는 단계.

피타제 효소 변이체의 제조 방법의 기술된 문헌 및 바람직한 관점은 상기 피타제 효소 변이체를 포함한 동물 사료의 제조 방법에도 적용된다.

본 발명의 또다른 관점에서 여기서 기술된 피타제를 암호화하는 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포가 제공된다.

적당하게는 본 발명의 이러한 관점에 따른 숙주 세포는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편 또는 이에 적어도 75% 이상 상동적인 서열을 포함한다.

바람직한 실시태양에서 상기 숙주 세포는 피타제를 생성한다.

본 발명의 또다른 관점에서 본 발명에 따른 피타제를 암호화는 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포가 제공된다. 바람직하게는 피타제는 여기서 기술된 부티옥셀라 또는 그의 상동체 또는 유도체이다. 적당하게는 상기 피타제 효소는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편 또는 이에 적어도 75% 이상 상동적인 서열을 포함한다. 바람직하게는 상기 숙주 세포는 피타제를 생성한다.

하나의 실시태양에서 본 발명에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 동등한 균주로부터 분리되고 또는 정제된 효소가 동등하게 사용되기도 함이 인식되나 부티옥셀라종으로부터 수득가능하다(실제로 수득되어야 하는 것은 아님).

적당하게는 숙주 세포는 박테리아 및 효모를 포함한 진균을 포함한 미생물에서 유래된다. 특히 바람직한 실시태양에서 숙주 세포는 원핵성 박테리아 세포이다. 적당한 박테리아 숙주 세포는 알파, 베타, 감마, 델타 및 엡실론 하위분할(subdivision)의 멤버를 포함한 프로테오박테리아, 방선균속, 페르미쿠테스속(Firmicutes), 클로스트리듐속(Clostridium) 및 관련균과 같은 그람-양성 박테리아, 황색균, 남조류, 녹색 유황 세균, 녹색 비-유황 세균 및 고세균을 포함한 다른 원핵성 분류 집단 유래의 박테리아를 포함한다. 감마 하위분할에 속하는 에스케리키아 콜리, 프로테오박테리아 및 바실러스와 같은 GC-그람 양성 박테리아와 같은 장내세균(Enterobacteriaceae)이 특히 바람직하다.

적당한 진균 숙주 세포는 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 및 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 사카로마이세스속, 스키조사카로마이세 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 스키조사카로마이세스속 및 아스페르길루스(Aspergillus)를 포함한 왜상 자낭균류를 포함한 자낭균류로 구성된 군에서 선택된 효모를 포함한다.

또다른 적다한 진핵성 숙주 세포는 SF9, SF21, Trychplusiani 및 M121 세포와 같은 곤충 세포를 포함한다. 예를 들어 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 곤중 세포 시스템 내에서 유익하게 발현될 수 있다. 배양액 내 곤충 세포 내 발현뿐만 아니라 피타제 유전자는 전체 곤충 생체 내에서 발현될 수 있다. 바큘로바이러스와 같은 바이러스 벡터는 전체 곤충의 감염을 가능하게 한다. 누에나방과 같은 거대 곤충은 고수율의 이형적 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 종래의 추출 기술에 따라 곤충으로부터 추출될 수 있다. 본 발명에 사용되기에 적당한 발현 벡터는 곤충 세포주 내에서 외래 단백질을 발현하는 것이 가능한 모든 벡터를 포함한다.

또다른 숙주 세포는 원형질체, 세포, 캘러스, 조직, 기관, 종자, 배아, 난세포, 접합체 등으로 구성된 군에서 선택된 식물 세포를 포함한다. 또한 본 발명은 형질전환되고 본 발명의 재조합 DNA를 포함한 전체 식물을 제공한다.

일반적으로 "식물"이라는 용어는 원핵성 조류, 선태식물, 고생양치류 및 겉씨식물 및 속씨식물과 같은 종자식물을 포함한 유배식물을 포함한다.

바람직하게는 상기 숙주 세포는 미생물이다. 바람직한 미생물은 원핵성 박테리아 세포, 바람직하게는 E. coli, B. subtilis 및 바실러스속의 다른 종, 효모, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 시키조사카로마이세스 폼베를 포함한다.

본 발명의 또다른 관점에서 수탁번호 NCIMB 41248호로 2004년 9월 22일 핀란드 핀-02460 칸트비크 소케리테흐하안티에 20 대니스코 글로발 이노베이션에 의해 기탁된 박티레아 세포 균주 부티옥셀라종 P1-29가 제공된다.

또다른 관점에서 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 플라스미드로 숙주 세포를 트랜스펙트시키는 단계, 상기 숙주 세포를 피타제의 발현 조건 하에서 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 배양 배지에서 상기 피타제를 추출하는 단계를 포함한 피타제의 제조 방법이 제공된다.

적당하게는 상기 방법은 숙주 세포 내에서 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 서열 또는 그의 유효 단편을 발현시키는 단계 및 상기 숙주 배양 배지에서 분비된 단백질을 추출하는 단계를 포함한 피타제의 제조 방법이다.

본 발명의 또다른 관점은 본 발명에 따른 피타제를 포함한 사료 조성물을 제공한다. 바람직하게는 사료 조성물은 10∼10000 U/kg 사료, 바람직하게는 200∼2000U/kg 사료, 더욱 바람직하게는 500∼1000 U/kg 농도의 피타제를 포함한다.

하나의 실시태양에서 사료 조성물은 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함한다.

또다른 관점에서 식품 또는 동물 사료 내 본 발명에 따른 피타제의 이용이 제공된다.

바람직한 관점

바람직한 관점은 수반된 청구범위 및 하기 설명 및 실시예 섹션에 나타나 있다.

추가 장점

본 발명은 동물 사료 첨가제로 특히 유용하게 하는 많은 특성을 지닌 피타제를 제공하므로 유익하다.

특히 본 발명의 피타제는 낮은 pH, 바람직하게는 약 pH 4∼4.5에서 최대 활성을 지닌 pH 2∼5.5 범위에서 활성적이다. 적당하게는 본 발명의 피타제는 위장 환경의 낮은 pH에서 활성적이다(pH 2.5에서 약 40%의 최대 활성을 보유).

더욱이 본 발명의 피타제는 고유 숙주 내 및 이형적 발현 동안 모두에서 유효하게 분비되어 사료에 첨가하기 위해 더욱 유효한 제조 및 분리를 유발한다.

더욱이 본 발명의 피타제는 바람직하게는 펜타-, 테트라, 트리 및 디-포스페이트 기질을 포함한 광범위한 기질 특이성을 지녀서 동물(인산염 이용가능한)에 의한 흡수에 유용한 총 인산염을 증가시킨다. 또한 본 발명의 피타제는 바람직하게는 300 U/mg +/- 약 10%, 바람직하게는 300 U/mg의 범위에서 높은 특이 활성을 지닌다.

본 발명의 생성물은 식품 및 사료의 첨기제/보충제로 사용된다. 또한 생성물은 다양한 이노시톨-인산염의 통상의 제조에 유용하다.

피트산염/피트산/피타제

피트산(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트(myo-inositol hexakisphosphate))은 곡류, 콩류 및 지방종자 농작물의 중요한 성분이다. 염 형태인 피트산염은 이들 식물 내 인의 주요 저장 형태이다.

피타제는 무기인산염의 유리뿐만 아니라 단계적 형태의 미오이노시톨 펜타키스-, 테트라키스-, 트리-, 비스- 및 모노포스페이트를 유발하는 피트산의 인산염 모노에스테르 가수분해를 촉매한다.

여기서 사용된 "야생형 피타제" 또는 "야생형"이라는 용어는 자연에서 발션되는 아미노산 서열을 지닌 피타제 효소를 나타낸다.

"피타제 변이체", 또는 "변이체" 또는 "변형형"이라는 용어는 "돌연변이"로 표기되는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 지닌 모피타제의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지닌 피타제 효소를 나타낸다.

"모피타제(parent phytase)" 또는 "모효소"라는 용어는 피타제 변이체가 유래하는 피타제 효소를 나타낸다. 모피타제는 야생형 피타제 또는 또다른 피타제 변이체가 될 수 있다. 특히 본 발명에서 "모피타제"는 부티옥셀라종에서 유래된다. 적당하게는 "모피타제"는 바람직하게는 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열을 지닌 여기서 나타난 부티옥셀라 균주 P1-29에서 유래된다.

분리

하나의 관점에서 바람직하게는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 분리된 형태이다. "분리된"이라는 용어는 서열이 자연적으로 자연과 관련되고 자연 내에서 발견되는 서열을 지닌 적어도 하나 이상의 다른 성분을 실질적으로 지니지 않음을 의미한다.

정제

하나의 관점에서 바람직하게는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 서열이 적어도 1%, 5% 이상 또는 10% 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 순도의 매우 순수한 상태임을 의미한다. 바람직한 관점에서 폴리펩타이드에 대한 표기시 상기 한정된 순도는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 다른 폴리펩타이드로부터 정제되는 것으로 환산하여 측정된다. 바람직한 실시태양에서 폴리뉴클레오타이드에 대한 표기시 상기 한정된 순도는 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 정제되는 것으로 환산하여 측정된다.

뉴클레오타이드 서열

본 발명의 범위는 여기서 한정된 특정 특성을 지닌 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

여기서 사용된 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체이다(그의 일부와 같은). 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 스트랜드를 나타내는 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원이다.

본 발명과 관련한 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 분자"라는 용어는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 이는 DNA, 더욱 바람직하게는 본 발명에 대해 암호화하는 cDNA 서열을 의미한다.

바람직한 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 원래 범위에 관련하고 이에 포함될 때 자연 환경 내에 있고 그의 자연 환경 내에 있는 자연적으로 관련된 서열(들) 결합시 본 발명에 따른 고유의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 용이한 참고를 위해 이러한 바람직한 실시태양을 "비-고유 뉴클레오타이드 서열"이라고 명명한다. 이러한 관점에서 "고유 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 고유의 환경 내에 존재하고 자연적으로 관련된 전체 프로모터에 실시가능하게 결합시 프로모터도 그의 고유 환경 내에 존재하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 그러나 본 발명의 범위에 포함된 아미노산 서열은 그의 고유 생물체 내 뉴클레오타이드 서열의 발현 후 분리되고 또는 정제될 수 있다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 범위에 포함된 아미노산 서열은 고유의 생물체 내의 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현될 수 있으나 뉴클레오타이드 서열은 생물체 내에서 자연적으로 관련된 프로모터의 조절 하에 있지 않다.

뉴클레오타이드 서열의 제조

일반적으로 본 발명의 범위에 포함된 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다(즉, 재조합 DNA). 그러나 본 발명의 대안적 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 당분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(Caruthers MH et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 및 Horn T et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조).

여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소 또는 변형에 적당한 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 효소를 생성하는 세포 또는 생물체로부터 확인되고/또는 분리되고/또는 정제된다. 뉴클레오타이드 서열의 확인 및/또는 분리 및/또는 정제를 위한 다양한 방법이 당분야에 잘 알려져 있다. 예로서 적당한 서열이 확인되고/또는 분리되고/또는 정제되면 많은 서열을 제조하는 PCR 증폭 기술이 이용된다.

