CN110603323A - 使用古细菌丝氨酸蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了使用古细菌丝氨酸蛋白酶序列的方法。

Description

使用古细菌丝氨酸蛋白酶的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月15日提交的PCT/CN 2017/076770的优先权，将其通过引用以其全文特此并入。
通过引用并入序列表
将于2018年3月2日创建并同时提交的、以大小为29KB、名称为NB41217WOPCT_SequenceListing_ST25的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本领域涉及热稳定的古细菌丝氨酸蛋白酶，并且特别地涉及所述蛋白质的鉴定和表征，所述蛋白质在本文中称为TnaPro1，其是适合用于饲料或谷物应用中的嗜热蛋白酶。
背景技术
蛋白酶(protease)(也称为肽酶或朊酶(proteinase))是能够裂解肽键的酶。蛋白酶经过多次进化，且不同种类的蛋白酶可以通过完全不同的催化机制进行相同的反应。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。
蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶属于羰基水解酶亚组，其包含具有广泛特异性和生物学功能的不同类别的酶。尽管存在这种功能多样性但丝氨酸蛋白酶的催化机制已与至少两种遗传上不同的酶家族接近：1)枯草杆菌蛋白酶；和2)胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)。
丝氨酸蛋白酶的这两个家族具有非常相似的催化机制。这两个酶家族的三级结构汇集了由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸的保守的催化三联体。
已经对丝氨酸蛋白酶进行了大量研究，这主要归因于它们在工业应用中有用。另外的工作集中于以下环境条件(例如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端温度和/或pH)，这些条件可能在各种应用中不利地影响这些酶的功能。
在工业中，例如蛋白酶特别用于食物产品中。此类产品可以适用于人类，但更常见地适用于诸如农场动物或宠物等家畜。在食物产品中添加蛋白酶或在食物产品的生产中使用蛋白酶会导致食物产品中蛋白质的部分降解，从而导致食物产品的消化率提高。此类食物产品对于消耗它们的动物的营养价值因此可以得到改善。
蛋白酶也通常用于工业过程中以降解例如在植物材料的制造、酿造和加工中的含蛋白质的材料。例如，在从油籽或其他植物产品中提取油的过程中，蛋白酶可用于降解细胞材料。蛋白酶可以类似地用于例如酿造期间的谷物加工中。
在此类工业过程、用途或产品中，蛋白酶可能暴露于如上所述的环境条件(例如极端温度和/或pH)下，这可能对酶的稳定性或活性有害。蛋白酶在此类过程和产品中的使用(其可以用于动物饲料和洗涤剂中)是现有技术已知的，例如US 2010/0081168(其公开了酸稳定的蛋白酶在动物饲料中的用途)和US 8772011(其公开了具有修改的温度活性曲线的天然蛋白酶变体)。然而，对开发可以在不利条件下使用并保持或具有改善活性的蛋白酶的应用存在持续需求。
发明内容
在第一个实施例中，描述了重组构建体，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列，其中所述编码核苷酸序列与至少一个在生产宿主中起作用的调控序列有效地连接，并且所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少92％氨基酸序列同一性的多肽；
并且其中所述调控序列对于所述编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和所述编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。
在第二个实施例中，所述重组构建体的编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
在第三个实施例中，本文描述的重组构建体的编码核苷酸序列选自由以下组成的组：
i)编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少86％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列；或
ii)编码具有SEQ ID NO:5或14所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少84％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
在第四个实施例中，所述重组构建体的调控序列包含启动子。
在第五个实施例中，描述了包含本文所述重组构建体的载体。
在第六个实施例中，描述了包含本文所述重组构建体的生产宿主或宿主细胞。
在第七个实施例中，如权利要求6所述的生产宿主或宿主细胞是可以选自由以下组成的组的细胞：细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
在第八个实施例中，描述了生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
i)用本文所述的任何重组构建体转化宿主细胞；和
ii)在通过本文所述的方法产生热稳定丝氨酸蛋白酶的条件下，培养步骤(i)的转化的宿主细胞，并回收。
在第九个实施例中，从宿主细胞回收热稳定丝氨酸蛋白酶。
在第十个实施例中，宿主细胞可以选自由以下组成的组：细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
在第十一个实施例中，描述了包含通过本文所述的任何方法获得的热稳定丝氨酸蛋白酶的培养物上清液。
在第十二个实施例中，描述了用于水解衍生自玉米的材料的方法，所述方法包括：
(a)使从玉米中获得的材料与液体接触以形成醪液；和
(b)通过使水解产物与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触而水解醪液中的至少一种蛋白质以形成水解产物，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，以及
(c)任选地，回收步骤(b)中获得的水解产物。
在第十三个实施例中，描述了动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其包含至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且是热稳定的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与其具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物任选地进一步包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
在第十四个实施例中，本文所述的饲料添加剂组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的组的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
在第十五个实施例中，可以将本文所述的任何饲料添加剂组合物进行制粒并且其包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
在第十六个实施例中，这些颗粒的平均直径在50和2000微米之间。
在第十七个实施例中，本文所述的任何饲料添加剂组合物呈液体、干粉、或颗粒或包衣的形式，或呈包被的形式或包入胶囊内的形式。
在第十八个实施例中，本文所述的任何饲料添加剂组合物可以呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
在第十九个实施例中，其中至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽以1至20g/吨的本文所述任何动物饲料的量存在。
在第二十个实施例中，描述了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)用包含丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列；
(b)糖化步骤(a)的产物；
(c)用合适的生物体进行发酵；以及
(d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
在第二十一个实施例中，同时进行步骤(b)和(c)。
在第二十二个实施例中，通过使用1-20g丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料，使本文描述的方法中的氮源的添加消除或减少至少50％，其中丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
在第二十三个实施例中，所述氮源是尿素。
在第二十四个实施例中，当液化产物是乙醇并且当使用1-20g热稳定丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料时，不需要酸性蛋白水解酶，其中丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
附图和序列说明
图1显示了为表达AprE-TnaPro1而构建的质粒，即质粒pGX706，其具有质粒p2JM103BBI的载体主链。如图所示，aprE-TnaPro1基因是包含aprE信号肽序列、编码氨基酸序列Ala-Gly-Lys(AGK)的9-核苷酸接头和TnaPro1酶原序列的单个可读框(以此顺序)。所述aprE-TnaPro1基因受aprE启动子(PaprE)的控制。CAT代表氯霉素乙酰转移酶，其赋予携带该质粒的细菌以氯霉素抗性。Bla代表β-内酰胺酶。
图2是剂量响应曲线，其显示了增加浓度的TnaPro1对显色底物AAPF-pNA的蛋白水解活性。蛋白水解活性由溶液的净A410表示。实验在pH 8下进行。
图3是纯化的TnaPro1的pH曲线，显示了其在从pH 3到pH 10的各种pH下对AAPF-pNA的蛋白水解活性。相对活性以相对于在pH 9下观察到的最大活性的百分比值给出。误差条代表平均值两侧的一个标准偏差。
图4是纯化的TnaPro1的温度曲线，显示了其在从30℃到95℃的各种温度下对AAPF-pNA的蛋白水解活性。相对活性以相对于在70℃下观察到的最大活性的百分比值给出。误差条代表平均值两侧的一个标准偏差。
图5表示在pH 3下使用纯化的TnaPro1进行玉米大豆粉水解测定的结果。使用OPA测定对水解进行定量，并记录为净A340。误差条代表平均值两侧的一个标准偏差。
图6表示在pH 3下使用纯化的TnaPro1进行玉米大豆粉水解测定的结果。使用BCA测定对水解进行定量，并记录为净A562。误差条代表平均值两侧的一个标准偏差。
图7表示与图5中所呈现的测定等效的玉米大豆粉水解测定的结果，不同之处在于该测定是在pH 6下进行的。
图8表示与图6中所呈现的测定等效的玉米大豆粉水解测定的结果，不同之处在于该测定是在pH 6下进行的。
图9表示对TnaPro1和ProAct蛋白酶进行的胃蛋白酶稳定性测定的结果，显示了在37℃下与胃蛋白酶一起孵育30分钟后的活性。孵育后的残余活性证明了当暴露于胃蛋白酶后该酶的稳定性。残余的蛋白酶活性以原始活性的百分比表示，确定为TnaPro1和ProAct在37℃与热灭活的胃蛋白酶一起孵育30分钟后的活性。
以下序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)，并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)、以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。
SEQ ID NO:1示出了TnaPro1的核苷酸序列(NCBI参考序列：NZ_CP007264.1，1327825-1329105，互补)。
SEQ ID NO:2示出了SEQ ID NO:1编码的TnaPro1前酶原的氨基酸序列(GenBank登录号：AHL23118.1)。
SEQ ID NO:3示出了完全加工的成熟酶TnaPro1的氨基酸序列(即SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:4示出了编码AprE-(AGK)-TnaPro1蛋白的合成基因的核苷酸序列(即在编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AprE信号序列的核苷酸序列的3′端和编码TnaPro1酶原的核苷酸序列的5′端之间具有三个另外的载体衍生密码子(编码AGK)的核苷酸序列)。
SEQ ID NO:5示出了AprE-(AGK)-TnaPro1蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID NO:4编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:6示出了完全加工的成熟酶TnaPro1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7示出了TnaPro1酶原的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8示出了TnaPro1酶原的氨基酸序列(即SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:9示出了TnaPro1信号序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10示出了TnaPro1信号序列的氨基酸序列(即SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:11示出了TnaPro1前肽片段的核苷酸序列(TnaPro1前结构域)。
SEQ ID NO:12示出了TnaPro1前肽片段/前结构域的氨基酸序列(即SEQ ID NO:11编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:13示出了AprE-TnaPro1蛋白的核苷酸序列(即具有AprE信号序列的TnaPro1酶原)。
SEQ ID NO:14示出了AprE-TnaPro1蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID NO:13编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:15示出了AprE信号序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16示出了AprE信号序列的氨基酸序列(即SEQ ID NO:15编码的氨基酸序列)。
SEQ ID NO:17示出了存在于显色蛋白酶底物AAPF-pNA中的氨基酸序列。
具体实施方式
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，以下定义适用：
在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。
术语“包含”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由......组成”和“由......组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由......组成”旨在包括由术语“由......组成”所涵盖的实施例。
在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
如本文所使用的，术语“蛋白质”和“多肽”是可互换的，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。
术语“蛋白酶”是指蛋白质或多肽、或蛋白质或多肽的结构域，其具有催化在蛋白质主链的一个或多个位置处的肽键裂解的能力。蛋白酶可获自生物体，例如微生物(例如，真菌、细菌或古细菌)或高等生物(例如植物或动物)。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可以互换使用。蛋白酶可在生命的所有领域中找到：真核生物(包括动物、植物、真菌等)、细菌和古细菌。蛋白酶也由病毒编码。
蛋白酶可分为两组：“外肽酶”和“内肽酶”，前者裂解多肽链的末端肽键或倒数第二个肽键(从而从底物多肽链上释放一个氨基酸或二肽)，后者仅裂解多肽链中的非末端肽键。因此，外肽酶能够将多肽裂解成它们各自的组成氨基酸；内肽酶不能做到这一点。
蛋白质水解(即蛋白水解)可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。本公开涉及丝氨酸蛋白酶的用途。丝氨酸蛋白酶使用包含组氨酸残基、丝氨酸残基和天冬氨酸残基的催化三联体来催化肽水解。
丝氨酸蛋白酶活性可以通过多种方法鉴定。生物信息学方法通常用于鉴定丝氨酸蛋白酶序列。也可以使用功能测定。根据本公开，具有丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质可以通过其裂解显色底物N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(AAPF-pNA)的能力来鉴定。存在于AAPF-pNA中的氨基酸序列如SEQ ID NO:17中所示。AAPF-pNA是被大多数丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶G、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和糜酶)裂解的底物。并非所有的丝氨酸蛋白酶都能裂解AAPF-pNA，例如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶不能做到这一点。本文所述的丝氨酸蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶家族，并且因此能够裂解AAPF-pNA。
因此，本文定义的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可以通过其裂解AAPF-pNA的能力来鉴定。裂解反应可以例如如下进行：可以在50mM HEPES(pH 8)的溶液中提供蛋白酶。可以在DMSO中以10mM的浓度提供AAPF-pNA。然后可以将AAPF-pNA溶液以17份缓冲液与1份AAPF-pNA溶液的比例稀释于50mM HEPES缓冲液中，并将混合物在40℃下孵育5分钟。然后可以将适量的酶添加到溶液中，然后可以在40℃下孵育10分钟。适量的酶可以是反应混合物中的最终浓度，例如0.1ppm。
然后可以根据反应混合物在410nm处的吸光度(即其A410值)测量酶活性。可以进行阴性对照反应，其中将不含酶的缓冲液或水代替酶添加到稀释的AAPF-pNA溶液中。如本文所述的丝氨酸蛋白酶可以通过与阴性对照相比，反应混合物的A410的统计学显著增加来鉴定。就缓冲液、温度、时间等而言，以上呈现的测定的细节仅是示例性的，并且可以由技术人员适当地改变。技术人员无需特别说明就能很好地测定推定的蛋白酶的蛋白水解活性，因此，尽管可以如上所述使用测定法，但是可以适当地改变方案。可替代地，根据技术人员的知识和能力，可以使用不同的测定法。
可替代的测定包括基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的测定，其为在280nm的吸光度测量的或使用Folin方法进行比色测量的；以及基于染料标记的偶氮酪蛋白的水解的测定，其为在440-450nm的吸光度测量的。其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward,“Proteinases[蛋白酶]”,在Fogarty(编辑),Microbial Enzymes andBiotechnology[微生物酶与生物技术],Applied Science[应用科学出版社],伦敦,[1983]，第251-317页中)。也可以使用一种使用高标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)酪蛋白作为底物的蛋白酶检测方法，其是由Twining[Twining,S.S.,(1984)“FluoresceinIsothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes”[荧光素异硫氰酸酯标记酪蛋白酶蛋白水解测定]Anal.Biochem.[生物化学年鉴]143:30-34]描述的程序的修改版本。
其他示例性测定包括但不限于：酪蛋白裂解成三氯乙酸可溶性肽(其含有酪氨酸和色氨酸残基)，随后通过与福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂反应并在660nm进行产物的比色检测；内部猝灭的FRET(荧光共振能量转移)多肽底物的裂解，随后使用荧光计检测产物。荧光共振能量转移(FRET)是能量从被激发的荧光团(或供体)非辐射转移到合适的猝灭剂(或受体)分子。FRET用于各种应用中，包括使用底物进行的蛋白酶活性测定，其中荧光团通过含有酶裂解位点的短肽序列从猝灭剂中分离出来。当荧光团和猝灭剂分离时，肽的蛋白水解产生荧光。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]223:119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]242:221-227[1999])。
然而，优选地，使用上述使用AAPF-pNA的测定。
