DE69822142T2

DE69822142T2 - Transformation von schimmeln durch agrobacterium, insbesondere von der gattung aspergillus

Info

Publication number: DE69822142T2
Application number: DE69822142T
Authority: DE
Inventors: Godelieve Alida BEIJERSBERGEN; Paul-Rijks Universiteit Leiden Bundock; Johannes Robertus GOUKA; Marcellus Johannes A. De Groot; Jan Paul HOOYKAAS
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2018-03-25
Also published as: EP0973917B1; AU7428398A; US6255115B1; ES2216284T3; EP0973917A1; JP4307563B2; JP2001518786A; WO1998045455A1; ID22929A; DE69822142D1; CN1259167A; CN1151264C; MY121328A; CA2286307A1; BR9807941A

Description

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
(1) Allgemeine Transformationstechniken für Mikroorganismen
In der rekombinanten DNA Technologie sind Transformationstechniken für Bakterien und Hefen gut entwickelt, aber die Transformationsraten für Schimmelpilze sind relativ gering.
Beispielsweise wurden in genetischen Transformationen des Bakteriums Escherichia coli regelmäßig Transformationsraten von ca. 5 × 10⁸ Transformanten/μg Vektor DNA beobachtet, wobei ein chemisches Transformationsverfahren verwendet wurde. Ungefähr 3,5 % der lebensfähigen Zellen wurden transformiert (Hanahan; J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580). Kürzlich wurde sogar von noch höheren Raten, von 10⁹ bis 10¹⁰ Transformanten/μg Vektor DNA nach Hochspannungselektroporation berichtet (Dower et al.; Nucleic Acids Research 16 (1988) 6127–6145). Für andere Bakterien wurden niedrigere Transformationsraten beschrieben (z. B. Chassy und Flickinger; FEMS Microbiology Letters 44 (1987) 173-177; Miller et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 856-860). Bei Hefen wurden Transformationsraten von bis zu 1 × 10⁷ Transformanten pro μg Vektor DNA beobachtet (Meilhoc et al.; Bio/Technology 8 (1990) 233–227 und Gietz et al.; Yeast 11 (1995) 355–360).
Bei Schimmelpilzen schwanken die Transformationsraten von

– nur 0,1 – 0,5 Transformaten/μg Vektor DNA für Agaricus bisporus (Van Rhee et al.; Mol Gen Genet 250 (252–258), über
– 5 Transformanten/μg Vektor DNA für Fusarium graminearum A3/5 (Roger et al.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483),
– ca. 12 Transformanten/μg Vektor DNA für Aspergillus awamori (Ward et al.; Experimental Mycology 13 (1989) 289-293), und
– 20 – 300 Transformanten/μg Vektor DNA für Aspergillus nidulans (Yelton et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1470-1474) bis
– ca. 10⁴ Transformanten/μg Vektor DNA für Neurospora crassa (Vollmer und Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4869-4873).

Für Übersichtsartikel über die Transformation von Schimmelpilzen wird Bezug genommen auf die Artikel:

– „Transformation in Fungi" von John R.S. Fincham, veröffentlicht in Microbiological Reviews (Mar. 1989) 148-170, der einen Überblick über die möglichen Transformationsverfahren für Pilze gibt, d.h. sowohl Hefen als auch Schimmelpilze.
– „Genetic engineering of filamentous fungi" von Timberlake, W.E. und Marshall, M.A. Science 244 (1989) 1313-1317.
– „Transformation" von David B. Finkelstein (Kapitel 6 in dem Buch „Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products" (1992) 113-156, herausgegeben von Finkelstein und Ball).

