DE10046932B4

DE10046932B4 - Expressionssystem zur Überexpression von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen in eukaryontischen Zellen

Info

Publication number: DE10046932B4
Application number: DE2000146932
Authority: DE
Inventors: Karin Dr. Marbach-Ringhandt; Rupert Dipl.-Chem. Dr. Pfaller; Andreas Uldschmid
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: DE10046932A1

Abstract

Expressionssystem zur Überexpression von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen in eukaryontischen Zellen ausgewählt aus der Gruppe der Ascomyceten, Basidiomyceten und mitosporen Pilze, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gen welches für eine Laccase kodiert, sowie mindestens eines der Kupferhomeostase Gene tah1-Gen, cta1-Gen und ihrer Homologe enthält.

Description

Die Erfindung betrifft ein Expressionssystem zur Überexpression von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen in eukaryontischen Zellen, Bestandteile des Expressionssystems sowie Verfahren zu seiner Nutzung. Dabei versteht man unter Kupfer-abhängigen Proteinen solche, die für ihre Enzymaktivität Kupferionen als Co-Faktoren benötigen.

Wie in der Literatur dokumentiert, hängt die Produktion von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen wie z.B. der multi-Kupferoxidase Laccase in verschiedenen Expressionssystemen wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger und Trametes versicolor stark von einer ausreichenden Kupferversorgung ab (siehe z.B. DE 19724039 (entspricht der US-Anmeldung mit der Serial Number 09/445381) oder WO 95/33836.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Expressionssystem zur Verfügung zu stellen, das eine verstärkte Expression von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen in eukaryontischen Zellen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Expressionssystem, gemäß Anspruch 1.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem eignet sich insbesondere zur verbesserten Expression Kupfer-abhängiger sekretierter Proteine, vor allem aus der Proteinfamilie der sog. blauen Kupferoxidasen wie z. B. Laccase, (Poly)-Phenoloxidase, Galaktose-Oxidase, Glukose-Oxidase, Ascorbat-Oxidase, Bilirubin-Oxidase, Mangan-Oxidase, Tyrosinase und Ceruloplasmin, oder aber auch generell anderer Kupfer-abhängiger Proteine.

Daher umfaßt das erfindungsgemäße Expressionssystem als Kupfer-abhängiges sekretiertes Protein ein Gen kodierend für eines der genannten Proteine.

Insbesondere umfaßt das erfindungsgemäße Expressionssystem als Kupfer-abhängiges sekretiertes Protein ein Gen kodierend für eine Laccase.

Die erfindungsgemässen Kupferhomeostase Gene kodieren für Proteine, die Kupfer-Ionen zu dem sekretorischen Weg transportieren. Durch die Überexpression dieser Gene wird eine ausreichende Versorgung des sekretorischen Weges mit Kupfer ermöglicht, was zu einer erhöhten Ausbeute an Kupfer-abhängigen Proteinen führt.

Das Gen tah1 (Trametes ATX1 homologue) kodiert für ein im Cytoplasma lokalisiertes Kupferchaperon, während das Gen cta1 (copper transporting ATPase) für eine im sekretorischen Weg lokalisierte Kupfer transportierende P-Typ ATPase kodiert.

Insbesondere geeignet als Kupferhomeostase Gen im erfindungsgemäßen Expressionssystem sind die tah1- und cta1-Gene aus einem Basidiomyceten der Gattung Agaricus, Coprinus, Coriolus, Polyporus, Pleurotus, Phanerochaete, Schizophyllum oder Trametes.

Homologe Gene für tah1 sind z. B. aus Saccharomyces cerevisiae (das ATX1-Gen, S.-J. Lin and V. C. Culotta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 3784 – 3788), menschlichen Zellen (das hah1-Gen, L. W. J. Klomp et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 9221 – 9226) und Arabidopsis thaliana (E. Himmelblau et al., Plant Physiol. (1998) 117: 1227 – 1234) beschrieben.

Homologe Gene für cta1 sind z. B. aus S. cerevisiae (das CCC2-Gen, D. Fu et al., Yeast (1995) 11: 283 – 292), menschlichen Zellen (Menkes- und Wilson-Krankheits Proteine, C. Vulpe et al., Nature Genetics (1993) 3: 7 – 13 und R. E. Tanzi et al., Nature Genetics (1993) 5: 344 – 350) und Arabidopsis thaliana (T. Hirayama et al., Cell (1999) 97: 383 – 393) beschrieben.

Besonders bevorzugt umfaßt das erfindungsgemäße Expressionssystem als dem Kupferhomeostase Gen sowohl ein tah1-Gen als auch ein cta1-Gen.

Insbesondere bevorzugt handelt es sich um das tah1-Gen und das cta1-Gen aus T. versicolor.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die DNS-Sequenzen dieser Gene aus T. versicolor.

Eine DNS-Sequenz, die für ein Tah1 Protein (Protein mit der Funktion eines cytoplasmatischen Kupfer-Chaperons) kodiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß sie die cDNS-Sequenz SEQ ID NO:1 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-1) oder die cDNS-Sequenz SEQ ID NO:3 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-2) umfaßt oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 65% zu den genannten Bereichen der DNS-Sequenzen SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfaßt.

Bevorzugt ist eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie, größer als 70 % zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO:1 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-1) oder SEQ ID NO:3 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-2).

Besonders bevorzugt hat die DNS-Sequenz eine Sequenzhomologie größer als 80 % zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO:1 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-1) oder SEQ ID NO:3 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 (Allel tah1-2).

In der vorliegenden Anmeldung beziehen sich alle genannten Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin" erhalten werden. Die Homologiebestimmung erfolgt durch eine Suche in der Datenbank mit dem Unterprogramm "fasta" und den voreingestellten Werten („word size 6"). Die ähnlichsten Sequenzen werden dann mit dem Unterprogramm "gap" auf Homologie untersucht. Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 50" und "gap extension penalty 3" verwendet.

Genomische DNS-Sequenzen für die Gene tah1-1 und tah1-2 sind in SEQ ID NO:5 ab Position 832 bis einschließlich Position 1294 (Allel tah1-1) und in der genomischen DNS-Sequenz SEQ ID NO:6 ab Position 293 bis einschließlich Position 754 (Allel tah1-2) angegeben.

Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:5 besitzt fünf Introns, die an folgenden Positionen lokalisiert sind: Intron 1: ab Position 749 bis einschließlich 806, Intron 2: ab Position 835 bis einschließlich Position 897, Intron 3: ab Position 928 bis einschließlich Position 985, Intron 4: ab Position 1041 bis einschließlich Position 1106, Intron 5: ab Position 1211 bis einschließlich Position 1267. Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:6 besitzt fünf Introns, die an folgenden Positionen lokalisiert sind: Intron 1: ab Position 208 bis einschließlich 267, Intron 2: ab Position 296 bis einschließlich Position 358, Intron 3: ab Position 389 bis einschließlich Position 446, Intron 4: ab Position 502 bis einschließlich Position 566, Intron 5: ab Position 671 bis einschließlich Position 727. Die Introns werden nicht in Proteinsequenz übersetzt.

Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:5 gibt von Position 1 bis Position 715 die DNS Sequenz für die Promotorregion zur Transkription des tah1-1-Gens aus Trametes versicolor wieder. Der tah1 Promotor wird durch erhöhte Kupferkonzentrationen induziert und kann dadurch auch als induzierbarer Promotor, vorzugsweise für die Genexpression in filamentösen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten und hier speziell in den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus eingesetzt werden. Diese Promotorsequenz läßt sich gegen beliebige andere Promotorsequenzen zur Transkription austauschen.