또다른 예로서 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 효소를 생성하는 생물체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 이용하여 구축된다. 효소의 아미노산 서열 또는 효소의 아미노산 서열의 일부가 알려진 경우 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성되고 생물체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 효소-암호화 클론을 확인하는데 이용된다. 대안으로 또다른 알려진 효소 유전자에 상동적인 서열을 포함한 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 효소-암호화 클론을 확인하는데 이용될 수 있다. 후자의 경우 낮은 스트린전시의 혼성화 및 세척 조건이 이용된다.

대안으로 효소-암호화 클론은 게놈 DNA의 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터 내에 삽입시키고, 수득된 게놈 DNA로 효소-음성 박테리아를 형질전환시킨 후 형질전환된 박테리아를 효소에 대한 기질(즉, 글루코시다제(말타제) 생성 효소에 대한 말토오스)을 포함한 한천 플레이트에 도말하여 효소를 발현하는 클론이 확인되게 함으로서 확인될 수 있다.

또다른 대안으로 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수립된 표준 방법 즉, Beucage S.L. et al(1981) Tetrahedron Letters 22, p1859-1869에 의해 기술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al(1984) EMBO J. 3, p801-805에 의해 기술된 방법에 의해 합성적으로 제조된다. 포스포로아미디트 방법에서 올리고뉴클레오타이드가 합성된다 즉, 자동 DNA 합성기에서 정제되고, 어닐되고, 라이게이트되고 적당한 벡터 내에서 클론된다.

뉴클레오타이드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한)의 단편을 라이게이트함으로서 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원이다. 각각의 라이게이트된 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열의 다양한 부분에 상응한다. 또한 DNA 서열은 예를 들어 미국특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al(Science(1988) 239, pp487-491)에 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된다.

유전자 코드의 축퇴에 의해 본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산의 일부 또는 전부에 대한 삼중자 코드가 변화되어 본래 뉴클레오타이드 서열에 대해 낮은 상동성을 지니나 본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 동일하거나 또는 그의 변이체를 암호화하게 되어 뉴클레오타이드 서열이 용이하게 제조된다. 예를 들어 대부분의 아미노산에 있어서 유전자 코드의 축퇴는 삼중자 코돈 내 세 번째 위치(동요 위치)(Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7 참조)에 존재하고 따라서 모든 삼중자 코돈이 세 번째 위치에서 "동요된" 뉴클레오타이드 서열은 본래 뉴클레오타이드 서열과 약 66% 동일하나 보정된 뉴클레오타이드 서열은 본래 뉴클레오타이드 서열과 동일한 1차 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 암호화한다.

따라서 본 발명은 삼중자 코돈을 암화하는 적어도 하나 이상의 아미노산에 대한 대안적 삼중자 코돈 용법을 지니나 본래 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 동일한 폴리펩타이드 서열 또는 그의 변이체를 암호화하는 어떠한 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

더욱 이 일반적으로 특정 생물체는 삼중자 코돈이 아미노산을 암호화하는데 사용되는 경향을 지닌다. 바람직한 코돈 용법 삼중자는 광범위하게 이용 가능하고 코돈 최적화 유전자를 제조하는데 이용될 수 있다. 이러한 코돈 최적화 기술은 이형적 숙주 내 트랜스유전자의 발현을 최적화하는데 일반적으로 이용된다.

분자적 진화

효소-암호화 뉴클레오타이드 서열이 분리되고 또는 정제되거나 추정 효소-암호화 뉴클레오타이드 서열이 확인되면 선택된 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것이 바람직하고, 예를 들어 본 발명에 따른 효소를 제조하기 위해 서열을 돌연변이시키는 것이 바람직하다.

돌연변이는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 도입된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 원하는 돌연변이 사이트의 측면에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

적당한 방법은 Morinaga et al(Biotechnology(1984) 2, p646-649)에 개시되어 있다. 돌연변이를 효소-암호화 뉴클레오타이드 서열 내로 도입시키는 또다른 방법은 Nelson and Long(Analytical Biochemistry(1989), 180, p147-151)에 기술되어 있다.

자리 지정 돌연변이 대신에 상기 기술된 바와 같이 Stratagene사의 GeneMorph PCR 돌연변이유발 키트 또는 Clontech사의 Diversify PCR 무작위 돌연변이유발 키트와 같은 상품화 키트를 사용하여 무작위로 돌연변이를 도입시킬 수 있다.

신규한 서열을 수득하는 세 번째 방법은 많은 제한 효소 또는 Dnase I과 같은 효소를 이용하고, 기능적 단백질을 코드하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 재집합시킴으로서 비-동일성 뉴클레오타이드 서열을 분해시키는 것이다. 대안으로 하나 또는 다수의 비-동일성 뉴클레오타이드 서열을 사용하고 전체 뉴클레오타이드 서열의 재집합 동안 돌연변이를 도입시킬 수 있다.

따라서 생체 내 및 시험과 내에서 뉴클레오타이드 서열 내로 많은 자리 지정 및 무작위 돌연변이를 제조한 후 다양한 수단에 의해 인코드된 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해 선별하는 것이 가능하다.

더욱이 비-제한적 예로서 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 또는 자연 변이체가 야생형 또는 다른 돌연변이 또는 자연 변이체에 재조합되어 새로운 변이체를 제조할 수 있다. 이러한 새로운 변이체는 인코드된 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해서도 선별될 수 있다. 신규한 바람직한 변이체의 제조는 예를 들어 오류 역치 돌연변이유발(WO 92/18645), 올리고뉴클레오타이드 매개 무작위 돌연변이유발(US 5,723,323), DNA 셔플링(US 5,605,793), 엑소-매개 유전자 어셈블리(WO 0058517)와 같은 당분야에 잘 수립된 다양한 방법에 의해 달성된다. 또다른 적당한 방법은 예를 들어 WO 0134835, WO 02/097130, WO 03/012100, WO 03/057247, WO 2004/018674, 미국특허 제6,303,344호 및 미국특허 제6,132,970호에 기술되어 있다.

상기-논의된 것의 적용 및 유사한 분자적 진화 방법은 단백질 구조 또는 기능의 사전 지식 없이 바람직한 특성을 지닌 본 발명의 효소 변이체의 확인 및 선택을 가능하게 하고, 예측할 수 없으나 유익한 돌연변이 또는 변이체의 제조를 가능하게 한다. 효소 활성의 최적화 또는 변화에 대한 당분야의 분자적 진화 적용의 많은 예가 있고, 이러한 예는 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 숙주 세포 내 또는 시험관 내의 최적화된 발현 및/또는 활성, 증가된 효소적 활성, 변화된 기질 및/또는 생성물 특이성, 증가되거나 감소된 효소적 또는 구조적 안정성, 바람직한 환경 조건 즉, 온도, pH, 기질 내에서의 변화된 효소 활성/특이성.

상기 분자적 진화 방법은 여기서 기술된 피타제 효소 변이체의 제조 방법에 이용된다.

아미노산 서열

또한 본 발명의 범위는 여기서 한정된 특정 특성을 지닌 효소의 아미노산 서열을 포함한다.

여기서 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩타이드" 및/또는 "단백질"이라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩타이드"라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"은 "효소"라는 용어와 동의어이다.

아미노산 서열은 적당한 원료로부터 제조/분리되거나 합성적으로 제조되거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다.

본 발명에 포함된 효소는 다른 효소와 결합되어 사용된다. 따라서 본 발명자는 본 발명의 효소 및 본 발명에 따른 또다른 효소인 또다른 효소를 포함한 효소의 결합도 포함한다. 이러한 관점은 하기 섹션에서 논의된다.

바람직하게는 아미노산 서열은 본 발명의 범위에 관련하고 이에 포함될 때 고유 효소가 아니다. 이러한 관점에서 "고유 효소"라는 용어는 고유의 환경 내에 존재하고 고유 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되는 전체 효소를 의미한다.

변이체/상동체/유도체

또한 본 발명자는 효소의 아미노산 서열 또는 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 변이체, 상동체 및 유도체를 포함한다.

여기서 "상동체"라는 용어는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열과 특정한 상동성을 지닌 실재를 의미한다. 여기서 "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동등하다. 적당하게는 문맥상 "상동체"는 하기 더욱 상세하게 설명된 정렬 알고리즘을 이용하여 서열을 정렬시킨 후 2개 효소 사이의 서열 동일성의 백분율을 나타낸다.

이러한 정황하에서 상동적 아미노산 서열은 피험 서열에 대해 적어도 75, 80, 81, 85 또는 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 피험 아미노산 서열과 동일한 활성 사이트를 포함할 것이다. 상동성이 유사성(즉, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성/기능을 지님)의 표현으로 고려될 수 있더라도 본 발명의 문맥상 서열 동일성의 표현으로 표시되는 것이 바람직하다.

"기능적 단편"은 폴리펩타이드의 특정 특성을 보유한 폴리펩타이드의 단편을 의미한다. 본 발명의 문맥상 피타제 효소의 기능적 단편은 전체 단백질의 카로티노이드 분열 능력을 보유한다.

문맥상 상동적 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(피험 서열)에 대해 적어도 75, 80, 81, 85 또는 90% 이상 동일한, 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 상동체는 활성 사이트를 코드하는 피험 서열과 동일한 서열을 포함할 것이다. 상동성이 유사성(즉 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성/기능을 지님)의 표현으로 고려될 수 있더라도 본 명세서의 문맥상 서열 동일성의 표현으로 표기되는 것이 바람직하다.

아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 있어서, 상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 수단으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.

% 상동성은 인접 서열에 대해 계산되고 즉, 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내의 각각의 아미노산은 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 매우 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.

이는 매우 단순하고 일관성 있는 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍 내에서 하나의 삽입 또는 삭제가 하기 아미노산 잔기를 정렬로부터 제거되게 하고, 따라서 전체 정렬이 수행될 때 % 상동성의 큰 감소를 잠재적으로 유발할 것임이 고려되지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점에 부당하게 패널티를 과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려하도록 최적 정렬을 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.

그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내에 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 동일한 수의 아미노산의 경우 가능한 적은 갭을 지닌 서열 정렬이 - 2개의 비교 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. "친화성 갭 코스트(Affine gap cost)"는 일반적으로 갭의 존재에 대해 매우 높은 코스트 및 갭 내 각각의 하위 잔기에 대한 적은 패널티를 부과하는데 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 이용시 디폴트 수치를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit package를 이용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장(extension)에 대해 -4이다.

따라서 최대 % 상동성의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit package(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST package(Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), FASTA(Altschul et al, 1990 J MoI. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparison tools을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색으로 이용 가능하다(Ausubel et ah, 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 내지 7-60 참조).

그러나 일부의 적용에 있어서 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 명명된 새로운 기구도 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).

최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전무(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 점수를 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다(또다른 상세한 설명은 사용자 설명서 참조). 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.

대안으로 백분율 상동성은 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244)와 유사한 알고리즘에 기반하여 DNASIS^TM(Hitachi Software) 내의 다수의 정렬 특징을 이용하여 계산된다.

소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수적인 결과를 생성한다.