术语“热稳定丝氨酸蛋白酶”意指热稳定的丝氨酸蛋白酶。如本文所使用的，术语“热稳定的(thermostable)”和“热稳定的(heat-stable)”是可互换的。此外，术语“热稳定丝氨酸蛋白酶”和“具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽”也是可互换的。根据本发明，如果多肽未变性并且在大多数多肽会变性并失去其功能的温度下保留其活性，则可以将该多肽定义为热稳定的。特别地，如果多肽在至少50℃或至少60℃的温度下仍能保持其活性，则可以将其定义为热稳定的。优选地，仅当多肽在至少65℃、70℃或80℃或更高的温度下保留其活性时，其才被认为是热稳定的。通常，可通过将酶在升高的温度(例如，至少50℃、60℃、70℃或更高)下孵育一定时间(例如，5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时或3小时或更长时间)来确定热稳定性。在这一点上，热不稳定的酶预期会被变性，因此在此孵育后保留其活性的多肽可被认为是热稳定的。如本文所定义，要被认为是热稳定的，多肽必须在至少50℃或至少60℃(优选至少70℃、75℃或80℃)的温度下孵育至少5分钟、10分钟、20分钟或30分钟(优选至少1小时)之后保留其活性。在至少100℃或110℃的温度下孵育后，所述多肽不必保留其活性。
为了使多肽如本文所定义“保持其活性”，在上述孵育后，其必须保留其活性的至少50％，优选其活性的至少60％、70％、80％或90％。相对于基线活性水平，测量多肽孵育后的活性，以计算保留的活性的比例。该基线活性可以对应于在被鉴定为多肽活性最佳的温度(即，多肽活性最高的温度)下多肽的活性水平。这样的最佳温度可以是例如50℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃或更高，并且可以由技术人员确定。技术人员将能够不费力气地确定用于获取基线读数的合适条件。
在此，所述多肽的相关活性是丝氨酸蛋白酶活性。如本文所定义的多肽的丝氨酸蛋白酶活性可以如上详述地使用以AAPF-pNA为底物的蛋白水解测定法或使用本领域已知的任何其他合适的测定法来测量。
术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。术语“动物”包括人类和非人类动物。如本文所指，动物可以是非反刍动物(例如人)或反刍动物(例如牛、绵羊或山羊)。在一个特定的实施例中，所述动物是非反刍动物，例如单胃动物或马。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、和母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、和下蛋鸡(即饲养以下蛋的禽类)；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。根据本发明的反刍动物的实例包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
如本文所使用的术语“病原体”意指任何疾病的致病物。这样的致病物可以包括但不限于细菌、病毒、真菌致病物等。
如本文所使用的“饲料”和“食品”意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其旨在或适合于分别被非人类动物或人类食用、消耗、摄取、或消化。关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。
术语“食物产品”还涵盖食品或饲料的任何组分或成分、食品或饲料所基于的任何预混物等、以及在由动物消耗前添加到食品或饲料中的任何补充剂、添加剂等。因此，食物产品可以理解为涵盖动物食用或消耗的任何产品，包括作为独立食品或饲料食用或消耗的产品以及作为更复杂的食品或饲料的一部分食用或消耗的产品。
术语“使液化”、“液化”、“液化物”及其变体是指将淀粉转化为可溶性糊精化底物(例如较小多糖)的方法或产物。
“液化物”可以称为“醪液”，或者也可以称为可溶性淀粉底物或液化的底物。在一些情况下，它可以是含有热稳定α淀粉酶的完全碾磨的谷物浆料，所述浆料已经经受高温液化，以产生用于糖化和发酵或同时糖化和发酵(SSF)的可溶性底物。高温是高于谷物多糖的糊化温度的温度。
术语“经研磨”在本文中用于指已经进行尺寸减小的植物材料(例如通过碾磨、粉碎、分馏或任何其他粒度减小的手段)。研磨包括干磨或湿磨。“干磨”是指完整干燥谷物的研磨。“湿磨”是指其中首先将谷物浸泡(浸透)在水中以软化谷物的过程。
术语“水解”是指化合物通过与水反应而分解的化学反应或过程。淀粉消化酶将淀粉水解成较小的单元，即较小的多糖。
术语“木质纤维素”是指包含木质素和纤维素二者的组合物。其还可以含有半纤维素。
术语“木质纤维素生物质”是指任何木质纤维素材料，并且包括包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可以包含另外的组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可衍生自单一来源，或者生物质可包括衍生自多于一种来源的混合物；例如，生物质可以包含玉米芯和玉米秸秆的混合物，或者草和叶的混合物。木质纤维素生物质包括但不限于生物能源作物、农业残余物、城市固体废物、工业固体废物、来自纸张生产的淤渣、庭院废物、木材和林业废物。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余物，例如玉米壳、玉米秸秆、草(包括芒草属(Miscanthus))、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱材料、大豆植物材料、从谷物的研磨或在生产过程中使用谷物得到的组分(如DDGS：干酒糟及可溶物)、乔木、树枝、根、叶、木片、锯屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、棕榈空果串(empty palm fruit bunch)、和能源甘蔗。术语“能源甘蔗”是指培育用于在能源生产中使用的甘蔗。其因为比糖更高百分比的纤维而被选择。
术语“预处理的木质纤维素生物质”是指在糖化之前已经经受物理、热和/或化学处理的生物质。术语“氨预处理的木质纤维素生物质”是指至少已经经受采用氨的预处理过程的生物质。在一个实施例中，氨预处理是低氨预处理，其中使生物质与包含氨的水溶液接触以形成生物质-氨水混合物，其中氨浓度足以保持所述生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于生物质的干重为小于约12重量百分比，并且其中生物质的干重相对于所述生物质-氨水混合物的重量为至少约15重量百分比固体，如美国专利号7,932,063(将其通过引用并入本文)中所公开的。
术语“木质纤维素生物质水解产物”是指由木质纤维素生物质的糖化产生的产物。生物质也可以在糖化之前进行预处理或预加工。术语“糖化”和“进行糖化”是指使用酶将多糖转化为右旋糖单体的方法。糖化可以指液化物中多糖的转化。糖化产物是例如葡萄糖和其他小(低分子量)低聚糖，如二糖和三糖。
术语“SSF”是指同时糖化和发酵。
术语“酶混合物”是指至少两种不同酶的混合物或组合，这使得酶对任何催化反应更有效率并且更有效。
术语“发酵”或“进行发酵”是指从还原的植物材料转化糖以产生发酵产物的过程。
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体的发酵步骤的方法产生的产物。
术语“副产物”是指衍生自制造过程或化学反应的次级产物。它不是生产的主要产物或服务。
术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然发生的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关联的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换地使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非-天然的或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段构成。
术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
如本文所使用的，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然存在的微生物的来源。特别地，可以将DFM作为食品或饲料所针对的动物的天然存在的活微生物的来源添加到食品或饲料中。DFM可以包含一个或多个这样的天然存在的活微生物，特别是细菌或真菌菌株。DFM的类别包括芽孢杆菌属细菌、乳酸菌和酵母。因此，术语DFM涵盖以下中的一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母及其组合。
DFM尤其可以包含孢子形式的杆菌。芽孢杆菌在某些环境条件(通常是由例如营养不足引起的应激)下形成孢子。此类孢子在代谢上是无活性的，并且能够承受极端的环境条件，例如酷热和高低pH。此类孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞。芽孢杆菌孢子可用于粗粉和压成丸粒的(pelleted)食物产品中。此类孢子当然应该是芽孢杆菌的非致病性物种和菌株。
乳酸菌是许多菌株和属的革兰氏阳性细菌，它们产生乳酸作为碳水化合物代谢的主要终产物。食物产品中乳酸菌的存在被认为对致病性细菌种类的生长具有拮抗作用。乳酸菌能够在低pH值下生长，但往往对热敏感，这意味着它们可能不适合包含在压成丸粒的食物产品中。乳酸菌的类型包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)的物种。
术语“益生元(prebiotic)”意指通过在消耗所述益生元的动物中选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主的不可消化食物成分。特别地，益生元可以在消耗所述益生元的动物的肠道微生物群落中选择性地刺激有益细菌物种的生长和/或活性。有益细菌是指细菌的物种，其在动物中，特别是在动物的肠道微生物群落中的生长对该动物有益。特别地，此类细菌可以有益于动物消化系统的功能和/或健康(例如，防止生态失调或肠道定殖有致病性物种)、动物的新陈代谢(例如，它们可以促进动物的健康生长)和/或动物免疫系统的功能。特别地，益生元可以在消耗益生元的动物的肠道中增加双歧杆菌和乳酸菌的活性量。
如本文所使用的，术语“益生菌培养物”是指当例如以足够数量摄取或局部应用时，有益地影响受体生物体(例如通过赋予宿主生物体一个或多个可证明的健康益处)的活的微生物(包括例如细菌或酵母)的培养物。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所使用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少106-1012，优选至少106-1010，优选108-109个集落形成单位(cfu)作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。益生菌可以特别地包括双歧杆菌属的细菌和乳酸菌(例如乳杆菌属的细菌)。酵母属(Saccharomyces)的酵母当被动物消耗时也可以具有有益的作用，因此可以包括在益生菌中。
术语“集落形成单位”(CFU)是活细胞数量的度量，其中集落代表衍生自单个祖细胞的细胞聚集体。
蛋白原(proprotein或pro-protein)或酶原(proenzyme或pro-enzyme)是蛋白质或酶的未成熟形式。蛋白原不包含信号肽(在没有信号肽的情况下编码或在信号肽裂解后剩余的多肽序列)。蛋白原或酶原在一个或另一个末端(即其N-末端或C-末端)包含氨基酸序列，该序列对于蛋白质的正确折叠和/或分泌是必需的，或用于维持无活性形式或类似形式的蛋白质或酶。该氨基酸序列在本文中被称为酶原。蛋白原或酶原通过裂解而转化成其成熟形式，所述裂解将成熟的、活性蛋白序列与其前肽片段(前结构域)分开。蛋白酶通常表示为酶原，其仅当通过裂解去除前肽而转化为成熟形式时才被激活。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟形式或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列，即标记用于分泌的多肽的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的(由前体蛋白的基因天然编码的信号序列)或外源的(作为不同基因序列的一部分天然编码的信号序列，或人工信号序列)。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质裂解。前酶原或前体多肽是由信号序列、前肽和成熟序列组成的翻译产物。
具有信号序列的蛋白质被称为前蛋白原或前酶原。在某些情况下，信号序列的裂解可以产生蛋白质的成熟形式。以具有信号序列的蛋白原形式合成的蛋白被称为前蛋白原(或在酶的情况下为前酶原)。从前蛋白原裂解信号序列留下了蛋白原，随后可以对其进行进一步加工以产生成熟蛋白。
如本文所使用的，蛋白质或多肽的“成熟”形式是已从中裂解信号序列和/或前肽片段的蛋白质、多肽或酶的功能形式。成熟蛋白不包含信号序列或前肽片段。前蛋白和前蛋白原(即，包含信号序列或前肽片段的任何多肽)通常可以称为前体蛋白。
在本发明的多肽的情况下，成熟的TnaPro1酶(即不含信号(“前(pre)”)序列且不含前结构域(“原(pro)”)序列的酶的活性形式)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；“蛋白原”的氨基酸序列(即没有信号序列但具有“原”序列)如SEQ ID NO:8所示，在该评估中表达的全长前体TnaPro1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，而在鹦鹉螺嗜热球菌(Thermococcus nautili)中鉴定的全长前体TnaPro1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”(或“非天然的”)是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。
本领域技术人员将认识到，在保留与公开的氨基酸序列相关联的功能的同时，可以对本文公开的氨基酸序列进行修饰。例如，基因的改变导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性是常见的，这是本领域所熟知的。例如，本文公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸都可以替代另一种功能上等价的氨基酸。出于本公开的目的，功能上等价的氨基酸是指属于以下五个组中的同一组的氨基酸：
1.小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
2.极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；
4.大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys；以及
5.大的芳香族残基：Phe、Tyr、和Trp。
在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。
术语“密码子优化的”是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，其中核酸分子的基因或编码区中存在的密码子被改变以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽的序列。如本领域普通技术人员将认识到的，由于核酸密码的简并性质，此类密码子改变是可能的。核酸序列的此类修饰可以使用本领域普通技术容易地实现。
术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含没有在自然界中一起发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
根据该定义，应当理解，如本文所述的重组构建体可以被视为包含或代表嵌合基因。特别地，嵌合基因(其也可以被定义为嵌合核苷酸序列)包含编码热稳定丝氨酸蛋白酶的编码核苷酸序列，调控序列与所述编码核苷酸序列连接(更特别地是有效地连接)或以自然界中不存在的方式与之连接。
术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列有效地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。
术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换地使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列能以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列。
“启动子”或“启动子序列”是指定义RNA聚合酶在何处开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5′末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。
“3′非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。
如本文所使用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
如本文所使用的，术语“重组”是指两个或更多个另外分开的核酸序列的人工组合。所述两个或更多个核酸序列可以通过例如化学合成或使用遗传工程技术操纵分离的核酸或核酸片段而组装在一起。所述两个或更多个核酸序列可以是天然序列、人工序列或两者的组合。经人工操纵(例如重新排列分子中的序列、改变分子的序列、合并来自两个或多个不同分子的序列、合并两个或多个不同分子的序列、从分子中去除一个或多个序列或任何其他序列操纵、或以上的任何组合)的DNA是重组DNA分子。因此，包括本发明的重组构建体的重组DNA序列具有自然界中未发现的序列。引入了重组DNA分子(或重组构建体)的生物体是重组生物体。关于生物体，术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“经修饰用于外源基因表达”在本文中可互换使用。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换地使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法、以及该转化的目的。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化、选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可以导致不同水平和模式的表达(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol GenGenetics[分子和普通遗传学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件，从而获得显示所需表达水平和模式的品系。此类筛选可以使用标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定来完成，这些测定包括DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。
术语“载体”是指用作将外来遗传物质引入细胞的媒介物的DNA分子。载体可以例如是克隆载体或表达载体。载体包括质粒，自主复制序列，转座元件，噬菌粒，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或PI衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或Ml 3噬菌体，以及动物病毒。载体可以是基因组整合序列，或者可以染色体外地保持在细胞中。它可以是线性或环状的，并且包含单链或双链DNA或RNA或由其组成。
“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。
表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始对照的基因的5′区和控制转录终止的DNA片段的3′区。两个对照区都可以衍生自与生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要如此衍生。
可以包含在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱动基因表达的启动子都是合适的，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属(Pichia)中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)以及用于在芽孢杆菌中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。所述启动子应适合于驱动相关基因在待使用的生产宿主中表达。所述启动子可以是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型或阻抑型的，原因是环境因素的变化，这些环境因素包括但不限于碳、氮或其他可利用的营养素、温度、pH值、渗透压、一种或多种重金属的存在、抑制剂的浓度、应力或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一些实施例中，诱导型或阻抑型的启动子是通过代谢因素诱导或抑制的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代谢物的水平、或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一个实施例中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉为宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子，例如cbh1启动子，其保藏在GenBank中的登录号D86235下。