Eine solche DNS-Sequenz läßt sich beispielsweise durch Klonierung aus dem Basidiomycetenstamm Trametes versicolor TV-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11523) erhalten. Dazu wird mittels an sich bekannter Methoden eine Genbank von Trametes versicolor TV-1 erstellt. Es kann sich dabei um eine cDNS- oder um eine genomische Genbank handeln.

Zur Isolierung der erfindungsgemäßen DNS-Sequenz in der Genbank werden DNS-Sonden verwendet, die tah1-spezifische DNS-Sequenzen enthalten. Solche DNS-Sonden lassen sich beispielsweise mittels PCR-Reaktion unter Verwendung von DNS-Primern aus genomischer DNS von Trametes versicolor TV-1 gewinnen.

Als Primer werden degenerierte DNS Abschnitte einer Länge von vorzugsweise 15 bp verwendet, deren Sequenz durch Sequenzvergleich bekannter Kupferchaperon-Sequenzen festgelegt wird. Die als Primer geeigneten DNS-Abschnitte erhält man vorzugsweise durch Oligonukleotidsynthese der festgelegten DNS-Abschnitte. Die Isolation eines erfindungsgemäßen tah1-Gens kann beispielsweise wie in den Beispielen 1, 2, 5 und 6 beschrieben erfolgen.

Ein beispielsweise derart isoliertes tah1-Gen läßt sich mittels dem Fachmann bekannten Techniken, wie beispielsweise der „site directed" Mutagenese, an jeweils gewünschter Position der Sequenz modifizieren. Daher ist auch eine DNS-Sequenz, kodierend für ein Protein mit Tah1-Aktivität, umfassend eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 65 %, bevorzugt 70 %, besonders bevorzugt 80% zu den DNS-Sequenzen SEQ ID NO:1 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 und SEQ ID NO:3 ab Position 59 bis einschließlich Position 277 von der Erfindung umfaßt.

Die DNS Sequenzen SEQ ID NO:1 von Position 59 bis einschließlich Position 277 und SEQ ID NO:3 von Position 59 bis einschließlich Position 277 bzw. die dazugehörigen genomischen Sequenzen SEQ ID NO:5 von Position 832 bis einschließlich Position 1294 (ohne die vier Introns Position 835-897, Position 928-985, Position 1041-1106 und Position 1211-1267) und SEQ ID NO:6 von Position 293 bis einschließlich Position 754 (ohne die vier Introns Position 296 – 358, Position 389 – 446, Position 502 – 566 und Position 671 – 727) kodieren für ein Protein von 72 Aminosäuren Länge (Tah1), das als sog. Kupferchaperon fungiert. Es bindet Kupfer(I) Ionen (Cu^I+) im Cytoplasma und transportiert sie zum sekretorischen Weg. Tah1 interagiert mit der in der post-Golgi Membran lokalisierten P-Typ ATPase Cta1 und überträgt dabei Cu^I+ an Cta1.

Das Tah1-Protein mit der Funktion eines Kupferionenchaperons ist dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO:2 umfaßt.

Eine DNS-Sequenz, die für ein Cta1 Protein mit der Funktion einer Kupfer-transportierenden P-Typ ATPase kodiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß sie die cDNS-Sequenz SEQ ID NO:7 ab Position 7 bis einschließlich Position 2958 (Allel cta1-1) oder die cDNS-Sequenz SEQ ID NO:9 ab Position 1 bis einschließlich Position 2952 (Allel cta1-2) umfaßt oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 60 % zu den DNS-Sequenzen SEQ ID NO:7 ab Position 7 bis einschließlich Position 2958 oder SEQ ID NO:9 ab Position 1 bis einschließlich Position 2952 umfaßt.

Bevorzugt ist eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 70 % zu den DNS-Sequenzen SEQ ID NO:7 ab Position 7 bis einschließlich Position 2958 oder SEQ ID NO:9 ab Position 1 bis einschließlich Position 2952.

In einer besonders bevorzugten Ausführung hat die DNS-Sequenz eine Sequenzhomologie größer als 80 % zu den DNS-Sequenzen SEQ ID NO:7 ab Position 7 bis einschließlich Position 2958 oder SEQ ID NO:9 ab Position 1 bis einschließlich Position 2952.

Die genomische DNS-Sequenz für das cta1-1 cDNS-Gen aus SEQ ID NO:7 ist in SEQ ID NO:11 ab Position 899 bis einschließlich Position 4597 angegeben.

Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:11 besitzt vier Introns, die an folgenden Positionen lokalisiert sind: Intron 1: ab Position 1073 bis einschließlich 1122, Intron 2: ab Position 1243 bis einschließlich Position 1886, Intron 3: ab Position 4035 bis einschließlich Position 4087 und Intron 4: ab Position 4629 bis einschließlich Position 4728. Die Introns werden nicht in Proteinsequenz übersetzt. Intron 4 befindet sich im 3' nicht-translatierten Bereich und wird in T. versicolor differentiell gespleißt.

Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:11 gibt von Position 1 bis Position 898 die DNS Sequenz für die Promotorregion zur Transkription des cta1-1-Gens aus Tramtetes versicolor wieder.

Die DNS-Sequenz läßt sich beispielsweise durch Klonierung aus dem Basidiomycetenstamm Trametes versicolor TV-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11523) erhalten. Dazu wird mittels an sich bekannter Methoden eine Genbank von Trametes versicolor TV-1 erstellt. Es kann sich dabei um eine cDNS- oder um eine genomische Genbank handeln.

Zur Isolierung der cDNS-Sequenzen werden ccc2-Deletionsmutanten von Saccharomyces cerevisiae mit einer cDNA-Bank aus Trametes versicolor in an sich bekannter Weise komplementiert. Die Isolation der erfindungsgemäßen cta1-1 und cta1-2 cDNS-Gene kann erfolgen wie im 4. Beispiel beschrieben. Die Isolierung genomischer cta1 DNS-Gene ist im 5. Beispiel beschrieben.

Ein beispielsweise derart isoliertes cta1-Gen läßt sich mittels dem Fachmann bekannten Techniken, wie beispielsweise der site directed Mutagenese, an jeweils gewünschter Position der Sequenz modifizieren. Daher ist auch eine DNS-Sequenz kodierend für ein Protein mit Cta1-Aktivität umfassend eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 60 %, bevorzugt 70 %, besonders bevorzugt 80% zu den cDNS-Sequenzen SEQ ID NO:7 ab Position 7 bis einschließlich Position 2958 und SEQ ID NO:9 ab Position 1 bis einschließlich Position 2952 von der Erfindung umfasst.