본 발명의 바람직한 관점에서 백분율 서열 상동성/동일성을 계산하기 위한 하기 소프트웨어 및 셋팅이 사용된다. 아미노산 서열에 있어서 동일성(상동성) 백분율 또는 "양성"은 아미노산 서열의 각각의 가능한 쌍에 대해 AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 from Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA.)에 의해 계산된다. 셋팅은 디폴트 파리미터이다(갭 오프닝 패털티 - 10, 갭 확장 패널티 0.1).

핵산 서열에 있어서 동일성(상동성) 백분율 또는 "양성"은 핵산 서열의 각각의 가능한 쌍에 대해 AlignX VectorNTI programme from Informax Inc. (USA)에 의해 계산된다. DNA용 디폴트 셋팅은: 갭 오프닝 패털티: 15 및 갭 확장 패널티: 6.66이다(다수 정렬에 대한 동일한 셋팅).

바람직하게는 아미노산 동일성(상동성)은 전체-길이 아미노산 서열 또는 각각의 전체-길이 아미노산 서열을 암호화하는 대응 폴리뉴클레오타이드에 대한 핵산 서열에 대해 계산된다.

또한 서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 물질을 유발하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 아미노산 특성 내의 유사성(잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성)에 기반하여 이루어지고, 따라서 기능적인 그룹에 아미노산을 함께 분류하는 것이 유용하다. 아미노산은 그의 측쇄 단독의 특성에 기반하여 함께 분류될 수 있다. 그러나 돌연변이 데이터를 포함시키는 것이 유용하다. 이렇게 유래된 아미노산 세트는 구조적 원인으로 인해 보존되게 된다. 이들 세트는 벤다이어그램(Livingstone CD. and Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218)의 형태로 기술될 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어 일반적으로 수용되는 아미노산의 벤다이어그램 분류를 기술한 하기 표에 따라 이루어진다.

또한 본 발명자는 발생하는 상동적 치환(치환 및 대치는 모두 여기서 현존하는 아미노산 잔기와 대안적 잔기의 상호교환을 의미하는데 사용됨) 즉, 염기성에 대해 염기성, 산성에 대해 산성, 극성에 대해 극성과 같은 유사성-대-유사성(like-for-like) 치환을 개시한다. 또한 한 분류의 잔기로부터 또다른 잔기 또는 오르니틴(이하 Z로 표기), 디아미노부티르산(diaminobutyric acid) 오르니틴(이하 B로 표기), 노르류신 오르니틴(이하 O로 표기), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비자연적 아미노산의 함유물 관련 대안 잔기로 비-상동적 치환이 발생한다.

또한 대치는 비천연 아미노산에 의해 이루어진다.

변이 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 간격 외에 메틸기, 에틸기 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함한, 서열의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입되는 적당한 간격(spacer) 그룹을 포함한다. 추가적인 변이의 형태는 펩토이드(peptoid) 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 이는 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 회피하기 위해 α-탄소 치환기가 α-탄소보다는 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이 아미노산을 나타내는데 "펩토이드 형태"가 사용된다. 펩토이드 형태 내에 펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 Simon RJ et al., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134와 같이 당분야에 알려져 있다.

본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 합성적 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드로의 많은 다른 형태의 변형이 당분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5'말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열이 당분야에 유용한 어떠한 방법에 의해서도 변형됨이 이해된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 생체 내 활성 또는 수명을 증가시키기 위해 이러한 변형이 수행된다.

또한 본 발명은 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 유도체 또는 단편의 이용을 포함한다. 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 서열은 다른 생물체 내의 유사한 암호화 서열을 확인하는 프로브로서 사용될 수 있다.

본 발명의 서열에 100% 상동적이지 않은 폴리뉴클레오타이드는 많은 방법에 의해 수득된다. 여기에 기술된 서열의 다른 변이체는 예를 들어 다른 집단으로부터의 개체와 같은 광범위한 개체로부터 제조된 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 상동체가 수득되고 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 서열목록에 나타난 서열을 선택적으로 혼성화하는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 종으로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA를 프로브하고, 중간 내지 높은 스트린전시 조건 하에서 첨부된 서열목록 내의 어느 한 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 프로브로 이러한 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 유사한 고려는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 수득하는데 적용된다.

또한 변이체 및 균주/종 상동체는 본 발명의 서열 내에서 보존된 아미노산 서열을 암호화하는 변이체 및 상동체 내에 서열을 타겟하도록 고안된 프라이머를 이용하는 퇴화 PCR을 이용하여 수득된다. 보존된 서열은 예를 들어 일부 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로서 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당분야에 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 광범위하게 이용된다.

퇴화 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 퇴화 위치를 포함하고 알려진 서열에 대해 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용되는 것 보다 더 낮은 스트린전시 조건에서 사용될 것이다.

대안으로 이러한 폴리뉴클레오타이드는 특성화된 서열의 자리-지정 돌연변이유발에 의해 수득된다. 이는 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 우선권을 최적화하는데 침묵 코돈 서열 변화가 필요할 때 유용하다. 제한 폴리펩타이드 인식 사이트를 도입시키거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 성질 또는 기능을 변화시키기 위해 다른 서열 변화가 바람직하다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 서열)는 프라이머 즉, PCR 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 프로브 즉, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 통상적 방법에 의해 노출 표지로 표지된 프로브를 제조하는데 이용되고 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 20 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오타이드 길이이고 또한 여기서 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드라는 용어에 포함된다.

본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 유용한 어떠한 방법에 의해서도 제조된다. 또한 이들은 표준 기술에 의해 클론된다.

일반적으로 프라이머는 한 번에 하나의 뉴클레오타이드로 원하는 핵산 서열의 계단식 제조를 포함한 합성적 방법에 의해 제조될 것이다. 자동화된 기술을 이용하여 이를 달성하기 위한 기술은 당분야에서 용이하게 이용된다.

더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 제조될 것이다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하여 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있도록 고안된다.

생물학적으로 활성적

바람직하게는 변이체 서열 등은 적어도 여기서 제공된 서열 정도로 생물학적으로 활성적이다.

여기서 사용된 "생물학적으로 활성적"은 자연 발생적 서열의 유사한 구조적 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 조절 기능(동일한 정도일 필요는 없음) 및/또는 유사한 생화학적 기능(동일한 정도일 필요는 없음)을 지닌 서열을 나타낸다.

특히 변이체 서열 또는 변형형은 여기서 확인된 피타제 프로파일과 유사한 효소 프로파일을 지닌다. 이러한 프로파일은 pH 2∼5.5, 바람직하게는 4.0∼4.5의 범위에서 pH 최적조건을 지거나 pH 범위 2.0∼5.5 내에서 적어도 50% 이상의 최대 활성을 보유하거나 300 U/mg 이상의 특이 활성을 지닌 분비된 단백질과 같은 특성을 포함한다.

혼성화

또한 본 발명은 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 서열 또는 본 발명의 서열 또는 그에 상보적인 서열에 혼성화하는 것이 가능한 서열을 포함한다.

여기서 사용된 "혼성화"라는 용어는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정뿐만 아니라 "염기 짝짓기를 통해 핵산 스트랜드를 상보적 스트랜드와 결합시키는 공정"을 포함한다.

또한 본 발명은 여기서 제공된 서열 또는 그의 유도체, 단편에 상보적인 서열에 혼성화하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함한다.

또한 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

더욱 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na₃구연산염 pH 7.0})하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열(여기서 제공된 것의 상보적 서열을 포함)에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열(여기서 제공된 것의 상보적 서열을 포함)에 관한 것이다.

또한 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.

바람직한 관점에서 본 발명은 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

더욱 바람직한 관점에서 본 발명은 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC) 하에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

자리-지정 돌연변이유발

효소-암호화 뉴클레오타이드 서열이 분리되고 또는 정제되거나 추정 효소-암호화 뉴클레오타이드 서열이 확인되면 본 발명의 효소를 제조하기 위해 본 서열을 돌연변이시키는 것이 바람직하다.

돌연변이는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 도입된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 원하는 돌연변이 사이트에 인접한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

적당한 방법은 Morinaga et al.,(Biotechnology (1984) 2, p646-649)에 개시되어 있다. 효소-암호화 뉴클레오타이드 서열 내로 돌연변이를 도입시키는 또다른 방법은 Nelson and Long(Analytical Biochemistry (1989), 180, p147-151)에 기술되어 있다. 또다른 방법은 Sarkar and Sommer(Biotechniques (1990), 8, p404-407 - "The megaprimer method of site directed mutagenesis")에 기술되어 있다.

재조합

하나의 관점에서 본 발명에 사용되는 서열은 재조합 서열 - 즉, 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 서열이다.

이들 재조합 DNA 기술은 당업자의 능력 내에 있다. 이러한 기술은 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press와 같은 문헌에서 설명되어 있다.

합성

하나의 관점에서 본 발명에 사용되는 서열은 합성 서열 - 시험관 내에서의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된 서열이다. 이는 숙주 생물체 - 메틸영양체성 효모 피키아 및 한세눌라와 같은 -에 대한 최적 코돈 용법으로 제조된 서열을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

효소의 발현

본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 도입된다. 벡터는 효소의 형태로 적합성 숙주 세포 내 및/또는 그로부터 뉴클레오타이드 서열을 복제하고 발현하는데 사용된다.

발현은 제어 서열 즉, 조절 서열을 이용하여 조절된다.

뉴클레오타이드의 발현에 의한 숙주 재조합 세포에 의해 제조된 효소는 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 분비되거나 세포내적으로 포함된다. 코딩 서열은 특정한 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 코딩 서열 물질의 분비를 지시하는 신호 서열을 지니도록 고안될 수 있다.

대안으로 본 발명의 효소는 분비된다.

발현 벡터

"플라스미드", "벡터 시스템" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 생체 내 또는 시험관 내 발현을 가능하게 하는 컨스트럭트를 의미한다. 본 발명의 문맥상 이들 컨스트럭트는 효소를 암호화하는 유전자를 숙주 세포 내로 도입시키는데 사용된다. 적당하게는 발현이 도입되는 유전자는 "발현 가능한 트랜스유전자"로 표기된다.

바람직하게는 발현 벡터는 적당한 숙주 생물의 게놈 내로 도입된다. "도입된다"라는 용어는 바람직하게는 게놈 내로의 적당한 도입을 포함한다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열이 적당한 숙주 생물에 의해 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 조절 서열에 실시가능하게 연결된 벡터 내에 존재한다.

본 발명에 사용되는 벡터는 하기에 기술된 바와 같이 적당한 숙주 세포 내로 형질전환되어 본 발명의 폴리펩타이드의 발현이 제공된다.

벡터의 선택 즉, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터는 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.

본 발명에 사용되는 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 - 항생제 저항성 즉 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 저항성을 부여하는 유전자 -를 포함한다. 대안으로 선택은 동시-형질전환에 의해 달성된다(WO91/17243에 기술됨).

벡터는 예를 들어 RNA의 제조를 위해 시험관 내에서 사용되거나 숙주 세포를 트랜스펙트시키거나 형질전환시키거나 형질도입시키거나 감염시키는데 사용된다.

따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 복제 가능 벡터 내로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 도입시키고 상기 벡터를 적합성 숙주 세포 내로 도입시키고 벡터의 복제를 유발하는 조건 하에서 숙주 세포를 생장시킴으로서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법을 제공한다.