Aus dieser Literatur ist klar, dass einige Transformationstechniken entwickelt wurden, um eine ansteigende Zahl von filamentösen Pilzen zu transformieren. Die meisten Transformationsprotokolle nützen Protoplasten. Protoplasten können aus Hyphenkulturen oder keimenden Konidien unter Verwendung von Novoryme 234° einer Multi-Enrym-Präparation, abgeleitet von Trichoderma reesei hergestellt werden. Die Transformation von Protoplasten mit DNA wird durch Elektroporation oder durch eine Kombination von CaCl₂ und Polyethylenglykol (PEG) vermittelt. Einige alternative Verfahren vermeiden die Notwendigkeit, Protoplasten herzustellen, was die Verfahren schneller und einfacher macht. Intakte Zellen können transformiert werden unter Verwendung einer Kombination von Lithiumacetat und PEG, Partikelbeschuss (Lorito et al.; Curr. Genet. 24 (1993) 349-356 und Herzog et al.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 45 (1996) 333-337) oder auch Elektroporation (Ozeki et al.; Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 2224-2227).
In Anbetracht der relativ niedrigen Transformationsraten von Schimmelpilzen in Vergleich zu den Transformationsraten von Bakterien und Hefen besteht eine Notwendigkeit für höhere Transformationsraten in Schimmelpilzen.
(2) Pflanzentransformation unter Verwendung von Agrobacterium
Eine andere Transformationstechnik, die für Pflanzen entwickelt wurde, basiert auf der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens, das ein Gram-negatives Bodenbakterium ist, das Wurzelhalsgallen-Tumore an Wundstellen von infizierten dikotyledonen Pflanzen verursacht. Während der Tumorinduktion bindet Agrobacterium an Pflanzenzellen und überträgt anschließend einen Teil seines tumorinduzierenden (Ti) Plasmids, die übertragene DNA oder T-DNA, auf die Zelle, wo sie in das Pflanzenkerngenom integriert wird. Die T-DNA wird flankiert von 24 Basenpaar unvollständigen direkten Repetitionen. Diese direkten Repetitionen sind auch als „Grenzrepetitionen" oder „Grenzen" oder „T-DNA Grenzen" oder „Grenzsequenzen" oder Kombinationen davon bekannt. Die T-DNA enthält einen Satz von Genen. Die Expression einer Teilmenge dieser Gene, der onc Gene, führt zu der Herstellung von Phytohormonen, welche die Pflanzenzellproliferation und die Bildung eines Tumors induzieren. Der Vorgang der Übertragung hängt von der Induktion eines Satzes von Virulenzgenen, die durch das Ti-Plasmid kodiert werden, ab. Das Übertragungssystem wird aktiviert, wenn VirA induzierende Verbindungen aus verletzten Pflanzen, wie Acetosyringon (AS) wahrnimmt. Über den transkriptionellen Aktivator VirG werden die verbleibenden vir Loci aktiviert, und eine lineare einzelsträngige DNA, der T-Strang, wird nach Aufbrechen der Grenzrepetitionen durch eine virD1/D2 kodierte ortsspezifische Endonuklease hergestellt. Das VirD2 Protein bleibt kovalent an das 5' Ende gebunden. Der T-Strang ist durch das einzelstrangbindende Protein VirE geschützt, und der resultierende Komplex wird in die Pflanzenzelle übertragen. Obwohl der Mechanismus, durch den der T-DNA Komplex von dem Bakterium in die Pflanzenzelle übertragen wird, nicht gut verstanden ist, wird angenommen, dass der T-DNA Komplex die Agrobacterium Zelle durch eine transmembrane Struktur verlässt, die aus Proteinen besteht, die durch das virB Operon kodiert werden. Für einen ausführlichen Überblick über Agrobacterium tumefaciens Transformation siehe Hooykaas und Schilperoort (Plant Molecular Biology 19 (1992) 15-38) und Hooykaas und Beijersbergen (Annu. Rev. Phytopathol. 32 (1994) 157- 179). Die Fähigkeit von Agrobacterium tumefaciens, seine T-DNA in die Pflanzenzelle zu übertragen, wo sie stabil in das Kerngenom integriert wird, hat zu einer weit verbreiteten Verwendung dieses Organismus für den Gentransfer in Pflanzen und Pflanzenzellen geführt. Um die Regeneration von Pflanzen nach Agrobacterlum tumefaciens Transformation zu erlauben, wurden die onc Gene in der T-Region deletiert, was zu einer entschärften oder nicht-oncogenen T-DNA führte. Es wurden zwei Typen von Vektorsystemen für die Pflanzentransformation entwickelt. Zunächst ein binäres System, in dem neue Gene zwischen die T-DNA Grenzen eines Plasmids, enthaltend eine künstliche T-DNA, kloniert werden. Dieses Plasmid wird anschließend in einen Agrobacterium Stamm, enthaltend ein T-Plasmid mit einer intakten vir Region, aber ohne die T-Region transformiert (Hoekema et al.; Nature 303 (1983) 179-180 und Bevan; Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8721). Zweitens ein kointegratives System, in dem neue Gene über homologe Rekombination in eine künstliche T-DNA eingeführt werden, die bereits auf einem T-Plasmid mit einer aktiven vir Region vorliegt (Zambryski et al.; EMBO-J. 2 (1983) 2143-2150).
Eine große Vielzahl von Pflanzenarten wurden unter Verwendung solcher Systeme transformiert. Dies schließt viele landwirtschaftlich wichtige dikotyledone Arten wie Kartoffel, Tomate, Sojabohne, Sonnenblume, Zuckerrübe und Baumwolle, ein (für eine Übersicht siehe Gasser und Fraley; Science 244 (1989) 1293-1299). Obwohl Agrobacterium Transformation von monokotyledonen Pflanzen für eine lange Zeit unmöglich erschien, wurden heute einige Arten wie Mais (Ishida et al/.; Nature-Biotechnology 14 (1996) 745-750) und Reis (Aldemita und Hodges; Planta 199 (1996) 612-617) unter Verwendung von Agrobacterium transformiert. Einer der Gründe, warum dieses Verfahren eine breite Anwendung in der Transformation von Pflanzen erfahren hat, ist seine hohe Transformationsrate. Beispielsweise wurden in Ko-Kultivierungsexperimenten mit Tabakprotoplasten ca. 25 % der Mikrocalli, die aus Protoplasten nach Ko-Kultivierung mit Agrobacterium (im Durchschnitt 20 %) regeneriert wurden, transformiert (Depicker et al.; Mol. Gen. Genet. 201 (1985) 477-484 und Van den Elzen et al/.; Plant Molecular Biology 5 (1985) 149-154). Dies bedeutet, das bis zu ca. 5 % der Zellen transformiert sind. Darüber hinaus ist das Verfahren viel einfacher im Vergleich zu anderen Pflanzentransformationsverfahren, die nackte DNA verwenden. Es kann auf intakte Pflanzengewebe, wie Segmente von Blättern, dem Stamm, der Wurzel und den Knollen ebenso wie die Protoplasten, angewendet werden. Darüber hinaus besitzt das Verfahren den Vorteil, dass nur die T-DNA, enthaltend die einzuführende Fremd-DNA, in das Ptlanzengenom integriert wird. Die Vektor DNA Sequenzen, die für Replikation und Selektion des Vektors in dem Bakterium benötigt werden, werden nicht von dem Bakterium in die Pflanzenzelle transportiert. Daher ist es ein relativ sauberes Transformationsverfahren.
Eine andere Agrobacterlum Art, Agrobacterium rhizogenes, besitzt ein ähnliches natürliches Gentransfersystem.
(3) Transformation von Mikroorganismen unter Verwendung von Agrobacterium
Zusätzlich zu den vielen Veröffentlichungen über Transformation von Pflanzen unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens wurden kürzlich die Ergebnisse einiger Untersuchungen über die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens zur Transformation von Mikroorganismen veröffentlicht. Beijersbergen et al. (Science 256 (1992) 1324-1327) zeigten, dass das Virulenzsystem von A. tumefaciens den konjugativen Transfer zwischen Agrobakterien vermitteln kann, was nur die Transformation von verschiedenen Stämmen derselben Art betrifft.
Bundock et al. (EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214) berichteten über die erfolgreiche Transformation von Hefe durch dieses Bodenbakterium. Dieses Ergebnis wurde anschließend von Piers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 1613-1618) bestätigt. Beide Gruppen verwendeten DNA Sequenzen aus S. cerevisiae wie den Hefe 2μ Ursprung (Bundock et al.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214) oder Hefe-telomere Sequenzen und den ARS1 Replikationsursprung (Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci USA 93 (1996) 1613-1618), um die T-DNA in Hefe zu stabilisieren. Vor kurzem berichteten Risseeuw et al. (Mol. Cell. Biol. 16 (1996) 5924-5932 und Bundock & Hooykaas (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 15272-15275) von Ergebnissen über den Mechanismus von T-DNA Integration in S. cerevisiae.
Die Daten, die durch diese Veröffentlichungen zur Verfügung gestellt wurden, zeigen, dass die Transformation von Mikroorganismen durch Agrobacterium tumefaciens sehr viel weniger effizient ist als die von Pflanzen. Wie oben erwähnt, wurden in Pflanzen bis zu 5 % der Zellen transformiert, wohingegen für Hefe über sehr viel niedrigere Raten von transformierten Zellen/Empfängerzellen berichtet wurde, nämlich 3 × 10^–3 (Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1966) 1613-1618 und 3,3 × 10^–6 (Bundock et al.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214).
Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass A. tumefaciens Transformation von Mikroorganismen weniger effizient ist als traditionelle Transformationstechniken für Mikroorganismen. Für gewöhnlich wird die Transformationsrate für die Übertragung von nackter DNA als die Zahl der Transformanten pro μg Vektor DNA angegeben, wohingegen die Transformationsrate für A. tumefaciens Transformation oft als die Zahl der transformierten Zellen, die im Verhältnis zu der Zahl der Empfängerzellen erhalten werden kann, ausgedrückt wird. In einer früheren Veröffentlichung über herkömmliche Transformation von Hefe (Gietz et al.; Yeast 11 (1995) 355-360) sind sowohl Werte für Transformanten/μg Vektor DNA als auch Werte über transformierte Zellen pro Empfängerzelle angegeben, was einen Zusammenhang zwischen den beiden Berechnungsverfahren für die Transformationsrate herstellt. Gietz et al. bestimmten, dass mit ihrem LiAc/SS-DNA/PEG Verfahren ein Maximum von ca. 4 % der Hefezellen in der Reaktion transformiert werden konnten, d.h. eine Transformationsrate von bis zu 4 × 10^–2. Aus 1A und der dazugehörigen Beschreibung dieser Veröffentlichung kann man berechnen, dass diese 4 % 8 × 10⁵ Transformanten/μg Vektor DNA entsprechen. Für A. tumefaciens Transformation von Hefe betragen die maximal berichteten Transformationsraten 3 × 10^–3 (Piers et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 1613-1618) und 3,3 × 10^–6 (Bundock et al.; EMBO-J. 14 (1995) 3206-3214), was einem Faktor von jeweils ca. 10 oder 10.000 niedriger als die maximale Transformationsrate (4 %) von Hefen mit nackter DNA, über die bei Gietz et al, berichtet wurde, entspricht.
Basierend auf diesem Beweis scheint A. tumefaciens kein zusätzliches vielversprechendes Werkzeug für die Transformation von Mikroorganismen zu sein, weil die Transformationsraten, die mit A. tumefaciens erhalten werden, sehr viel geringer sind als jene, die mit herkömmlichen Transformationsverfahren für Hefe erzielt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf der Idee der Verwendung von Agrobacterium für die Transformation von Schimmelpilzen. Ungeachtet der gerade angegebenen niedrigen Transformationsraten, die mit nur einer Hefeart, nämlich Saccheromyces cerevisiae, erhalten wurden, haben sich die Erfinder entschieden, die Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation des Schimmelpilzes Aspergillus awamori zu untersuchen. Der zuletzt Genannte ist ein wichtiger Schimmelpilz für die Herstellung von Enzymen, Proteinen und Metaboliten, aber er besitzt den Nachteil, dass die herkömmlichen Schimmelpilztransformationstechniken relativ ineffizient sind, wie durch die oben genannten Zahlen gezeigt wird (siehe Ward et al.).
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Pflanzentransformationstechnik mit Agrobacterium tumefaciens erfolgreich auf den Schimmelpilz Aspergillus awamori angewandt werden konnte. Nach einigen Versuchen wurde eine Transformationsrate von mehr als 70.000 Transformanten pro 10⁷ Empfängerzellen erhalten, was ca. 400fach der Transformationsrate, die mit herkömmlicher Transformation erhalten wird, entspricht (siehe Beispiel 1 unten).
Anschließend wurde diese Technik auch erfolgreich auf eine große Vielzahl von Schimmelpilzen angewendet, einschließlich Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Fusarium solani pisi (CBS 230.34), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Trichoderma reesei (CBS 383.78), Colletotrichum gloeosporioides (CBS 862.70), Neurospora crassa (CBS 195.57), Pleurotus ostreatus (Stamm Somycel 3015; erworben von „Proefstation voor de Champignoncultuur"), und Agaricus bisporus (kommerzieller Stamm Horst U1, ebenfalls erworben von „Proefstation voor de Champignoncultuur"). Diese Schimmelpilze gehören zu verschiedenem taxonomischen Hintergrund, wie in Tabelle 1 unten gezeigt ist. Tabelle 2 unten bezeichnet die ungefähre Zahl von Gattungen und Arten innerhalb jeder Abteilung der Eumycota. Die Unterabteilung Mastigomycotina umfasst die Chytridiomycetes und die Oomycetes. Wie in Beispiel 11 beschrieben ist, wurde die direkte Transformation von Agaricus bisporus Stamm Horst U1 vorher nicht durchgeführt. Deshalb liefert die Erfindung zum ersten Mal eine direkte Transformation dieses wirtschaftlich wichtigen Horst U1 Stammes.
Daher betrifft die Erfindung in einem breiten Sinn die Transformation von Schimmelpilzen, die auch als filamentöse Pilze bekannt sind. Die Beispiele, die unten gegeben sind, repräsentieren die drei Hauptunterabteilungen der Eumycota, die zusammen ca. 95 % der Schimmelpilzarten bilden (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2 Ungefähre Zahl von Gattungen und Arten in jeder Abteilung der Eumycota (wie veröffentlicht von O'Donnell und Peterson in Kapitel 2 des Buches „Biotechnology of Filamentous Fungi, Technology and Products" (1992) 7-33, herausgegeben von Finkelstein und Ball)
Für Colletotrichum gloeosporioides ist das erfindungsgemäße Verfahren ca. 5- bis 10fach besser als die veröffentlichte Rate für die Übertragung von nackter DNA (siehe Beispiel 5). Einige der weiteren getesteten Schimmelpilze, wie Fusarium graminearum (siehe Beispiel 7), Neurospora crassa (siehe Beispiel 8), Trichoderma reesei (siehe Beispiel 9) und Pleurotus ostreatus (siehe Beispiel 10) ergaben Transformationsraten nach Agrobacterium Transformation, die ähnlich waren zu den optimalen Übertragungsverfahren für nackte DNA. Die Schimmelpilze Aspergillus nidulans, Aspergillus niger und Fusarium solani ergaben Transformationsraten nach Agrobacterium Transformation, die niedriger sind als die Raten für die Übertragung von nackter DNA. Bei den Aspergillus Arten wird dies vermutlich durch Probleme mit der Selektion von Transformanten verursacht (siehe Beispiele 3 und 4). Es sollte angemerkt werden, dass die Transformation von anderen Schimmelpilzen nicht optimiert wurde. Basierend auf der Erfahrung mit Agrobacterium Transformation in Pflanzen ist es wahrscheinlich, dass die Transformationsraten weiter gesteigert werden können.
Viele dieser Schimmelpilze sind wichtig in der Industrie, Landwirtschaft und in der biologischen Grundlagenforschung.
Beispielsweise wurde für Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Trichoderma reesei und Fusarium graminearum gezeigt, dass sie attraktive Wirte für die Herstellung von homologen und heterologen Proteinen im großen Maßstab sind (Van den Hondel et al.; „Heterologous gene expression in filamentous fungi" (Kapitel 18) in dem Buch „More Gene Manipulations in Fungi" (1991) 397-428, herausgegeben von Bennett und Lasure; Verdoes et al.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 43 (1995) 195-205; Royer et al.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483). Sie besitzen die Fähigkeit, wesentliche Mengen an Protein in das Medium abzugeben, die Fermentation im großen Maßstab ist für gewöhnlich gut etabliert, und sie besitzen einen GRAS (Generally Recognized As Safe) Status, der es möglich macht, diese Arten in der Nahrungsmittel- und nahrungsmittelverarbeitenden Industrie einzusetzen.
Darüber hinaus wurde der Schimmelpilz Fusarium graminearum A 3/5, der Quorn^® Mykoproteinpilz außerdem als eine kommerzielle humane Nahrungsmittelquelle im Vereinigten Königreich für über zehn Jahre verwendet (Royer et al.; Bio/Technology 13 (1995) 1479-1483).
Die Schimmelpilze Fusarium solani und Colletotrichum gloeosporioides sind Pilzpathogene (Marek et al.; Curr. Genet. 15 (1989) 421-428; Hwang et al.; The Plant Cell 7 (1995) 183-193).
Sowohl Aspergillus nidulans als auch Neurospora crassa sind wichtige Organismen für die Grundlagenforschung bezüglich genetischer Mechanismen, biochemischer Wege und zellulärer Physiologie (Vollmer und Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4869-4873; Das Buch „Aspergillus 50 year on" (1994), herausgegeben von Martinelli und Kinghorn).
Die Champingnons Pleurotus ostreatus und Agaricus bisporus sind essbar und wirtschaftlich wichtig. Erfolgreiche Transformationen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Beispielen 10 und 11 beschrieben.
Darüber hinaus wurde herausgefunden, das nicht nur ein exprimierbares Gen in diese Schimmelpilze eingeführt werden kann, sondern sogar multiple Kopien solcher Gene, die darüber hinaus auch zielgerichtet werden können, z. B. in den chromosomalen pyrG Locus. Diese multiplen Kopien können von einem Gen abstammen, das ein gewünschtes, homologes oder heterologes Protein kodiert. Diese Ausführungsform der Erfindung ist in Beispiel 12 dargestellt.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt die Herstellung des Plasmids pUR5750.
Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:

RB = rechte T-DNA Grenze (Right T-DNA Border),
Pnos = Promotorsequenz des Nopalinesynthase Gens,
nptII = kodierende Region des Neomycinphosphotransferase II Gens aus Tn5,
Tocs = Terminatorsequenz des Octopinsynthase Gens,
TtrpC = Terminatorsequenz des A. nidulans trpCGens,
hph = kodierende Region des Hygromycinphosphotransferase Gens aus E. coli,
Pgpd = Promotorsequenz des A. nidulans gpd Gens,
LB = linke T-DNA Grenze (Left T-DNA Border).

2 zeigt die Herstellung des Plasmids pUR5751.
Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:
AMA1 = der Plasmidreplikator AMA1 aus Aspergillus nidulans
3 zeigt das Autoradiogramm des Southern Blots von acht unabhängigen Aspargillus awamori Transformanten (Nr. 1 – 8). Die genomische DNA wurde mit Bg/II oder HindIII (Spur 1) gespalten oder blieb ungespalten (Spur 2). M zeigt den 1 kb DNA Marker (BRL), die Hybnidisierungsbande zeigt das 1,6 kb Markerfragment. N (in der oberen Abbildung) ist eine Negativkontrollprobe mit untransformiertem Schimmelpilzgewebe.
4 zeigt das Autoradiogramm des Southern Blots von neun unabhängigen Schimmelpilztransformanten. Nummer 1 und 2 sind Aspergillus niger Transformanten, Nummer 5 und 6 sind Trichoderma reesei Transformanten, Nummer 7 und 8 sind Fusarium graminearum Transformanten, Nummer 9 und 10 sind Neurospora crassa Transformanten und Nummer 11 ist eine Colletotrichum gloeosporioides Transformante. Die Spuren 3, 4 und 12 enthielten keine DNA. Die genomische DNA wurde mit HindIII (obere Abbildung) oder Bg/II (untere Abbildung) gespalten. P (in der oberen Abbildung) stellt eine Positivkontrolle dar, die ungespaltene DNA aus der Aspergillus awamori Transformante 7 (siehe 3) ist. N (in der unteren Abbildung) sind Negativkontrollproben von untransformierten Schimmelpilzen. M zeigt den 1 kb DNA Marker (BRL), die Hybridisierungsbanden zeigen das 0,5 und 1,6 kb Markerfragment.
5 zeigt das Autoradiogramm des Southern Blots von vier unabhängigen Agaricus bisporus Transformanten (Nr. 1 – 4). Die genomische DNA wurde mit Bg/II (see 1B – 4B) gespalten oder blieb ungespalten (siehe 1U – 4U). M zeigt den 1 kb DNA Marker (BRL).
6 zeigt den Versuchsablauf des Vorgangs für die ortsgerichtete Integration von multiplen Kopien eines Gens in den Schimmelpilz A. awamori.