Die DNS Sequenz SEQ ID NO:11 von Position 899 bis einschließlich Position 4597 (ohne die drei Introns von I1: 1073-1122, I2: 1243-1886 und I3: 4035-4087) bzw. die dazugehörige cDNS-Sequenz SEQ ID NO:7 von Position 7 bis einschließlich Position 2958 (ohne die transkribierten aber nicht translatierten Bereiche 1 bis 6 und 2959 bis 3103) und die cDNS-Sequenz SEQ ID NO:9 von Position 1 bis einschließlich Position 2952 (ohne die transkribierten, aber nicht translatierten Bereiche 2953 bis 3143) kodieren für ein Membranprotein von 983 Aminosäuren Länge, die von Tah1 angelieferte Cu^I+-Ionen von dem Cytoplasma in das Lumen des post-Golgi transportiert. Cta1 gehört zur Proteinklasse der Kupfer-transportierenden P-Typ ATPasen, zu denen auch das Protein Ccc2 aus Saccharomyces cerevisiae sowie die sogenannten Menkes- und Wilson-Krankheits Proteine gehören. Diese Proteine sind spezifiziert durch folgende, zu anderen P-typ ATPasen konservierte Sequenzen: zwei N-terminalen Kupfer-Bindedomänen, eine Phosphatasestelle, ein Ionen-Transduktionskanal, eine Phosphorylierungsstelle und eine ATP- Bindestelle. Cta1 ist weiterhin dadurch charakterisiert, daß es die Wachstumsdefekte von S. cerevisiae ccc2 Deletionsmutanten auf Eisenmangelmedien komplementieren kann. Ein Verfahren zur Komplementation des ccc2 Gendefekts in S. cerevisiae ist im 4. Beispiel beschrieben.

Ein Protein mit Cta1 Aktivität (Kupfer-transportierender ATP-ase-Aktivität) ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO:8 (Allel Cta1-1) und SEQ ID NO:10 (Allel Cta1-2), umfaßt. Bei Cta1-1 und Cta1-2 handelt es sich um zwei Allele, deren Aminosäuresequenz auf 11 Positionen verschieden ist.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem kann ein oder mehrere Kupferhomeostase Gene sowie das Kupfer-abhängige sekretierte Protein auf einem Expressionsvektor oder auf zwei oder mehreren getrennten Expressionsvektoren enthalten.

Bei dem Expressionsvektor kann es sich um ein DNS-Konstrukt handeln, das in das Genom des Wirtsorganismus integriert und zusammen mit diesem repliziert wird. Alternativ kann es sich bei dem Expressionsvektor um ein autonom replizierendes DNS-Konstrukt handeln, das nicht in das Wirtsgenom integriert, wie z. B. ein Plasmid, ein artifizielles Chromosom oder ein vergleichbares extrachromosomales genetisches Element.

Eine für die Überexpression des erfindungsgemäßen Expressionssystems besonders geeignete eukaryontische Zelle ist ein filamentöser Pilz.

Bevorzugt überexprimiert das erfindungsgemäße Expressionssystem nach Einbringen in einen filamentösen Pilz die Kupferhomeostase Gene. Bevorzugt überexprimiert das erfindungsgemäße Expressionssystem nach Einbringen in einen filamentösen Pilz auch das Kupfer-abhängige sekretierte Protein.

Die Erfindung umfaßt ferner einen Expressionsvektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein Kupferhomeostase Gen umfaßt, wobei er vorzugsweise ein tah1- oder ein cta1-Gen oder diese beiden Gene umfaßt.

Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor sollte neben einem Kupferhomeostase Gen vorzugsweise folgende genetische Elemente enthalten:
Einen Promotor, der die Expression der tah1- und/oder cta1-Gene in dem Wirtsorganismus vermittelt. Es sollte sich dabei vorzugsweise um einen starken Promotor handeln, damit eine hohe Expressionsleistung gewährleistet werden kann. Der Promotor ist vorzugsweise funktionell mit dem 5'-Ende des tah1- bzw. cta1-Gens verknüpft.

Vorzugsweise geeignete Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe GAL-Promotor, ADH-Promotor, TAKA-Amylase-Promotor, Polyhedrin-Promotor, Glucoamylase-Promotor, gapDH-Promotor und Alkoholoxidase Promotor.

Vorzugsweise eignen sich die GAL- bzw. ADH-Promotoren für die Expression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der TAKA-Amylase- oder Glucoamylase-Promotor für die Expression in Aspergillus niger, der Polyhedrin-Promotor für die Expression in Baculovirus-infizierten Insektenzellen oder der Alkoholoxidase-Promotor für die Expression in der Hefe Pichia pastoris. Vorzugsweise geeignete Promotoren für die Expression in Basidiomyceten sind ausgewählt aus der Gruppe der in filamentösen Pilzen der Klasse der Basidiomyceten aktiven Promotoren wie z. B. der gapDH-Promotor aus Trametes versicolor, Promotoren für Laccasegene aus Trametes versicolor oder Polyporus pinsitus, der Promotor für das Ornithin-Transcarbamoylasegen oder das gapDH-Gen aus Coriolus hirsutus oder der gapDH-Promotor aus Agaricus bisporus.

Besonders bevorzugt für die Expression in Trametes sind der dem tah1-Gen eigene Promotor (z. B. SEQ ID NO:5, bp 1 – 715), der Laccase III Promotor und der gapDH-Promoter aus Trametes versicolor. Die DNS-Sequenzen für diese beiden Promotoren sind in DE-A-19814853 SEQ ID NO:3, Base 1 – 547 (Laccase-III Promotor) und SEQ ID NO:5, Base 1 – 1542 (gapDH-Promotor) offenbart. Für die Expression in Ascomyceten oder mitosporen Pilzen eignen sich insbesondere der Glucoamylase-Promotor, der TAKA-Amylase-Promotor und der gapDH-Promotor, jeweils aus filamentösen Pilzen der Gattung Aspergillus oder der ADH-Promotor aus Saccharomyces cerevisiae oder der Alkoholoxidase-Promotor aus der Hefe Pichia pastoris für die Expression der erfindungsgemäßen DNS-Sequenzen tah1 und cta1.

Ferner sollten vorzugsweise für den Wirtsorganismus passende Signale für die Transkriptionstermination und in Eukaryonten zusätzlich Signale für die Polyadenylierung in dem Expressionsvektor enthalten und funktionell mit dem 3'-Ende des tah1- bzw. cta1-Gens verknüpft sein. Solche Signale für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung sind in SEQ ID NO:5, bp 1295 – 1405 sowie in SEQ ID NO:11, bp 4598 – 4980 gezeigt.

Als Transkriptionsterminator kann der Terminator des zu exprimierenden proteinkodierenden Gens verwendet werden oder aber der Terminator eines fremden Gens. Bevorzugt wird für Expressionen in Basidiomyceten der Transkriptionsterminator aus dem Gen einer Laccase oder aus den oben genannten erfindungsgemässen Genen tah1 oder cta1 verwendet.

Des weiteren enthält der Expressionsvektor vorzugsweise das Gen für einen Selektionsmarker. Die durch das Gen kodierten Selektionsmarker können dem Wirtsorganismus entweder Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen oder einen Defekt im Wirtsorganismus komplementieren.

Bevorzugte Selektionsmarker sind Gene, die Resistenz gegen Antibiotika wie Hygromycin, Zeocin oder Bialaphos verleihen. Als Selektionsmarker für die Komplementation von Wachstumsdefekten sind Gene wie amdS, pyrG, pyrF, trpC, his4, TRP1 oder HIS3 bevorzugt.

Insbesondere eignen sich als Selektionsmarker das pyrF und das pyrG Gen sowie das URA3 Gen und die Resistenzgene für das Antibiotikum Bialaphos.

Das Selektionsmarkergen kann dabei zusammen mit dem tah1- und/oder dem cta1-Gen in einem Expressionsvektor enthalten sein oder die Gene können getrennt in verschiedenen Expressionsvektoren enthalten sein.