벡터는 벡터를 의문의 숙주 세포 내에서 발현시키는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함한다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pIJ101, pTZ12 및 pET11의 복제 기점이다.

조절 서열

일부 적용시 본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 세포에 의해서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 조절 서열에 실시가능하게 결합된다. 예로서 본 발명은 이러한 조절 서열에 실시가능하게 결합된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터를 포함한다 즉 벡터는 발현 벡터이다.

"실시가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬을 나타낸다. 코딩 서열에 "실시가능하게 결합된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 적합한 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이트된다.

"조절 서열"이라는 용어는 프로모터 및 인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다.

"프로모터"라는 용어는 당분야의 일반적 의미 즉, RNA 중합효소 결합 사이트로 사용된다.

또한 본 발명의 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 증가된 발현은 이형적 조절 영역 즉, 프로모터, 분비 리더 및 터미네이터 영역의 선택에 의해 달성된다.

바람직하게는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 적어도 프로모터에 실시가능하게 결합된다.

박테리아, 진균 또는 효모 숙주 내에서 뉴클레오타이드 서열의 전사를 지시하기 위한 적당한 프로모터의 예는 당분야에 잘 알려져 있다.

컨스트럭트

"컨스트럭트"라는 용어는 - "컨쥬게이트", "카세트" 및 "하이브리드"와 같은 용어와 동의어인 - 프로모터에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 발명에 따라 사용되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

간접적 부착의 예는 프로모터와 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 매개하는 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론 등의 인트론과 같은 적당한 간격 그룹의 제공이다. 직접 또는 간접적 부착을 포함한 본 발명에 관련된 "융합된"이라는 용어에 대해서도 동일하다. 일부의 경우 본 용어는 야생형 유전자 프로모터와 일반적으로 결합된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 자연적 결합 및 이들 모두 그의 자연 환경 내에 존재하는 경우를 포함하지 않는다.

컨스트럭트는 유전자 컨스트럭트의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현한다.

일부의 적용에 있어서 바람직하게는 본 발명의 컨스트럭트는 프로모터에 실시가능하게 결합된 적어도 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

숙주 세포

"숙주 세포"라는 용어는 - 본 발명에 관련하여 - 상기 기술되고 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소의 재조합 생성 및 본 발명의 방법에 사용되는 뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터를 포함한 어떠한 세포도 포함한다.

따라서 본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명에 기술된 효소를 발현하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포를 제공한다. 세포는 상기 벡터에 적합한 것으로 선택되고 예를 들어 원핵성(예를 들어 박테리아성), 진균성, 효모 또는 식물 세포이다. 바람직하게는 숙주 세포는 인간 세포는 아니다.

적당한 박테리아성 숙주 생물체의 예는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아종이다.

바람직한 실시태양에서 부티옥셀라 P1-29 피타제가 E. coli에서 유효하게 분비되기 때문에 숙주 세포는 에스케리키아 콜리이다. 변이체를 포함한 피타제 효소는 하나 이상의 하기 발현 숙주 내에서의 이형적 발현후 특성화되었다: 에스케리키아 콜리 K12; 바실러스 섭틸리스; 사카로마이세스 세레비시에. 따라서 이들 숙주도 역시 바람직하다.

본 발명의 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 성질 및/또는 발현되는 단백질의 부차적인 처리에 대한 바람직함에 따라 다르게 효모 또는 다른 진균과 같은 진핵성 숙주가 바람직하다. 일반적으로 효모 세포가 조작하기에 용이하기 때문에 진균 세포보다 바람직하다. 그러나 일부 단백질은 효모 세포로부터 불충분하게 선택되거나 일부의 경우 적당히 처리되지 않는다(즉 효모 내 과당쇄화). 이러한 경우 다른 진균 숙주 생물체가 선택된다.

효모, 진균 및 식물 숙주 세포와 같은 적당한 숙주 세포의 이용은 본 발명의 재조합 발현 생성물 상에 최적의 생물학적 활성을 부여하기 때문에 후-발현 변형(즉, 미리스토일레이션(myristoylation), 당화, 절단, 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)을 제공한다.

숙주 세포는 프로테아제 결함 또는 프로테아제 마이너스 균주이다.

숙주 세포의 유전형은 발현을 개선시키도록 변형된다.

숙수 세포 변형의 예는 프로테아제 결핍, 희귀 tRNA의 보충 및 이황화결합 형성을 증가시키기 위한 세포질 내 환원 전위의 변형을 포함한다.

예를 들어 숙주 세포 E. coli는 Kane(Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli")에 예시화되고/기술된 바와 같이 희귀 tRNA를 과발현시켜 이형적 단백질의 발현을 개선시킨다. 숙주 세포는 많은 환원 효소가 결핍되어 Bessette(Proc Natl Acad Sci USA (1999), 96, 13703-13708 " Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm")에서 예시화되고/기술된 바와 같이 안정한 이황화결합의 형성에 호의적이다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 문맥상 숙주 세포는 동물 사료에 직접 첨가될 수 있는 세포를 포함한다.

생물체

본 발명에 관련한 "생물체"라는 용어는 본 발명에 기술된 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함할 수 있고, 생물체 내에 존재시 프로모터가 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다.

적당한 생물체는 원핵생물, 진균, 효모 또는 식물을 포함한다.

본 발명과 관련한 "형질전환 생물체"라는 용어는 본 발명에 기술된 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함하고, 생물체 내에서 프로모터가 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 생물체의 게놈 내에 도입된다.

"형질전환 생물체"라는 용어는 자연 환경 내에도 존재하는 고유의 프로모터의 조절 하에 있는 경우 그의 자연 환경 내의 고유의 뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하지 않는다.

따라서 본 발명의 형질전환 생물체는 본 발명에 기술된 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 본 발명에 따른 컨스트럭트, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 플라스미드, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 조직 또는 본 발명에 따른 생성물 중의 어느 하나 또는 그의 결합을 포함한 생물체를 포함한다.

또한 예를 들어 형질전환 생물체는 이형적 프로모터의 조절 하에서 본 발명의 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

숙주 세포/생물체의 형질전환

상기 나타난 바와 같이 숙주 생물체는 원핵성 또는 진핵성 생물체가 될 수 있다. 적당한 원핵성 숙주의 예는 E. coli 및 바실러스 섭틸리스를 포함한다.

원핵성 숙주의 형질전환 상의 지침은 당분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 참조. 원핵성 숙주가 사용되는 경우 뉴클레오타이드 서열은 인트론의 제거와 같이 형질전환 전에 적당히 변형될 필요가 있다.

섬질 진균 세포는 당분야에 알려진 다양한 방법 - 원형질체의 형성 및 원형질체의 형질전환 후 잘 알려진 방법으로 세포벽을 재생시키는 것을 포함한 방법과 같은 -을 이용하여 형질전환된다. 숙주 미생물로서 아스페르길루스의 이용이 EP 0 238 023에 기술되어 있다.

또다른 숙주 생물체는 식물이 될 수 있다. 식물을 형질전환하는데 사용되는 일반적 기술의 고찰은 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문에 나타나 있다. 식물 형질전환에 대한 또다른 지침은 EP-A-0449375에 나타나 있다.

진균, 효모 및 식물의 형질전환에 대한 일반적 지침은 하기 섹션에 제공된다.

형질전환된 진균

숙주 생물체는 섬질 진균과 같은 진균이다. 이러한 적당한 숙주의 예는 써모마이세스속(Thermomyces), 아크레모니움속(Acremonium), 아스페르길루스속, 페니실리움속(Penicillium), 뮤코속(Mucor), 뉴로스포라속(Neurospora), 트리코더마속(Trichoderma) 등의 속을 포함한다.

섬질 진균의 형질전환 상의 지침은 섬질 진균의 형질전환에 대한 표준 기술을 나타내는 US-A-5741665에 보고되어 있고, 진균을 배양하는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. N. crassa에 적용된 기술의 광범위한 조사는 Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A:79-143에 나타나 있다.

섬질 진균의 형질전환 상의 지침은 US-A-567407에 보고되어 있다.

하나의 관점에서 숙주 생물체는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)와 같은 아스페르길루스가 될 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환 아스페르길루스는 예를 들어 Turner G. 1994(Vector for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp.641-666)의 지침에 따라 제조될 수 있다.

섬질 진균 내의 유전자 발현은 Punt et al.(2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997) 17(4):273-306에서 보고되었다.

형질전환 효모

또다른 실시태양에서 형질전환 생물체는 효모가 될 수 있다.

효모 내에서의 이형적 유전자 발현 원리의 보고는 예를 들어 Methods Mol Biol(1995), 49:341-54 및 Curr Opin Biotechnol(1997) Oct;8(5):554-60에서 제공된다.

이러한 관점에서 효모 - 사카로마이세스 세레비시에 또는 피키아 카스토리스(Pichia pastoris)(FEMS Microbiol Rev(2000 24(1):45-66) 종과 같은 -가 이형적 유전자 발현에 대한 운반체로서 사용된다.

사카로마이세스 세레비시에 내의 이형적 유전자 발현 및 유전자 생성물의 분비 원리의 보고는 E Hinchcliffe E Kenyy(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous gene", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)에 의해 제공된다.

효모의 형질전환의 경우 일부 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어 본 발명에 따른 형질전환 사카로마이세스는 Hinnen et al.,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104); 및 Ito, H et al(1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 지침을 따라 제조될 수 있다.

형질전환된 효모 세포는 영양요구성 마커 우성 항생제 저항성 마커와 같은 다양한 선택성 마커를 이용하여 선택된다.

형질전환 식물/식물 세포

본 발명에 적당한 숙주 생물체는 식물이다. 일반적 기술의 보고는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문 또는 WO01/16308에 나타나 있다.

배양 및 제조

본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 암호화된 효소의 제조에 적절하고 세포 및/또는 배양 배지로부터의 효소 회수를 촉진시키는 조건 하에서 배양된다.

세포를 배양하는데 사용되는 배지는 의문의 숙주 세포를 성장시키고 효소의 발현을 획들하는데 적당한 종래의 어떠한 배지도 된다.

재조합 세포에 의해 제조된 단백질은 세포의 표면 상에 표시된다.

효소는 숙주 세포로부터 분비되고 잘-알려진 절차를 이용하여 배양 배지로부터 회수된다.

분비

효소는 발현 숙주로부터 효소가 더욱 용이하게 회수되는 배양 배질 내로 분비되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 분비 리더 서열은 원하는 발현 숙주를 기초로 선택된다. 하이브리드 신호 서열도 본 발명의 상황에 따라 사용된다.

이형적 분비 리더 서열의 일반적인 예는 진균 아밀로글루코시다제(AG) 유전자(galA - 아스페르길루스 유래의 18개 및 24개 아미노산 버전 모두), a-인자 유전자(효모 즉 사카로마이세스, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 한세눌라) 또는 α-아밀라제 유전자(바실러스)로부터 기원한 것이다.

예로서 E. coli 내 이형적 단백질의 분비는 Methods Enzymol (1990) 182:132-43에서 보고되었다.

검출

아미노산 서열의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당분야에 알려져 있다. 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역측정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다.

다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에 의해 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다.

Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ), Promega(Madison, WI) 및 US Biochemical Corp(Cleveland, OH)와 같은 많은 회사가 이러한 절차를 위한 상품화된 키트 및 프로토콜을 공급한다.