A. Das Wildtyp pyrG Gen ist in dem oberen Teil der Figur gezeigt. Der kodierende Bereich des Gens ist durch das hellgrau schattierte Kästchen angegeben.
B. Darunter sind der Ziellocus, enthaltend den verbleibenden, nichtfunktionellen 5' Abschnitt des pyrG Gens und 3' flankierende Sequenzen des chromosomalen pyrG Locus in dem A. awamori Stamm AWCSCE, gezeigt. Dieser Stamm wurde aus einem Wildtyp A. awamori durch Deletion eines Teils des 3' Abschnitts des pyrG Gens hergestellt. Dieser Stamm wurde ebenfalls für andere Transformationsarbeiten verwendet, in denen eine I-SceI Stelle, die unterhalb des verbleibenden 5' Abschnitts des pyrG Gens liegt, für andere Zwecke verwendet wurde. „Sa/I – I-SceI – HindIII" bedeutet einen synthetischen DNA Linker, enthaltend die 18 bp Erkennungsstelle für die I-SceI-Endonuklease (5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3' = SEQ ID NR 1), flankiert von Sa/I und Hind/III Stellen; I-SceI ist eine selten schneidende Restriktionsendonuklease aus Saccharomyces cerevisiae.
C. Das Fragment, das in den Stamm AWCSCE eingeführt wird, enthält einen nicht-funktionellen 3' Abschnitt des pyrG Gens, der teilweise homolog ist zu dem verbleibenden 5' Abschnitt des pyrG Gens an dem chromosomalen Ziellocus, eine oder multiple Genkopien (dargestellt durch die dunkelgrau schattierten Kästchen 1, 2 und n), umfassend (a) ein strukturelles Gen/strukturelle Gene, kodierend (a) ein gewünschtes Protein/gewünschte Proteine und eine zusätzliche Sequenz aus dem pyrG Locus, die homolog ist zu Sequenzen, die unmittelbar unterhalb der I-SceI Stelle in dem Ziellocus liegen. Dieses Fragment liegt in einem Vektor von Agrobacterium tumefaciens zwischen den T-DNA Grenzen, die in diesem Vektor vorkommen, wobei dieser Vektor in einen Agrobacterium tumefaciens Stamm eingeführt wird, der eine vir Region in seiner DNA enthält.
D. Nach homologer Rekombination wird das intakte pyrG Gen wiederhergestellt, und die multiplen Genkopien werden gleichzeitig in den pyrG Locus integriert, was in dem unteren Abschnitt der Figur dargestellt ist.

7 zeigt die Herstellung der Plasmide pUR5710, pUR5711 und pUR5712.
Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:

amp = Ampicillinresistenz Gen
pyrG = pyrG Gen aus A. awamori, „pyrG oder pyrG" zeigt an, dass das jeweils an dem 5' oder 3' Ende verkürzt ist.

8 zeigt die Herstellung des Plasmids pUR5713 (8A) und pUR5714 (8B). Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:
pBS-SK = pBluescript^®-SK
9 zeigt die Herstellung der Plasmide pUR5716 und pUR5718. Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:
cos = cos Stelle
10 zeigt die Herstellung des Plasmids pUR5729. Erklärung der Abkürzungen, die in dem Herstellungsschema verwendet werden:

PexIA = Promotorsequenz des A. awamori 1,4-β-Endoxylanase A Gens,
cut = kodierende Region des F. solani pisi Cutinase-Gens (synthetische Kopie von cDNA),
TexIA = Terminationssequenz des A. awamori 1,4-β-Endoxylanase A Gens

11 zeigt die Herstellung des Cosmids pUR5725.
12 zeigt die Herstellung des Plasmids pUR5756.
In den 10 – 12 wurde „cut" oder „cu" verwendet, um die Cutinaseexpressionskassette zu bezeichnen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Schimmelpilzes, dadurch gekennzeichnet, dass

(1) ein DNA Fragment, enthaltend wenigstens ein exprimierbares Gen zur Einführung in einen Schimmelpilz, zuerst in einen Vektor von Agrobacterium tumefaciens zwischen die T-DNA Grenzen, die in dem Vektor vorliegen;
(2) der Vektor enthaltend das DNA Fragment zwischen den T-DNA Grenzen in einen Agrobacterium tumefaciens Stamm, der eine vir Region in seiner DNA enthält, eingeführt wird;
(3) T-DNA enthaltend das DNA Fragment aus dem Agrobacterium tumefaciens durch Hinzufügen einer vir induzierenden Verbindung freigesetzt wird, und der Agrobacterium tumefaciens Stamm mit dem zu transformierenden Schimmelpilz inkubiert wird; und
(4) der transformierte Schimmelpilz von dem untransformierten Schimmelpilz in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingeführten DNA oder ihres Expressionsproduktes selektiert wird, und wahlweise der transformierte Schimmelpilz kultiviert wird.

Die Selektion des transformierten Schimmelpilzes kann durchgeführt werden, indem ein selektierbarer Marker verwendet wird. Beispielsweise ist ein solcher selektierbarer Marker eine Eigenschaft eines natürlich vorkommenden Wildtyp-Schimmelpilzstammes, während der zu transformierende Schimmelpilzstamm ein mutanter Stamm davon ist, und defizient ist in dem selektierbaren Marker, z.B. im Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylasegen (pyrG Gen), das in Wildtyp Aspergillus awamori vorkommt. Geeignete selektierbare Marker schließen Antibiotikaresistenzmarker, Gene für die Nutzung von Metaboliten, die normaler Weise nicht in diesem Schimmelpilzstamm verwendet werden, und Gene, die ein einfach zu testendes Produkt bilden, ein.
Manchmal kann die in den Schimmelpilz eingeführte DNA als selektierbarer Marker verwendet werden. Wenn beispielsweise die eingeführte DNA exprimiert wird, kann dies zu einem Produkt führen, das in dem nicht-transformierten Schimmelpilz nicht gebildet wird, das aber mehr oder weniger einfach zu testen ist. Oder die Anwesenheit oder Abwesenheit der DNA kann durch die Anwendung von PCR-Techniken bestimmt werden.
Vorzugsweise gehört der Schimmelpilz zu der Pilzabteilung der Eumycota, weiter bevorzugt zu einer der Pilzunterabteilungen

– Ascomycotina einschließlich der Arten Aspergillus nidulans und Neurospora crassa,
– Basidiomycotina einschließlich Bjerkandera, Coprinus, Coriolus Arten und der Arten Agaricus bisporus, Flammulina velutipes (Enokitake), Lentinus edodes (Shiitake), Phanerochaete chrysosporium, Schizophyllum commune, Tricholma matsutake und Pleurotus ostreatus,
– Deuteromycotina einschließlich Beauveria und Metarhizium Arten (geeignet als biologische Kontrollmittel gegen Insekten), Acremonium und Penicillium Arten (geeignet für die Herstellung von Antibiotika) und die Arten Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Fusarium solani, Fusarium graminearum, Trichoderma reesei und Colltotrichum gloeosporioides,
– Mastigomycotina umfassend die Oomycetes einschließlich Achlya (geeignet für die Herstellung von pharmazeutisch aktiven Proteinen), Phytophtora, Pythium und Plasmopara Arten und die Chytridiomycetes einschließlich Rhizophydium und Rhizophlyctis Arten, und
– Zygomycotina einschließlich Mucor und Rhizopus Arten.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, in dem das DNA Fragment multiple Kopien eines gewünschten Genes enthält. Alternativ dazu kann das DNA Fragment wenigstens eine Kopie von mehreren Genen enthalten, oder es kann eine oder mehrere Kopie(n) eines fusionierten Gens enthalten.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das DNA Fragment in einen ausgewählten Locus des Schimmelpilzgenoms integriert. Ein Beispiel für einen solchen ausgewählten Locus ist der pyrG Locus des Schimmelpilzgenoms (der als der pyrA Locus für A. niger und der pyr4 Locus für Neurospora crassa bekannt ist). Dies erlaubt die Herstellung eines transformierten Schimmelpilzes, der keine ungewünschte bakterielle DNA Sequenz einschließlich einer T-DNA Grenze enthält.
Daher stellt die Erfindung einen transformierten Schimmelpilz zur Verfügung, der erhältlich ist durch Agrobacterium vermittelte Transformation gemäß der Erfindung, der keine ungewünschte DNA Sequenz, einschließlich einer T-DNA Grenze, enthält. Ein solcher transformierter Schimmelpilz kann in einem Verfahren zur Kultivierung eines transformierten Schimmelpilzes verwendet werden, um ein gewünschtes Protein herzustellen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, in dem das DNA Fragment zufällig in das Schimmelpilzgenom integriert ist, ebenso wie ein transformierter Schimmelpilz, erhältlich durch Agrobacterium vermittelte Transformation, der einen oder mehrere Abschitt(e) von T-DNA Grenzsequenzen aufweist und ein Verfahren zur Kultivierung eines solchen transformierten Schimmelpilzes, um ein gewünschtes Protein herzustellen.
Die Verwendung von supervirulenten A. tumefaciens Stämmen ist bevorzugt, weil sie eine relativ hohe Transformationsrate ergeben. Solche Stämme, deren Verwendung und Vektoren für die Herstellung solcher Stämme sind in der Literatur beschrieben; siehe Jin et al. (J. Bacteriology 169 (1987) 4417-4425 & Molecular Microbiology 7 (1993) 555-562), Raineri et al. (BIO/TECHNOLOGY 8 (Januar 1990) 33-38) und Ishida et al. (Nature Biotechnology 14 (1996) 745-750) für Pflanzentransformation und Piers et al. für Hefetransformation.
Die Transformation kann durch ein binäres System oder durch Ko-Integration durchgeführt werden auf ähnlichem Weg, wie er bekannt ist für die oben in Abschnitt (2) diskutierte Pflanzentransformation unter Verwendung von Agrobacterium.
Alle Arten von Schimmelpilzgewebe können verwendet werden einschließlich Protoplasten, Konidiosporen, keimenden Sporen, Mycelien und Pellets, von denen Protoplasten, Konidien und rehydriertes gefriergetrocknetes Kulturmaterial exemplarisch unten dargestellt sind.
Die Vorteile von Agrobacterium vermittelter Transformation von Schimmelpilzen schließen ein

– es ist ein „nahrungsmittelreines" Verfahren, das zu einem Schimmelpilzstamm ohne Reste von bakteriellen Antibiotikaresistenzmarkern oder anderen bakteriellen Sequenzen wie Replikationsursprüngen führt,
– größere Abschnitte von DNA können eingeführt werden. Im Gegensatz zu den älteren Verfahren von Schimmelpilztransformation mit nackter DNA, mit denen bis zu ca. 40 kb DNA eingeführt werden können, wurde mit Agrobacterium vermittelter Pflanzentransformation wenigstens 150 kb Fremd-DNA in das Pflanzengenom eingeführt (Hamilton et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 9975-9979).

Beispiele
Die Erfindung wird verdeutlicht durch die folgenden Beispiele 1 – 12, die begleitet werden von einer Beschreibung der Materialien und Methoden, die verwendet wurden. Diese Beispiele zeigen die Transformation von sowohl A. awamori Protoplasten (Bsp. 1) als auch Konidien (Bsp. 2), A. nidulans Konidien (Bsp. 3), A, niger Konidien (Bsp. 4), Colletotrichum gloeosporioides (Bsp. 5), Fusarium solani pisi Konidien (Bsp. 6) sowohl von Fusarium graminearum Konidien als auch rehydratiertem gefriergetrocknetem ATCC Material (Bsp. 7), Neurospora crassa Konidien (Bsp. 8), Trichoderma reesei Konidien (Bsp. 9), Pleurotus ostreatus Konidien (Bsp. 10) und Agaricus bisporus Konidien (Bsp. 11). Darüber hinaus zeigt Beispiel 12 die Transformation von A. awamori durch Einführen von multiplen Kopien einer Cutinaseexpressionskassette in den pyrG Locus.
MATERIALIEN UND METHODEN
Bakterielle Stämme und Schimmelpilzstämme
Für die bakterielle Klonierung wurde der Escherichia coli Stamm DH5α (Genotyp: F, end A1, hsdR17 (rk^– mk⁺), supE44, thi-1, lamda^–, recA1, gyrA96, re/A1, Δ (argF lacIZYA)U169, deoR (phi80d-(lacn ΔM15); Hanahan; J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580) verwendet. Der Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA1100 wurde für die Transformation von Schimmelpilzen verwendet (Beijersbergen et al., 1992, Science, 256, S. 1324-1327). Die Schimmelpilzstämme Aspergillus awamori #40 (ein Derivat von A. awamori CBS 115.52, der auch in der WO 93/12237, Seite 9, Zeile 13, genannt ist), Aspergillus niger (Stamm N402, eine cspA1 (kurze Konidiophoren) Mutante von Aspergillus niger var. niger ATCC9029, CBS 120.49, der beschrieben ist in UNILEVER's WO 91/19782), Aspergillus nidulans (Laborsammlung URL-VL), Fusarium solani pisi (CBS 230.34), Fusarium graminearum (ATCC 20334), Trichoderma reesei (CBS 383.78), Colltotrichum gloeosporioides (CBS 862.70), Neurospora crassa (CBS 195.57) und Pleurotus ostreatus Stamm Somycel 3015 und Agaricus bisporus Stamm Horst U1 (beide erworben von „Proefstation voor de Chamgignoncultuur", Postfach 6042, 5960 AA Horst, Niederlande), wurden als der Empfänger in Transformationen mit Agrobacterium tumefaciens verwendet.
Die Herstellung von A. awamori #40 (auch als A, niger var. awamori #40 bekannt) wurde beschrieben in der WO 91/19782 auf Seite 13, Zeilen 29-39, in denen steht:

„Die Herstellungsmenge der A. niger var. awamori Transformanten kann jedoch weiter gesteigert werden, indem geeignete A. niger var. awamori mutante Stämme verwendet werden, wie A. niger var. awamori #40, der deutlich mehr Xylanase als der Wildtypstamm bildet.
Die Mutante A. niger var. awamori #40 wurde durch Mutagenese von A. niger var. awamori Sporen und Selektion auf Xylanasebildung erhalten. In Bran-Medium bildete die „xylA" A. niger var. awamori #40 Transformante 190.000 U Xylanase, was ein beträchtlicher Anstieg gegenüber der am besten bildenden A. niger var. awamori Transformante ist."