Im letzteren Fall umfaßt ein erfindungsgemäßes Expressionssystem zwei bis drei verschiedenen Expressionsvektoren. Diese müssen zur Expression gemeinsam in einen Mikroorganimus cotransformiert oder sukzessive transformiert werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren. Verschiedene Möglichkeiten sind in den Beispielen dargelegt. Die dort beschriebenen Verfahren lassen sich vom Fachmann auf beliebige andere Vektoren, Resistenzgene, Regulationselemente und Strukturgene anwenden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der DNS-Sequenzen, kodierend für Tah1, bzw. Cta1 Proteine. Zur Expression dieser Gene, kodierend für Tah1, bzw. Cta1 Proteine, werden mittels der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren Extrakopien dieser Gene in einen Mikroorganismus eingebracht und in dem Mikroorganismus exprimiert.

Bei dem Mikroorganismus handelt es sich vorzugsweise um Ascomyceten oder mitospore Pilze, wie z. B. die Gattungen Saccharomyces, Pichia, Fusarium oder Aspergillus oder um filamentöse Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten, wie z. B. die Gattungen Trametes, Coprinus, Coriolus, Polyporus, Agaricus, Pleurotus, Phanerochaete oder Schizophyllum.

Die Gene tah1 bzw. cta1 können unter der Kontrolle verschiedener Regulationssequenzen, exprimiert werden. Bei diesen Kontrollsequenzen handelt es sich um genetische Elemente, die wichtig oder von Vorteil für die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind. Diese Kontrollsequenzen können den nativen Sequenzen aus den Genen entsprechen, von anderen Quellen (Genen, Organismen) stammen oder eine Kombination aus beiden sein. Die fremden Kontrollsequenzen können die nativen ersetzen oder an sie addiert werden, um eine starke oder kontrollierte Induktion zu erhalten. Solche Sequenzen beinhalten (aber sind nicht darauf beschränkt) einen Promotor, eine Signalsequenz, einen Transkriptionsterminator und eine Polyadenylierungssequenz.

Bei dem Promotor sollte es sich dabei vorzugsweise um einen starken Promotor handeln, damit eine hohe Expressionsleistung gewährleistet werden kann. Der Promotor ist vorzugsweise funktionell mit den 5'-Enden des tah1- bzw. des cta1-Gens verknüpft. Der Promotor kann von dem zu exprimierenden Gen stammen oder es kann auch der Promotor eines fremden Gens verwendet werden. Der Promotor kann jede Promotorsequenz sein, die eine Transkriptionsaktivität in der ausgewählten Wirtszelle zeigt und kann daher von Genen stammen, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Beispiele für geeignete Promotoren für die Transkription der erfindungsgemäßen Gene stammen z. B. von stark exprimierten Genen aus Hefen, filamentösen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten, der Ascomyceten oder mitosporen Pilze.

Die Expressionsvektoren eignen sich insbesondere zur verbesserten Expression von Genen die für Proteine kodieren in Wirtsorganismen der Hefe-Gattungen Saccharomyces und Pichia, wie S. cerevisiae und P. pastoris, Gattungen der filamentösen Pilze aus der Klasse der Ascomyceten, bzw. mitosporen Pilze wie Aspergillus, Fusarium oder Neurospora und Gattungen der filamentösen Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten wie Trametes, Coprinus, Coriolus, Polyporus, Schizophyllum, Pleurotus, Agaricus oder Phanerochaete. Unter Genen die für Proteine kodieren sind im Sinne der Erfindung auch die von den Strukturgenen abgeleiteten cDNS-Gene der Proteine zu verstehen. Bei den Proteinen kann es sich um für den Wirtsorganismus heterologe Proteine oder um für den Wirtsorganismus homologe Proteine handeln.

Vorzugsweise eignen sich die Expressionsvektoren zur effizienten Expression und Sekretion von Kupfer-abhängigen Proteinen.

Insbesondere bevorzugt eignen sich die Expressionsvektoren zur verstärkten Expression eines Gens für eine Laccase.

Die Expressionsvektoren eignen sich ferner zur Herstellung von Pilzstämmen, die zur effizienten Expression und Sekretion von Kupfer-abhängigen Proteinen befähigt sind.

Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von Pilzstämmen, die zur effizienten Expression und Sekretion von Proteinen befähigt sind.

Diese Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Art und Weise ein vorgenannter Expressionsvektor in einen Pilzstamm eingebracht wird.

Solche Verfahren sind beispielsweise in DE 19814853 A1 und DE 19934408.6 offenbart. Bei diesen Verfahren wird ein Pilz mit einem auxotrophen Gendefekt als Wirtsstamm mittels an sich bekannter Verfahrensschritte transformiert mit einem Expressionsvektor, der ein Gen zur Komplementation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm besitzt. Aus dem Transformationsansatz werden mit dem Expressionsvektor transformierte Klone durch Selektion auf Komplementation des auxotrophen Gendefekts ausgewählt. Dabei wird die Expression des Gens zur Komplementation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm durch ein genetisches Regulationselement kontrolliert, das im Wirtsstamm aktiv ist.

Die Transformation des Wirtsstammes erfolgt nach Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen. Zu diesen Methoden gehören die Transformation von Protoplasten nach der CaCl₂/PEG-Methode, die Transformation durch Elektroporation oder die biolistische Transformation durch Beschuß mit DNS-haltigen Mikroprojektilen. Diese Verfahren sind in Standardlehrbüchern beschrieben.

Beispielsweise werden die zu transformierenden Gene in bekannter Art und Weise in einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor kloniert und mittels der genannten Methoden in eine Hefe, wie z. B. der Gattungen Pichia oder Saccharomyces oder in einem filamentösen Pilz der Gattung Aspergillus, Fusarium, Trametes, Coprinus, Coriolus oder Polyporus eingebracht.

Die zu transformierenden Gene können aber auch in einen Expressionsvektor ohne Selektionsmarkergen kloniert werden und zusammen mit einem den auxotrophen Gendefekt des Wirtsstammes komplementierenden Vektor zur Erzeugung von Transformanten verwendet werden (Cotransformation).

Bevorzugter Stamm für die Transformation ist ein filamentöser Pilz ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus. Bei dem betreffenden Stamm aus der Klasse der Basidiomyceten kann es sich um einen monokaryontischen oder aber auch um einen dikaryontischen Stamm handeln.

Besonders bevorzugt für die Transformation ist ein monokaryontischer, Uridin-auxotropher, pyrF oder pyrG defizienter Stamm aus der Art Trametes versicolor.

Die Selektion positiver Transformanten erfolgt beispielsweise, indem Protoplasten nach der Transformation mit Vektor DNS auf einem Medium ausgebracht werden, welchem zur osmotischen Stabilisierung der Protoplasten ein Zusatz wie z. B. Sorbitol, Mannitol oder Saccharose beigefügt ist und welches die Selektion von Transformanten mit dem komplementierenden Prototrophievermittelnden Gen, z. B. das pyrF-Gen erlaubt.

In einer bevorzugten Ausführung wird in einem homologen System der filamentöse Pilz Trametes versicolor mit den Genen tah1 und cta1 und einem zu sekretierenden Kupfer-abhängigen Protein, wie z. B. der Laccase aus Trametes versicolor transformiert. Dadurch wird eine Steigerung der Expressionsrate für die besagte Laccase erzielt, welche die nach dem Stand der Technik erzielbare Produktionsrate in der Fermentation von 0,1 g Laccase/l Kulturmedium signifikant verbessert.

Als Promotoren für die Proteinexpression verwendet man vorzugsweise den Promotor für ein stark exprimiertes Gen aus Trametes versicolor. Vorzugsweise verwendet man den gapDH-Promotor für die Trametes Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase oder die Promotoren der Laccasegene I und III, deren Isolierung und Verwendung in DE-A-19814853 offenbart ist.