적당한 수용체 분자 또는 표지는 기질, 조인자, 억제제, 자기 입자뿐만 아니라 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색소유전제를 포함한다. 이러한 표지의 이용을 나타내는 특허는 US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 및 US-A-4,366,241을 포함한다.

또한 재조합 면역글로불린은 US-A-4,816,567에 나타난 바와 같이 제조된다.

융합 단백질

본 발명에 따라 사용되는 아미노산 서열은 그의 추출 및 정제에 도움을 주기 위해 융합 단백질로서 제조된다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하기 위해 융합 단백질 파트너와 목적 단백질 서열 사이의 가수분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다.

바람직하게는 융합 단백질은 단백질 서열의 활성을 방해하지 않을 것이다.

E. coli 내의 유전자 융합 발현 시스템은 Curr. Opin. Biotechnol.(1995) 6(5):501-6에서 조사되었다.

본 발명의 또다른 실시태양에서 아미노산 서열은 융합 단백질을 암호화하기 위해 이형적 서열에 라이게이트된다. 예를 들어 물질 활성에 영향을 미치는 것이 가능한 약제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해 통상적으로 상품화된 항체에 의해 인식되는 이형적 에피토프를 발현하는 키메라 물질을 암호화하는 것이 유용하다.

추가 서열

또한 본 발명에 따라 사용되는 서열은 하나 이상의 목적 추가 단백질(POI) 또는 목적 뉴클레오타이드 서열(NOI)과 결합하여 사용된다.

POI의 비-제한적 예는 자일라나제, 리파제, 산성 포스파타제 및/또는 다른 것들을 포함한다. 이들은 예를 들어 사료의 점도를 조절하는 효소를 포함한다. NOI는 어떠한 서열에 대해 안티센스 서열도 된다.

POI는 예를 들어 추출 및 정제를 원조하거나 생체 내에서 피타제 대사를 증가시키는 융합 단백질도 된다.

POI는 분비 서열에 융합되기도 한다.

또한 다른 서열은 분비를 촉진시키거나 분비된 POI의 수율을 증가시킬 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어 영국 특허출원 제9821198.0호에 기술된 아스페르길루스 니게르의 생성물과 같이 샤프롱(chaperon) 단백질을 암호화할 수 있다.

발현 생성물의 처리 및/또는 발현을 변형시키는 변경을 포함하나 이에 한정적인 것은 아닌 많은 이유로 그의 활성을 변경시키기 위해 POI를 암호화하는 NOI가 설계된다. 또다른 예로서 NOI는 특정 숙주 세포 내 발현을 최적화하도록 변형된다. 제한 효소 인식 사이트를 도입시키기 위해 다른 서열 변화가 바람직하다.

POI를 암호화하는 NOI는 합성적 또는 변형 뉴클레오타이드 - 메틸포스페이트 및 포스포로티오에이트 백본과 같은 -를 포함한다.

POI를 암호화하는 NOI는 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키도록 변형된다. 가능한 변형은 분자의 5' 및/또는 3' 말단의 측면 서열 첨가 또는 분자 백본 내 포스포디에스테르 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2'O-메틸의 사용을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

항체

본 발명의 하나의 관점은 서열번호: 3의 아미노산과 면역적으로 반응성인 아미노산에 관한 것이다.

항체는 본 발명의 물질과의 면역화와 같은 표준 기술에 의해 제조된다.

본 발명의 목적으로 "항체"라는 용어는 상세한 기술이 없는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 단편은 타겟 물질에 대한 결합 활성을 보유한 전체 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')₂ 단편뿐만 아니라 단일 사슬 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질을 포함한다. 더욱이 항체 및 그의 단편은 인간화 항체도 된다. 중화 항체 즉, 폴리펩타이드 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단제 및 치료제로서 특히 바람직하다.

폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 본 발명의 서열로 면역화된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다.

면역화된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. 본 발명의 서열(또는 그의 면역 에피토프를 포함한 서열)에 대한 폴리클론 항체를 함유한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 제조하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이러한 항체가 제조되기 위해서는 본 발명은 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용되는 또다른 아미노산 서열로 합텐화된(haptenised) 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 단편도 제공한다.

본 발명의 서열에 대해 지시되는 단일클론 항체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있고, Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

더욱이 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술, 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454).

대안으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 설명된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정 단일 사슬 항체 물질을 생성하도록 개조될 수 있다.

또한 물질에 대한 특이적 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편 및 F(ab')₂ 단편의 이황 결합을 환원시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리가 구축되어 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 한다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281).

대규모 적용

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서 본 발명의 C. freundii-유래 피타제를 암호화하는 아미노산 서열 또는 방법은 대규모 적용에 사용된다. 특히 본 발명의 방법은 식품 또는 사료 조성물의 첨가제/보충제로서 산업적 이용을 위해 대규모의 피타제 제조레 이용된다.

바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 5∼10 g의 양으로 제조된다.

바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 100∼900 mg의 양으로 제조된다.

바람직하게는 아미노산 서열은 숙주 생물체의 배양 후 총 세포 배양 부피의 리터 당 250∼500 mg의 양으로 제조된다.

피타제의 이용

상기 기술된 바와 같이 본 발명은 여기서 기술된 피타제의 제조에 관한 것이다.

특히 본 발명은 유기 및 무기 인산염 화합물의 제조시 여기서 개시된 아미노산 서열의 이용에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 피타제의 발현을 위한 발현 벡터 또는 시스템의 생성시 피타제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 이용에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은 피타제를 발현하는 숙주 세포의 생성시 이러한 발현 벡터 또는 시스템의 이용에 관한 것이다.

또한 본 발명은 유기 및 무기 인산염 화합물 전구체의 생성 또는 특정 유기 인산염 화합물의 생성시 변형된 숙주 세포의 이용에 관한 것이다.

적당한 유기 및 무기 인산염 화합물은 미오-이노시톨 펜타키스-, 테트라키스-, 트리스-, 비스- 및 모노포스페이트를 포함한다.

따라서 적당하게는 본 발명은 부티옥셀라종 유래의 피타제로 피타제를 처리하는 것을 포함한 유기 인산염 화합물의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 방법은 효소가 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 75% 이상의 동일성(상동성)을 지닌 서열 또는 유효 단편 또는 그의 변형형을 포함함을 특징으로 한다. 적당하게는 유기 인산염은 피트산염 또는 미오-이노시톨 디-, 트리-, 테트라 및 펜타포스페이트의 모든 가능한 입체이성질체이다. 다른 적당한 유기 인산염은 이노시톨-테트라포스페이트 및 이노시톨-올리고포스페이트를 포함한다. 바람직한 실시태양에서 본 방법은 생체 내 생명공학적 방법이다.

이러한 유기 인산염 화합물의 제조 방법은 적당하게는 하기 단계를 포함한다:

a) 부티옥셀라종 피타제를 포함한 발현 가능 트랜스유전자를 포함한 숙주 세포를 제공하는 단계;

b) 트랜스유전자 발현에 적당한 조건 하에서 형질전환 생물체를 배양하는 단계;

c) 배양액에서 유기 인산염 화합물을 회수하는 단계.

화합물은 피타제의 특성화를 위한 분석을 포함한 많은 적용에 사용될 수 있다. 일부 이노시톨 인산염은 세포내 조절 내 신호 분자로서 포함되거나 화학물질을 연구하는데 사용될 수 있다.

또다른 관점에서 식품 또는 동물 사료의 제조 방법이 제공된다. 동물 사료는 일반적으로 원료가 먼저 적당한 입자 크기로 분쇄된 후 적당한 첨가제와 혼합되는 사료 제분기 내에서 제조된다. 이후 사료는 매쉬(mash) 또는 펠렛으로서 제조되고;그 이후에는 일반적으로 온도가 목표 수준까지 증가된 후 사료가 형틀에 통과되어 특정 크기의 펠렛이 제조되는 방법을 포함한다. 펠렛은 수송 전에 냉각된다. 또한 동물 사료의 제조는 펠렛팅 전 압출성형 또는 확장을 포함한 추가 단계도 포함한다.

따라서 본 발명은 식품 또는 사료 제품의 제조에 사용되는 피타제를 제공하기 위한 피타제를 암호화하는 아미노산 서열 또는 피타제를 발현하는 숙주 세포의 잉용을 더욱 제공한다. 하나의 관점에서 식품 또는 사료 제품의 제조시 여기서 기술된 아미노산 서열의 이용이 제공된다. 또다른 관점에서 식품 또는 사료 제품의 제조시 본 발명에 따른 숙주 세포의 이용이 제공된다. 또다른 관점에서 식품 또는 사료 제품의 제조시 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 시스템의 이용이 제공된다.

또한 본 발명은 동물에 전달시키기 위해 다른 성분과 결합된 사료 성분으로서 효소를 사용하는 것도 포함한다.

다른 성분과의 결합

본 발명의 효소는 다른 성분 또는 담체와 결합되어 사용된다.

사료 효소용으로 적당한 담체는 호밀(거칠게 분쇄된)을 포함한다. 그 외에 지방/왁스 정화에 기반한 것, 식물 검 첨가 등을 포함한 많은 캡슐화 기술이 존재한다.

다른 성분의 예는 하나 이상의 농화제, 겔화제, 유화제, 바인더, 결정 변형제, 감미료(인공 감미료 포함), 유동 변형제, 안정화제, 항산화제, 염료, 효소, 담체, 운반제, 부형제, 희석제, 윤활제, 향미제, 착색제, 현탁제, 붕괴제, 과립 바인더 등을 포함한다. 이들 다른 성분은 천연의 것이다. 이들 다른 성분은 화학적 및/또는 효소적 기술을 이용하여 제조된다.

여기서 사용된 "농화제 또는 겔화제"라는 용어는 혼합 불가능한 액체 방울, 공기 또는 불용성 고체와 같은 입자의 이동을 감소시키거나 방지함으로서 분리를 방지하는 제품을 나타낸다.

여기서 사용된 "안정화제"라는 용어는 시간 경과시 제품(즉 식품)이 변화하지 않게 하는 성분 또는 성분 화합물로서 정의된다.

여기서 사용된 "유화제"라는 용어는 유제의 분리를 방지하는 성분(즉, 식품 성분)을 나타낸다.

여기서 사용된 "바인더"라는 용어는 물리적 또는 화학적 반응을 통해 생성물을 함께 결합시키는 성분(즉, 식품 성분)을 나타낸다.

여기서 사용된 "결정 변형제"라는 용어는 지방 또는 물의 결정화에 영향을 미치는 성분(즉, 식품 성분)을 나타낸다.

"담체" 또는 "운반제"는 화합물 투여에 적당한 물질을 의미하고 예를 들어 비-독성이고 유해한 방식으로 조성물의 어떠한 성분과도 상호작용하지 않는 액체, 겔, 용매, 액상 희석제, 용해제 등과 같은 당분야에 알려진 어떠한 물질도 포함한다.

영양적으로 수용 가능한 담체의 예는 곡물, 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 석유 젤리, 식용유 등을 포함한다.

부형제의 예는 하나 이상의 미정질 셀룰로스 및 다른 셀룰로스, 락토오스, 구연산나트륨, 탄산칼슘, 제2인산칼슘, 글리신, 전분, 우유 당 및 고분자량 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.