In dieser Beschreibung werden die folgenden Endonukleaseschnittstellen verwendet:
und die selten schneidende Restriktionsendonuklease aus Saccharomyces cerevisiae I-SceI 18 bp:
Plasmidherstellung
Das Plasmid pUR5750 (siehe 1) wurde hergestellt durch Klonierung eines 4 kb BglII/HindIII Fragments, das in dem Vektor pAN7.1 (Punt et al.; Gene 56 (1987) 117- 124) vorliegt und den Promotor des A. nidulans gpd Gens, fusioniert mit dem kodierenden Bereich des E. coli hph Gens und gefolgt durch Terminationssequenzen des A. nidulans trpCGens enthält, in die BamHI/HindIII Stelle des binären Vektors pBIN19 (Bevan, M.; Nucleic Acids Res. 22 (1984) 8711-8721).
Das Plasmid pUR5751 (siehe 2) wurde hergestellt durch Klonierung des Plasmidreplikators AMA1 aus Aspergillus nidulans (Aleksenko und Clutterbuck; Molecular Microbiology 19 (1996) 565-574) als ein 5,3 kb HindIII Fragment aus dem Plasmid pUR7984 in die HindIII Stelle von pUR5750. pUR7984 wurde erhalten durch Klonierung des 5,3 kb AMA1 HindIII Fragments aus pHELP1 (zur Verfügung gestellt von Clutterbuck) in die HindIII Stelle von pAN7.1. Das 5,3 kb AMA1 HindIII Fragment ist das Fragment zwischen der HindIII Stelle an Position 367 und der HindIII Stelle an Position 5620 der Sequenz, die in der EMBL/GenBank/DDBJ Nukleotidsequenzdatenbibliothek unter der Zugangsnummer X78051 hinterlegt ist.
Der Agrobacterium Stamm LBA1100, der zuerst von Beijersbergen et al. (Science 256 (1992) 1324-1327) beschrieben wurde und auf den in vielen späteren Veröffentlichungen Bezug genommen wird, wurde mit den Konstrukten pUR5750 und pUR5751 gemäß Mozo und Hooykaas (Plant Mol. Biol. 16 (1991) 917-918) elektroporiert.
Dieser Agrobacterium Stamm LBAi100 wurde am 27. März 1997 gemäß dem Budapester Vertrag bei dem Centralbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande (Nr. CBS 634.97) hinterlegt.
Transformationsexperimente
Der Agrobacterlum Stamm enthaltend den binären Vektor pUR5750 wurde bei 29°C über Nacht auf LB Platten, enthaltend die jeweiligen Antibiotika in den folgenden Konzentrationen, angezogen: Kanamycin, 100 μg/ml; Spectinomycin, 250 μg/ml, Rifampicin, 20 μg/ml. Eine einzelne Kolonie wurde auf einer Minimalmedium Platte ausgestrichen. Minimalmedium (MM) enthält pro Liter: 10 ml K-Puffer pH 7,0 (200 g/l K₂HPO₄, 145 g/l KH₂PO₄), 20 ml M-N (30 g/l MgSO₄ × 7H₂O, 15 g/l NaCl), 1 ml 1 % CaCl₂ × 2H₂O (w/v), 10 ml 20 % Glukose (w/v), 10 ml × 0,01 % FeSO₄ (w/v), 5 ml Spurenelemente (100 mg/l ZnSO₄ × 7N₂O, 100 mg/l CuSO₄, × 5H₂O, 100 mg/l H₃BO₃, 100 mg/l MnSO₄ × H₂O, 100 mg/l Na₂MoO₄ × 2H₂O) und 2,5 ml 20 % NH₄NO₃ (w/v) (Hooykaas et al.; J. Gen. Microbiol. 110 (1979) 99-109), Bacto-Agar bei 15 g/l und den entsprechenden Antibiotika. Die Platten wurden bei 29°C für 1 bis 2 Tage inkubiert. Mehrere Kolonien wurden in Minimalmedium, enthaltend die jeweiligen Antibiotika, inokuliert und bei 29°C über Nacht angezogen. Nach der Verdünnung von Agrobacterium Zellen auf eine OD_660nm von ungefähr 0,15 in Induktionsmedium wurde die Kultur für 6 Stunden bei 29°C angezogen. Das Induktionsmedium (IM) unterscheidet sich von Minimalmedium, indem die 10 ml 20 % Glukose (w/v) durch 10 mM Glukose ersetzt wurden, und 40 mM MES (ex Sigma) (pH 5,3), 0,5 % Glycerol (w/v) und 200 μM Acetosyringon (AS) wurden hinzugefügt. Um zu bestätigen, dass die Transformation der Schimmelpilze durch Agrobacterium unabhängig von der T-DNA Übertragung ist, wurde eine Negativkontrolle eingeschlossen, in welcher der vir Induktor AS weggelassen wurde. Es wurden Kolonien erhalten, wenn die Schimmelpilzstämme bei Raumtemperatur auf einem Nitrozellulosefilter (Hybond-N, Amersham) angezogen wurden, auf eine PDA (Kartoffeldextrose-Agar) (engt.: Potato Dextrose Agar) Platte für einige Tage gesetzt wurden und die Filter anschließend mit physiologischer Salzlösung gewaschen wurden. Protoplasten aus A, awamori wurden hergestellt wie bei Punt und Van den Hondel (Methods in Enrymology 216 (1993) 447-457) beschrieben. Für die Transformation von Protoplasten wurde ein 100 ml Aliquot, enthaltend 10⁶ bis 10⁷ Protoplasten mit 100 μl einer Agrobacterium Kultur gemischt. Für die Transformation von Konidien wurden die Konidien in physiologischer Salzlösung auf eine Konzentration von 10⁶, 10⁷ oder 10⁸ Konidien/ml verdünnt, und 100 μl wurden mit 100 μl einer Agrobacterium Kultur gemischt. Anschließend wurden die Mischungen auf Nitrozellulosefiltern ausplattiert, die auf IM Platten (IM Medium mit 15 g/l Bacto-Agar), enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt wurden und bei Raumtemperatur oder 29°C für 2, 3, 5 oder 6 Tage (wie in den Beispielen angegeben) inkubiert. Die Negativkontrollproben wurden auf IM Platten inkubiert, in denen der vir Induktor AS weggelassen wurde. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten überführt (Bennett und Lasure, Growth media in: Bennett und Lausure (Hrsg.) More gene manipulations in fungi, Academic Press, San Diego (1991) 441-458) oder auf PDA Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um Agrobacterium Zellen abzutöten, und Hygromycin (bezüglich der Konzentrationen siehe Beispiele), um auf Transformanten zu selektieren.
DNA Isolierung und Southern Analyse
Die Southern Analyse wurde durchgeführt, um auf einer molekularen Ebene zu bestätigen, dass die Schimmelpilzzellen transformiert worden waren und dass die gewünschte DNA in das Genom integriert worden war.
Um Mycel-Material für eine genomische DNA Isolierung zu erhalten, wurden ungefähr 10⁸ Schimmelpilzkonidien in 50 ml eines Aspergillus Minimalmediums, das mit 0,5% Hefeextrakt ergänzt worden war, inokuliert und für einen Zeitraum im Bereich von 22 Stunden bis 3 Tagen bei 30°C in einem Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Das Mycel wurde durch Miracloth^® (Calbiochem) geerntet und in flüssigem N₂ tiefgefroren. Die gefrorenen Proben wurden unter Verwendung eines Mikro-Dismembrator^® (ex Braun Biotech International) für 1 Minute bei 1750 rpm zu einem feinen Pulver gemahlen. Die schimmelpilzgenomische DNA wurde unter Verwendung von Qiagen genomic tips (Kat. Nr. 10223) und gemäß dem Protokoll für genomische DNA Reinigung aus filamentösen Pilzen, das von dem Hersteller zur Verfügung gestellt wurde, isoliert. Der Schritt für die Spaltung von Zellwandmaterial wurde weggelassen. Ungefähr 2,5 μg DNA wurden mit BglII oder HindIII (4 Units/μg) für 16 Stunden gespalten und auf einem 0,8 % Agarose TBE Gel aufgetrennt. Die DNA wurde auf eine Hybond N Membran durch Kapillarblotten (über Nacht) übertragen, und die Membran wurde gemäß dem Hybond Protokoll (prä-)hybridisiert. Für den Southern Blot, der in 3 gezeigt ist, wurde das 4 kb BglII/HindIII Fragment aus pAN7.1, das oben beschrieben ist, als Sonde verwendet. Für den Southern Blot, der in den 4 und 5 gezeigt ist, wurde das 0,8 kb BamHI/EcoRI Fragment von pAN7.1 als Sonde verwendet, die einen Teil des E. coli hph Gens enthält. Es wurde eine DNA Sonde, die mit α³²P-dCTP markiert wurde unter Verwendung des RTS RadPrime DNA Markierungssystems von GibcoBRL (Kat. Nr. 10387-017) erhalten. Die elektronischen Autoradiogramme wurden unter Verwendung eines Instant Imager (Packard) erhalten.
Beispiel 1 Transformation von A. awamori Protoplasten
Für die Protoplastenisolation wurde eine Schüttelflasche, enthaltend 200 ml MM Medium einschließlich 0,5 % Hefeextrakt mit 10⁶ Konidien/ml von A, awamori inokuliert und für 18 Stunden bei 30°C in einem Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Das Mycel wurde durch steriles Miracloth^® geerntet und mit eiskaltem 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Mycel wurde in OM Medium (pro Liter: 500 ml 2,4 M MgSO₄, 480 ml H₂O, 16,8 ml 0,5 M Na₂HPO₄, 3,2 ml 0,5 M Na₂HPO₄, pH 5,8 – 5,9) zu 5 ml/g Mycel resuspendiert. Anschließend wurden 5 mg Novozym 234^® und 6 mg BSA pro g Mycel hinzugefügt. Die Bildung von Protoplasten wurde für 1 – 2 Stunden bei 30°C in einem Schüttler bei 80 – 100 rpm fortgesetzt. Die Bildung von Protoplasten wurde unter Verwendung eines Lichtmikroskops überprüft. Die Protoplasten wurden durch steriles Miracloth^® filtriert, und die Probe wurde in 30 ml Aliquots in Falconröhrchen geteilt. STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂ × 2H₂O) wurde hinzugefügt, um das Volumen auf 50 ml zu bringen, und die Protoplasten wurden durch Zentrifugation bei 2000 rpm für 10 Minuten bei 4°C geerntet. Die Protoplasten wurden nochmals in 50 ml STC gewaschen und in STC bei einer Konzentration von ungefähr 10⁸ Protoplasten/ml resuspendiert. Um die Transformationsrate bei Verwendung von A. tumefaciens mit PEG Transformation zu vergleichen, wurden PEG Transformanten ebenfalls hergestellt. Fünf μg pAN7.1 wurden zu einem Aliquot von 100 μl (10⁷) Protoplasten hinzugefügt, gemischt und für 25 Minuten auf Eis inkubiert. PEG wurde in zwei 200 μl Aliquots und einem 850 μl Aliquot hinzugefügt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Schließlich wurde die Mischung mit 10 ml STC gewaschen, sie wurde durch Zentrifugation bei 2000 rpm für 10 Minuten bei Raumtemperatur geerntet, und die Probe wurde auf einer MM Platte, enthaltend 100 μg/ml Hygromycin für die Selektion auf Transformanten ausplattiert.
Für die A. tumefaciens Transformation wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 3 × 10⁶ bis 10⁷ Protoplasten, mit 100 μl A. tumefaciens gemischt, der angezogen wurde wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Aus dieser Probe wurden 1/10, 1/100 und 1/1000 Verdünnungen in IM hergestellt. Anschließend wurden die Mischungen auf Nitrozellulosefiltern ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur oder 29°C für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 100 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen.
Drei getrennte Experimente wurden mit A. tumefaciens, enthaltend den binären Vektor pUR5750, durchgeführt. In jedem Experiment wurden die Transformationen doppelt durchgeführt, und eine Negativkontrolle ohne AS wurde eingeschlossen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Transformierte hygromycinresistente Zellen wurden nur in Medium mit AS erhalten. Die Negativkontrollen enthielten nie transformierte Zellen. Diese Ergebnisse zeigen unzweideutig, dass die Induktion der vir Gene für die Übertragung der T-DNA auf die Schimmelpilzzelle essentiell ist, und damit, dass A. tumefaciens die Fähigkeit besitzt, den Schimmelpilz Aspergillus awamori zu transformieren. Die Transformationsrate schwankte zwischen ungefähr 300 bis 7200 Transformanten pro 10⁷ Protoplasten, was wesentlich höher ist als die Werte für PEG Transformation, die in früheren nicht-veröffentlichten Experimenten erhalten wurden. Bei der PEG Transformation mit pAN7.1 (enthaltend die gleiche Expressionskassette mit dem Hygromycingen als selektierbarem Marker, der ebenfalls in pUR5750 vorliegt, siehe „Materialien und Methoden") wurden bis zu 18 Transformanten pro μg pro 10⁷ Protoplasten erhalten. Dies stimmt mit dem Wert von ca. 12 Transformanten/μg Vektor DNA überein, die von Ward et al. (siehe oben) veröffentlicht wurden.
Diese Daten zeigen, dass bei Verwendung von A. tumefaciens vermittelter Schimmelpilztransformation bis zu 400 Mal mehr Transformanten gebildet werden können als mit PEG Transformation (pro μg pro 10⁷ Protoplasten).