Vorzugsweise verwendet man Selektionsmedien, auf denen nur solche Transformanten von Trametes versicolor wachsen können, die mit einem funktionell exprimierten Selektionsmarkergen wie dem pyrG- oder pyrF-Gen, transformiert worden waren. Bevorzugt handelt es sich um ein Minimalmedium in Abwesenheit von Uridin, auf dem pyrF und pyrG-auxotrophe Stämme von Trametes versicolor nicht mehr wachsen können, bzw. erst nach Zusatz von Uridin wieder wachsen können.

Geeignete Mikroorganismen zur Expression eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors sind Stämme filamentöser Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten sowie Stämme filamentöser Pilze aus der Klasse der Ascomyceten, bzw. mitosporen Pilze, sowie Hefen.

Besonders geeignet sind Stämme der Klasse der Basidiomyceten, wie Schizophyllum, Trametes, Coprinus, Coriolus, Pleurotus, Agaricus und Polyporus, sowie Stämme aus der Klasse der Ascomyceten, wie die Familien der Saccharomycetacae (die Gattungen Pichia und Saccharomyces) und der anamorphen Ascomyceten (die Gattungen Aspergillus und Fusarium).

Besonders bevorzugte Wirtsorganismen sind monokaryontische Stämme aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus oder Stämme aus den Gattungen Saccharomyces, Pichia und Aspergillus.

Insbesondere bevorzugt sind Wirtsorganismen der Art Trametes versicolor, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus niger, Aspergillus awamori bzw. Aspergillus oryzae.

Die Erfindung hat auch die Aufgabe, Pilzstämme mit einer verbesserten Kupferversorgung des sekretorischen Weges zur Verfügung zu stellen.

Diese Stämme, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Extrakopien einer oder beider der erfindungsgemäßen DNS Sequenzen kodierend für tah1 bzw. cta1 enthalten und durch Überexpression der Tah1, bzw. Cta1-Proteine zu einer verbesserten Kupferversorgung des sekretorischen Weges in der Lage sind.

Die Erfindung betrifft ferner Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor oder ein erfindungsgemäßes Expressionssystem enthalten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Mikroorganismus enthaltend ein erfindungsgemäßes Expressionssystem in an sich bekannten Weise fermentiert wird.

Bevorzugt wird das Protein nach der Fermentation aus der Fermenterbrühe aufgereinigt.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Protein um eine Laccase.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mikroorganismus um einen Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe der Ascomyceten, Basidiomyceten und mitosporen Pilze.

Solche Herstellungsverfahren sind prinzipiell beispielsweise bekannt aus DE 19814853 A1 und DE 19934408.6 .

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die in den Beispielen verwendeten Standardmethoden zur Behandlung von DNS oder RNS, wie die Behandlung mit Restriktionsendonukleasen, DNS Polymerasen, Reverser Transkriptase etc. sowie die Standardverfahren wie Transformation von Bakterien, Southern und Northern Analyse, DNS Sequenzierung, radioaktive Markierung, Screening und PCR-Technologie wurden, wenn nicht anders angegeben, durchgeführt wie vom Hersteller der jeweils eingesetzten, genannten Kits empfohlen, oder wenn keine Herstelleranleitung vorhanden war, entsprechend dem aus den Standardlehrbüchern bekannten Stand der Technik.