붕괴제의 예는 하나 이상의 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 길리콜레이트, 크로스카멜로스 나트륨 및 특정 복합 실리케이트를 포함한다.

과립 바인더의 예는 하나 이상의 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로스(HPC), 슈크로스, 말토오스, 젤라틴 및 아카시아를 포함한다.

윤활제의 예는 하나 이상의 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 비헤네이트(glyceryl behenate) 및 활석을 포함한다.

희석제의 예는 하나 이상의 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 글리세린 및 그의 결합을 포함한다.

다른 성분은 동시에(즉, 혼합물 내에 함께 존재시 또는 다른 경로로 전달시) 또는 개별적으로(즉, 다른 경로로 전달시) 사용된다.

여기서 사용된 "동물 또는 인간 소비에 적당한 성분"이라는 용어는 영양적 이익, 섬유질 대용품이 되거나 일반적으로 소비자에게 유익한 효과를 지니는 보충제로서 본 발명의 조성물에 첨가되거나 첨가될 수 있는 화합물을 의미한다.

예로서 본 성분은 알지네이트(alginate), 크산탄, 펙틴, 로커스트콩검(LBG), 이눌린, 구아검, 갈락토-올리고사카라이드(GOS), 프럭토-올리고사카라이드(FOS), 락토슈크로스, 대두, 올리고사카라이드, 팔라티노스, 이소말토-올리고사카라이드, 글루코-올리고사카라이드 및 자일로-올리고사카라이드와 같은 프리바이오틱스(prebiotics)이다.

식품 또는 사료 물질

화합물은 식품 또는 사료 물질로서 또는 그의 제조에 사용된다. 여기서 식품"이라는 용어는 광범위한 의미로 사용되고 인간용 식품 또는 식품 제품뿐만 아니라 동물용 식품(즉 사료)도 포함한다. "사료"라는 용어는 가축 사육시 동물에 공급되는 제품을 참고로 사용된다. 바람직한 관점에서 식품 또는 사료는 돼지, 가금류 및 어류와 같은 단일위장 동물에 의한 소비용이다.

식품 또는 사료는 사용 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고형 형태이다.

식품 및 사료 성분 및 보충제

화합물은 식품 또는 사료 성분으로 사용된다.

여기서 사용된 "식품 또는 사료 성분"이라는 용어는 식품 또는 식료품에 첨가되거나 첨가될 수 있는 제형을 포함하고 다양한 제품 내에서 낮은 수치로 사용될 수 있는 제형을 포함한다.

화합물은 식품 보충제이거나 이에 포함된다.

식품 및 사료 조성물

단일위장 동물용 사료 조성물은 일반적으로 피트산염을 함유한 식물 제품을 포함한 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 옥수수가루, 대두박, 평지씨가루, 옥수수, 밀, 보리 및 사탕수수계 사료를 포함한다.

여기서 기술된 피트산염은 식품 또는 사료 물질 및 조성물이거나 이에 첨가된다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법 또는 본 발명에 따른 조성물에 의해 제조된 피트산염을 또다른 식품 성분과 혼합시키는 단계를 포함한 식품 또는 사료 성분 또는 보충제의 제조 방법을 제공한다. 또한 식품 성분의 제조 방법은 본 발명의 또다른 관점이다. 동물 사료의 제조 방법은 상기에 나타나 있다. 또한 효소는 프리-믹스(pre-mix)와 같이 고형 형태로 또는 사료 첨가제로서 첨가될 수 있다. 고형 형태는 일반적으로 혼합 단계 동안 또는 그 전에 첨가되고; 액체 형태는 일반적으로 펠렛팅 단계 후 첨가된다.

약제적

또한 본 발명의 피타제는 일부 약제적 효과를 제공하기 위해 약제적 제제 또는 식료품 내로의 결합을 위해 사용된다. 예를 들어 EP 1,389,915는 인체용 식품 또는 음료의 칼슘, 철 및/또는 아연을 증가시키기 위한 식품 또는 음료 내 피타제의 사용을 기술하고 있다.

그 외에도 EP 1,389,915는 생체원소 즉 칼슘 및 철의 생물학적 이용 가능성을 증가시키는데 유용한 피트산염 함유 약물 또는 영양 보충제를 기술한다.

여기서 "약제적"이라는 용어는 광범위한 의미로 사용되고 동물용 약제 및/또는 영양제(즉, 수의학적 적용)만 아니라 인간용 약제 및/또는 영양제도 포함한다. 바람직한 관점에서 약제는 인간 사용용 및/또는 경작 동물 사용용이다.

약제는 치유력이 있거나 완화적 또는 예방적인 치료 목적이 될 수 있다. 약제는 진단 목적도 된다.

약제로서 또는 그의 제조에 사용시 본 발명의 생성물 및/또는 화합물은 하나 이상의 약제적으로 수용 가능한 담체, 약젝적으로 수용 가능한 희석제, 약제적으로 수용 가능한 부형제, 약제적으로 수용 가능한 보조제, 약제적으로 수용 가능한 활성 성분과 결합되어 사용된다.

약제는 사용 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고형 형태가 된다.

약제적 성분

본 발명의 생성물 및/또는 화합물은 약제적 성분으로 사용도니다. 여기서 본 발명의 생성물 및/또는 화합물은 단독 활성 성분 또는 적어도 하나 이상(즉 2 이상)의 활성 성분이 된다.

약제적 성분은 사용 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고형 형태가 된다.

약제적 성분은 약제의 용해 특성을 개선시키기 위해 기포 제품 형태도 된다.

형태

본 발명의 생성물 및/또는 화합물은 단독으로 또는 조성물 내에 존재하는 여부에 관계없이 어떠한 적당한 형태로도 사용된다. 또한 본 발명에 따라 제조된 피타제(즉 성분 - 식품 성분, 기능성 식품 성분 또는 약제적 성분)는 어떠한 적당한 형태로도 사용된다.

형태의 적당한 예는 매개된-, 지연된-, 변형된-, 지속된-, 펄스된- 또는 제어된-방출 적용을 위해 향미제 또는 착색제를 포함한 정제, 환약, 캡슐, 오불(ovule), 용액 또는 현탁액 중 하나 이상을 포함한다.

예로서 생성물 및/또는 조성물이 정제 형태 - 기능성 성분으로 사용되는 것과 같은 -로 사용되는 경우 정제는 부형제, 붕괴제, 과립 바인더 또는 윤활제 중 하나 이상도 포함한다.

상기 형태 제조에 사용되는 영양적으로 수용 가능한 담체의 예는 예를 들어 물, 염 용액, 알코올, 왁스, 바셀린 등을 포함한다.

상기 형태의 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.

수성 현탁액 및/또는 엘릭서, 카로티노이드 분해 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착섹제 또는 염료, 유화제 및/또는 현탁제 및 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 글리세린 및 그의 혼합물과 같은 희석제와 결합된다.

또한 상기 형태는 젤라틴 캡슐; 섬유질 캡슐, 섬유질 정제 등도 포함한다.

일반적 재조합 DNA 방법론 기술

본 발명은 나타내지 않는 한 다른 경우를 나타내지 않는 한 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명된다. 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press 참조. 이들 각각은 참고문헌에 포함된다.

도 1은 DEAE-Sepharose 크로마토그래피에 의해 정제된 부티옥셀라(Buttiauxella) P1-29 유래의 재조합 피타제의 SDS PAGE 분석을 나타낸 것이다. 본 도면은 부티옥셀라 피타제의 표본을 포함한 레인의 디지털 촬영 사진의 스캐닝 추적을 제공한다.

도 2는 부티옥셀라 P1-29 유래의 피타제의 pH 프로파일을 나타낸 것이다.

도 3은 다른 정도의 인산화 및 모델 기질을 지닌 이노시톨 인산염 분획을 지닌 부티옥셀라 P1-29 유래의 정제된 재조합 피타제의 기질 특이성을 나타낸 것이다. 약어: IP6 - 피트산, IP5, IP4 및 IP3 - 각각 이노시톨 펜타-, 테트라- 및 트리포스페이트 이성체 혼합물. Fru P2 - 프럭토스 1,6-디포스페이트, Fru P1 - 프럭토스 6-포스페이트.

서열번호: 1은 박테리아 균주의 동정을 위해 수득된 서열을 나타낸다.

서열번호: 2는 부티옥셀라 P1-29 유래의 피타제 유전자를 포함한 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

서열번호: 3은 부티옥셀라 P1-29 유래의 피타제 유전자의 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명은 하기 비-한정적 실시예에서 더욱 상세히 설명된다.

(실시예 1) 피타제 활성 분석

마이크로-1 = 마이크로리터

피타제 분석은 미량 역가판에서 수행되었다. 반응 혼합물(100 마이크로-l)은 pH 3.5의 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내의 2 mM 피트산염 및 0.8 mM CaCl₂을 함유하였다. 반응은 37℃에서 1시간 동안 진행되었고 이후 방출된 인산염은 알려진 정제 절차(Heinonen J.K., Lahti R.J. Anal Biochem. 113 (2), 313-317 (1981))에 의해 측정되었다. 간단하게는 200 마이크로-l의 신선하게 준비된 AMM 용액(7.5 N H₂SO₄, 15 mM 몰리브덴산암모늄 및 아세톤 - 1:1:2)이 각각의 미량 역가판 웰 내 100 마이크로-l 반응 혼합물 내에 첨가되었다. 390 nm에서의 흡광도는 AMM 시약 첨가 10∼30분 내에 측정되었다. 인산염의 함량은 알려진 농도의 인산염 용액의 표준 곡선을 구축함으로서 측정되었다. 다른 pH 수치에서 피타제 활성을 분석하기 위해 하기(모두 200 mM) 완충액이 사용되었다: pH 2.0∼3.0의 글리세린/HCL, pH 3.5∼ 5.5의 아세트산염/아세트산, pH 6.0∼7.5의 트리스/말레산.

(실시예 2) 피타제-생성 균주 P1-29

박테리아 균주 P1-29는 최초로 핀란드 남부의 숲의 진흙 바닥에서 채취된 부패 식물 물질 덩어리에서 분리되었다. 본 균주는 30℃의 많은 표본 배양 배지 즉, LB(1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.4) 또는 낮은 인산염 배지 PP1(1% 펩톤, 1% 쇠고기 추출물, 0.5% 효모 추출물, CaCl₂ - 0.2 M) 상에서 호기성으로 배양될 수 있다. 배지는 NaOH로 약 11로 pH를 적정하고 10분간 끓여서 준비된다. 침전물은 여과에 의해 제거되고 pH는 5.5로 재-적정되고 배지는 121℃에서 15분간 가압증기멸균시킴으로서 멸균된다.

액체 PP1 배지 내에서의 생장 후 균주는 pH 3.5 및 5.5 모두에서 피타제 활성을 나타내는 것을 판명되었다(실시예 1에 기술된 바와 같이 분석됨). 3.5 및 5.5에서의 활성비는 약 1.3이었다. 또한 활성은 P3-42의 세포 및 배양 상청액 내에서 개별적으로 측정되었다. 이들 측정에 따라 모든 피타제 활성 대부분은 배양 배지 상청액 내에서 발견된 10∼20%의 활성으로 세포-결합되었다.