Darüber hinaus wurde in Experiment 3 (siehe Tabelle 3 unten) ein direkter Vergleich zwischen beiden Transformationsverfahren, unter Verwendung desselben Batches an Protoplasten, angestellt. In zwei PEG Transformationen wurden bei Verwendung von 5 μg pAN7.1 pro Transformation von 10⁷ Protoplasten jeweils 6 bzw. 16 Transformanten erhalten. Im Durchschnitt sind dies 2,2 Transformanten pro μg pro 10⁷ Protoplasten. Bei Verwendung von A. tumefaciens Transformation wurden 300 und 480 Transformanten pro 10⁷ Empfängerzellen erhalten, dies sind im Durchschnitt 390 Transformanten pro 10⁷ Empfängerzellen.
Daher wurden bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bei Verwendung von A. tumefaciens Transformation ca. 180 Mal mehr Transformanten erhalten.
Tabelle 3 Transformation von Schimmelpilzen bei Verwendung von Agrobacterium tumefaciens
Tabelle 3 Transformation von Schimmelpilzen bei Verwendung von Agrobacterum tumefaciens (Fortsetzung)
In den Experimenten 1 und 2 wurde die Ausplattierrate (% überlebender Zellen relativ zur Zahl der Ausgangszellen) durch Ausplattieren von 1/1000 und 1/10.000 Verdünnungen auf MM Platten ohne Hygromycin bestimmt. In Experiment 1 betrug die Ausplattierrate 5 %, und in Experiment 2 betrug sie 2,6 %.
Der Hyg-resistente Phänotyp der Transformanten wurde für 78 zufällig ausgewählte Transformanten bestätigt, indem die Konidien auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 100 μg/ml Hygromycin, ausgestrichen wurden. Für acht dieser Transformanten wurden Konidien aus einzelnen Kolonien abermals auf MM Platten, enthaltend 100 μg/ml Hygromycin ausgestrichen. Dies wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurden Konidien isoliert, und es wurden Kulturen angezogen, um Mycel für genomische DNA Isolierung zu erhalten. Die DNA Isolierung und die Southern Analyse ist in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die genomische DNA wurde mit BglII oder HindIII gespalten. BglII schneidet nicht in der T-DNA, deshalb bildet diese Spaltung ein Fragment, das die gesamte T-DNA sowie die chromosomalen Sequenzen, die sowohl die rechten und linken Grenzstellen der T-DNA flankieren, umfasst. Dieses Fragment ist mindestens 7,5 kb groß. HindIII schneidet einmal in der T-DNA, und die pAN7.1 Sonde detektiert nur das T-DNA Fragment, das die Hygromycinexpressionskassette und die chromosomalen Sequenzen, welche die linke T-DNA Grenze flankieren, trägt. Dieses Fragment ist mindestens 5 kb groß. Ungespaltene DNA wurde eingeschlossen, um die Anwesenheit der T-DNA in der Hochmolekulargewicht chromosomalen DNA zu bestätigen. Die Autoradiogramme der Southern Blots sind in 3 gezeigt. In allen acht Transformanten wurde die T-DNA in einen einzigen chromosomalen Locus integriert. Sieben von acht enthielten außerdem eine einzelne T-DNA Integration. In einem Fall war die T-DNA als eine Tandemwiederholung integriert. Bei den ungespaltenen DNA Proben fällt das Hybridisierungssignal mit der Hochmolekulargewichts-DNA zusammen, was die T-DNA Integration in das Chromosom bestätigt.
Es wurden nicht nur Transformationen mit A. tumefaciens mit dem binären Vektor pUR5750 durchgeführt, sondern auch mit dem binären Vektor pUR5751 (siehe 2). Dieser Vektor enthält den Plaspidreplikator AMA1 von Aspergillus nidulans Plasmide, die das AMA1 Replikon tragen, besitren die Fähigkeit, dass sie autonom in Aspergillus nidulans aufrecht erhalten werden. Deshalb sollte diese T-DNA fähig sein, eine transformierte Zelle zu erhalten, in der die T-DNA als ein extrachromosomales Element vorliegt. Die Ergebnisse von zwei Experimenten sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Die Transformationsrate schwankte von ungefähr 300 bis 950 Transformanten pro 10⁷ Protoplasten. Der Hygromycin-resistente Phänotyp von Transformanten wurde für 20 zufällig ausgewählte Transformanten bestätigt, indem die Sporen auf MM Platten, enthaltend 100 μg/ml Hygromycin ausgestrichen wurden.
Beispiel 2 Transformation von Aspergillus awamori Konidien Für die A. tumefaciens Transformation von Aspergillus awamori Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁷ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens gemischt, das angezogen worden war wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Von dieser Probe wurden 1/10 oder 1/100 Verdünnungen in IM hergestellt. Anschließend wurden die Mischungen auf Nitrozellulosefilter ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten und 100 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, überführt. Die Ergebnisse von zwei Experimenten sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Die Transformationsrate schwankte von ungefähr 1000 bis 2000 Transformanten pro 10⁷ Konidien, was in dem gleichen Bereich liegt wie die Rate nach Protoplastentransformation. Der Hygromycin-resistente Phänotyp der Transformanten wurde für 15 unabhängig ausgewählte Transformanten bestätigt, indem die Konidien auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 100 μg/ml Hygromycin ausgestrichen wurden.
Beispiel 3 Transformation von Aspergillus nidulans Konidien Für die A. tumefaciens Transformation von Aspergillus nidulans Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁷ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens gemischt, das angezogen worden war wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefilter ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μl Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 1000 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, überführt. Die Filter wurden mit MM Agar, enthaltend Cefotaxim und Hygromycin in gleichen Konzentrationen, überschichtet.
Die Aspergillus nidulans Selektion erwies sich als schwierig. Anscheinend keimten die Konidien während der Ko-Kultivierung und wuchsen für eine stringente Selektion zu weit aus. Diese Beobachtung stimmt überein mit den Ergebnissen, die von Cullen et al. (Gene 57 (1989) 21-26) erhalten wurden. Sie bestimmten, dass die Inkubationszeit vor Beginn der Selektion für ein gutes Ergebnis sehr wichtig ist. Wenn eine Inkubationszeit von mehr als 16 Stunden vor Selektion eingehalten wurde, führte dies zu einem signifikanten Hintergrundwachstum, wohingegen nach einer Inkubationszeit von nur 8 Stunden keine Kolonien beobachtet wurden. Die beschriebenen Zahlen wurden nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden erhalten. Sie beobachteten außerdem eine deutliche Stammvariabilität bezüglich der Hygromycinsensitivität. Angesichts der Ergebnisse von Cullen et al. könnte die Transformationsrate dieses Beispiels durch Optimierung der Inkubationszeit vor der Selektion verbessert werden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Insgesamt wurden 15 mutmaßlich transformierte Kolonien erhalten. Darüber hinaus führte die Negativkontrolle zu drei wachsenden und sporulierenden Kolonien. Um den transformierten Phänotyp zu bestätigen, wurden Konidien auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 1000 μg/ml Hygromycin ausgestrichen. Die Negativkontrollen wuchsen nicht, und nur 2 der 15 mutmaßlichen Transformanten konnten wachsen. Deshalb hing auch in diesem Fall die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab.
Literaturdaten von PEG Transformationen unter Verwendung des Hygromycinresistenzgens zeigten Transformationsraten von 5 – 20 Transformanten pro μg Vektor DNA (Cullen et al.; Gene 57 (1987) 21-26; Punt et al.; Gene 56 (1987) 117-124).
Bei Verwendung anderer selektierbarer Marken, des argB Gens, erhielten Fungaro et al. (FEMS Microbiology Letters 125 (1995) 293-298) bis zu 81 Transformanten pro μg Vektor DNA, wohingegen 20 – 300 Transformanten pro μg Vektor DNA mit dem trpC Gen als dem Marker (Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1470-1474) erhalten wurden. Diese Literaturdaten legen nahe, dass die Zahl der Transformanten, die bei Verwendung von Agrobacterium Transformation erhalten werden kann, durch Verwendung eines anderen selektierbaren Markergens verbessert werden kann.
Beispiel 4 Transformation von Aspergillus niger Konidien
Für die A. tumefaciens Transformation von Aspergillus niger Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁵, 10⁶ oder 10⁷ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens gemischt, das angezogen worden war wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefiltern ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 200 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen. Im Allgemeinen erwies sich die Selektion als schwierig. Offensichtlich keimten die Konidien während der Ko-Kultivierung und wuchsen für eine stringente Selektion zu weit aus. Dies könnte zu einem gewissen Grad verbessert werden, indem man eine Überschichtung auf den Filtern verwendet, die aus MM Agar, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 200 μg/ml Hygromycin, besteht.
Die Ergebnisse eines typischen Experiments sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Das Experiment führte zu 6 wachsenden Kolonien auf der Negativkontrollplatte und 6 mutmaßlich transformierten Kolonien auf den Transformationsplatten, die AS enthielten. Um den Hygromycin-resistenten Phänotyp dieser Kolonien zu bestätigen, wurden Konidien aller zwölf Kolonien auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 200 μg/ml Hygromycin ausgestrichen. Nur fünf der sechs mutmaßlichen Transformanten wuchsen auf den neuen Selektionsplatten. Die verbleibenden mutmaßlichen Transformanten und die Kolonien aus dem Negativkontrollexperiment wuchsen nicht. Deshalb hing auch in diesem Fall die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Zwei Transformanten wurden der Southern Analyse unterzogen. Die genomische DNA wurde mit BglII oder HindIII gespalten. BglII schneidet nicht in der T-DNA, deshalb wird diese Spaltung ein Fragment bilden, das die gesamte T-DNA und die chromosomalen Sequenzen, die sowohl die rechten als auch die linken Grenzstellen der T-DNA flankieren, enthält. Das Fragment wird mindestens 7,5 kb groß sein. HindIII schneidet einmal in der T-DNA und die Sonde für das hph Gen aus pAN7.1 weist nur das T-DNA Fragment nach, das die Hygromycinexpressionskassette und die chromosomalen Sequenzen, welche die linke T-DNA Grenze flankieren, trägt. Dieses Fragment wird mindestens 5 kb groß sein. Die Southern Analyse (siehe 4) zeigte, dass in beiden Transformanten die T-DNA in einen einzelnen chromosomalen Locus integriert war, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigt.
Literaturdaten über PEG vermittelte Protoplastentransformation unter Verwendung des Hygromycinresistenzgens zeigen Transformationsraten von 5 – 20 Transformanten pro μg (Punt et al.; Gene 56 (1987) 117-124) und bis zu 17.000 Transformanten pro μg (Mohr und Esser; Appl. Microbiol. Biotechnicol. 34 (1990) 63-70). Jedoch erwähnen die zuletzt genannten Autoren in ihrer Veröffentlichung:
„Nach der Koloniereinigung der primären Isolate auf vollständigem Medium wuchsen nur einige wenige Stämme (ca. 10 %) auf Hygromycinmedium:"
Offensichtlich hatten sie Probleme mit ihrem Selektionsverfahren. Für intakte keimende Konidien durch Elektroporation unter Verwendung des argB Gens wurde eine Transformationsrate von 0,5 – 4 Transformanten pro μg beschrieben (Ozeki et al.; Biosci. Biotech. Biochem. 58 (1994) 2224-2227).
Beispiel 5 Transformation von Colltotrichum gloeosporioides Konidien