1. Beispiel
Herstellung einer genomischen Genbank aus Trametes versicolor.
Es wurde der Stamm Trametes versicolor TV-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11523) verwendet. Mycel von Trametes versicolor wurde zuerst durch Anzucht für 7 Tage bei 28°C auf Malzagarplatten (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, 1,5 % Agar-Agar, pH 5,0) gewonnen. Von den Malzagarplatten wurden drei Stücke ausgestanzt und damit 100 ml steriles Malzextrakt Medium (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, pH 5,0) in 500 ml Erlenmeyerkolben angeimpft. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 100 rpm für 7 Tage bei 28°C inkubiert. Die auf diese Weise hergestellte Mycelsuspension wurde über eine Porzellannutsche abgesaugt und mit 0,9 % Saline gewaschen. 1 g Mycel von T. versicolor wurden in Gegenwart von flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben. Das Pulver wurde in einem sterilen Probengefäß aufgenommen und sofort mit 5 ml Extraktionslösung (0,1 mol/l Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 mol/l EDTA, 0,25 mol/l NaCl, 0,6 mg/ml Proteinase K) und 0,5 ml einer 10 % (w/v) Natriumlauroylsarcosinlösung versetzt. Nach Incubation bei 50°C für mindestens 2 h wurde das Gemisch mit 0,85 ml 5 mol/l NaCl und 0,7 ml einer 10 % (w/v) CTAB-Lösung in 0,7 mol/l NaCl versetzt und 30 min bei 65°C inkubiert. Nach Zugabe von 7 ml eines Chloroform-Isoamylalkoholgemisches (24:1) wurde der Ansatz ausgeschüttelt, die beiden Phasen durch Zentrifugation getrennt, die wässrige Phase entfernt und chromosomale DNS durch Zugabe von 0,6 Volumenanteilen Isopropanol gefällt. Die weitere Reinigung der gefällten DNS erfolgte anschließend über eine Säule (Qiagen Genomic Tip, Qiagen, Hilden). Auf diese Weise konnten aus 16 g Mycel 0,5 mg chromosomale DNS isoliert werden.
Zur Herstellung der chromosomalen Genbank wurden 90 μg chromosomale DNS von Trametes versicolor TV-1 in einem Partialverdau mit Sau 3A geschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese aufgetrennt. Die chromosomalen DNS-Fragmente wurden im Größenbereich von 5 – 20 kb und größer 20 kb isoliert und jeweils in mit Bam HI vorgeschnittene Lambda-Phagen kloniert ("Lambda Zap^® Express" Klonierungssystem von Stratagene, Heidelberg). Von der 5 – 20 kb DNS-Fraktion wurden 4 × 10⁴ Phagen/μg Vektor-DNS und von der DNS-Fraktion größer 20 kb wurden 5 × 10⁴ Phagen/μg Vektor-DNS erhalten. Die Phagen wurden durch Infektion des E. coli Stammes XL-1 Blue MRF' amplifiziert.
2. Beispiel
Isolierung einer tah1-spezifischen DNS Sonde
Eine DNS-Sonde zur Isolierung eines tah1-Gens wurde durch PCR-Amplifikation aus einer T. versicolor cDNS-Bank mit degenerierten Primern erzeugt. Die degenerierten Primer wurden anhand eines Sequenzvergleichs bekannter Golgi-spezifischer Kupferchaperone konstruiert. Basierend auf besonders stark konservierten Bereichen der bekannten Kupferchaperone wurden dann die degenerierten Primer abgeleitet. Gene für Kupferchaperone wurden aus den DNS-Sequenz Datenbanken GenBank, EMBL and DDBJ sowie aus den Proteindatenbanken PIR, SWISSPROT, PRF und Protein Data Bank (PDB) erhalten.
Kupferchaperongene folgender Organismen wurden für den Sequenzvergleich ausgewählt: Saccharomyces cerevisiae (bezeichnet als Atx1), Homo sapiens (bezeichnet als Hah1) und Arabidopsis tha liana (bezeichnet als Cch1). Die Aminosäuresequenzen der genannten Kupferchaperone wurden verglichen. Durch den Sequenzvergleich konnten zwei Peptide mit einer Länge von vier bis fünf Aminosäuren identifiziert werden, die in allen Kupferchaperonen vollständig konserviert waren. Diese Peptide wurden unter Berücksichtigung degenerierter Codons in DNS zurück übersetzt, um degenerierte Primer herzustellen. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Primer A: 5'-GTC GNN ATG ACC TGC-3' SEQ ID NO:12
Primer B: 5'-CTT RCC GGT CTT-3' SEQ ID NO:13
PCR-Amplifikationen wurden entsprechend dem Stand der Technik nach den Angaben des Herstellers (Taq-Polymerase, Roche, Penzberg) durchgeführt: Eine 50 μl PCR Reaktion enthielt 500 ng T. versicolor cDNS-Bank (hergestellt wie im Beispiel 3 beschrieben) den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und darüberhinaus 1 E Taq Polymerase, 1,5 mmol/l MgCl₂, je 0,2 mmol/l der vier dNTPs (dATP, dCTP, cGTP, dTTP) und jeweils 500 pmol der Primer A und B. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 4 min bei 94°C, gefolgt von 24 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 46°C und 1 min bei 72°C. Es wurde ein PCR-Produkt von ca. 170 bp erhalten. Das PCR-Produkt wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, in den pCR 2.1 Vektor (Kloniervektor für PCR-Fragmente von Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert und in E. coli transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli Klone wurde das Plasmid isoliert. Eine DNS-Sequenzanalyse vom 5'- und 3'-Ende bestätigte, daß es sich bei dem klonierten DNS-Fragment um ein Fragment eines tah1-Gens handelte. Dieses cDNS Fragment wurde für die Durchmusterung einer genomischen T. versicolor Genbank eingesetzt.
Zur Vorbereitung der DNS-Sonde für die Isolierung von tah1-Genen aus einer genomischen T. versicolor Genbank (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde das tah1-spezifische PCR-Fragment durch Behandlung mit Eco RI aus dem pCR2.1 Vektor ausgeschnitten, über Agarose Elektrophorese isoliert und mit α-[32P]-dATP („Random Primer Labelling System" von GIBCO BRL, Karlsruhe) radioaktiv markiert.
3. Beispiel
Herstellung einer T. versicolor cDNA-Bank Die RNS wurde aus einer T. versicolor Flüssiganzucht gewonnen, der 25 μmol/l Kupfersulfat und 40 μmol/l DABA (4-Dimethylamino-Benzaldehyd, Aldrich, Steinheim) zugesetzt worden waren. Gesamt-RNS wurde nach der Methode von Logemann et al. (1987, Analytical Biochemistry 163, 16-20) isoliert. Für die mRNS-Aufreinigung wurde der mRNA-Purification Kit von Pharmacia (Freiburg), eingesetzt. Die erhaltene mRNS wurde entsprechend den Angaben des Herstellers, unter Verwendung des cDNA-Synthese Kits von Stratagene (Heidelberg) mit Hilfe eines eine XhoI-Erkennungsstelle enthaltenen Linker-Primers in Erststrang-cDNS umgeschrieben und nach der Zweitstrang-Synthese mit EcoRI-Adaptoren versehen. Nach Restriktion mit XhoI wurden die erhaltenen cDNS über Gelfiltration (mit CL-2B Sepharose) entsprechend der Angaben des Herstellers der Größe nach fraktioniert. Die ca. 0,2 bis 5 kb-Fraktionen wurden vereinigt und direktional in zwei verschiedene Hefe-Expressionsvektoren ligiert: Ein Teil der cDNS wurde direktional in den mit EcoRI und XhoI geschnittenen Vektor pJG4-5 ligiert (ClonTech, Heidelberg). Ein anderer Teil wurde in den mit EcoRI und SalI geschnittenen Hefe-Expressionsvektor pAH kloniert (1). pAH ist ein Derivat des Expressionsvektors pRS313 (beschrieben in R. S. Sikorski and P. Hieter, Genes 122: 19 – 27 (1989)). Die Herstellung des sog. CEN-Vektors pAH ist beschrieben in H. Feldmann et al., J. Biol. Chem. 271:, 27765 – 27769 (1996). pAH wurde aus pRS313 hergestellt, indem die Expressionssignale (Promotor und Terminator der Transkription) des stark exprimierten ADH1-Gens (Alkoholdehydrogenase) aus S. cerevisiae in den Vektor pRS313 kloniert wurden. pAH ermöglicht so die Expression klonierter DNS-Gene unter der Kontrolle des starken ADH1-Promotors und des ADX1-Terminators (1). Als Selektionsmarke fungiert das HIS3-Gen. Wie die Restriktionsanalyse der Inserts von erhaltenen Transformanten zeigt, enthält die cDNS-Bank cDNS-Fragmente von ca. 0,1 kb bis 3,5 kb.