合适的启动子的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1、和xyn2，产黄青霉菌(P.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见例如Graessle等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-756)，葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如Leuker等人，(1997),Gene[基因],192:235-240)，麦芽糖诱导型、葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人，(2006),Eukary.Cell[真核细胞],5:638-649)，pKi启动子和cpc1启动子。其他有用启动子的实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人，(1984)Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见例如EPA 137280Al)。
控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。
术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，包括原核细胞，例如细菌细胞，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入或转化以表达基因。因此，“宿主细胞”可以是任何合适的真核或原核宿主细胞，但通常是微生物宿主细胞，例如，原核宿主细胞或真菌(例如酵母)细胞、或哺乳动物细胞或细胞系。在生产宿主是生物体(而不是分离的或培养的宿主细胞或细胞系)的情况下，则在一个特定的实施例中，所述生物体是非人类生物体或非哺乳动物生物体，最特别地，所述生物体是微生物。术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。
“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体，包括转移至宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。含有经转化的核酸的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。
所述表达载体可以引入所述宿主细胞中，特别是微生物宿主的细胞中。所述宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。
在将所述表达载体引入所述宿主细胞后，可以表达多肽，使得其驻留于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。如果蛋白质是跨膜蛋白质，则它可能驻留在细胞膜内。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使从生产宿主的培养物中回收所需蛋白质更容易。被表达使其驻留在细胞膜内的蛋白质很难回收。
如本文所使用的，术语“表达”是指呈前体或成熟形式的、基因的终产物(例如，功能性RNA分子或蛋白质)的产生。因此，蛋白质编码基因的表达是指基因的转录和所得mRNA的翻译以产生蛋白质。
术语“百分比(％)同一性”和“百分比(％)序列同一性”是指如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑),牛津大学出版社[OxfordUniversity Press],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组工程](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第一部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](vonHeinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；和Sequence Analysis Primer[引物序列分析](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。
如本文所使用的，“％序列同一性”或“百分比序列同一性”是指蛋白质或核酸序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic AcidsRes[核酸研究]，25:3389-3402,1997；以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参考”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参考”序列称为“查询”序列。
如本文所使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,MillerW,Lipman DJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein databasesearch programs.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]NucleicAcids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。
可以使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人，Nucleic AcidsRes[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。
作为某些方面的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，某些实施例中的变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。
关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参考多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。
已经鉴定了来自古细菌鹦鹉螺嗜热球菌的丝氨酸蛋白酶的工业用途。所述蛋白酶已被命名为TnaPro1。所述TnaPro1基因具有SEQ ID NO:1所示的序列。由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列(对应于TnaPro1酶的全长序列)在SEQ ID NO:2中示出。SEQ ID NO:1的DNA序列对应于NCBI参考序列：NZ_CP007264.1，碱基1327825-1329105，互补。SEQ ID NO:2的氨基酸序列是GenBank登录号：AHL23118.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2所示的全长TnaPro1序列对应于前酶原，即它既包含信号序列又包含酶原片段。全长TnaPro1的N-末端26个氨基酸(即SEQ ID NO:2的氨基酸1-26)构成了预测的信号肽。预测的TnaPro1信号肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中示出；天然编码TnaPro1信号肽的DNA序列在SEQ ID NO:9中示出。TnaPro1酶原，即信号肽裂解后的TnaPro1蛋白，具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，它对应于SEQ ID NO:2的氨基酸27-426。天然编码TnaPro1酶原的DNA序列在SEQ ID NO:7中示出。
天然编码TnaPro1酶原片段的DNA序列在SEQ ID NO:11中示出。将酶原片段从TnaPro1酶原上裂解下来，以产生成熟、活性形式的酶。所述酶的成熟形式具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸102-426。天然编码成熟形式的TnaPro1的DNA序列在SEQ ID NO:6中示出。
因此，可以看出提供活性丝氨酸蛋白酶所需的TnaPro1的最小部分是单独地具有SEQ ID NO:3所示的，或者是N-末端和/或C-末端添加了约3个氨基酸和/或N-末端和/或C-末端缺失了约3个氨基酸的序列的成熟形式。
因此，在一个实施例中，描述了重组构建体，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列，其中所述编码核苷酸序列与至少一个在生产宿主中起作用的调控序列有效地连接，并且所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少92％氨基酸序列同一性的多肽；
并且其中所述调控序列对于所述编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和所述编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。
在第二个实施例中，本文所述的任何重组构建体的编码核苷酸是编码具有SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
在第三个方面，所述编码核苷酸序列选自由以下组成的组：
i)编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少86％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列；或
ii)编码具有SEQ ID NO:5或14所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少84％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
此外，至少一个调控序列包含启动子。
“所述调控序列与所述编码核苷酸序列是异源的”是指所述调控序列不与所述编码序列一起出现于自然界中。换句话说，其不是像存在于天然鹦鹉螺嗜热球菌细胞中一样在TnaPro1基因中存在的天然调控序列，或者替代地，它不是天然内源基因中与所述编码序列一起存在的调控序列。仍然不同的是，它不是TnaPro1基因的天然内源调控序列。在一个特定的实施例中，所述调控序列是从与获得所述编码核苷酸序列的物种不同的物种获得的。所述编码核苷酸序列是TnaPro1基因或其变体。如上所述，TnaPro1由鹦鹉螺嗜热球菌天然编码。因此，与所述编码核苷酸异源的调控序列可以是从鹦鹉螺嗜热球菌以外的物种获得的调控序列，或者是人工调控序列。
对于不以自然界中发现地那样排列的调控序列和编码序列而言，仅意味着重组构建体中的调控序列和编码序列与鹦鹉螺嗜热球菌中的TnaPro1基因的排列不同。因此，如果丝氨酸蛋白酶的编码序列与来自不是鹦鹉螺嗜热球菌的物种的调控序列有效地连接，则将必然地满足该要求。然而，不要求调控序列来自不同于鹦鹉螺嗜热球菌的物种。它可以是来自鹦鹉螺嗜热球菌的调控序列，其天然调节不同基因(即不是TnaPro1的基因)的表达，例如，管家基因，例如RNA聚合酶等。可替代地，在本发明的重组构建体中，所述丝氨酸蛋白酶编码序列可与对于TnaPro1基因天然的调控序列(例如TnaPro1启动子)有效地连接，使得调控序列和编码序列的排列与自然界中发现的排列不同。所述排列可以在调控序列的序列上不同，例如，天然的TnaPro1启动子可以被改变，以改变例如增强其活动性。可替代地，调控序列和编码序列之间的间隔可以不同于自然界中发现的间隔。
调控序列可以是对于表达丝氨酸蛋白酶多肽必需或有利的任何序列，即它可以是任何表达控制序列。这种调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽片段序列、启动子序列、信号序列和转录终止子。
在本发明的一个优选实施例中，与编码丝氨酸蛋白酶的编码序列有效地连接的至少一个调控序列包含启动子。如本文所定义，所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。此类启动子可以特别是被细菌宿主细胞或特定或具体的细菌宿主细胞或宿主细胞群识别的启动子序列。在一个特定的实施例中，所述启动子可以源自芽孢杆菌宿主细胞或被芽孢杆菌宿主细胞识别。启动子区可包含单个启动子或启动子的组合。当启动子区包含启动子的组合时，启动子优选地串联。启动子区的启动子优选地是可以引发编码在目的芽孢杆菌属宿主细胞中具有生物活性的多肽的多核苷酸的转录的启动子。此类启动子可以特别地从天然芽孢杆菌基因，特别是天然枯草芽孢杆菌基因获得，其指导具有生物学活性的多肽的表达。所述调控序列还可以或可替代地包含终止子、操纵子序列或本文定义的任何其他调控序列。
因此，在某些实施例中，与编码丝氨酸蛋白酶的编码序列有效地连接的至少一个调控序列包含从细菌来源获得的启动子。可能的细菌来源包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于以下属的那些：芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)和以下属的那些：假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria和脲原体属(Ureaplasma)。启动子区可包含获得自芽孢杆菌属物种或菌株(例如，粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradherens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))的启动子；或获得自链霉菌属菌株(例如，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))的启动子。
用于在本公开的方法中指导编码具有生物活性的多肽的多核苷酸转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(B.thuringiensis subsp.tenebfionis)CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分、原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA[美国科学院院报]75:3727-3731)、和巨大芽孢杆菌xylA基因(Rygus和Hillen,1992,J.Bacteriol.[细菌学杂志]174:3049-3055；Kim等人,1996,Gene[基因]181:71-76)。其他实例是spo1细菌噬菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等人,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]80:21-25)。另外的启动子描述于在Scientific American[科学美国人]中的“Useful proteins fromrecombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”,1980,242:74-94；和Sambrook,Fritsch和Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册]，第2版，冷泉港，纽约州。优选的启动子是野生型枯草芽孢杆菌aprE启动子、突变型aprE启动子或共有aprE启动子，如PCT国际公开号WO 2001/51643中所阐述。其他的启动子包括野生型枯草芽孢杆菌spoVG启动子、突变型spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber,1991)。
所述启动子可以是核糖体启动子，例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白启动子。核糖体RNA启动子可以是衍生自枯草芽孢杆菌的rrn启动子，更具体地，rrn启动子可以是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中，核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO 2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2 rrnI启动子。
启动子区可以包含是“共有”启动子的启动子，所述启动子具有针对“-35”区的序列TTGACA和针对“-10”区的TATAAT。共有启动子可以从任何可以在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的启动子获得。“共有”启动子的构建可以通过使用本领域熟知的方法进行定点诱变来完成，以产生更完美地符合所建立的共有序列的启动子，所述共有序列是针对枯草芽孢杆菌的营养“σA型”启动子的“-10”和“-35”区(Voskuil等人,1995,Molecular Microbiology[分子微生物学]17:271-279)。
与编码丝氨酸蛋白酶的编码序列有效地连接的至少一个调控序列还可以或可替代地包含合适的转录终止子序列，例如被细菌宿主细胞(例如芽孢杆菌宿主细胞)识别以终止转录的序列。终止子序列与编码热稳定丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的3′末端有效地连接。优选地，可以使用在芽孢杆菌宿主细胞或大肠杆菌宿主细胞中有功能的终止子。
调控序列(也可以称为控制序列或表达控制序列)也可以是或包括合适的前导序列、对于宿主细胞(尤其是细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌宿主细胞或大肠杆菌宿主细胞)进行的翻译很重要的mRNA的非翻译区。前导序列与核苷酸序列的5′末端有效地连接，从而指导具有生物活性的多肽的合成。在所选宿主细胞(例如，微生物、细菌或芽孢杆菌宿主细胞)中有功能的任何前导序列都可用于本发明中。
所述至少一个调控序列还可以或可替代地包含mRNA稳定序列。术语“mRNA稳定序列”在本文中定义为位于启动子区下游和编码热稳定丝氨酸蛋白酶的多核苷酸编码序列上游的序列，其中启动子区与其有效地连接，使得可以加工从启动子区合成的所有mRNA以产生在转录物的5′末端具有稳定序列的mRNA转录物。例如，在mRNA转录物的5′末端存在这种稳定序列会增加它们的半衰期(Agaisse和Lereclus,1994，同上，Hue等人,1995,Journalof Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3′端互补。在某些实施例中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在转录物的5′末端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地与细菌16S核糖体RNA的3′端互补。参见，美国专利号6,255,076和美国专利号5,955,310。
可以提供带接头的调控序列以引入的特定的限制性位点便于调控序列与编码热稳定丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的编码区连接。在本发明的重组构建体中，编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列可以有效地连接到一个或多个能够在与调控序列相容的条件下指导编码序列在宿主细胞(例如芽孢杆菌宿主细胞，特别是枯草芽孢杆菌细胞)中表达的调控序列。
重组构建体中的热稳定丝氨酸蛋白酶编码序列编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽或与其具有至少92％序列同一性的多肽。在特定的实施例中，对编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列进行密码子优化，以在非天然宿主细胞中表达所述核苷酸序列。特别地，可以对所述核苷酸序列进行密码子优化以在原核生物如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中表达。利用克隆方法对核酸序列进行修饰的技术是本领域中众所周知的。
在特定的实施例中，由本发明的重组构建体的编码序列编码的具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽以酶原的形式编码。酶原的酶原片段可以在其N-末端或在其C-末端编码。优选地，所述酶原片段位于酶原的N-末端。
在本发明的一个特定的实施例中，所述重组构建体的编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少70％、75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
在该特定的实施例中，所述酶原是天然的TnaPro1酶原或其变体。在TnaPro1酶原的任何变体中，有必要从成熟酶序列中裂解酶原片段。因此，优选地，在SEQ ID NO:7的任何变体或编码SEQ ID NO:8的变体的核苷酸序列中，编码酶原裂解位点的序列未改变，或者至少其编码的序列未改变，使得从构建体表达的酶原中的裂解位点保持不变并被识别以用于裂解，因此所述酶原可以被正确地加工成其活性成熟形式。
由本文描述的重组构建体的编码序列编码的具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽可以被编码，使得其包含信号肽，即被编码为前酶或前酶原。优选地，具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽被编码为前酶原，所述前酶原从N-末端至C-末端包含信号肽、酶原片段和成熟酶序列。优选地，所述酶原序列是如上所定义的。在该实施例的一个方面，所述信号序列是天然TnaPro1蛋白的信号序列，即它具有SEQ ID NO:10所示的多肽序列。因此，在一个实施例中，本发明的重组构建体中的编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