Für die A, tumefaciens Transformation von Colltotrichum gloeosporioides Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁵ oder 10⁶ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens, gemischt, das angezogen worden war wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefiltern ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten und 100 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, überführt. Nach fünf Tagen Inkubation bei Raumtemperatur traten auf den Transformationsplatten Kolonien auf. Die Transformation mit 10⁵ Konidien ergab 7 Transformanten, wohingegen die Transformation mit 10⁶ Konidien 175 Transformanten ergab. Auf der Negativkontrollplatte wurden keine Kolonien erhalten. Einen Tag später begannen kleine Kolonien auf der Negativkontrollplatte aufzutreten. Offensichtlich war die Selektion nicht strikt genug, um das Wachstum von nicht-transformierten Zellen vollständig zu verhindern. Um den Hyg-resistenten Phänotyp zu bestätigen, wurde Mycel von 11 mutmaßlich transformierten Kolonien und 3 Kolonien von der Negativkontrolle auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 100 μg/ml Hygromycin, übertragen. Acht der elf mutmaßlichen Transformanten wuchsen auf den neuen Selektionsplatten. Die drei verbleibenden mutmaßlichen Transformanten und die drei Kolonien aus dem Negativkontrollexperiment wuchsen nicht. Deshalb hing auch in diesem Fall die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Die Ergebnisse, die in der Tabelle 3 oben gezeigt sind, sind hinsichtlich der falsch positiven, die erhalten wurden, korrigiert. Die Transformation erreichte 500 bis 1300 Transformanten pro 10⁷ Konidien. Ein Transformante wurde der Southern Analyse, wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist, unterzogen. Dies zeigte, dass die T-DNA in einen einzelnen chromosomalen Locus integriert war, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigt.
Stephenson et al. (Aust. Soc. Biochem. Mol. Biol. 26 (1994) Pos-1-31) berichteten von einer Transformationsrate von weniger als 100 Transformanten pro μg. Kürzlich haben Armstrong und Harris (Phytopathology 83 (1993) 328-332) von einer Transformationsrate von 2-50 Transformanten pro 10⁸ Protoplasten berichtet, als sie Benomylfungizidresistenz für die Selektion verwendeten.
Beispiel 6 Transformation von Fusarium solani pisi Konidien Für die A. tumefaciens Transformation von Fusarium solani pisi Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁵ oder 10⁷ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens gemischt, das angezogen worden war wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefilter ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 100 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Die Transformation on 10⁷ Konidien ergab 1 Transformante. Es wurden keine Kolonien auf der Negativkontrollplatte erhalten. Der Hyg-resistente Phänotyp der Transformante wurde durch Anzucht der Transformante auf MM Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 100 μg/ml Hygromycin, bestätigt. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab.
Wenn das Hygromycinresistenzgen für die PEG Transformation von Protoplasten verwendet wurde, wurden Transformationsraten von 10.000 Transformanten pro μg pro 10⁷ Protoplasten für Fusarium solani f.sp. cucurbitae Rasse 2 (Crowhurst et al., Current Genetics 21 (1992) 463-469), berichtet. Die Transformation von Fusarium solani f.sp. phaseoli durch PEG und Lithiumacetat, wie sie von Marek et al. (Curr. Genet. 15 (1989) 421-428), berichtet wurde, führte zu 0,2 bis 3,3 Transformanten pro μg.
Beispiel 7 Transformation von Fusarium graminearum Konidien und rehydriertes gefriergetrocknetes ATCC Material
Für die A. tumefaciens Transformation von Fusarium graminearum Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 4 × 10⁵ Konidien mit 100 μl A. tumefaciens, das wie in „Materialien und Methoden" beschrieben angezogen worden war, gemischt. Außerdem wurde eine rehydrierte gefriergetrocknete Kultur, die von der American Type Culture Collection erhalten wurde, für die Transformation verwendet. Das gefriergetrocknete Material, das in einem Doppelgefäß vorlag, wurde durch Hinzufügen von 0,4 ml sterilem Wasser rehydriert und für 30 Minuten bei RT inkubiert. Das Material, das für die Transformation verwendet wurde, wurde bei 4°C für ungefähr zwei Wochen gelagert. Ein Aliquot des 100 μl ATCC Materials wurde mit 200 μl A. tumefaciens gemischt. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefilter ausplattiert, auf IM Platten, enthaltend 5μM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert. Die Hälfte des ATCC Materials wurde auf IM Platten für fünf Tage ko-kultiviert. Danach wurden die Filter auf PDA Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 150 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben dargestellt. Die Transformation von 4 × 10⁵ Konidien ergab 1 Transformante, was 25 Transformanten pro 10⁷ Konidien entspricht. Bei dem ATCC Material wurden fünf Transformanten erhalten, wenn es für 5 Tage kokultiviert worden war. Auf der Negativkontrollplatte wurden keine Kolonien erhalten. Der Hyg-resistente Phänotyp der Transformante wurde durch Anzucht der Transformanten auf PDA Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 150 μg/ml Hygromycin bestätigt. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Zwei Transformanten, die nach Transformation des ATCC Materials erhalten wurden, wurden der Southern Analyse, wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist, unterzogen. Dies zeigte, dass die T-DNA an einem einzelnen chromosomalen Locus integriert war, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigte.
Die Transformation von 5 × 10⁶ bis 2 × 10⁷ Protoplasten von Fusarium graminearum mit dem A. nidulans Acetamidasegen unter Verwendung eines PEG Transformationsverfahrens führte zu Transformationsraten von 5 Transformanten pro μg (Royer et al., Bio/technology 13 (1995), S. 1479-1483).
Beispiel 8 Transformation von Neurosra crassa Konidien
Für die A. Tumefaciens Transformation von Neurospora crassa Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁵ Konidien mit 100 μl A, tumefaciens, das angezogen wurde wie in „Materialien und Methoden" beschrieben, gemischt. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefilter ausplattiert, die auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert wurden. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 200 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben gezeigt. In dem ersten Experiment ergab die Transformation von 10⁵ Konidien ungefähr 50 Transformanten, wohingegen die 1/10 Verdünnung 5 Transformanten ergab. In dem zweiten Experiment ergab die Transformation von 10⁵ Konidien ebenfalls ungefähr 50 Transformanten. Dies bedeutet, dass die Transformation bis zu 5000 Transformanten pro 10⁷ Konidien ergibt. Der Hygresistente Phänotyp von 20 Transformanten wurde durch Anzucht der Transformanten auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim und 200 μg/ml Hygromycin, bestätigt. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Zwei Transformanten wurden der Southern Analyse, wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist, unterzogen. Dies zeigte, dass die T-DNA in einen einzigen chromosomalen Locus integriert war, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigte.
Neurospora crassa wurde unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren transformiert. Keimende Konidien wurden durch Elektroporation bei Verwendung des Resistenzgens transformiert, wobei Transformationsraten von 3000 bis 6000 Transformanten pro μg pro 10⁷ Konidien erhalten wurden (Chakraborty et al.; Can. J. Microbiol. 37 (1991) 858-863). Lithiumacetattransformationen von keimenden Konidien führten zu Transformationsraten von 2 bis 10 Transformanten pro μg pro 10⁷ Konidien (Dhawale et al.; Curr. Gen. 8 (1984) 77-79). Die PEG Transformation von Protoplasten führte zu Transformationsraten im Bereich von 400 bis 15.000 Transformanten pro μg (Vollmer und Yanofsky; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4867-4873).
Beispiel 9 Transformation von Trichoderma reesei Konidien
Für die A. tumefaciens Transformation von Trichoderma reesei Konidien wurde ein 100 μl Aliquot, enthaltend 10⁵ oder 10⁷ mit 100 μl A. tumefaciens, das wie in „Materialien und Methoden" beschrieben angezogen worden war, gemischt. Die Mischungen wurden auf Nitrozellulosefiltern ausplattiert, auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt und bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubiert. Danach wurden die Filter auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 100 μ/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben dargestellt. Die Transformation von 10⁷ Konidien ergab ungefähr 240 Transformanten, wohingegen die Transformation von 10⁵ Konidien 12 Transformanten ergab. Dies bedeutet, dass die Transformationsrate zwischen 240 und 1200 Transformanten pro 10⁷ Konidien schwankt. Der Hyg-resistente Phänotyp von 9 Transformanten wurde durch Anzucht der Transformanten auf Aspergillus Minimalmedium Platten, enthaltend 200 mM Cefotaxim und 100 μg/ml Hygromycin, bestätigt. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab.
Zwei Transformanten wurden der Southern Analyse, wie in Beispiel 4 beschrieben, unterzogen. Dies zeigte, dass die T-DNA in einen einzelnen chromosomalen Locus integriert worden war, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigte.
Wenn dasselbe Hygromycin-selektierbare Markergen (pAN7.1) für die PEG Transformation von Protoplasten verwendet wurde, wurden ungefähr 100 Transformanten pro μg pro 10⁷ Protoplasten erhalten (Mach et al.; Current Genetics 25 (1994) 567-570). Wenn das Hygromycingen von homologen Expressionssignalen, die von Trichoderma reesei selbst abstammten, flankiert wurde, berichteten Mach et al. steigende Transformationsraten von 1800 bis 2500 Transformanten pro μg pro 10⁷ Protoplasten. Ähnliche Ergebnisse wurden von Gruber (Curr. Genet. 18 (1990) 447-451) berichtet. Bei Verwendung heterologer Vektoren erhielten sie ca. 800 bis 1500 Transformanten pro μg. Ein Vektor, der das homologe pyrG Gen enthielt, führte bis zu 12.000 Transformanten pro μg.
Beispiel 10 Transformation von Pleurotus ostreatus Konidien
Es sind nur wenige Veröffentlichungen über die Transformation von essbaren Pilzen bekannt. Peng et al. (Curr. Genet. 22 (1992) 53-59) transformierten erfolgreich Pleurotus ostreatus, aber die transformierten Stämme waren instabil. Jedoch erhielten Yanai et al. (Biosci. Biotech. Biochem. 60 (1996) 472-475) kürzlich stabile Transformanten von Pleurotus ostreatus.
Für die A. tumefaciens Transformation von Pleurotus ostreatus Konidien wurden zwei Verfahren verwendet. In Experiment 1 wurde ein Aliquot von 1,25 × 10⁷ Konidien mit 150 μl A, tumefaciens, das wie in „Materialien und Methoden" beschrieben angezogen worden war, gemischt. Die Mischung wurde auf einen Nitrozellulosefilter ausplattiert, auf eine IM Platte, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt. In Experiment 2 wurden 2,5 × 10⁷ Konidien auf einen Nitrozellulosefilter ausplattiert, auf eine PDA Platte gesetzt und für 4 Tage bei Raumtemperatur prä-inkubiert. Anschließend wurde der Filter in eine Petrischale übertragen, in 25 ml Agrobacterium Kultur in IM (angezogen für 6 Stunden wie in „Materialien und Methoden" beschrieben) untergetaucht und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Filter auf eine IM Platte, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 3 oder 6 Tage inkubiert. Danach wurden die Filter auf PDA Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 75 μg/ml Hygromycin, um auf Transformanten zu selektieren, übertragen. Die Ergebnisse nach 6 Tagen Ko-Kultivierung sind in Tabelle 3 oben dargestellt. Die Transformation von 10⁷ Konidien führte zu ungefähr 48 Transformanten.