균주는 수탁번호 41248호로 NCIMB에 기탁된다.

(실시예 3) 균주 P1-29에서의 염색체 DNA의 분리

염색체 DNA는 표준 절차에 의해 제조되었다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1996). 30℃의 LB 배지 내에서 밤새 생장된 배양액 250 ml는 10,000 rpm에서 30분간 원심분리되었고 20 ml의 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA pH 8 내에서 세척되었고 차가운 10 ml의 TES(50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, 15% 글루코스 pH 8)에 재현탁되었다. 리소자임은 10 mg/ml에 첨가되었고 세포 현탁액은 세포용해가 발생할 때가지 37℃에서 30∼60분간 인큐베이트되었고 100 마이크로-l의 반응 혼합물의 1 ml의 1% SDS로의 희석에 의해 확인되고 "점액성" 농도에 대해 검사되었다. 이때 SDS 및 단백분해효소 K(Sigma)는 각각 1% 및 0.5 mg/ml의 최종 농도에 첨가되었다. 반응 혼합물은 56℃에서 30분간 인큐베이트된 후 2 ml의 5 M NaCl 및 1.4 ml의 10% 세틸트리메틸암모늄브로마이드(Sigma)가 첨가되었다. 인큐베이션은 65℃에서 15분간 지속되었다. 용액은 클로로포름/이소아밀알코올(24:1)로 1회, 페놀/클로로포름으로 1회 추출되었다. 추출 후 수상은 0.6 vol의 이소프로판올과 혼합되었고 DNA 침전물은 원심분리(10,000 rpm, 15분)에 의해 수집되었고 70% 에탄올로 세척되었고 진공 건조되었고 2 ml의 10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA pH 8, 5 ㎍/ml RNAse에 재현탁되었다.

(실시예 4) 박테리아 균주 P1-29의 분류학적 동정

균주 P1-29의 16S rRNA 유전자 단편은 프라이머: 536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC) 및 1392r(ACGGGCGGTGTGTRC)를 사용하여 Taq DNA 중합효소(Roche)로의 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었다(Lane, D. J. In Nucleic acid techniques in bacterial systematics, Stackbrandt, E. and Goodfellow, M. eds, John Wiley & Sons, New York: pp 115-117 (1991)). 하기 프로그램이 사용되었다: 1) 95℃에서 5분간 개시 DNA 변성 단계; 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 30 사이클; 70℃에서 10분간 최종 연장 단계. 약 900 염기쌍 크기의 PCR 생성물은 0.8% 아가로스겔 내의 전기영동에 의해 정제되었고 Gel Purification Kit(Qiagen)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 겔에서 추출되었다. 정제된 PCR 생성물은 통상적으로 사용되는 Medprobe(노르웨이)에 의해 서열분석되었다. 서열분석된 영역은 서열번호: 1에 나타나 있다. 이러한 서열은 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 내의 DNA 서열과 비교되었다. 최대 매치(691 뉴클레오타이드 중 688∼689, 99.6∼99.7%)는 부티옥셀라 이자르디이(B. izardii) DSM 9397, 부티옥셀라 가비니에(B. gaviniae) DSM 9393 및 부티옥셀라 노악키에(B. noackiae) ATCC 51607T와 같은 일부 부티옥셀라 균주 유래의 16S RNA 유전자 서열에서 발견되었다. 따라서 균주 P1-29는 분류학적으로 부티옥셀라종으로 분류되었다.

(실시예 5) 부티옥셀라종 P1-29 유래의 피타제 유전자 클로닝

부티옥셀라종 P1-29 유래의 염색체 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A로 부분적으로 분해되었고 분해물은 1% 아가로스겔 상에서 분획화되었다. 3∼5 kb의 DNA 단편은 Gel Purification Kit(Qiagen)을 사용하여 겔에서 분리되었고 BamHI-분해된 탈인산화 람다-ZAP 팔(arm)(Stratagene)으로 라이게이트되었다. 라이브러리 구축용 하위 단계는 Stratagene의 ZAP Express Predigested Vector/Gigapack Cloning Kit의 지침을 따랐다. 라이브러리의 파지 형태는 제조사(Stratagene)에 의해 기술된 "대량 절제"에 의해 플라스미드 형태로 전환되었다. 플라스미드 라이브러리의 선별은 Petri 플레이트 상에서의 피타제 활성 검출에 대해 공지된 방법과 유사하게 수행되었다(Howson and Davis. Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382 (1983); Chen J.C. Biotechnology techniques 12 (10) 751-761 (1998); Riccio M.L. et al, J. Appl. Microbiol. 82, 177-185 (1997)). 일부 피타제-양성 클론이 분리되었고 서브-클로닝에 의해 정제되었다. 이들 분리체는 액체 배양액(30℃의 LB 배지 및 24시간 동안 200 rpm) 내에서 생장되었고 피타제 활성은 수득된 세포 현탁액 내에서 측정되었다(실시예 1). 최대 피타제 활성(pH 3.5에서 약 1.2 U/ml)을 지닌 클론이 하위 특성화를 위해 선택되었다. 플라스미드 DNA는 이러한 클론에서 분리되었고 pBK(P1-29)로 명명되었고 삽입 DNA의 부분적 DNA 서열분석에 의해 특성화되었다(서열분석 작업은 Medprobe(노르웨이))로부터 입수됨). 피타제 유전자를 포함한 서열은 서열번호: 2에 나타나 있다. 부티옥셀라종 P1-29 피타제의 추론된 서열은 서열번호: 3에 나타나 있다. NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에 의헤 제고오되는 BLAST 작업을 이용한 서열번호: 3과 GenBank 내 서열의 비교는 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus)(GenBank 수탁번호 AAQ90419) 유래의 피타제가 부티옥셀라종 P1-29의 가장 가까운 알려진 상동체로서 증명하였다. 그러나 상동성 수치는 다소 낮다 - 아미노산 잔기의 약 74%만이 두 단백질에서 동일함.

(실시예 6) 부티옥셀라종 P1-29 유래의 피타제 유전자의 증폭 및 발현

피타제 유전자는 PCR에 의해 증폭되었다. 부티옥셀라종 P1-29 균주의 염색체 DNA가 주형으로 사용되었고 올리고뉴클레오타이드 o29-5 (GGAATTCATATGACGATCTCTGCGTTTAAC) 및 o29-3 (GGAATTCGGATCCTTA- CTGTAGCTGGCAGCCTG)이 프라이머로 사용되었다. 증폭은 Expand High Fidelity PCR System kit(Roche)를 사용하여 수행되었다. 하기 프로그램이 사용되었다: 1) 94℃에서 3분간 개시 DNA 변성; 2) 94℃에서 45초간, 55℃에서 45초간, 68℃에서 1분간, 72℃에서 1분간, 74℃에서 1분간 35 사이클; 72℃에서 10분간 최종 연장 단계. 수득된 PCR 생성물은 0.8% 아가로스겔 내의 전기영동에 의해 정제되었고 Gel Purification Kit(Qiagen)을 사용하여 겔에서 추출되었다. 정제된 PCR 생성물은 제한효소 NdeI 및 BamHI로 분해되었고 PCR Purification Kit(Qiagen)에 의해 반응 혼합물에서 분리되었다. 벡터 플라스미드 pET11a(Novagen)은 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamHI로 분해되었고 새우 알칼리성 포스파타제(Roche)를 사용하여 탈-인산화되었고 0.8% 아가로스겔 내의 전기영동에 의해 정제되었다. 선형화 플라스미드 DNA 밴드는 겔에서 절단되었고 Gel Purification Kit(Qiagen)을 사용하여 정제되었다. 2개의 정제된 DAN 단편은 T4 DNA 리가제(Roche)를 사용 라이게이트되었다. 라이게이션 반응은 70% 에탄올로 침전되었고 에탄올로 세척되었고 50 마이크로-l의 전기적합성 E. coli XL-1 Blue MRF' 세포 내로 직접 재현탁되었다. 현탁액은 0.1 cm 일렉트로포레이션(electroporation) 큐벳(BioRad)로 옮겨졌고 1800 V, 25 마이크로-F 및 200 옴으로 셋팅된 Gene Pulser Xcell(BioRad)를 이용하여 일렉트로포레이트되었다. 일렉트로포레이션 직후 1 ml의 LB 배지가 첨가되었고 세포 현탁액은 15 ml의 플라스틱 튜브(Falcon)으로 옮겨졌고 1시간 동안 진탕하면서(200 rpm) 37℃에서 인큐베이트되었다. 형질전환 세포는 100 ㎍/ml를 함유한 LP 플레이트에 도말되었고 37℃에서 밤새 인큐베이트되었다. 24개 형질전환체는 액체 배양액 내에서 생장되었고 배양액은 피타제 활성을 분석하고 및 플라스미드 DNA의 분리하는데 사용되었다. 최대 피타제 활성을 생성하고 예측되는 제한 패턴의 플라스미드 DNA를 생성하는 클론이 선택되었다. pET11(P1-29)로 명명된 이러한 클론에 의해 포함된 플라스미드는 발현 숙주 균주 BL21(DE3)pLysS(Novagen)을 형질전환시키는데 사용되었다. 형질전환 세포 현탁액은 2% 글루코스를 함유한 LB 내에서 37℃로 1시간 동안 진탕되었고 암피실린(100 ㎍/ml) 및 글루코스(2%)를 함유한 LB 50 ml 내로 접종되었고 진탕하면서(200 rpm) 30℃에서 밤새 생장되었다. 수득된 배양액의 OD는 600 nm에서 측정되었고 배양액은 1 L의 LB + 암피실린(100 ㎍/ml)을 0.04의 OD₆₀₀으로 접종시키는데 사용되었다. 이러한 배양액 내 피타제 활성은 일반적으로 8∼12 U/ml 이었다. 약 40%의 피타제 활성이 배양 배지 내로 분비되었고 나머지는 관련 세포에 잔존하였다. 이러한 관찰은 부티옥셀라 P1-29 피타제가 고유 숙주 보다 E. coli 내에서 어느정도 더 효율적으로 분비됨을 나타낸다. 동일한 조건 하에서 생장된 pET11로 형질전환된 대조군 균주 BL21(DE3)pLysS의 배양액 내 활성은 0.05 U/ml 미만이었다.

(실시예 7) 부티옥셀라 P1-29 유래 재조합 피타제의 정제

pET11(P1-29)로 형질전환된 BL21(DE3)pLysS의 배양액은 박테리아 세포를 제거하기 위해 원심분리되었고 회전 증발기를 이용하여 본래 부피의 약 1/10으로 농축되었고 용액의 전도율이 250 마이크로-S/cm 미만으로 감소될 때까지 물에 대해 투석되었다. 용액의 pH는 트리스 염기로 8.0으로 적정되었고 pH 8.0의 25 mM 트리스-HCl로 평형화된 DEAE Sepharose Fast Flow(Roche) 컬럼(3x20 cm)에 적용되었다. 컬럼은 30분간 3 ml/분의 유속으로 평형화 완충액으로 세척된 후 25 mM 트리스-HCl, pH 8.0 내의 3가지 연속 기울기로 용출되었다: 0∼50 mM, 50∼150 mM 및 150∼500 mM. 3가지 기울기 각각은 3 ml/분의 일정한 유속으로 1시간 동안 프로그램화되었다. 9 ml 분획이 수집되었고 피타제 활성으로 분석되었다. 하나의 강한 활성 피크가 검출되었다. 피크 분획 내 단백질은 Centriplus 농축기(Amicon)를 이용하여 농축되었고 12% 겔 및 표준 Laemmli 완충 시스템을 이용한 SDS PAGE로 분석되었다. 이러한 분석 결과는 DEAE Sepharose에 의해 수득된 재조합 부티옥셀라 P1-29 피타 제 제제가 단일의 중요한 단백질 성분을 포함함을 나타내었다. 겔의 디지털 이미지의 스캐닝에 기반한 반-정량적 분석(도 1)은 약 65%의 순도를 나타낸다.