然而，信号序列可以替代地是来自任何其他基因或生物体的信号序列，或者是人工信号序列。特别地，所述信号序列可以是对宿主细胞天然的信号序列，在所述宿主细胞中将表达具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽。例如，信号序列可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌信号序列。此类信号序列是众所周知的，并且对于本领域技术人员而言是容易获得的。在本发明的一个特定的实施例中，具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽被编码为前原酶，其中所述酶原序列是TnaPro1酶原序列或是其变体(即重组构建体的编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列)，并且其中所述信号序列是枯草杆菌AprE信号序列。AprE是对枯草芽孢杆菌天然的丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E。AprE信号序列具有SEQ ID NO:16所示的多肽序列，并由SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列天然编码。具有AprE信号序列和天然TnaPro1酶原序列的TnaPro1前酶原具有SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列天然编码(在这种特定情况下，天然编码表示基因由AprE信号序列的天然编码序列和TnaPro1酶原的天然编码序列组成)。
以下实例描述了蛋白质的表达，其中AprE信号序列通过3-氨基酸(AGK)间隔子与天然TnaPro1酶原序列分开，所述间隔子是由于将编码序列连接到表达载体p2JM103BBI而引入的。该蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5中，其编码核苷酸序列示于SEQ ID NO.4中。
因此，在一个特定的实施例中，本文所述的重组构建体中的编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:5或14所示氨基酸序列的多肽或与其具有至少70％、75％、80％、8`％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
在其他实施例中，所述信号序列可以是在所希望的宿主细胞(例如芽孢杆菌宿主细胞)中有效的任何信号序列。其实例包括从以下获得的信号肽编码区：来自芽孢杆菌NCIB11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。
因此，在某些实施例中，所述编码序列可以编码没有信号序列(即，没有“前”序列)并且优选还没有“原”序列的成熟丝氨酸蛋白酶。在这样的实施例中，所述编码核苷酸序列可以由以下组成：(i)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或与其具有至少92％序列同一性的核苷酸序列，或(ii)编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽或与其具有至少92％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。可替代地，所述编码序列，或更具体地，所述重组载体，可包含(i)或(ii)的核苷酸序列，但不包含任何来自SEQ ID NO:1(侧翼或紧邻于SEQ IDNO:6的序列)的另外的核苷酸序列，或任何另外编码来自SEQ ID NO:2(侧翼或紧邻于SEQID NO:3的序列)的任何氨基酸序列的核苷酸序列。换句话说，所述重组构建体可以仅包含编码成熟多肽的编码序列，并且不包括编码来自SEQ ID NO:2的前序列、原序列或前原序列或与SEQ ID NO:2的前序列、原序列或前原序列具有至少86％序列同一性的前序列、原序列或前原序列。
如果编码核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的变体、或编码SEQ ID NO:2、5或14的变体、或编码前酶原的变体，其中信号序列既不是TnaPro1也不是枯草芽孢杆菌aprE信号序列(例如，所述信号序列是上面列出的信号序列之一，或者是可替代的非天然信号序列)，则优选的是不仅编码所述酶原裂解位点的序列未发生改变，或者至少其编码的序列未发生改变，使得由构建体表达的酶原中的裂解位点未发生改变并被识别以裂解，并且编码信号序列裂解位点(即所述位点被信号肽酶裂解以从前蛋白中除去信号序列)的序列也未发生改变，或者至少其编码的序列未发生改变，因此被信号肽酶识别以允许对前蛋白进行适当的加工。
本文所述的构建体中编码的丝氨酸蛋白酶可以优选地用亲和标签编码以提高纯化的容易性。此类标签优选位于蛋白酶的末端。如果蛋白酶被编码为在其N-末端具有信号序列和/或酶原片段的酶原或前酶原，则所述蛋白酶优选在其C-末端被编码亲和标签。合适的标签是本领域熟知的，并且包括多组氨酸标签、链球菌(strep)标签、FLAG标签、HA标签等。
在另一个实施例中，还公开了包含本文所述重组构建体的载体。所述载体可以是本文定义的任何载体，包括它可以是克隆载体或表达载体。载体可以是能被引入(例如，转化到)宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。优选地，所述载体是质粒。本发明的载体优选地适合用于细菌中，特别是用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中。用于这些物种和其他特定物种的合适载体是本领域众所周知的。
合适的载体可以包含如上所述的调控序列，例如，一种或多种启动子、终止子或前导序列等。合适的载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。
合适的载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
因此合适的克隆载体典型地包括允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测的标记。适用于细菌特别是大肠杆菌的通用克隆载体的实例包括pUC19、pBR322、pBluescript载体(Stratagene公司(Stratagene Inc.))和来自英杰公司(Invitrogen Inc.)的pCR例如pCR2.1-TOPO。
合适的表达载体典型地以与克隆载体相同的方式包括允许载体在选择的生产宿主或宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包含控制核苷酸序列，例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。
表达载体还可以包含用于将亲和标签框内地(in-frame)融合到目的基因的序列中的序列，从而使编码的蛋白质与在一个或另一个末端处的这种标签一起产生。上面给出了可以在本发明中使用的亲和标签的实例。适用于细菌的表达载体的实例尤其包括那些衍生自pET家族的载体，例如pET3a、pET3b、pET3c、pET3d、pET12a、pET14b、pET15b、pET16b、pET28a和pET28c；pBAD家族的载体，例如pBAD/HisA、pBAD/HisB和pBAD/HisC；以及pGEX家族的载体，例如pGEX-3X、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3。另一个代表性的细菌表达载体是p2JM103BBI。适合于酵母的表达载体尤其包括那些衍生自pAG家族的载体，例如pAG423型载体、pAG424型载体、pAG425型载体、pAG426型载体和pAG303型载体；pRG家族的载体，例如pRG206、pRG221、pRG227和pRG236；以及pYC家族的载体，例如pYC48、pYC50、pYC55和pYC64。如果技术人员希望构建本发明的克隆载体或表达载体，则他或她将能够基于上述考虑选择合适的载体主链。用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件，并将它们插入到含有复制必需信息的合适载体中的方案是本领域技术人员熟知的。
进一步提供了包含本文定义的重组构建体或载体的生产宿主或宿主细胞。所述宿主细胞优选是非天然宿主细胞，即不是TnaPro1所源自的物种的宿主细胞，即优选不是鹦鹉螺嗜热球菌细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选地，它是微生物的细胞。所述宿主细胞可以是细菌(其意指真细菌的)细胞、古细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、哺乳动物细胞或任何其他类型的细胞。所述细胞不位于动物体内。当所述宿主细胞是细菌细胞时，它可以来自革兰氏阳性或革兰氏阴性物种。优选地，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。所述宿主细胞可以来自嗜热原核生物，例如嗜热细菌或嗜热古细菌。如果宿主细胞是真菌细胞，则它可以是丝状真菌的细胞或酵母细胞，特别是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)物种的细胞。
上文已描述了将核苷酸序列(例如构建体和载体)引入细胞的方法，并且其是本领域众所周知的，鉴定已引入这类构建体的细胞的方法也是如此。本发明的宿主细胞可以使用任何此类适当方法获得，例如转化，然后使用诸如抗生素抗性等标记进行阳性选择。细菌的转化和表达方法公开于Brigidi等人(1990)。Ferrari等人(美国专利号5,264,366)描述了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的一般转化和表达方案。将DNA引入细胞中的其他方法包括：电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂质转染介导的转染和DEAE-糊精介导的转染)；用磷酸钙DNA沉淀物孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；基因枪(gene gun)或生物射弹转化和原生质体融合等。公开了可以使用的一般方法的基本文献包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法](1994))。
将核酸转化为丝状真菌(例如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)、灰腐质酶(Hylarana grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)和里氏木霉(Trichoderma reesei))的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如EP 238023中。用于转化木霉属(Trichoderma)宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人,2011,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121中。
许多标准转染方法可以用于产生表达大量蛋白酶的细菌和丝状真菌(例如曲霉属或木霉属)细胞系。一些用于将DNA构建体引入木霉属的产纤维素酶菌株的公开的方法包括Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,(1990)Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-174；以及Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人,“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes”[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用],在Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学]中,编辑Leong和Berka,MarcelDekker Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992)第129-148页；对于曲霉属，包括Yelton,Hamer和Timberlake,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]81:1470-1474；对于镰孢菌属，包括Bajar,Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:8202-8212；对于链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,Genetic Manipulationof Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册],The JohnInnes Foundation[约翰·英尼斯基金会],诺威奇,英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生物学]149:1623-1632(2003)；以及对于芽孢杆菌属，包括Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138)。
然而，可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，Sambrook等人，同上)。还使用的是美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。
包含在本文所述的宿主细胞中的本发明的构建体或载体可以被稳定地整合到宿主细胞的染色体中，从而使得所述构建体或载体的遗传物质能够在宿主的世代之间进行无选择的转移。将DNA构建体或载体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。例如，PCT国际公开号WO 2002/14490描述了芽孢杆菌转化的方法、其转化体及其文库。
可替代地，可将构建体或载体维持在宿主细胞中染色体外，以使其不整合入染色体。与将构建体或载体整合入生物体的染色体相比，构建体或载体的染色体外维持可能较不稳定，这需要不断选择以确保构建体或载体在宿主细胞繁殖期间不会丢失。如技术人员众所周知的，质粒的稳定整合或染色体外维持各自对于某些目的可能是有益的。
本发明提供了用于产生热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
i)将本发明的构建体或载体引入宿主细胞；以及
ii)在产生热稳定丝氨酸蛋白酶的条件下，培养步骤(i)产生的宿主细胞。
所述宿主细胞可以是如上所定义的任何宿主细胞。优选其是细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。在特定的实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。
可以使用任何如上所述用于将核苷酸序列(例如DNA)引入宿主细胞的方法，将构建体或载体引入宿主细胞。优选地，通过转化将构建体或载体引入宿主细胞。
“培养”意指使宿主细胞生长，使其复制。用于培养细胞的方法是本领域众所周知的。例如，所述宿主细胞可以在生理温度(约37℃)或对于细胞生长和分裂最适的温度下在富集培养基(即富含营养素的培养基)中生长。根据用作宿主的细胞的类型，可在培养期间摇动培养基以确保培养基的通气，例如，可以使用摇动培养箱。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。
“产生热稳定丝氨酸蛋白酶的条件”是指可以检测到热稳定丝氨酸蛋白酶表达的条件。检测可以是蛋白质的直接检测，例如蛋白质印迹。可替代地，可以直接检测蛋白酶mRNA，例如通过RT-PCR，但是优选的是直接检测蛋白质。可替代地可以通过其功能进行检测。上文描述了确定或鉴定丝氨酸蛋白酶活性的测定。如果包含本文所述的构建体或载体的宿主细胞的培养物的蛋白水解活性在统计学上显著高于对照细胞的培养物的蛋白水解活性，则可以说丝氨酸蛋白酶被表达。合适的对照细胞包括未引入构建体或载体的生产宿主细胞株的野生型细胞，或已引入空载体的生产宿主细胞株的细胞。“空载体”是指没有克隆本发明的构建体的本发明载体的主链。因此，空载体可包含本文所述载体的所有调控序列或控制序列和标记，但不编码具有蛋白酶活性，特别是丝氨酸蛋白酶活性的多肽。
如果由本文公开的构建体或载体编码的丝氨酸蛋白酶用信号肽编码，使得其从宿主细胞分泌，则可以在培养物上清液中检测其活性。如果丝氨酸蛋白酶在没有信号肽的情况下编码并因此不能从宿主细胞中分泌出来，则有必要收获并裂解宿主细胞，并尝试检测其裂解物中的丝氨酸蛋白酶活性。优选地，所述丝氨酸蛋白酶由信号肽编码并从细胞分泌。
丝氨酸蛋白酶的表达可以是组成型或诱导型的，这取决于所使用的启动子。如果启动子是组成型的，则蛋白酶在基本上所有生长条件下都能连续表达。如果启动子是诱导型的，则需要刺激来诱导表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松、阿拉伯糖、IPTG或槐糖来启动蛋白质生产，这取决于所使用的表达系统。
取决于所使用的宿主细胞，可以在基因表达期间进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使热稳定丝氨酸蛋白酶从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行翻译后加工成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，所述剪切可导致获得如热稳定丝氨酸蛋白酶多肽并且进一步去除N-末端或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的热稳定丝氨酸蛋白酶。
转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。
在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致热稳定丝氨酸蛋白酶的表达。
因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和丝氨酸蛋白酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
本领域熟知的任何发酵方法都可以合适地用于发酵已引入构建体或载体的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞例如真菌细胞或细菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。
经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且所述组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。换句话说，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。
可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素如pH和氧气浓度。通常，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测量实际的底物浓度是困难的并且因此其是基于可测量因子的变化而估测的，所述因子为如pH、溶解氧、和废气(如CO2)的分压。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。
连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
优选地，用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法进一步包括在其生产后回收热稳定蛋白酶的步骤。热稳定蛋白酶的回收可以采取其分离的形式，例如蛋白酶的纯化和/或浓缩。因此，在生产已发生后，可以分离(isolated或separated)蛋白酶，例如，将其从宿主细胞或从培养物分离。在第一步，可以分离细胞和培养基，例如通过离心或过滤。如果蛋白酶处于细胞级分中，则可以裂解细胞并丢弃上清液。裂解方法是本领域众所周知的，并且包括例如超声、弗氏压碎器(French Press)和使用蛋白质提取试剂(例如EMD密理博公司(EMD Millipore)(美国))的化学裂解。如果蛋白酶被宿主细胞分泌，使得其处于上清液级分中，则可以丢弃所述细胞级分。然后可以将蛋白酶纯化，例如通过色谱法。纯化技术时本领域熟知的。例如，如果蛋白酶如上所述用亲和标签表达，则可以通过亲和色谱法纯化蛋白酶。还可以或可替代地使用尺寸排阻色谱法和/或离子交换色谱法，以及本领域已知的任何其他技术，例如，电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、提取微量过滤或两相分离。对于合适的纯化技术中的一般指导，请参见Scopes，Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。
可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过本领域已知的任何技术来实现。富集/浓缩方法的实例包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。可替代地，可以使用例如沉淀剂，如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。
示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述经由用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化热稳定丝氨酸蛋白酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全肉汤培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。