Wenn die Konidien direkt für die Transformation verwendet wurden, wurden nur Transformanten nach 6 Tagen Ko-Kultivierung (Experiment 1) erhalten. Wenn die Konidien jedoch für 4 Tage vor der Transformation prä-inkubiert worden waren (Experiment 2), wurden Transformanten nach 3 und 6 Tagen der Ko-Kultivierung erhalten, obwohl nach 3 Tagen die Zahl der Transformanten geringer war als nach 6 Tagen: 10 anstelle von 48. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab.
Wenn dasselbe Hygromycin-selektierbare Markergen (pAN7.1) für die PEG Transformation von Protoplasten verwendet wurde, wurden ungefähr 5-46 Transformanten pro μg pro 10⁷ lebensfähiger Protoplasten erhalten (Peng et al.; Current Genetics 22 (1992) 53-59). Bei Verwendung von Bialaphos als einem dominanten selektierbaren Marker erhielten Yanai etal. (Biosci. Biotech. Biochem. 60 (1996) 472-475) ca. 2 Transformanten pro μg.
Beispiel 11 Transformation von Agaricus bisporus Konidien
Für die A. tumefaciens Transformation von Agaricus bisporus Konidien wurde der kommerzielle Stamm Horst U1 (bezogen von „Proefstation voor de Champignoncultuur", Postfach 6042, 5960 AA Horst, Niederlande) verwendet. Die folgenden Medien wurden verwendet, um die Konidien zu keimen. Ein Malzextrakt-Agar (MOx; 50 g/l umfassend Malzextrakt, mykologisches Pepton und Agar), bezogen von Oxoid oder ein Malzextrakt-Agar, wie er beschrieben ist bei „Proefstation voor de Champignoncultuur" (MPrf; 2 % Malzextrakt, 10 mM MOPS, 1,5 % Agar, pH 7,0 mit KOH). Ca. 1,2 × 10⁷ Konidien wurden auf einen Nitrozellulosefilter ausplattiert und entweder auf MOx oder MPrf Medium gesetzt. Ein Agaricus bisporus Zuchtgranulat (ebenfalls erworben von „Proefstation voor de Champignoncultuur") wurde auf den Agar, der den Filter umgibt, gesetzt, um die Keimung der Konidien zu erleichtern. Die Petrischalen wurden mit Parafilm versiegelt. Die Platten wurden für 5 oder 7 Tage bei Raumtemperatur prä-inkubiert. Anschließend wurden die Filter in eine Petrischale überführt und in 25 ml Agrobacterium tumefaciens Kultur in IM (angezogen für 6 Stunden wie in „Materialien und Methoden" beschrieben) untergetaucht. Für die Transformation wurde der A. tumefaciens Stamm LBA1126 (Bundock & Hooykaas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 15272-75) verwendet, in den der binäre Vektor pUR5750 eingeführt wurde. Dieser Stamm LBA1126 wurde mit Beschränkungen bezüglich seiner Verwendung von der staatlichen Universität Leiden erhalten, an der Bundock et al. beschäftigt sind. Die Filter wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Filter auf IM Platten, enthaltend 5 mM Glukose, gesetzt, und die Platten wurden bei Raumtemperatur für 5 Tage inkubiert. Danach wurden die Filter auf MOx oder MPrf Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim, um die Agrobacterium Zellen abzutöten, und 25 μg/ml Hygromycin (Van Rhee et al., Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258), um auf Transformanten zu selektieren, übertragen. Hygromycin-resistente Kolonien erschienen nach ungefähr 5 Wochen der Inkubation. In fünf Transformationen wurden 10 transformierte Kolonien erhalten (siehe Tabelle 3 oben). Transformanten wurden mit beiden Medien und nach 5 und 7 Tagen der Prä-Inkubation vor der Transformation erhalten. Auch in diesem Fall hing die Transformation von der Induktion der vir Gene durch AS ab. Sieben Transformanten wurden weiter auf MPrf Platten, enthaltend 200 μM Cefotaxim mit oder ohne 25 μg/ml Hygromycin kultiviert. Vier Transformanten wurden der Southern Analyse, wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist, unterworfen. Die Southern Analyse (siehe 5) zeigte, dass in allen Transformanten die T-DNA in die chromosomale DNA integriert wurde, was den transformierten Phänotyp auf der molekularen Ebene bestätigte.
Der kultivierte Pilz Agaricus bisporus wurde kürzlich von Van Rhee et al. (Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258) transformiert. Obwohl sie in der Lage waren, einen einzelnen homokaryotischen Stamm ATCC 24663 zu transformieren, waren sie jedoch nicht in der Lage, den kommerziellen heterokaryotischen Stamm Horst U1 zu transformieren, der häufig für die Herstellung von essbaren Pilzen verwendet wird. Für diesen Stamm mussten sie zunächst einen abgeleiteten Stamm selektieren, der dem ATCC 24663 Phänotyp glich, bevor sie in der Lage waren, Transformanten zu erhalten. Deshalb war die Anwendung von Biotechnologie in dieser Art, die ein wichtiges Erzeugnis mit einer weltweiten Herstellung von 1,5 Millionen Tonnen in 1990 darstellt (Van Rhee et al. Mol Gen Genet 250 (1996) 252-258) darstellt, immer noch durch den Mangel eines allgemein anwendbaren Transformationssystems behindert. Die Anwendung von biotechnologischen Techniken auf die Pilzkultivierung kann die Qualität und die Erzeugnisausbeuten stark verbessern.
Beispiel 12 Seitengerichtete Integration von multiplen Kopien eines Gens in Aspergillus awamori
Experimentelle Bedingungen
Die experimentelle Ausgestaltung eines Verfahrens für die seitengerichtete Integration von multiplen Kopien eines Gens in den Schimmelpilz A. awamori ist in 6 gezeigt. Das System beruht auf zwei Bestandteilen, (1) einem Pilzstamm, enthaltend das pyrGGen mit einer 3' Deletion, und (2) einem Agrobacterium Stamm, enthaltend einen binären Vektor, der das pyrG Gen nach Rekombination wieder herstellen kann. Dieser binäre Vektor enthält zwischen den T-DNA Grenzen ein Reparaturkonstrukt, das ein pyrG Gen mit einer 5' Deletion trägt, so dass beide verkürzte pyrG Gene einen gemeinsamen Abschnitt des pyrG Gens tragen, der als eine der Rekombinationsstellen dient. Die andere Rekombinationsstelle muss unterhalb des pyrG Gens liegen, so dass bei Rekombination das pyrGGen wieder hergestellt wird.
Um mindestens ein weiteres Gen einzuführen, sollte der binäre Vektor multiple Kopien von mindestens einem Gen enthalten, das ein gewünschtes Protein zwischen den zwei Rekombinationsstellen kodiert, vorzugsweise unterhalb des verkürzten pyrG Gens. Als eine Alternative ist vorgesehen, dass die Rekombination mit Einführung von mindestens einem Gen ebenfalls stattfinden kann, wenn der Ziellocus eine 5' Deletion enthält und das Reparaturkonstrukt das Gen (die Gene), das (die) oberhalb eines 3' deletierten pyrG Gens eingeführt werden soll(en), mit einer zweiten Rekombinationsstelle oberhalb des (der) einzuführenden Gens (Gene). Jedoch muss in diesem Fall darauf geachtet werden, dass der Promotor des pyrG Gens nicht gestört wird.
Um spezifisch die Integration durch homologe Rekombination nachzuweisen, wurde das endogene pyrG Gen als ein selektierbares Markergen verwendet (Gouka et al., Current Genetics 27 (1995) 536-540).
Herstellung der Zielstelle
Das Plasmid pUR5710 (siehe 7) wurde hergestellt durch Klonieren eines 2,0 kb BamHI/SalI Fragments, enthaltend einen 5' Abschnitt des pyrG Gens, das in dem Plasmid pAW4.1 (Gouka et al.; siehe oben) vorliegt, in den allgemeinen Klonierungsvektor pIC20R (Marsh et al.; Gene 32 (1984) 481-485), gespalten mit BamHiI und SalI. Anschließend wurde ein synthetischer DNA Linker, enthaltend die 18 by Erkennungsstelle für die I-SceI Endonuklease (5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3' = SEQ. ID. NR. 1), flankiert durch SalI und HindIII Stellen, in das Plasmid pUR5710 kloniert, das mit SalI und HindIII gespalten wurde. Dies führte zu dem Plasmid pUR5711 (siehe 7). Das Plasmid pUR5712 (siehe 7) wurde hergestellt durch Klonieren eines 2,0 kb HindIII Fragments, enthaltend Sequenzen unterhalb der pyrG kodierenden Region, die in dem Plasmid pAW4.4 (Gouka et al.; siehe oben) vorliegen, in das Plasmid pUR5711, das mit HindIII gespalten wurde. Die Orientierung dieses HindIII Fragments im Vergleich zu der kodierenden Region des pyrG Gens ist identisch mit der Situation im Wildtyp. Das Plasmid pUR5712 wurde verwendet, um den mutanten A, awamori pyrG^– Stamm AWCSCE herzustellen.
Herstellung des mutanten A, awamori pyrG^– Stamms AWCSCE Die Transformation des Wildtyp A. awamori Stamms wurde durchgeführt mit einem gereinigten (Qiaex Gelextraktionskit; Qiagen Kat. Nr. 20021) EcoRI Fragment, das erhalten wurde aus dem Plasmid pUR5712, enthaltend das mutante pyrG Gen mit der I-SceI Restriktionsstelle an der Deletionsstelle (siehe 6 und 7). Pro Transformation wurden 2 × 10⁶ Protoplasten mit 10 μg DNA transformiert. Da pyrG^– Stämme resistent sind gegen gegenüber 5-FOA (5-Fluororoticsäure; Boeke et al. Mol Gen Genet 197 (1984) 345-346), können pyrG Transformanten direkt aus den Wildtypstämmen selektiert werden. Die Transformanten wurden auf MM Platten selektiert (AspA wird durch AspA-N ersetzt; 50 × AspA-N = 0,35 M KCl, 0,55 M KH₂PO₄, pH 6,5 mit KOH), ergänzt mit 10 mM Uridin und 0,75 mg/ml 5-FOA, mit 10 mM Prolin als der N-Quelle. Der mutante Phänotyp der Transformanten, die erhalten wurden, wurde durch Anzucht dieser Kolonien auf MM Platten ohne Uridin überprüft. Zwei Transformanten, die nicht in der Lage waren, ohne Uridin zu wachsen, wurden weiter durch Southern Blot Analyse analysiert. Das beobachtete DNA Muster stimmte mit dem erwarteten Muster für den Stamm AWCSCE überein.
Herstellung eines multi-Kopien Vektors
Für die Herstellung des Plasmids pUR5713 (siehe 8A) wurde das Plasmid pAW4.4 (siehe Gouka et al.; siehe oben) mit HindIII gespalten, die HindIII Stelle wurde mit Klenow aufgefüllt, und das Fragment wurde anschließend mit BamHI gespalten. Das resultierende 1,6 kb Fragment, enthaltend Sequenzen unterhalb der pyrG kodierenden Region, wurde isoliert. Darüber hinaus wurde das Plasmid pAW4.20 (Gouka et al.; siehe oben) mit BamHI und NindIII gespalten, und das 0,4 kb Fragment, enthaltend Sequenzen, die unmittelbar oberhalb des 1,6 kb Fragments, das oben beschrieben wurde, liegen, wurde isoliert. Das 0,4 kb HindIII/BamHI und das 1.6 kb BamHI/aufgefüllte HindIII Fragment wurden gleichzeitig in den allgemeinen Klonierungsvektor pBluescript^® SK (Stratagene) kloniert, der mit HindIII und SmaI gespalten wurde. Dies führte zu dem Plasmid pUR5713.
Das Plasmid pUR5714 (siehe 8B) wurde durch Klonieren eines 1,0 kb BglII/HindIII Fragments hergestellt, enthaltend einen 3' Abschnitt des pyrG Gens, das in dem Vektor pAW4.1 vorliegt, in den allgemeinen Klonierungsvektor pBluescript^® SK, der mit BamHI und HindIII gespalten wurde. Das Cosmid pUR5716 (siehe 9) ist abgeleitet von dem Cosmid Vektor pJB8 (Ish-Horowicz, D. und Burke, J.F.; Nucleic Acids Res 9 (1981) 2989) durch Austauschen des EcoRI/HindIII Polylinkerfragments durch einen synthetischen Linker, enthaltend eine EcoRI und NofI Restriktionsstelle mit der folgenden Sequenz (siehe SEQ ID NR. 2):
In diesem Klonierungsschritt geht die HindIII Stelle verloren. Das Cosmid pUR5718 (siehe 9) wurde hergestellt durch gleichzeitige Klonierung des 1,0 kb NotI/HindIII Fragments aus dem Plasmid pUR5714 und des 2,0 HindIII/NotI Fragments aus dem Plasmid pUR5713 in das Plasmid pUR5716, das mit NofI gespalten wurde. Dadurch trägt dieser Vektor eine Sequenz, die homolog ist zu beiden Seiten der I-SceI Stelle in dem pyrG Ziellocus in dem mutanten A, awamori pyrG- Stamm AWCSCE.