(실시예 8) 부티옥셀라 P1-29 유래 재조합 피타제의 pH 프로파일

부티옥셀라 P1-29(실시예 7에 따라 정제된) 활성의 pH에 따른 의존성이 완충액 내에서 실시예 1에서 기술된 조건 하에서 조사되었다. 효소는 약 pH 4.5에서의 최대값 및 약 pH 3에서의 강한 곡선 "숄더(shoulder)"를 지니는 광범위한 pH 영역(2-5.5)에서 활성적이었다(도 2).

(실시예 9) 부티옥셀라 P1-29 유래 재조합 피타제의 기질 특이성

이노시톨 당 3, 4 또는 5개 인산염을 포함한 이노시톨 인사염의 분획은 이온-교환 크로마토그래피에 의해 진균 피타제(Natuphos)로 처리된 피트산의 부분적 가수분해물에서 분리되었다. 이들 제제의 생성 및 정제는 BioChemis Ltd (St.Petersburg, Russia)의 통상적 서비스이었다. 각 분획의 다른 정도의 인산화를 지닌 이노시톨-인산염으로의 오염은 HPLC(Sandberg A.S., Ahderinne R. J. Food Sci. 51 (3), 547-550)에 의한 판단시 5% 이하이었다. 통상의 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 프럭토스 6-포스페이트(Sigma)는 디- 및 모노포스페이트 기질에 대한 부티옥셀라 P1-29의 특이성을 평가하기 위해 모델 기질로 사용되었다. 실시예 7에 따 라 정제된 다른 기질에 대한 부티옥셀라 피타제의 활성은 최종 반응 혼합물 내 2 mM 농도의 기질을 이용하여 pH 3.5에서의 표준 분석(실시예 1)으로 측정되었다. 결과(도 3)는 효소가 매우 광범위한 기질 특이성을 지님을 나타낸다. 펜타-, 테트라- 및 트리포스페이트에 대한 그의 활성은 기질로서 피트산에 대한 활성과 본질적으로 동일하거나 다소 높았다. 프럭토스 1,6-디포스페이트 - 대부분의 피타제에 대해 불량한 기질 -는 부티옥셀라종 피타제(특히 P1-29 유래 피타제)에 의해 다소 효율적으로 가수분해되었다. 또한 프럭토스 6-포스페이트의 가수분해도 다른 시험된 기질의 가수분해보다 훨씬 덜 효율적이더라도 검출 가능하였다.

(실시예 10) 부티옥셀라 P1-29 유래 재조합 피타제의 특이 활성

부티옥셀라 P1-29 피타제의 특이 활성은 실시예 7에 따라 정제된 제제를 이용하여 평가되었다. 피타제 활성은 실시예 1에 따라 pH 3.5에서 측정되었다. 피타제 농도는 BCA Protein Assay Kit (Pierce)로 총 단백질 농도를 측정하고 SDS PAGE에 의해 조사된 피타제 함량(실시예 7)으로 이를 보정함으로서 계산되었다. 이러한 측정에 따라 부티옥셀라 P1-29 유래 재조합 피타제의 특이 활성은 37℃에서 약 300 U/mg이다.

(실시예 11) 피타제 변이체의 생성 및 특성화

피타제 변이체는 Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p 646-649) 또는 Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)에 기술된 방법 또는 WO 92/18645에 기술된 오류 역치 돌연변이유발 프로토콜과 같은 상기 기술된 돌연변이유발을 이용하여 뉴클레오타이드 서열 서열번호: 2의 돌연변이유발에 의해 구축되었다. 또다른 적당한 돌연변이 PCR 방법은 Cadwell and Joyce (PCR Methods Appl. 3(1994), 136-140)에 의해 개시되어 있다.

피타제 효소 변이체는 하나 이상의 하기 발현 숙주 내의 이형적 발현 후 특성화되었다: 에스케리키아 콜리 K12; 바실러스 섭틸리스; 사카로마이세스 세레비시에.

2개 위치, 3개 위치, 4개 위치, 5개 위치, 6개 위치, 7개 위치, 8개 위치, 9개 위치, 10개 위치, 11개 위치, 12개 위치를 포함한 서열번호: 3과 하나 이상의 아미노산 위치가 다른 피타제 변이체가 유도되었다. 여기서 기술된 바와 같이 적당한 반복 라운드의 돌연변이유발이 수행되었다.

피타제 변이체의 특성

1. 열안정성

이러한 변이체의 열안정성은 효소의 불활성화 온도에 의해 특성화되었다. 불활성화 온도는 다른 온도에서 10분간 인큐베이션 후 피타제 효소의 잔여 활성을 측정한 후 실온으로 냉각시킴으로서 측정되었다. 불활성화 온도는 잔여 활성이 실온에서 동일한 온도 하에서 동일한 기간 동안의 인큐베이션 후 잔여 활성 대비 50%인 온도이다. 50% 잔여 활성에 대응하는 온도를 측정하기 위해 측정된 활성 데이터로부터의 적당한 보간법 및 보외법이 수행된다. ℃ 내의 열안정성 차이는 서로로부터 2개 효소의 불활성화 온도를 차감함으로서 계산되었다.

표 1은 다른 변이체에 대한 열안정성 차이를 나타낸다.

2. 다른 특성

다른 특성도 개선되었다.

선택된 변이체의 열안정성, 특이 활성 및 펩신 안정성은 상기 기술된 분석을 이용하여 비교되었다. 이러한 변이체의 펩신 안정성은 대조군 고전과 비교시 펩신 인큐베이션 후 pH 3.5, 37℃에서 측정된 잔여 활성에 의해 특성화되었다(잔여 활성 = 펩신 인큐베이션 후 활성/대조군 조건 하에서의 인큐베이션 후 활성). 펩신 인큐베이션은 pH 2.0, 0.25 mg/ml 펩신, 1 mM CaCl₂ 및 5 mg/ml BSA로 37℃에서 2시간 동안 수행되었다. 대조군 조건은 pH 5.0, 1 mM CaCl₂ 및 5 mg/ml BSA로 37℃에서 2시간 동안 수행되었다.

표 2는 선택된 변이체의 특성을 나타낸다(서열번호: 3에 따른 야생형 피타제에서 유래되고 이에 대해 비교됨).

상기 명세서에 기술된 모든 문헌 및 상기 문헌에 인용된 참고문헌은 참고문헌에 포함되어 있다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정적이지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에 명백한 본 발명을 수행하기 위한 방법의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 존재하게 된다.

SEQUENCE LISTING <110> DANISCO A/S <120> ENZYMES <130> P021161WO <140> PCT/IB2005/003376 <141> 2005-10-17 <150> GB 0423139.5 <151> 2004-10-18 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 691 <212> DNA <213> Buttiauxella <400> 1 actacgacgc actttatgag gtccgcttgc tctcgcgagg tcgcttctct ttgtatgcgc 60 cattgtagca cgtgtgtagc cctactcgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac 120 cttcctccag tttatcactg gcagtctcct ttgagttccc ggccgaaccg ctggcaacaa 180 aggataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ttcacaacac gagctgacga 240 cagccatgca gcacctgtct cacagttccc gaaggcacta aggcatctct gccaaattct 300 gtggatgtca agagtaggta aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac 360 cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg 420 cggtcgactt aacgcgttag ctccggaagc cactcctcaa gggaacaacc tccaagtcga 480 catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca 540 cctgagcgtc agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac cggtattcct ccagatctct 600 acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta caagactcta gcctgccagt 660 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<222> (289)..(289) <223> Any amino acid. <220> <221> SITE <222> (294)..(294) <223> Any amino acid. <220> <221> SITE <222> (303)..(303) <223> Any amino acid. <220> <221> SITE <222> (336)..(336) <223> Any amino acid. <220> <221> SITE <222> (351)..(351) <223> Any amino acid. <400> 3 Met Thr Ile Ser Ala Phe Asn Arg Lys Lys Leu Thr Leu His Pro Gly 1 5 10 15 Leu Phe Val Ala Leu Ser Ala Ile Phe Ser Leu Gly Ser Thr Ala Tyr 20 25 30 Ala Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile 35 40 45 Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met 50 55 60 Arg Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly 65 70 75 80 Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe 85 90 95 Tyr Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys 100 105 110 Pro Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys His 130 135 140 Leu Thr Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Pro Leu Phe 145 150 155 160 His Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln 165 170 175 Gln Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Asp Asn Leu Asn Gln 180 185 190 His Tyr Ile Pro Phe Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser 195 200 205 Thr Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu 210 215 220 Gly Leu Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys 225 230 235 240 Val Ala Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile 245 250 255 Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn 260 265 270 Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Val 275 280 285 Gln Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly 290 295 300 Thr Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr 305 310 315 320 Glu Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile 325 330 335 Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met 340 345 350 Arg Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala 355 360 365 Leu Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser 370 375 380 Val Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro 385 390 395 400 Leu Ser Leu Asn Gln Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly 405 410 415 Cys Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr 420 425 430 Arg Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln 435 440 445 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 cagcmgccgc ggtaatwc 18 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 acgggcggtg tgtrc 15 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 ggaattcata tgacgatctc tgcgtttaac 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 7 ggaattcgga tccttactgt agctggcagc ctg 33

Claims (47)

1. 수탁번호 NCIMB 41248호로 기탁된 부티옥셀라 속(Buttiauxella sp) 스트레인 P1-29로부터 수득되는 폴리펩타이드에 있어서,

   상기 폴리펩타이드는 100 U/mg 이상의 피타제 활성을 지니고, pH 4∼5에서 최대 피타제 활성을 지님을 특징으로 하는 폴리펩타이드
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6. 제 1항에 있어서, 상기 피타제 활성은 37℃ 온도에서 pH 4.5의 200 mM 아세트산나트륨 완충액 내 2 mM 피트산염 및 0.8 mM CaCl₂를 함유한 용액 내에 상기 피타제를 인큐베이팅시켜 측정됨을 특징으로 하는 폴리펩타이드
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25. 액체 형태인 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 식품 또는 동물 사료에 스프레이하는 단계를 포함하는 식품 또는 동물 사료의 제조 방법
26. 건조 생성물인 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 식품 또는 동물 사료와 혼합하는 단계를 포함하는 식품 또는 동물 사료의 제조 방법
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28. ⅰ) 제 1항에 따른 피타제 또는 ⅱ) 제 25항에 따른 방법에 의해 제조된 동물 사료를 포함하는 식품 또는 동물 사료 조성물
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