在另一个方面，描述了培养物上清液，其包含通过上述生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法获得的具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽。包含在本发明的培养上清液中的具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽优选具有或包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，包含在本文所述的培养物上清液中的具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽具有或包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。当丝氨酸蛋白酶用信号肽编码、表达和产生时，可获得此类上清液，所述信号肽指导蛋白酶从宿主细胞分泌。丝氨酸蛋白酶因此被分泌到培养基中。信号肽在丝氨酸蛋白酶从宿主细胞中分泌后就从丝氨酸蛋白酶上裂解下来，因此培养物上清液中存在的热稳定丝氨酸蛋白酶不包含信号序列。培养物上清液可以通过从培养基分离细胞来获得。进行该步骤的方法在本领域中是众所周知的并在上文中描述，例如离心和过滤。
热稳定丝氨酸蛋白酶能以本领域技术人员已知的各种方式被分离或纯化，这取决于样品中存在的其他组分。标准纯化方法包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦、免疫学和尺寸排阻)、电泳(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、提取微量过滤、两相分离。例如，目的蛋白可以使用标准抗目的蛋白抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术联合蛋白浓缩也是有用的。对于合适的纯化技术中的一般指导，请参见Scopes，Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。
用于检测和测量酶(例如热稳定丝氨酸蛋白酶多肽)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如，热稳定丝氨酸蛋白酶多肽)的活性的多种测定法也是本领域普通技术人员已知的。具体地，测定可用于测量基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的蛋白酶活性，其作为在280nm的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测量，以及基于染料标记的偶氮酪蛋白的水解，其作为在440-450nm的吸光度测量。
其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward,“Proteinases[蛋白酶]”,在Fogarty(编辑),Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术],Applied Science[应用科学出版社],伦敦,[1983]，第251-317页中)。也可以使用一种使用高标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)酪蛋白作为底物的蛋白酶检测方法，其是由Twining[Twining,S.S.,(1984)“Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay forProteolytic Enzymes”[荧光素异硫氰酸酯标记酪蛋白酶蛋白水解测定]Anal.Biochem.[生物化学年鉴]143:30-34]描述的程序的修改版本。
其他示例性测定包括但不限于：酪蛋白裂解成三氯乙酸可溶性肽(其含有酪氨酸和色氨酸残基)，随后通过与福林酚试剂反应并在660nm进行产物的比色检测；内部猝灭的FRET(荧光共振能量转移)多肽底物的裂解，随后使用荧光计检测产物。荧光共振能量转移(FRET)是能量从被激发的荧光团(或供体)非辐射转移到合适的猝灭剂(或受体)分子。FRET用于各种应用中，包括使用底物进行的蛋白酶活性测定，其中荧光团通过含有酶裂解位点的短肽序列从猝灭剂中分离出来。当荧光团和猝灭剂分离时，肽的蛋白水解产生荧光。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]223:119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]242:221-227[1999])。
本文还提供了动物饲料产品，其包含具有丝氨酸蛋白酶活性并且是热稳定的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述饲料产品任选地进一步包含(a)至少一种直接饲喂微生物(DFM)、或(b)至少一种其他酶、或(c)直接饲喂微生物和至少一种其他酶两者。在某些实施例中，所述动物饲料产品可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽。
所述至少一种其他酶可以选自但不限于以下酶，例如α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶等。
使用这些酶中任一的量范围从0.5至500微克/g饲料或进料。
α-淀粉酶(α-1,4-葡萄糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1.)水解淀粉内的α-1,4-糖苷键，主要是随机产生更小的分子量的葡萄糖。这些多肽主要用于淀粉加工和酒精生产。可以使用任何α-淀粉酶，例如美国专利号8,927,250和7,354,752中所述。
淀粉葡糖苷酶催化末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基相继从麦芽寡糖和多糖的非还原末端的水解，并伴随β-D-葡萄糖的释放。可以使用任何淀粉葡糖苷酶。
植酸酶是指能够催化植酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸盐及(3)无机磷酸盐的蛋白质或多肽。例如，具有催化活性的酶如在酶委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26中定义的。可以使用任何植酸酶，例如美国专利号8,144,046、8,673,609和8,053,221中所述。
支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)是一种特殊的葡聚糖酶，是降解支链淀粉(一种由麦芽糖单元组成的多糖聚合物，也称为α-1,4-；α-1,6-葡聚糖)的淀粉分解内切酶。因此，这是脱支酶的一个实例。支链淀粉酶又称出芽短梗霉聚糖-6-葡聚糖水解酶。支链淀粉酶通常由芽孢杆菌属物种分泌。例如，脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)(美国专利号5,817,498；1998)、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利号0063909)和长野芽孢杆菌(美国专利号5,055,403)。生产商业使用的具有支链淀粉酶活性的酶，例如，来自芽孢杆菌物种(来自杜邦-杰能科公司的商品名l-100和来自诺维信的D2)。脱支酶的其他实例包括但不限于来自磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、假单胞菌属物种的异淀粉酶，以及来自结状闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)的热稳定支链淀粉酶(例如，WO 2010/76113)。来自假单胞菌属物种的异淀粉酶可作为来自麦格酶国际公司(Megazyme International)的纯化的酶使用。可以使用任何支链淀粉酶。
葡聚糖酶是分解葡聚糖的酶，是葡萄糖亚单位组成的多糖。当它们进行糖苷键的水解时，它们是水解酶。
β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)消化纤维。它有助于植物细胞壁(纤维素)的分解。
纤维素酶是由真菌、细菌和原生动物产生的几种酶的一种，它能催化溶纤作用、纤维素和一些相关多糖的分解。这个名称也用于任何自然发生的混合物或各种此类酶的复合物，这些酶连续或协同作用以分解纤维素材料。可以使用任何纤维素酶。
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是向直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，其分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶给出的名称。可以使用任何木聚糖酶。
如本文所定义，动物饲料或动物饲料产品涵盖动物(包括人类)的饲料或喂养料、饲料添加剂组合物、预混物。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料”在本文可互换使用。上文定义了“饲料”，该定义同样适用于可互换的术语“动物饲料组合物”、“喂养料”和“秣料”。
饲料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、及其组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。
饲料可以理解为提供给动物的任何食物产品(而不是动物必须自己觅食)。饲料涵盖已经切下的植物。此外，饲料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合口粮，也包括发芽谷物和豆类。
饲料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、休马流甘兰(Chau moellier)、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。
所述饲料可以是复合饲料。术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼、碎屑等形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、低芥酸菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其任何组合。
在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)或其组合。
本文所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。
在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。
另外或可替代地，喂养料也可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、具有可溶物的干酒糟(DDGS)、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维饲料材料：获得自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。在一个方面，如本文所述的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(特别是cDDG)、小麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：含可溶物干酒糟(DDGS)(特别是cDDGS)、小麦麸和小麦。
所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物；青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。饲料和/或饲料添加剂组合物可以与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合以形成如本文所定义的预混物。
如本文所使用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。
动物饲料在一些实施例中还涵盖鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(如β-胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中的以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食包含多种种子，但也可包含板油(牛肉或羊肉脂肪)。
动物饲料可以包括植物材料，如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。预期动物性能参数(如生长、饲料摄入量和饲料效率)将得到改善，并且将表现出改善的均匀性，并且将导致动物屋内的氨浓度降低，从而因此改善动物的福利和健康状况。更具体地，如本文所使用的“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养素的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确定。
优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。
“改善的动物性能”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养素或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎的负面影响的能力改善和/或免疫应答改善。
优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。如本文所使用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。
“增加的饲料效率”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下使用相同饲料饲喂的动物相比，在饲料中使用根据本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量的增重增加。
“增加的增重”是指与饲喂不含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含饲料添加剂组合物的饲料时体重增加的动物。
如本文所使用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。
改善的饲料转化率意指更低的饲料转化率，即必须向某种动物饲喂较少的饲料，以使其增加一定的体重。
“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。
如本文所使用的营养素消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失(例如，被吸收到血流中，被降解等)的营养素的比率。营养素消化率可测量为所施用至受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或施用至受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。
如本文所使用的，营养素消化率可以测量为通过一段时间内营养素摄入量与通过排泄物完全收集而得出的营养素的排出量之间的差异；或通过使用惰性标记来测量，其中该惰性标记不被动物吸收并允许研究者可计算在整个胃肠道或胃肠道的一部分消失的营养素的量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。
如本文所使用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
如本文所使用的“可消化能”意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所使用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量可消化能和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
在一些实施例中，本文所述的饲料和/或饲料添加剂组合物可提高受试者对膳食半纤维素或纤维的消化率或利用率。在一些实施例中，所述受试者是猪。
如本文所使用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。
氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
本发明的饲料可含有另外的矿物质(例如像，钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，所述饲料为玉米-大豆粉混合物。
饲料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将饲料生产成醪液或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶溶液。制备饲料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，特别是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
本文公开的饲料可以用于本文定义的任何动物。
因此，在另一个实施例中，公开了动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其包含至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且是热稳定的多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列、或与其具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物任选地进一步包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
术语“饲料添加剂组合物”是指用于食品中的酶组合物。该酶组合物还可包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶(即多于一种的酶)、或c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
饲料添加剂组合物可以与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所使用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的多于一种(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。所述饲料可以是复合饲料或其预混物。可以将饲料添加剂组合物与复合饲料，复合饲料组分，或复合饲料、或饲料、饲料组分的预混物，或饲料的预混物混合。
在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。
所述至少一种DFM可以包含至少一种活的微生物，例如活的细菌菌株或活的真菌(例如活的酵母)。优选地，DFM包含至少一中活的细菌。
DFM可以包含形成孢子的细菌菌株，因此DFM可以包含孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所使用的“活的微生物”包括微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。可替代地，本文所述饲料添加剂组合物中的DFM可以不包含微生物孢子。因此，活的微生物可以是代谢活性微生物(例如，营养细菌细胞)或无代谢活性微生物(例如，内生孢子)。因此，“活的”是指能够生长和繁殖的微生物。如果孢子能够萌发，则可以认为是活的。
微生物可以是天然存在的微生物，或可以是转化或突变的微生物，例如基因工程化的微生物。
如本文所述的DFM可包含来自一个或多个以下属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球型菌属(Megasphaera)及其组合。
优选地，DFM包含一种或多种选自以下的芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
如本文所使用的“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。应认识到，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)等此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在另一方面，DFM可以进一步包含一种或两种以下乳杆菌属物种：乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
DFM可以进一步包含一种或多种以下乳杆菌属物种：布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillusbifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)及其任何组合。
在仍另一个方面，DFM进一步可以包含一种或多种以下双歧杆菌属物种：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、及其任何组合。
DFM可以特别地包含一种或多种如下物种：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、枯草芽孢杆菌、特恩丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacteriumanimalisssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌属物种及其组合。