Das Plasmid pUR5729 (siehe 10) wurde hergestellt durch Klonierung des ca. 1,5 kb PsfI/SacI Fragments, enthaltend den offenen Leserahmen (ORF) des Cutinasegens aus Fusarium solani pisi (synthetische Kopie der cDNA; Van Gemeren et al.; Journal of Biotechnology 40 (1995) 155-162) unter der Kontrolle des Promotors und des Terminators des exlA Gens aus Aspergillus awamori (Gouka et al.; Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996) 28-35), aus dem Plasmid pUR7385 (Van Gemeren et al.; Applied Microbiology and Biotechnology 45, (1996) 755-763), in den allgemeinen Klonierungsvektor pIC19H (Marsh et al.; siehe oben), der mit PstI und Sad gespalten wurde.
Basierend auf dem Cosmid pUR5718 wurde ein neues Cosmid (pUR5725), enthaltend multiple Kopien des Cutinasegens unter der Kontrolle des exlA Expressionssignals (wie oben beschrieben), hergestellt. Eine einzelne Kopie dieser Expressionskassette wurde als ein 1,5 kb HindIII Fragment aus dem Plasmid pUR5729 isoliert und in das Cosmid pUR5718 ligiert, das mit HindIII gespalten wurde. Nach Verpackung des Ligationsmixes bei Verwendung des λ-DNA in vitro Verpackungsmoduls (Amersham; Code RPN1717) wurde der Verpackungsmix in den E. coli Stamm 1046 transformiert (beides nach dem Protokoll, das mit dem Modul geliefert wurde). Aus dieser Transformation wurde das Cosmid pUR5725 (siehe 11) erhalten, das eine Tandemanordnung von neun Kopien der Expressionskassette enthielt.
Um einen Agrobacterium tumefaciens Vektor herzustellen, der für die Transformation verwendet werden kann, wurde ein Schimmelpilzplasmid pUR5752 hergestellt. Dies ist ein binärer Vektor mit einer einzelnen NotI Stelle zwischen den linken und rechten Grenzrepetitionen der T-DNA, und er ist abgeleitet von pSDM14 (R. Offringa; Doktorarbeit „Gene targeting in plants using the Agrobacterium vector system"; Universität Leiden, Leiden 1992) durch Spaltung mit KpnI und BamHI und Ligation mit den folgenden angehefteten Oligonukleotiden:
Das Plasmid pUR5752 wurde für die Einführung von multiplen Kopien des ca. 1,5 kb Fragments mit dem Fusarium solani pisi Cutinasegen, kontrolliert durch den A. awamori Endoxylanasepromotor und Transkriptionsterminator, in die NotI Stelle verwendet. Dafür wurde ein 17 kb NotI Fragment aus pUR5752 (siehe oben), enthaltend 9 Kopien der Cutinaseexpressionskassette in die NotI Stelle des pUR5752 ligiert. Mit diesem Ligationsverfahren wurden die Plasmide pUR5756 (siehe 12), enthaltend 9 Kopien der Expressionskassette, und pUR5755, das nur 4 Kopien der Expressionskassette enthält (wahrscheinlich aufgrund des Verlustes von Kopien während der Ligation über intramolekulare Rekombination), erhalten.
Als Kontrolle wurde das Plasmid pUR5753 (das kein Cutinasegen enthält) durch Klonierung eines 3,0 kb NotI Fragments aus pUR5718 (siehe oben), enthaltend das pyrG Gen mit einer 5' Deletion und unterhalb angeordneten Sequenzen, in die NofI Stelle von pUR5752, hergestellt. Das Plasmid pUR5753 ist dasselbe Plasmid wie pUR5756, mit der Ausnahme, dass die 9 Kopien des Gens zwischen den HindIII Stellen fehlen, was zu einem Plasmid führt, das die folgenden Bestandteile aufweist: linke Grenze, NofI Stelle, pyrG Gen mit 5' Deletion, HindIII Stelle, 3' Sequenzen, die unterhalb des pyrG Gens angeordnet sind, NofI Stelle, rechte Grenze.
Sowohl das Plasmid pUR5752 als auch das Plasmid pUR5753 können für die Einführung jedes homologen oder heterologen Gens in die NofI Stelle oder HindIII Stelle angepasst werden.
Transformation und Analyse der Transformanten
Für die Transformation des A. awamori Stammes AWCSCE wurde der A. tumefaciens Stamm LBA1126 (Bundock & Hooykaas, PNAS 93 (1996) 15272-75; für die jeweilige Verwendung siehe oben) verwendet, enthaltend die binären Vektoren pUR5753, pUR5755 und pUR5756. Die Transformation wurde durchgeführt wie oben in „Materialien und Methoden" für Konidiosporen beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Platten mit IM Medium zusätzlich 1 mM Uridin enthielten.
Es wurden Transformanten nach ca. 7 Tagen der Inkubation erhalten. Die durchschnittliche Transformationsrate mit 10⁶ Konidiosporen betrug jeweils 17 und 30 Transformanten für pUR5753 bzw. pUR5755, aber nur 0,5 Transformanten für pUR5756. Das letzte Ergebnis bedeutet, dass pro 10⁷ Konidiosporen 5 Transformanten mit multiplen Kopien mit der Cutinaseexpressionskassette erhalten werden können. Diese Zahl ist bemerkenswert hoch, weil es mit der herkömmlichen Protoplastentransformation nur möglich gewesen ist, eine einzige Kopie eines Gens in einen bestimmten Locus zu integrieren, und dies mit einer Rate von ungefähr nur 1-2 Transformanten pro Transformation von 10⁷ Protoplasten (Gouka et al.; (1995) siehe oben).
Eine Anzahl von Transformanten wurde zweifach auf Aspergillus Minimalmedium gereinigt und Konidiosporen wurden von PDA Platten isoliert. Die Transformanten wurden der Southern Analyse unterzogen, um zu überprüfen: a) die Kopienzahl der Expressionskassette, b) die Integrationsstelle der Expressionskassette und c), ob DNA außerhalb der T-DNA Grenzrepetitionen integriert wurde. Die genomische DNA wurde mit BglII oder SalI gespalten, die Fragmente wurden nach der Größe in einem 0,7 % Agarosegel aufgetrennt und auf eine Hybond-N Membran geblottet. Die Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt unter Verwendung eines 0,5 kb AflII/SacI Fragments als Sonde, enthaltend den A. awamori exlA Terminator, der in der Cutinaseexpressionskassette vorliegt.
Wenn die DNA mit SalI gespalten wurde, enthielten alle Transformanten ein Hybridisierungsfragment von ca. 5 kb, was dem endogenen exklA SalI Fragment entspricht. Die Transformanten, die mit pUR5755 und pUR5756 erhalten wurden, schienen ein zweites hybridisierendes Fragment zu enthalten, das alle PexlA-Cutinase-TexlA-Expressionskassetten umfasste. Die Größe deutet auf die Zahl von Genkopien, die in dem Fragment vorliegen, hin. Es wurde gefunden, dass in dem untersuchten Stamm eine variable Anzahl von Expressionskassetten integriert worden war. Beispielsweise waren 2 Kopien in den Stämmen #8, #9 und #10 vorhanden, die mit Agrobacterium transformiert wurden, enthaltend DNA, abgeleitet aus Plasmid pUR5755 (enthielt ursprünglich 4 Kopien), wohingegen 4 Kopien in den Stämmen #13, #14, #15 und #17 vorlagen, 7 oder 8 Kopien in Stamm #12 und 9 Kopien in Stamm #16, die alle mit Agrobacterium transformiert wurden, das DNA enthielt, die von dem Plasmid pUR5756 (enthielt ursprünglich 9 Kopien) abgeleitet ist.
Diese Ergebnisse wurden durch Spaltung der DNA mit BglII bestätigt. BglI schneidet einmal in der Expressionskassette und deshalb werden alle Expressionskassetten als ein einzelnes hybridisierendes Fragment von 1,2 kb Länge dargestellt. Die Intensität dieses hybridisierenden Fragments zeigt die Kopienzahl an und stimmte mit den Kopienzahlen, die oben für die SalI Restriktionsfragmenten angegeben wurden, überein.
Weiterhin enthielten alle Transformanten, welche die Cutinaseexpressionskassette enthielten, zusätzlich ein 1,8 kb hybridisierendes Fragment, welches das 5' flankierende Fragment ist, das mit der Sonde hybridisiert. Die Integrationsmuster stimmten alle mit einer Integration in den pyrG Locus überein. Dies wurde ebenfalls durch Hybridisierung eines gleichen DNA Blots mit einem 2,4 kb BamHI/HindIII Fragment, enthaltend das A. awamori pyrG Gen, bestätigt. Darüber hinaus lag ein 5 kb hybridisierendes Fragment, das dem endogenen exl/A Gen entspricht, in allen Transformanten vor. Schließlich wurde ein 11,9 kb HindIII/EcoRI Fragment aus pUR5750, enthaltend A. tumefaciens DNA Sequenzen außerhalb der T-DNA Grenzrepetitionen verwendet, um die mögliche Anwesenheit von bakteriellen DNA Sequenzen zu analysieren. Keine der Transformanten zeigte ein Hybridisierungssignal, was bedeutet, dass alle frei von bakterieller DNA sind.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass A. awamori mit einem Agrobacterium tumefaciens Stamm transformiert werden kann, der multiple Kopien eines Modellgens enthält, mit Raten, die höher sind als bei herkömmlichen Transformationsverfahren. Bei Verwendung dieses Systems können multiple Genkopien gezielt in den pyrG Locus eingebaut werden ohne Integration von ungewünschten- bakteriellen – Sequenzen.
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Über die Hinterlegung eines Mikroorganismus nach dem Budapester Vertrag wird oben auf Seite 19, Zeilen 26-29, Information angegeben. In Übereinstimmung mit Regel 28 (4) EPÜ oder einem ähnlichen Übereinkommen für einen Staat, der kein Mitgliedstaat des EPÜ ist, wird hiermit beantragt, dass eine Probe dieser Hinterlegung, wenn sie angefordert wird, nur an einen Experten ausgehändigt wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines transformierten Schimmelpilzes, dadurch gekennzeichnet, dass (1) ein DNA Fragment, enthaltend wenigstens ein exprimierbares Gen zur Einführung in einen Schimmelpilz, zuerst in einen Vektor von Agrobacterium tumefaciens zwischen die T-DNA Grenzen, die in dem Vektor vorliegen, kloniert wird, wobei die T-DNA Grenzen 24 Basenpaare unvollständige direkte Repetitionen sind, welche die T-DNA flankieren; (2) der Vektor enthaltend das DNA Fragment zwischen den T-DNA Grenzen in einen Agrobacterium tumefaciens Stamm, der eine vir Region in seiner DNA enthält, eingeführt wird; (3) T-DNA enthaltend das DNA Fragment aus dem Agrobacterium tumefaciens durch Hinzufügen einer vir induzierenden Verbindung freigesetzt wird, und der Agrobacterium tumefaciens Stamm mit dem zu transformierenden Schimmelpilz inkubiert wird; und (4) der transformierte Schimmelpilz von dem untransformierten Schimmelpilz in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingeführten DNA oder ihres Expressionsproduktes selektiert wird, und wahlweise wird der transformierte Schimmelpilz kultiviert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Schimmelpilz zu der Gruppe der Eumycota gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Schimmelpilz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Pilzunterabteilungen Ascomycotina, Basidiomycotina, Deuteromycotina, Mastigomycotina und Zygomycotina.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das DNA Fragment multiple Kopien eines gewünschten Genes enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das DNA Fragment in einen ausgewählten Locus des Schimmelpilzgenoms integriert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, in dem das DNA Fragment in den pyrG Locus des Schimmelpilzgenoms (der als der pyrA Locus für A. niger und der pyr4 Locus für Neurospora crassa bekannt ist) integriert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, in dem der transformierte Schimmelpilz frei ist von einer bakteriellen DNA Sequenz, enthaltend eine T-DNA Grenze.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das DNA Fragment zufällig in das Schimmelpilzgenom integriert ist.
Transformierter Schimmelpilz erhältlich durch Agrobacterium vermittelte Transformation, wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei der Schimmelpilz in seinem Genom einen oder mehrere Abschnitte) von T-DNA Grenzsequenzen aufweist.