本文所述的直接饲喂微生物可包含一种或多种细菌菌株。DFM可以包括一种类型的细菌菌株、或一种类型的细菌物种或一种类型的细菌属。一种类型的细菌物种可以仅由单个菌株组成，或者可以包含多于一个菌株。一种类型的细菌属可以由单个物种组成，所述单个物种可以包含一个或多个菌株，或者所述属可以包含多于一种细菌物种，每个细菌物种可以包含一个或多个菌株。可替代地，DFM可包含属的混合物，每个属可包含一种或多种物种和菌株。
DFM可以包含WO 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物，总结如下：
枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRl B-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507(来自Enviva(以前称为))；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自)；枯草芽孢杆菌菌株PB6(来自)；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)(来自)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自&)；地衣芽孢杆菌(来自)；肠球菌和片球菌(来自Poultry)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌来自)；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自)；解淀粉芽孢杆菌CECT-5940(来自&Plus)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)SF68(来自)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自)；乳酸菌7屎肠球菌(来自)；芽孢杆菌菌株(来自)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(来自)；肠球菌(来自)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自Biomin)；香肠乳杆菌(来自)；肠球菌(来自Oralin)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌(来自)；肠球菌(来自)；酿酒酵母(来自Levucell SB)；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自(以前称为))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自SC47)；丁酸梭菌(来自)；肠球菌(来自Fecinor和Fecinor)；酿酒酵母NCYC R-625(来自)；酿酒酵母(来自)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自)；蜡样芽孢杆菌(来自)；蜡样芽孢杆菌变体toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自)；或其他DFM，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自YC)以及枯草芽孢杆菌(来自)。
DFM可以包含可商购自丹尼斯科公司(Danisco A/S)的PRO。Enviva是芽孢杆菌属菌株2084登录号NRRl B-50013、芽孢杆菌属菌株LSSAO1登录号NRRLB-50104和芽孢杆菌属菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469B中所教导的-通过引用并入本文)。
本文所述的DFM可进一步包含来自酵母属的酵母。
优选地，本文所述的DFM包含通常被认为是安全(GRAS)的微生物，优选地是经GRAS批准的微生物。因此，所述微生物优选是非致病的。
本领域普通技术人员将容易地知道来自本文所述属中的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。
在某些实施例中，重要的是DFM具有对热的耐受性，即耐热性。当饲料被压成丸粒时尤其如此。因此，在另一个实施例中，所述DFM可包含一种或多种耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。耐热“细菌”是指能够在高于生理温度(37℃)的温度下存活的细菌物种。优选地，这是指能够在至少50℃、60℃、70℃、80℃或90℃的温度下生存的物种。“能够生存”包括能够在这样的温度下以营养形式生存的物种，例如嗜热微生物，以及不能在这样的温度下以营养形式生存但能够形成孢子以产生能够在这样的温度下生存的孢子的物种。此类物种包括芽孢杆菌属物种，其产生能够在这样的温度下生存的内生孢子。
可能希望DFM包含产孢子细菌，例如芽孢杆菌属物种。芽孢杆菌属能够在生长不利的条件下形成稳定的内生孢子，并且对热、pH、水分和消毒剂有很强的抵抗力。
本文所述的DFM可减少或阻止致病性微生物(例如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种(Salmonella spp)和/或弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp))在肠道内的建立。换句话说，DFM可能具有抗致病性。如本文所使用的术语“抗致病性”，是指DFM抵抗病原体的作用(负作用)。
如上所述，DFM可以是任何合适的DFM。例如，所述“DFM测定”可以用来确定微生物是否适合成为DFM。如本文所使用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。为了避免疑问，根据本文所讲授的“DFM测定”，选择作为抑制性菌株(或抗致病性DFM)的DFM，是一种适合于根据本公开使用的DFM，即根据本公开的食物产品中使用的DFM。
每根试管中都植入了来自代表性簇的代表性病原体(例如细菌)。
来自潜在DFM的上清液，经好氧或厌氧培养，被添加到接种的管中(不添加上清液的对照组除外)并孵育。孵育后，对每一种病原菌分别测定对照和处理的上清的管的光密度(OD)。
与对照组(不含任何上清液)相比，产生了较低的OD的(潜在的DFM)菌株的菌落可以将其分类为抑制性菌株(或抗致病性DFM)。因此，如本文所使用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。
优选地，本DFM测定中使用的代表性病原体可以是下列一种(或多种)：梭菌属，例如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌、沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个优选的实施例中，所述测定用产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌中的一种或多种，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌，更优选地产气荚膜梭菌进行。
抗致病性DFM包括以下一种或多种细菌，并描述于WO 2013029013：
枯草芽孢杆菌菌株3BP5登录号NRRL B-50510、
解淀粉芽孢杆菌菌株918ATCC登录号NRRL B-50508、和
枯草芽孢杆菌菌株1013ATCC登录号NRRL B-50509中。
DFM可以作为一种或多种培养物和一种或多种载体制备(如果使用的话)，并可以将它们添加到条带或桨式混合器中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将组分混合，这样使得导致培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选地为干燥的可流动粉末。一种或多种DFM包含一种或多种细菌菌株，然后可以将其添加到动物饲料或饲料预混物，添加到动物的水，或以其他本领域已知的途径施用(优选地与本文所述的酶同时)。
在DFM混合物中包含单个菌株的比例可以从1％到99％不等，优选从25％到75％不等。
动物饲料中DFM的适合剂量范围为约1x 103CFU/g饲料至约1x1010CFU/g饲料，适当地在约1x 104CFU/g饲料至约1x 108CFU/g饲料之间，适当地在约7.5x 104CFU/g饲料至约1x107CFU/g饲料之间。
在另一方面，喂养料中DFM的剂量超过约1x 103CFU/g饲料，适当地超过约1x104CFU/g饲料，适当地超过约5x 104CFU/g饲料，或适当地超过约1x 105CFU/g饲料。
饲料添加剂组合物中DFM的剂量从约1x 103CFU/g组合物至约1x 1013CFU/g组合物，优选1x 105CFU/g组合物至约1x 1013CFU/g组合物，更优选在约1x 106CFU/g组合物至约1x 1012CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x 107CFU/g组合物至约1x 1011CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1x 105CFU/g组合物，优选大于约1x 106CFU/g组合物，并且最优选大于约3.75x 107CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2x 105CFU/g组合物，适当地大于约2x 106CFU/g组合物，适当地大于约3.75x 107CFU/g组合物。
包含如本文定义的热稳定丝氨酸蛋白酶的本文所述的饲料添加剂组合物可以用作食物产品(例如饲料)，可以用于食物产品(例如饲料)中，或用于制备食物产品(例如饲料)。
本文所述的饲料添加剂组合物还可包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶(即多于一种的酶)、或c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
所述饲料添加剂组合物可进一步包含以下一种或多种：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅助剂、和营养活性成分。例如，本文所述的饲料添加剂组合物可以包含至少一种选自由以下组成的组的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。“肽”是指包含少量通过肽键连接的氨基酸的化合物。例如，肽可含有30个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少、10个或更少或5个或更少的氨基酸。
该饲料添加剂组合物可以被制粒。制粒是指食物产品以颗粒形式提供，即食物产品呈颗粒的形式，例如呈粉末的形式。可以通过使用例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片等方法或上述方法的任何组合处理较大体积的产品(即处理非颗粒食物产品)来获得颗粒状食物产品。这些方法是技术人员众所周知的，并且通常在食物产品生产(特别是动物饲料生产)领域中进行。
将本文所述的饲料添加剂组合物配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，该文献通过引用并入本文。
在某些实施例中，颗粒状食物产品(例如饲料添加剂组合物)的颗粒的平均直径为从50微米(μm)至2000微米，例如100微米至1800微米、250微米至1500微米、500微米至1500微米、800微米至1200微米或约1000微米。
当本文所述的食品添加剂组合物被制粒时，所述食物产品可以由颗粒组成，所述颗粒包含包被在蛋白质芯上的水合屏障盐。此类盐涂层的优点在于使耐热性得到改善、使储存稳定性得到改善以及保护免受其他饲料添加剂(原本对所述热稳定丝氨酸蛋白酶和/或包含一种或多种细菌菌株的任选DFM有不良作用)的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na2SO4。
在一个实施例中，将本文所述的饲料添加剂组合物配制成颗粒以提供包含以下的饲料组合物：芯；活性剂；和至少一个涂层，在经历选自以下中的一种或多种条件后，颗粒的活性剂保持至少50％、60％、70％、或80％活性：a)饲料制粒方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，所述至少一个涂层可包含占所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或所述至少一个涂层可包含两个涂层。所述两个涂层可为水分水合涂层和防潮涂层。在一些实施例中，所述水分水合涂层可占所述颗粒的25％至60％w/w，并且所述防潮涂层可占所述颗粒的2％至15％w/w。所述水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
颗粒可使用饲料制粒方法生产，所述方法可在70℃和95℃之间，例如85℃和95℃之间进行长达若干分钟。
可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒方法之后，所述活性剂保持至少80％活性；防潮涂层；和水分水合涂层，其占所述颗粒的至少25％w/w，所述颗粒在蒸汽加热制粒方法之前具有小于0.5的水活度。
所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可占所述颗粒的25％至45％w/w，并且所述防潮涂层可占所述颗粒的2％至10％w/w。
颗粒可使用蒸汽加热制粒方法制备，所述方法可在85℃和95℃之间进行长达若干分钟。
本发明的食物产品(例如饲料添加剂组合物或包含饲料添加剂组合物的饲料)能以任何合适的形式使用。此类食物产品(例如，饲料添加剂组合物)能以固体或液体制剂或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂(包括干粉)、糊剂、大丸粒、胶囊、丸粒、片剂、尘剂和颗粒(所述颗粒可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的)。液体制剂的实例包括但不限于水性溶液、有机溶液或水性-有机溶液，悬浮液和乳液。此类食物产品可以被包被，例如包入胶囊内，例如以保护食物产品的酶免受热。包衣因此可以被认为是热保护剂。
干粉或颗粒可以通过任何本领域技术人员已知的手段制备，例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、和流化床喷雾。
如上所述，饲料添加剂组合物可以被粉末化。所述粉末可以被进一步制粒。在制粒过程中，可将粉末与本领域已知的其他组分混合，强加力使其通过模具，并将所得股线切成适宜的不同长度的丸料。
任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以从几秒到几分钟甚至几小时不等，例如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或1小时。应当理解，本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)适于添加到任何适宜的饲料材料中。
可替代地，可通过将热稳定丝氨酸蛋白酶施用(例如喷雾)于载体底物(例如碾碎的小麦)上来形成饲料添加剂组合物。
当饲料添加剂组合物呈液体形式时，优选地所述液体形式适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。
当饲料添加剂组合物呈液体形式时，其可以为适合消耗的制剂，所述制剂例如含有以下一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。
在一个实施例中，将所述热稳定丝氨酸蛋白酶和任选地DFM与至少一种生理学上可接受的载体一起配制，所述载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
在一些实施例中，本文定义的热稳定丝氨酸蛋白酶能以基于纯酶蛋白的1ppb(十亿分之一)至10％(w/w)的浓度存在于本发明的动物饲料产品(例如饲料)中。在一些实施例中，所述蛋白酶以1-100ppm(百万分之一)存在于所述喂养料中。优选的剂量可以是1-20g热稳定丝氨酸蛋白酶/吨(这是指公吨为1000kg)饲料产品或饲料组合物，例如1-18g/吨、2-18g/吨、5-15g/吨、1-10g/吨、10-20g/吨、或8-12g/吨，或最终剂量为最终产品中的1-20ppm热稳定丝氨酸蛋白酶，例如1-18ppm、2-18ppm、5-15ppm、1-10ppm、10-20ppm或8-12ppm。
优选地，所述热稳定丝氨酸蛋白酶以至少约200PU/kg、300PU/kg、400PU/kg、500PU/kg、600PU/kg、700PU/kg、800PU/kg、900PU/kg、1000PU/kg、1500PU/kg、2000PU/kg、2500PU/kg、3000PU/kg、3500PU/kg、4000PU/kg、4500PU/kg、或5000PU/kg饲料的活性存在于饲料中。
在另一个方面，所述热稳定丝氨酸蛋白酶能以小于约60,000PU/kg、70,000PU/kg、80,000PU/kg、90,000PU/kg、100,000PU/kg、200,000PU/kg、300,000PU/kg、400,000PU/kg、500,000PU/kg、600,000PU/kg或700,000PU/kg饲料存在于喂养料中。
范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。
应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 10.0在50℃下，每分钟内从酪蛋白底物释放2.3微克酚类化合物(表示为酪氨酸等价物)的酶量。这可被称为确定1PU的测定法。技术人员完全能够执行此类测定并确定样品中存在的PU的数量。
在另一个方面，公开了用于水解衍生自玉米的材料的方法，所述方法包括：
(a)使从玉米中获得的材料与液体接触以形成醪液；和
(b)通过使水解产物与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触而水解醪液中的至少一种蛋白质以形成水解产物，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，以及
(c)任选地，回收步骤(b)中获得的水解产物。
淀粉(Starch或amylum)是由通过糖苷键连接的大量葡萄糖单元组成的聚合碳水化合物。淀粉可以通过酸、各种酶或两者的组合水解成更简单的碳水化合物。
在工业中，淀粉被转化为糖(例如通过麦芽制造)，并且在啤酒、威士忌和生物燃料的制造中发酵以生产乙醇。
可以使用任何合适的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物选择起始材料。含淀粉材料的实例包括但不限于全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆、菜豆或其混合物或由其衍生的淀粉、或谷类。起始材料可以是干固体，如但不限于如本文所述的饲料或进料的干固体。考虑的还有蜡质和非蜡质类型或玉米和大麦。用于乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。最初使用湿磨、干磨或干磨方法从植物谷物收集淀粉。
通过本领域已知的方法还原或研磨包含植物材料的底物。植物材料可以从以下获得：小麦、玉米、黑麦、高粱(买罗高粱)、稻、粟、大麦、黑小麦、木薯(树薯)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类，如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻、买罗高粱及其组合。植物材料可包括杂交品种和经遗传修饰的品种(例如包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。
含有淀粉的植物的任何部分可用于生产液化物，包括但不限于植物部分，如叶、茎、壳、外壳、块茎、穗轴、谷物等。优选的全谷物包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱及其组合。在其他实施例中，淀粉可以从分馏的谷粒谷物获得，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。用于分馏植物材料(如玉米和小麦)的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可以将从不同来源获得的植物材料(例如玉米和蜀黍或玉米和大麦)混合在一起。研磨方法是本领域熟知的，参见The Alcohol Textbook:A Reference for the Beverage,Fuel and IndustrialAlcohol Industries[醇教科书：饮料、燃料和工业酒精行业参考]第3版.K.A.Jacques等人编辑,(1999)Nottingham University Press[诺丁汉大学出版社]。参见，第2章和第4章。
在一些实施例中，无论是通过研磨还是其他方式还原的植物材料将与溶液组合，产生包含淀粉底物的浆料。在一些实施例中，浆料可包括来自淀粉加工的侧流，例如逆流。在一些实施例中，浆料将包含15％-55％ds(例如，20％-50％、25％-45％、25％-40％和20％-35％)。在一些实施例中，浆料可包含10％至60％的逆流。包含还原的植物材料的浆料可以经受液化过程，其中可以在液化步骤期间添加α淀粉酶。这产生了液化物。为了产生液化物，可以将单一或分开剂量的α淀粉酶添加到浆料中。本领域技术人员可以容易地确定用于液化过程的α淀粉酶的有效剂量。
用于液化的α淀粉酶的量是有效引起大部分淀粉液化的量。在其他的实施例中，所述量有效地使得大于40％(包括50％、60％、70％、80％、90％和100％)的淀粉能够液化。在一些实施例中，范围将为0.05至50AAU/g ds(α-淀粉酶单位/克干固体(例如，饲料或进料，如玉米))，也可以为0.1至20AAU/gDS，并且也可以为1.0至10AAU/gDS。在另外的实施例中，α淀粉酶剂量范围将为0.01至10.0kg/公吨(MT)ds；也可以为0.05至5.0kg/MT ds；并且也可以为0.1至4.0kg/MT ds。
α淀粉酶可以在比还原的植物材料的颗粒状淀粉的淀粉糊化温度低0至30℃的温度下添加。这个温度可以是低于淀粉糊化温度0至25℃、0至20℃、0至15℃和0至10℃。这一具体值可变化并且取决于包含浆料的谷物的类型而变化。例如，玉米的淀粉糊化温度通常高于黑麦或小麦的淀粉糊化温度。在一些实施例中，温度将为45℃至80℃之间、也可为50℃至75℃之间、也可为50℃至72℃之间，并且在一些实施例中，温度将低于68℃；低于65℃、低于62℃、低于60℃以及低于55℃。在其他实施例中，温度将高于40℃、高于45℃、高于50℃、以及高于55℃。在一些优选的实施例中，孵育温度将为58℃至72℃之间，并且也可以为60℃至68℃之间。
在一些实施例中，浆料将保持在约3.0至小于6.5的pH范围内、也可在4.0至小于6.2的pH范围内、也可在约4.5至小于6.0的pH范围内、并且优选地在约5.0至6.0的pH范围内(例如约5.4至5.8)，并且浆料中的研磨颗粒将与酶组合物接触持续2分钟至8小时(例如，5分钟至3小时；15分钟至2.5小时和30分钟至2小时)的一段时间。在另外的步骤中，通过将孵育的底物暴露于升高的温度(如高于淀粉糊化温度0℃至55℃)，使得孵育的底物液化。(例如，65℃至120℃、70℃至110℃、70℃至90℃)在约4.0至6.5的pH下，持续2分钟至8小时的一段时间(例如，2分钟至6小时、5分钟至4小时、并且优选地1小时至2小时)。在一些实施例中，可以将温度升高至约85℃-90℃之间的温度，并且可以使用单剂量的α淀粉酶。如果温度升高到90℃-105℃以上，可在温度恢复正常后添加第二剂量的α淀粉酶。在另一个实施例中，温度可以升高至约105℃和140℃之间，并且可以使用分开剂量的α淀粉酶，其中一部分在升高温度之前添加，并且另一部分在温度降低至至少低于105℃(包括低于104℃、103℃、102℃、101℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、94℃、93℃、92℃和91℃，但优选地低于90℃)之后添加。在一些实施例中，在糖化之前冷却所得的液化物。
以上获得的液化物可以与葡糖淀粉酶、酸稳定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶(如来自杜邦公司(DuPont)的FERMGENTM或来自CTE环球公司(CTE Global)的AP1)以单剂量或分开剂量接触，只要维持所希望的酶的比率。因此，分开剂量意味着将所希望比率的总剂量以多于一个部分(包括两个部分或三个部分)添加。在一个实施例中，总剂量的一部分在开始时添加，第二部分在所述过程中的特定时间添加。在一个实施例中，在糖化开始时(或SSF)添加至少一部分剂量以开始糖化过程。在一个实施例中，酶组合物中的每种酶可以分别添加到液化物中，但在时间上同时或足够接近，使得维持所述活性比率。可替代地，可以在糖化和发酵中的一种或两种期间添加包含葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶共混物组合物。葡糖淀粉酶、酸稳定α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率优选地为约1:1.5:0.1至约1:8:1，并且更优选地约1:2:0.2至1:5:0.6，如通过GAU:SSU:SAPU测量。
糖化或SSF过程通常包括添加尿素或氨作为宿主生物的氮源(例如但不限于酵母)。在商业乙醇设备中，在糖化或SSF期间氮源(如尿素)的添加典型地在200-1000ppm之间，如至少200、300、400、500、600、700、800、900至高达1000ppm尿素。乙醇设备中的另一种富含氮源是玉米仁中存在的玉米蛋白质。当被水解成较小的片段像小肽和氨基酸时，这种氮源可用于发酵生物体。
令人惊奇且出乎意料地发现，当在由含淀粉材料生产发酵产物的方法的液化步骤中存在如本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶时，在糖化或SSF过程中需要添加的氮源(例如尿素)减少了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或完全消除(减少100％)。这表明本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶可以将玉米蛋白水解至使得发酵生物能够使用玉米蛋白作为氮源的程度。因此，可以向SSF添加更少的尿素或完全不添加尿素。氮源的强烈减少或消除使得设备能够以较低的成本运行。
描述了用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)用包含丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列；
(b)糖化步骤(a)的产物；
(c)用合适的生物体进行发酵；以及
(d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
因此，如上所述，步骤(b)和(c)可以同时进行。
此外，通过使用1-20g丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料，可消除或减少至少50％的氮源(如尿素)的添加，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
另外，当所述液化产物是乙醇时，当使用1-20g热稳定丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料时，不需要酸性蛋白水解酶，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
换句话说，这似乎表明在发酵过程中可能不需要除本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶以外的蛋白酶的存在。
糖化过程可持续12至120小时。然而，通常进行糖化30分钟至2小时，并且然后在发酵期间完成糖化。有时这被称为同时糖化和发酵(SSF)。糖化通常在30℃至65℃的温度下进行，并且典型地在3.0至5.0的pH，包括4.0至5.0下进行。糖化可导致可发酵糖的产生。
在一些实施例中，可发酵糖被发酵微生物发酵。接触步骤和发酵步骤可以在相同反应容器中同时进行或顺序进行。通常，发酵过程描述于：The Alcohol Textbook[醇教科书]第3版，A Reference for the Beverage,Fuel and Industrial Alcohol Industries[饮料、燃料和工业酒精行业参考],编辑Jacques等人,(1999)Nottingham UniversityPress[诺丁汉大学出版社]，英国。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在合适的发酵条件下使用可发酵糖(糊精，例如葡萄糖)作为微生物发酵中的发酵进料，以获得最终产物，如醇(例如乙醇)、有机酸(例如琥珀酸、乳酸)、糖醇(例如甘油)、抗坏血酸中间产物(例如葡糖酸盐、DKG、KLG)、氨基酸(例如赖氨酸)、蛋白质(例如抗体及其片段)。
可发酵糖可以被酵母在15℃至40℃、20℃至38℃、并且还25℃至35℃的温度范围下发酵；pH范围为pH 3.0至6.5；还为pH 3.0至6.0；pH 3.0至5.5、pH 3.5至5.0、并且还为pH3.5至4.5，持续5hr至120小时、优选地12至120小时、并且更优选地从24至90小时的一段时间，以产生醇产物，优选为乙醇。
酵母细胞通常以每ml发酵液104至1012，并且优选地从107至1010活酵母计数的量提供。除了发酵微生物(例如酵母)营养素之外，发酵还包括任选地酸和另外的酶。在一些实施例中，除了上述原料之外，发酵培养基将含有补充物，包括但不限于维生素(例如生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子、以及大量营养素和微量营养素和盐(例如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。
在一些优选的实施例中，碾磨的植物材料包括大麦、买罗高粱、玉米及其组合，并且接触和发酵步骤在3.5至5.5的pH范围、30℃至45℃的温度范围内、以及持续48至90小时的一段时间同时进行，其中至少50％的淀粉被溶解。
发酵过程的一个最终产物可以是醇产物，例如乙醇。其他最终产物可以是发酵副产物，如可以用作动物饲料的干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)。
使用本领域已知的合适的发酵微生物，发酵最终产物可包括但不限于甘油、1,3-丙二醇、葡糖酸盐、2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。
发酵生物体的实例是产乙醇微生物或产乙醇微生物，如表达醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的产乙醇细菌，并且可以从发酵单胞菌(Zymomonas moblis)获得(参见例如USP 5,000,000；USP 5,028,539，USP 5,424,202；USP 5,514,583和USP 5,554,520)。在另外的实施例中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(将木糖转化为木酮糖的酶)。在另外的实施例中，木糖异构酶用于将木糖转化为木酮糖。在特别优选的实施例中，使用能够将戊糖和己糖发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施例中，微生物可以是天然或非基因工程化的微生物，或者在其他实施例中，微生物可以是重组微生物。
发酵微生物包括但不限于来自芽孢杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)(例如檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌属和克雷白氏杆菌属(Klebsiella)(例如产酸克雷白氏菌(K.oxytoca))的细菌菌株。(参见例如USP 5,028,539、USP 5,424,202和WO 95/13362)。芽孢杆菌属是优选的发酵微生物。在发酵步骤中使用的发酵微生物将取决于待生产的最终产物。
产生乙醇的微生物可以是真菌微生物，如木霉属、酵母、并且特别是如酿酒酵母(S.cerevisiae)(USP 4,316,956)的酵母属。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann′s Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、(Ethanol Red，弗曼迪斯公司(Fermentis)，法国)、(Thrive，杜邦公司(DuPont))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。
例如，当乳酸是所希望的最终产物时，可以使用乳杆菌属物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所希望的最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡糖酸盐和2-酮基-L-古洛糖酸是所希望的最终产物时，檬泛菌(Pantoea citrea)可用作发酵微生物。以上列举的列表仅是示例性的，并且本领域技术人员将知道可以适当地用于获得所希望的最终产品的许多发酵微生物。
产生的最终产物可以从发酵培养基中分离和/或纯化。分离和纯化方法是已知的，例如通过使培养基经受萃取、蒸馏和柱色谱。在一些实施例中，通过将培养基提交至高压液相色谱(HPLC)分析来直接鉴定最终产物。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种重组构建体，其包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列，其中所述编码核苷酸序列与至少一个在生产宿主中起作用的调控序列有效地连接，并且所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少92％氨基酸序列同一性的多肽；
并且其中所述调控序列对于所述编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和所述编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。
2.如实施例1所述的重组构建体，其中所述编码核苷酸序列是编码具有SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
3.如实施例1或2所述的重组构建体，其中所述编码核苷酸序列选自由以下组成的组：
i)编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少86％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列；或
ii)编码具有SEQ ID NO:5或14所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少84％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
4.如实施例1至3中任一项所述的重组构建体，其中所述至少一个调控序列包含启动子。
5.一种载体，其包含如实施方案1至4中任一项所定义的重组构建体。
6.一种生产宿主或宿主细胞，其包含如实施例1至4中任一项所述的重组构建体。
7.如实施例6所述的生产宿主或宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
8.一种用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
i)用如实施方案1至4中任一项所定义的构建体转化宿主细胞；以及
ii)在产生所述热稳定丝氨酸蛋白酶的条件下，培养步骤(i)的转化的宿主细胞。
9.如实施例8所述的方法，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收所述热稳定丝氨酸蛋白酶。
10.如实施方案8或9所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
11.一种培养物上清液，其包含通过如实施例8至10中任一项所述的方法获得的热稳定丝氨酸蛋白酶。
12.一种用于水解衍生自玉米的材料的方法，所述方法包括：
(a)使从玉米中获得的材料与液体接触以形成醪液；和
(b)通过使水解产物与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触而水解醪液中的至少一种蛋白质以形成水解产物，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，以及
(c)任选地，回收步骤(b)中获得的水解产物。
13.一种动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其包含至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且是热稳定的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与其具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物任选地进一步包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
14.如实施例13所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的组的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
15.如实施例13或14所述的饲料添加剂组合物，其中将所述饲料添加剂组合物进行制粒并且所述饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
16.如实施例15所述的动物饲料，其中所述颗粒的平均直径在50和2000微米之间。
17.如实施例15或16所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物呈液体、干粉、或颗粒或包衣的形式，或呈包被的形式或包入胶囊内的形式。
18.如实施例17所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
19.如实施例13所述的动物饲料，其中所述至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽以1至20g/吨的量存在。
20.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)用包含丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列；
(b)糖化步骤(a)的产物；
(c)用合适的生物体进行发酵；以及
(d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
21.如实施例20所述的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。
22.如实施例20或21所述的方法，其中通过使用1-20g丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料，氮源的添加被消除或减少了至少50％，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
23.如实施例22所述的方法，其中所述氮源是尿素。
24.如实施方案22或23所述的方法，其中所述液化产物是乙醇，并且当使用1-20g热稳定丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料时不需要酸性蛋白水解酶，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
实例
除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wileyand Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。
本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
实例1
TnaPro1序列的分析
在SEQ ID NO:1中提供了在NCBI数据库中鉴定的全长TnaPro1基因的核苷酸序列(鹦鹉螺嗜热球菌，NCBI参考序列：NZ_CP007264.1，1327825-1329105，互补)。由TnaPro1基因编码的相应全长蛋白质序列示于SEQ ID NO:2(GenBank登录号：AHL23118.1)中。
TnaPro1蛋白的前肽和成熟区域是基于与同源酶Thermococcus kodakaraensisKOD1 TK-枯草杆菌蛋白酶蛋白质比对的蛋白序列进行预测的(Pulido等人(2006)Appliedand Environmental Microbiology[应用与环境微生物学],72(6):4154-4162)。使用SignalP v4.0(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法]8:785-786)软件，预测TnaPro1信号肽具有SEQ ID NO:10所示的序列，并且预测所述酶原具有SEQ ID NO:8所示的序列。基于与T.kodakaraensis KOD1的比对，预测了TnaPro1前肽N-末端。
编码信号肽的TnaPro1基因如SEQ ID NO:9所示，并且编码酶原的部分如SEQ IDNO:7所示。编码前肽片段的TnaPro1基因的部分如SEQ ID NO:11所示，而编码成熟TnaPro1的部分如SEQ ID NO:6所示。
实例2
TnaPro1的克隆
合成了编码TnaPro1酶原的DNA序列，并将其插入枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化],55:40-52,2007)中，得到名为pGX706(aprE-TnaPro1)的质粒(图1)。
将编码TnaPro1蛋白的基因连接到消化的载体中导致在枯草芽孢杆菌AprE信号序列的3′端与预测的TnaPro1天然前肽的5′端之间添加了三个密码子(编码Ala-Gly-Lys)。该基因具有可替代的起始密码子(GTG)。如图1所示，pGX706(aprE-TnaPro1)包含一个AprE启动子、一个用来指导枯草芽孢杆菌分泌靶蛋白的AprE信号序列和编码预测的TnaPro1酶原的合成核苷酸序列。SEQ ID NO:4示出了aprE-TnaPro1构建体的基因序列，包括在融合序列连接期间引入的三个另外的密码子。SEQ ID NO:5示出了AprE-TnaPro1融合蛋白的氨基酸序列，包括由三个另外的密码子编码的三个另外的氨基酸。
实例3
TnaPro1的表达和纯化
将pGX706质粒转化到合适的枯草芽孢杆菌菌株中，并将转化的细胞铺展到补充有5ppm氯霉素的Luria琼脂板上。选择菌落并在具有MOPS基的限定培养基的250mL摇瓶中进行发酵。
通过离心摇瓶培养物获得培养物上清液，浓缩并随后在85℃下孵育30min。为了纯化，向所得溶液中补充硫酸铵至终浓度为1M，然后将其上样至用补充有另外的1M硫酸铵的20mM Tris(pH 8.0)预平衡的HiPrepTM Phenyl FF柱上。用0.5M硫酸铵从柱洗脱靶蛋白。然后将所得的活性蛋白级分进行合并，使用10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃在40％甘油中储存直至使用。
对纯化的TnaPro1蛋白样品进行LC-质谱分析，结果确认成熟的TnaPro1蛋白为SEQID NO:3所示的序列，以及前肽序列为SEQ ID NO:12所示的序列。
实例4
纯化的TnaPro1的蛋白水解活性
使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF-pNA，目录号L-1400.0250，BACHEM)作为底物，在50mM HEPES缓冲液(pH 8)中测量纯化的TnaPro1的蛋白水解活性。在反应之前，将所述酶样品在水中连续稀释至0.01-1.25ppm。将AAPF-pNA溶解在二甲亚砜(DMSO，目录号STBD2470V，西格玛公司(Sigma))中至最终浓度为10mM。为了启动反应，首先将5μL的AAPF-pNA与85μL的HEPES缓冲液混合于非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(目录号3641，康宁生命科学公司(Corning Life Sciences))中，并在恒温混合器(艾本德公司(Eppendorf))中在40℃以600rpm孵育5min，然后添加10μL经稀释的酶(或仅水作为空白对照)。在恒温混合器中在40℃和600rpm孵育10min后，使用SpectraMax 190在410nm处直接读取反应板。通过从含酶的孔的A410中减去空白对照的A410来计算净A410，并且然后绘制出相对于不同蛋白质浓度(从0.001ppm到0.125ppm)的图。在图2中示出结果。每个值为三次重复测定的平均值。蛋白水解活性显示为净A410。以AAPF-pNA为底物的蛋白水解测定表明TnaPro1是一种活性蛋白酶。
实例5
纯化的TnaPro1的pH曲线
以AAPF-pNA为底物，在不同pH值(范围从pH 3.0至10.0)的25mM甘氨酸/乙酸钠/HEPES缓冲液中研究TnaPro1的pH曲线。测定前，首先将特定pH值的85μL的25mM甘氨酸/乙酸钠/HEPES缓冲液与5μL的10mM AAPF-pNA(溶解于DMSO中)混合于96-MTP中，并且然后添加10μL经稀释的酶(0.5ppm于水中或仅水作为空白对照)。反应的进行和分析如上所述。各pH值下的酶活性报告为相对活性，其中最佳pH值下的活性被设置为100％。测试的pH值为3、4、5、6、7、8、9和10。每个值为三次重复测定的平均值。如图3所示，在该测试的条件下，TnaPro1的最佳pH为9.0，在pH 8和10之间，其最大活性保持在70％以上。
实例6
纯化的TnaPro1的温度曲线
使用AAPF-pNA测定，在50mM HEPES缓冲液(pH 8)中分析纯化的TnaPro1的温度曲线。反应前，将85μL的50mM pH 8.0HEPES缓冲液和5μL的10mM AAPF-pNA添加到200μL PCR管中，将其随后在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中在所希望的温度(即30℃至95℃)下孵育5min。孵育后，将10μL经稀释的酶(0.4ppm于水中或仅水作为空白对照)添加至底物中以启动反应。在不同温度下在热循环仪中孵育10min后，将80μL的反应混合物转移到新的96-MTP中并在410nm处读取吸光度。所述活性报告为相对活性，其中最佳温度下的活性被设为100％。测试温度为30.0℃、39.4℃、45.0℃、49.8℃、59.9℃、70.0℃、79.1℃、84.4℃、90.2℃、和95.0℃，结果如图4所示。每个值为三次重复测定的平均值。
图4中的数据显示70℃是TnaPro1的最佳温度，并且在60℃与95℃之间，其最大活性保持在80％以上。
实例7
纯化的TnaPro1的热稳定性
使用20mM Tris缓冲液(pH 8，含150mM NaCl)和50mM乙酸钠缓冲液(pH 3)作为孵育缓冲液，对纯化的TnaPro1和可商购的ProAct(ProAct，DSM)蛋白酶分别进行热稳定性分析，且以AAPF-pNA为底物测量剩余活性。将纯化的TnaPro1在1mL孵育缓冲液中稀释至最终浓度为24ppm，然后在90℃或95℃孵育0、5、15、30或60min，同时将ProAct蛋白酶稀释至500ppm并在90℃孵育30秒或60秒。在每个孵育期结束时，将每种酶-缓冲液混合物的50μL等分试样转移至96-MTP中并置于冰上。为了启动酶反应，将85μL的50mM pH 8.0HEPES缓冲液与5μL的10mM AAPF-pNA和10μL的每种稀释孵育液(TnaPro1在水中稀释40倍，ProAct在水中稀释250倍)混合于96-微量滴定板(MTP)中。在恒温混合器中在40℃和600rpm孵育10min后，在96孔分光光度计上于410nm处测量吸光度。每种样品的酶活性报告为残余活性百分比，其中将0min的孵育时间的活性设置为100％。将TnaPro1的热稳定性结果汇总在表1中。在90℃下孵育1min后，ProAct完全失活(数据未显示)。
实例8
纯化的TnaPro1的玉米大豆粉水解分析
使用如下描述的OPA(邻苯二甲醛)或BCA(二喹啉甲酸)检测测定来评估纯化的TnaPro1对玉米大豆粉(具有60％玉米面粉和40％大豆粉)的水解程度，以测量酶促水解后分别释放到上清液中的新产生的N-末端胺基团或可溶性肽的量。为了进行测定，将140μL玉米大豆粉底物(在50mM乙酸钠pH 3缓冲液或MES pH 6缓冲液中的10％w/w)(Yu S,CowiesonA,Gilbert C,Plumstead P,Dalsgaard S.,Interactions of phytate and myo-inositolphosphate esters(IP1-5)including IP5 isomers with dietary protein and ironand inhibition of pepsin.[植酸盐和包括IP5异构体的肌醇磷酸酯(IP1-5)与膳食蛋白质和铁的相互作用以及胃蛋白酶的抑制]J.Anim.Sci.[动物科学杂志]2012,90:1824-1832)与20μL经稀释的TnaPro1酶样品(4.0mg/mL)混合于96-MTP中。在孵育器中在40℃下孵育2小时后，将板在4℃下以3700rpm离心15min。将所得的上清液在水中稀释10倍，使用OPA和BCA测定进行后续反应产物检测。包括用于比较的ProAct蛋白酶样品(ProAct，DSM)。将水用作(无酶)空白对照。
OPA检测：通过混合30mL的2％磷酸三钠缓冲液(pH 11)、800μL的4％OPA(目录号P1378，西格玛公司，溶解在96％乙醇中)、1mL的3.52％二硫苏糖醇(目录号D0632，西格玛公司)和8.2mL的水来制备OPA试剂。通过将10μL 10X稀释的蛋白酶反应物添加至96-MTP(目录号3635，康宁生命科学公司)中的175μL OPA试剂中来启动反应。孵育2min后，使用分光光度计在340nm(A340)处测量所得溶液的吸光度。通过从每个蛋白酶反应的A340减去空白(无酶)对照的A340来计算净A340(图5和7)，以测量每个蛋白酶样品对玉米大豆粉的水解程度。
BCA检测：BCA显色反应与长至少3个残基的多肽中的肽键数成正比。BCA反应是通过混合10μL 10倍稀释的蛋白酶反应物与200μL BCA试剂进行的。将混合物在恒温混合器中在37℃孵育30min。然后使用分光光度计在562nm(A562)处测量吸光度。通过从每个蛋白酶反应的A562减去空白对照(无酶)的A562来计算净A562(图6和8)，以确定每个蛋白酶样品对玉米大豆粉的水解程度。
如图5、6、7和8所示，纯化的TnaPro1可以有效地水解玉米大豆粉底物。
实例9
TnaPro1蛋白酶对玉米大豆蛋白的水解和溶解
向96孔MTP中添加140μL 10％(w/w)的玉米大豆饲料浆料，如(Yu S,Cowieson A,Gilbert C,Plumstead P,Dalsgaard S.,Interactions of phytate and myo-inositolphosphate esters(IP1-5)including IP5 isomers with dietary protein and ironand inhibition of pepsin.[植酸盐和包括IP5异构体的肌醇磷酸酯(IP1-5)与膳食蛋白质和铁的相互作用以及胃蛋白酶的抑制]J.Anim.Sci.[动物科学杂志]2012,90:1824-1832)所描述地制备所述浆料，其中pH调节至pH 3.0；在50mM乙酸钠(pH 3.0)中制备的20μLTnaPro1蛋白酶，以获得0、500、1000和1500ppm的终浓度；以及10μL胃蛋白酶(西格玛公司P7000，溶于水至1.69mg/mL的终浓度)。
添加胃蛋白酶和胰酶仅作为对照，而空白则省略胃蛋白酶和胰酶。可商购饲料蛋白酶ProAct(ProAct，DSM)被用作参考。在iEMS孵育器/振荡器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))中以1150rpm，在40℃下将板孵育45min。在孵育结束时，添加34μL猪胰酶溶液(西格玛公司P7545，在1M碳酸氢钠中制备的0.4636mg/mL)，并将样品在设定为1150rpm的iEMS中于40℃进一步孵育60min。孵育后，在5℃，4000rpm下将板离心15min。将上清液的10μL等分试样转移到含有90μL水(10x稀释)的新的96孔MTP中。将该10倍稀释的上清液用于通过OPA方法测定蛋白质水解。
使用邻苯二甲醛(OPA)试剂的蛋白质水解基本上如前所述进行(P.M.Nielsen,D.Petersen和C.Dambmann,Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis[用于确定食品蛋白质水解度的改善的方法],J.Food Sci.[食品科学杂志]66:642-646,2001)。通过混合30mL磷酸三钠(Na3PO4.12H2O，2％w/v在水中，其中将pH调节至pH11)、0.8mL OPA(0.4g邻苯二甲醛97％在10mL 96％乙醇中)、1ml DTT溶液(0.352g DL-二硫苏糖醇99％在10mL水中)以及水(至最终体积为40mL)来新鲜制备OPA试剂，并在-20℃下保存。将试剂保持在黑暗中并在制备后立即使用。将10倍经稀释的上清液的20μL等分试样与175μL OPA试剂混合5秒钟，并在2min后在340nm处准确测量吸光度。
表2显示了在胃蛋白酶和胰酶同时存在的情况下，当TnaPro1和ProAct蛋白酶在0至1500ppm的剂量下，玉米大豆饲料中的蛋白质水解增加。
实例10
TnaPro1的胃蛋白酶稳定性
通过在50mM乙酸钠缓冲液(pH 3.0)中将纯化的TnaPro1和ProAct酶与热灭活和具有活性的胃蛋白酶(西格玛公司，目录号P7000)一起孵育，分析纯化的TnaPro1和ProAct酶的胃蛋白酶稳定性并使用AAPF-pNA测量剩余活性。将溶解于50mM乙酸钠缓冲液(pH 3.0)中的50mg/mL胃蛋白酶储备溶液在PCR仪中于90℃加热15min以使其热失活。将TnaPro1和ProAct酶样品与热灭活的胃蛋白酶或活性胃蛋白酶以1:500的比例混合，其中纯化的TnaPro1和ProAct的剂量为100ppm。在37℃下孵育30min后，将样品在水中稀释160倍。为了测量剩余活性，将5μL的10mM AAPF-pNA与85μL HEPES缓冲液(50mM，pH8.0)混合于96-MTP孔中，然后添加10μL经稀释的孵育混合物。如上所述进行AAPF-pNA测定并分析结果。将含有50mg/mL胃蛋白酶的乙酸钠缓冲液用作空白对照。将剩余的酶活性报告为残余活性，其中将样品在热灭活的胃蛋白酶中的活性设为100％。结果显示在图9中，并且结果表明TnaPro1活性不受外源胃蛋白酶孵育的影响，而ProAct活性稍微受外源胃蛋白酶孵育的影响。
实例11
TnaPro1蛋白酶在淀粉液化中的评估
如下所述，在实验室规模的玉米液化方案中测试TnaPro1蛋白酶的作用。使用Retsch ZM200碾磨机研磨玉米仁(阿里勃洛克动物营养公司(Arie Blok AnimalNutrition)，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，并设置如下：3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加1:1的自来水/去矿物质水的混合物，将研磨的玉米面粉用于产生32.0％干固体的0.5kG浆料。用H2SO4将pH调节至5.5，并且然后以相关的商业剂量给予RSL(含有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加TnaPro1蛋白酶至最终浓度为4ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌条件下将0.5kG混合物在85℃孵育两小时。
通过不向液化中添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(Liquefact)，并通过HPLC尺寸排阻进行分析，以确定玉米液化过程中玉米蛋白溶解的程度。
将液化结束样品以13,000rpm旋转5分钟，并且将200uL上清液通过0.22um过滤器过滤。将此滤液的5uL等分试样注射到Waters 1.7um/300mm柱上的HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)上；并以0.3mL/min运行。运行缓冲液：25mMNaPO4 pH 6.8，0.1M NaCl。将保留时间4.8min至23min之间的总面积积分，检测：OD220 nm。
将液化样品中肽的HPLC检测结果示出于表3中，显示为曲线下积分面积，对于使用和不使用TnaPro1蛋白酶处理的样品，保留时间在4.8-23分钟之间。对照设置为100％面积单位。表3中示出的蛋白质水解结果表明，当在液化中添加TnaPro1蛋白酶时，观察到可溶性肽水平的增加。
实例12
TnaPro1蛋白酶作为液化蛋白酶的评估
进行液化-SSF研究，其中在实验室规模的玉米液化以及同时糖化和发酵(SSF)中测试蛋白酶TnaPro1。使用Retsch ZM200碾磨机研磨玉米仁(阿里勃洛克动物营养公司(Arie Blok Animal Nutrition)，NL-3440AA武尔登(Woerden)，商品编号：3777)，并设置如下：3mm筛，10k rpm。通过向面粉中添加6:4w/w的来自商业乙醇设备的自来水:逆流的混合物来制备32％干固体浆料。用H2SO4将pH调节至5.3，并且然后以相关的商业剂量给予RSL(含有细菌α淀粉酶的杜邦公司商业产品)。随后，添加TnaPro1蛋白酶至最终浓度为3.5ug/gDS，并且使用顶置式混合器在恒定搅拌条件下将0.5kG混合物在85℃孵育2小时。通过不向液化中添加蛋白酶来产生对照样品。孵育后，收集处理过的玉米样品(液化物)并用于随后的SSF实验。
将液化样品(含有和不含添加到液化反应的TnaPro1蛋白酶)的pH调节至4.8，并以商业相关剂量向含有49克液化物的每个SSF容器中添加Synerxia Thrive(含有真菌α-淀粉酶和真菌葡糖淀粉酶的杜邦公司商业产品)。然后，添加1mL繁殖的酵母培养物(Thrive，杜邦公司)，并且随后以表4中所示的不同浓度添加尿素和FERMGENTM2.5x(含有酸性真菌蛋白酶的杜邦公司商业产品)。实验以一式三份进行。
将发酵容器在32℃下在强制通风孵育器中以150rpm孵育。在五个不同的时间点(17h、23h、41h、48h和65小时)收集样品。使用如下所述的HPLC分离和定量来分析这些样品的乙醇浓度。
将发酵样品以15,000g离心10分钟。将50ul上清液添加到含有500ul 0.01N H2SO4的小瓶中。然后将样品在95℃加热7分钟，并在HPLC分析之前通过0.2μm过滤器过滤。HPLC(安捷伦科技公司1200系列)运行条件如下：Phenomenex RezexTMRFQ-快速酸H+柱保持在80℃，以0.01N H2SO4溶剂的1.0mL/min等度流速，10μL注射体积和5.3min洗脱运行时间运行。使用折射率检测来定量乙醇，并且将结果示于表4中。
结果表明，当将TnaPro1添加到液化中时，SSF中的尿素剂量可以减少75％，而对乙醇的形成没有负面影响。

Claims (24)

1.一种重组构建体，该重组构建体包含编码具有丝氨酸蛋白酶活性的热稳定多肽的核苷酸序列，其中所述编码核苷酸序列与至少一个在生产宿主中起作用的调控序列有效地连接，并且所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少92％氨基酸序列同一性的多肽；
并且其中所述调控序列对于所述编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和所述编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。
2.如权利要求1所述的重组构建体，其中所述编码核苷酸序列是编码具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少89％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的重组构建体，其中所述编码核苷酸序列选自由以下组成的组：
i)编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少86％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列；或
ii)编码具有SEQ ID NO:5或14所示的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少84％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的重组构建体，其中所述至少一个调控序列包含启动子。
5.一种载体，其包含如权利要求1至4中任一项所定义的重组构建体。
6.一种生产宿主或宿主细胞，其包含如权利要求1至4中任一项所述的重组构建体。
7.如权利要求6所述的生产宿主或宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
8.一种用于生产热稳定丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：
i)用如权利要求1至4中任一项所定义的构建体转化宿主细胞；以及
ii)在产生所述热稳定丝氨酸蛋白酶的条件下，培养步骤(i)的转化的宿主细胞。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收所述热稳定丝氨酸蛋白酶。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞或藻类细胞。
11.一种培养物上清液，其包含通过如权利要求8至10中任一项所述的方法获得的热稳定丝氨酸蛋白酶。
12.一种用于水解衍生自玉米的材料的方法，所述方法包括：
(a)使从玉米中获得的材料与液体接触以形成醪液；和
(b)通过使水解产物与包含热稳定丝氨酸蛋白酶的酶混合物接触而水解醪液中的至少一种蛋白质以形成水解产物，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，以及
(c)任选地，回收步骤(b)中获得的水解产物。
13.一种动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，其包含至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且是热稳定的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与其具有至少92％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物任选地进一步包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。
14.如权利要求13所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物进一步包含至少一种选自由以下组成的组的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
15.如权利要求13或14所述的饲料添加剂组合物，其中将所述饲料添加剂组合物进行制粒并且所述饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒(prilling)、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
16.如权利要求15所述的动物饲料，其中所述颗粒的平均直径在50和2000微米之间。
17.如权利要求15或16所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物呈液体、干粉、或颗粒或包衣的形式，或呈包被的形式或包入胶囊内的形式。
18.如权利要求17所述的饲料添加剂组合物，其中所述饲料添加剂组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。
19.如权利要求13所述的动物饲料，其中所述至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽以1至20g/吨的量存在。
20.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括：
(a)用包含丝氨酸蛋白酶的酶混合物液化含淀粉材料，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列；
(b)糖化步骤(a)的产物；
(c)用合适的生物体进行发酵；以及
(d)任选地，回收步骤(c)中产生的产物。
21.如权利要求20所述的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中通过使用1-20g丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料，氮源的添加被消除或减少了至少50％，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述氮源是尿素。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述液化产物是乙醇，并且当使用1-20g热稳定丝氨酸蛋白酶/含MT淀粉的材料时不需要酸性蛋白水解酶，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少92％序列同一性的氨基酸序列。
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