4. Beispiel
Isolierung der cDNS von cta1-1 und cta1-2 aus einer T. versicolor cDNS Bank über funktionelle Komplementation
Zwei cta1 Allele wurden über funktionelle Komplementation einer Δccc2-Hefemutante mit der im 3. Beispiel beschriebenen Trametes cDNS-Bank isoliert. Die verwendete Δccc2-Hefemutante „strain 3" (Genotyp: MAT alpha ccc2::URA3 ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1delta1 his3delta200 leu2delta1, von Andrew Dancis, Univ, of Pensylvania, USA bereitgestellt und in D.S. Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2632 – 2636 (1995) beschrieben) wurde mit der im 3. Beispiel beschriebenen cDNA-Bank nach dem Stand der Technik transformiert. Die Hefezellen aus einer Übernachtkultur wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,1 in 10 ml YPD Medium verdünnt und bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6 angezogen. YPD-Medium enthielt folgende Zusammensetzung: 10 g/l Hefe Extrakt, 20 g/l Pepton und 20 g/l Dextrose. Die Zellen wurden dann sedimentiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet mit 2,4 ml 50% Polyethylenglykol PEG 4000 überschichtet. Auf die PEG 4000 Phase wurde dann 10 μg cDNA-Bank in 500 μl Wasser, 250 μl Salmon Sperm-DNA (2 mg/ml, GIBCO BRL, Karlsruhe), 360 μl 1 M Lithiumchlorid gegeben und der ganze Ansatz durch vortexen gemischt. Das Gemisch wurde dann 30 min bei 30°C inkubiert und dann ein Hitzeschock von 30 min bei 42°C durchgeführt. Danach wurden die Zellen wieder sedimentiert und dann in 10 ml Wasser aufgenommen. Der Transformationsansatz wurde schliesslich auf Selektivmedium (YNB-Platten ohne Histidin) ausplattiert. Das Selektivmedium YNB hatte folgende Zusammensetzung: 0,67 g/l Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (Difco), 20 g/l Agar, einfach konzentrierte sog. Dropout-Mix (10-fach konzentrierte Dropout-Mix Stammlösung war zusammengesetzt aus Adenin, 40 μg/ml, L-Arginin, 20 μg/ml, L-Asparaginsäure, 100 μg/ml, L-Glutaminsäure, 100 μg/ml, L-Lysin, 30 μg/ml, L-Methionin, 20 μg/ml, L-Phenylalanin, 50 μg/ml, L-Serin, 375 μg/ml, L-Threonin, 200 μg/ml, L-Tryptophan, 40 μg/ml, L-Tyrosin, 30 μg/ml, L-Valin, 150 μg/ml, Leucin, 60 μg/ml, Uracil, 20 μg/ml, L-Hisitidin, 120 μg/ml. Für die Selektion auf Histidin Prototrophie wurde Dropout-Mix ohne Histidin verwendet).
Die bei der Transformation erhaltenen 200.000 Einzelklone wurden vereinigt und gemischt. Von diesen Primärtransformanten wurden ca. 1,6 × 10⁸ Zellen auf Selektionsplatten für den Δccc2-Phänotyp ausplattiert. Die Selektionsplatten enhielten YNB-Medium ohne Histidin, 2 % Glucose und 1 mmol/l Ferrozin (Fluka, Deisenhofen), einen Eisen(II)-Chelator, der die verfügbare Eisenkonzentration im Medium stark verringert. Unter diesen Eisenmangelbedingungen kann der ccc2-defiziente „strain 3" nicht wachsen, da er aufgrund der Deletion des CCC2-Gens ein Kupfer-abhängiges Enzym, Fet3p, das für die Eisenaufnahme essentiell ist, nicht mit Kupfer-Ionen versorgen kann. Es wurden 1.000 Klone, die auf diesen Selektionsplatten wuchsen, erhalten. Von 70 Klonen wurden die enthaltenen Plasmide isoliert und in E. coli transformiert. Von den Plasmiden, die aus den 70 E. coli Rücktransformanten isoliert und in einer Restriktionsanalyse untersucht wurden, enthielten 62 ein 3 kb Fragment. Die Sequenzanalyse von vier dieser Komplementationsklone zeigte, daß alle vier Klone für ein Protein kodierten, das zu den stark konservierten Bereichen des Ccc2p Proteins aus S. cerevisiae eindeutige Homologien zeigt. Diese Trametes-Gene, die eine delta ccc2 Hefe-Mutante komplementieren, werden als cta (copper transporting ATPase)-Gene bezeichnet. Drei dieser Klone, pAH-cta21, pAH-cta34 und pAH-cta36 wurden vollständig sequenziert. In diesen Klonen ist das cta1 cDNS Gen in dem Vektor pAH enthalten, wie im 3. Beispiel beschrieben. Es konnten zwei Allele des Trametes cta1 Gens (bezeichnet als cta1-1 und cta1-2) identifiziert werden. Diese beiden Allele unterscheiden sich in 152 Nukleotiden (cta1-1, SEQ ID NO:7 und cta1-2, SEQ ID NO:9) bzw. 11 Aminosäuren (Cta1-1, SEQ ID NO:8 und Cta1-2, SEQ ID NO:10). Die Aminosäureaustausche befinden sich nicht in den stark konservierten Sequenzen. Beide Allele sind in S. cerevisiae und in T. versicolor funktionell. Das Allel cta1-1, das in dem Klon pAH-cta21 exprimiert wird, ist mit der cDNS Sequenz SEQ ID NO:7 identisch und kodiert für ein Protein, das in der Proteinse quenz SEQ ID NO:8 dargestellt ist. Dieses Allel entspricht der genomischen Sequenz SEQ ID NO:11 (erhalten wie in Beispiel 5.4 beschrieben).
5. Beispiel
Isolierung der genomischen DNS von tah1 und cta1 aus der Lambda ZAP Express-Genbank.
Es wurde die im 1. Beispiel beschriebene genomische Genbank von Trametes versicolor TV-1 verwendet. Die Durchmusterung der Genbank wurde wie vom Hersteller des Klonier Kits (Stratagene, Heidelberg) empfohlen durchgeführt. In einer ersten Durchmusterungsrunde wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue MRF' auf 10 Petrieschalen zuerst kultiviert und dann mit 50.000 Phagen der chromosomalen Genbank (5 – 20 kb Fraktion, siehe 2. Beispiel) pro Petrieschale infiziert. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die neu gebildeten Phagen auf Nylonfilter (Amersham, Braunschweig) transferiert. Die Filter wurden dann entsprechend den Empfehlungen des Herstellers mit der radioaktiv markierten tah-spezifischen Sonde (siehe 2. Beispiel) und anschließend mit der ebenfalls radioaktiv markierten Sonde für das cta1-1 cDNS-Gen hybridisiert. Die cta1-1 DNS-Sonde war zuvor aus dem Plasmid pAH-cta21 (beschrieben im 4. Beispiel) durch Verdau mit Hind III herausgeschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese isoliert worden. Die radioaktive Markierung erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nach der Isolierung der kreuzreagierenden tah1-Klone wurden die Filter mit der cta1-Sonde unter den gleichen Bedingungen hybridisiert. Es wurde der Rapid Hybridization Buffer von Amersham (Braunschweig) entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. Die Hybridisierungstemperatur betrug mit beiden Sonden 65°C. Positive Klone wurden gepickt und durch Wiederholung des Screeningverfahrens gereinigt. Nach drei Runden der Vereinzelung wurden bei der Durchmusterung für das tah-Gen wie das cta-Gen neun stark hybridisierende Phagenklone isoliert, die nach einer Vorschrift des Herstellers (Stratagene, Heidelberg) durch "in vivo excision" in den pBK CMV Vektor (Stratagene, Heidelberg) umkloniert wurden. Analyse der Klone durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen und anschließender Southernanalyse zeigte, daß es sich bei jeweils fünf Klonen um mit tah1 bzw. cta1 kreuzreagierende Klone handelte.
Die Sequenzanalyse von den fünf tah1-Klonen bzw. fünf cta1-Klonen zeigte, daß keiner der Klone ein vollständiges Gen enthielt. Durch überlappende identische Sequenzen aller tah1- bzw. cta1-Klone konnten zwei vollständige Allele von tah1, genannt tah1-1 (SEQ ID NO:5) und tah1-2 (SEQ ID NO:6) und ein vollständiges Allel von cta1-1 (SEQ ID NO:11) erhalten werden.
5.1 Charakterisierung der tah1-Allele:
Die tah1 Allele unterscheiden sich im Bereich zwischen Start- und Stop-Codon um neun Basenpaare, von denen sich acht in den Introns befinden. Der Unterschied im Exon 3 (Basenaustausch ACG zu ACA) wirkt sich nicht auf die kodierten Aminosäuresequenzen aus, da beide Codons für Threonin kodieren. Die Aminosäuresequenzen beider tah1-Allele (SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4) sind daher identisch. Das Allel tah1-1 entspricht der Sequenz SEQ ID NO:5 und enthält neben dem tah1-Strukturgen (kodierender Bereich von Position 832 bis einschließlich 1294) auch die 5'- und 3'-regulativen Sequenzen. Im tah1-1 Gen befinden sich fünf Introns, die nicht in Aminosäuresequenz übersetzt werden. Das entsprechende tah1-1 cDNS-Gen ist in SEQ ID NO:1 angegeben.
SEQ ID NO:5 enthält auch Sequenzinformation in der Region 5' vor dem ATG-Startkodon (Promotorbereich, SEQ ID No:5, bp 1 – 715) sowie Sequenzinformation in der Region 3' nach dem Stopkodon (Terminatorbereich, SEQ ID No:5, bp 1295 – 1405). Es handelt sich hierbei um neue genetische Regulationselemente für Trametes versicolor, die für die Herstellung von Expressionsvektoren zur Genexpression in filamentösen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten verwendet werden können.
5.2 Isolierung eines vollständigen tah1-1 Gens:
Eine vollständiges genomisches tah1 Strukturgen wurde durch PCR mit den Primern gTAH-FW (SEQ ID NO:14) und gTAH-RV-Not (SEQ ID NO:15, unterstrichen die Sequenz für eine Not I Schnittstelle) erhalten.
gTAH-FW: 5'-CACCATGGTGGGTCCGCTT-3' SEQ ID NO:14
gTAH-RV-Not:5'-CAGCGGCCGCTTTCGAACACGGGAACCTATC-3' SEQ ID NO:15
Die PCR wurde mit Pwo-Polymerase entsprechend den Angaben des Herstellers (Roche, Penzberg) durchgeführt. Eine 18 μl Reaktion enthielt 10 ng genomische DNS aus T. versicolor (isoliert wie im 2. Beispiel beschrieben), den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und darüberhinaus 1 E Pwo Polymerase, 1,5 mmol/l MgSO₄, je 0,2 mmol/l der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer gTAH-FW und gTAH-RV-NOT. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 3 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 15 s bei 94°C, 10 s bei 65°C und 30 s bei 72°C. Es wurde ein PCR-Produkt von ca. 590 bp erhalten. Das PCR-Produkt wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, in die EcoRV-Schnittstelle des pZErO-2 Vektors (Kloniervektor für PCR-Fragmente von Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert und in E. coli transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli Zellen wurde das Plasmid isoliert. Der resultierende Klon pZgTAH-N enthält das tah1-1 Strukturgen (SEQ ID NO:5 von Position 828 bis Position 1409). Es wurde ein Klon ausgewählt, bei dem das tah1-1 Gen so orientiert war, dass bei einem Verdau mit Not I ein 3864 bp und ein 20 bp Fragment entstand. Diese genomische DNS-Sequenz des tah1-1 Strukturgens wurde für die Überexpression (unter Kontrolle des gapDH-Promotors) in T. versicolor eingesetzt (beschrieben in Beispiel 8.1.).
5.3 Charakterisierung des genomischen cta1-1-Allels:
Das genomische cta1-1 Allel (SEQ ID NO:11) wurde durch einen Sequenzvergleich dem entsprechenden cDNS-Gen zugeordnet. Die cDNS-Gene der cta1-1 (SEQ ID NO:7) und cta1-2 Allele (SEQ ID NO:9) unterscheiden sich im Bereich zwischen Start- und Stop-Codon um 152 Basenpaare. Die von den beiden cta1 Allelen kodierten Proteine Cta1-1 (SEQ ID NO:8) und Cta1-2 (SEQ ID NO:10) unterscheiden sich in 11 Aminosäuren.
Die DNS-Sequenz von cta1-1 (SEQ ID NO:11) konnte aus überlappenden Sequenzen von vier Partialklonen aus dem Genbankscreening zusammengesetzt werden. SEQ ID NO:11 enthält auch die 5'- (SEQ ID NO:11, bp 1 – 898) und 3'-regulativen (SEQ ID NO:11, bp 4598 – 5040) Sequenzen. Im cta1-1-Gen befinden sich vier Introns, die nicht in Aminosäuresequenz übersetzt werden (SEQ ID NO:11, Intron 1: bp 1073 – 1122, Intron 2: bp 1243 – 1886, Intron 3: bp 4035 – 4087, Intron 4: bp 4629 – 4728). Das Intron 4 ist in der 3'-transkribierten, nicht-translatierten Region hinter dem Stop-Codon lokalisiert. Vom cta1-2 Allel wurde nur eine partielle, nicht näher charakterisierte genomische Sequenz erhalten. Ein genomischer Klon von cta1-1, dessen Isolierung in Beispiel 5.4 beschrieben ist, wurde für die Überexpression in T. versicolor (siehe Beispiel 8.2) eingesetzt.
5.4 Isolierung eines vollständigen cta1-Gens
Ein vollständiges genomisches Strukturgen von cta1-1 wurde durch PCR erhalten. Dazu wurden die Primer gCTA-FW (SEQ ID NO:15) und gCTA-RV (SEQ ID NO:16) eingesetzt.
gCTA-FW: 5'-CAGTAATATTGAACTCAGCG-3' SEQ ID NO:16
gCTA-RV: 5'-GAATATTCGTACTCACCTTC-3' SEQ ID NO:17
Die PCR wurde mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche, Penzberg) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Eine 50 μl Reaktion enthielt 500 ng genomischer DNS aus T. versicolor (isoliert wie im 2. Beispiel beschrieben), den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und darüberhinaus 1,75 E Pwo Polymerase, 1,5 mmol/l MgSO₄, je 0,2 mmol/l der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer gCTA-FW und gCTA-RV. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 3 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 10 s bei 94°C, 10 s bei 60°C und 4 min bei 68°C. Die erhaltene Bande von 4,9 kb wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, in den Vektor pCR 2.1 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in E. coli transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli Klone wurde das Plasmid isoliert. Positive Klone wurden durch Analyse mit Restriktionsendonukleasen identifiziert und von einem ausgewählten Klon die DNS-Sequenz bestimmt. Der resultierende Klon pgCTA-EX enthält das cta1-1 Strukturgen SEQ ID NO:7 von Position 81 bis 4980 inklusive der Intronsequenzen 1 bis 3 sowie der 3'-Terminatorsequenz und kodiert für ein Protein mit der in SEQ ID NO:8 angegebenen Aminosäuresequenz. Diese genomische DNS-Sequenz des cta1-1 Strukturgens wurde für die Überexpression (unter Kontrolle des gapDH-Promotors) in T. versicolor eingesetzt (siehe Beispiel 8.2).
6. Beispiel
Isolierung von tah1 cDNS Genen
Basierend auf der Sequenz der in Beispiel 2 isolierten partiellen cDNS von tah1, der die 5'- und 3'-Enden fehlten, wurden die zwei Primer TCC-Ord (SEQ ID NO:18) und TCC-Rev (SEQ ID NO:19) angefertigt, mit denen die 5'- und 3'-Enden der cDNS bestimmt werden konnten:
TCC-Ord 5'-GCT GAA GAA GAC GGA CGG TGT-3' SEQ ID NO:18
TCC-Rev 5'-GTC GTC GTA CGG AAT CGT GCC-3' SEQ ID NO:19
Der Primer TCC-Ord bindet im 5'-Bereich des tah1-Gens, und TCC-Rev bindet im 3'-Bereich des tah1-Gens. TCC-Ord und TCC-Rev wurden zusammen mit je einem von zwei Vektor-spezifischen Primern (JG4-5-Ord, SEQ ID NO:20 und JG4-5-Rev, SEQ ID NO:21) verwendet, um aus der im 3. Beispiel beschriebenen cDNS-Genbank zwei überlappende, partielle tah1 cDNS Genfragmente zu erzeugen. JG4-5-Ord und JG4-5-Rev hatten die folgenden Sequenzen:
JG4-5-Ord: 5'-TTG CTG AGT GGA GAT GCC TCC-3' SEQ ID NO:20
JG4-5-Rev: 5'-TGG AGA CTT GAC CAA RCC TCT G-3' SEQ ID NO:21
Die überlappenden tah1 cDNS Genfragmente wurden in PCR-Reaktionen durch die Primerkombinationen TCC-Ord und JG4-5-Rev sowie TCC-Rev udn JG4-5-Ord erzeugt.
Die PCR-Reaktionen wurden mit Taq-Polymerase entsprechend den Angaben des Herstellers (Roche, Penzberg) durchgeführt. Eine 18 μl Reaktion enthielt 10 ng der pJG4-5 cDNA-Bank aus T. versicolor (hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben), den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und darüberhinaus 1 E Taq Polymerase, 1,5 mmol/l MgCl₂, je 0,2 mmol/l der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer TCC-Ord und JG4-5-Rev (für Amplifikation des 3'-Endes des tah1 cDNS-Gens) und in einem parallel durchgeführten PCR-Ansatz jeweils 100 pmol der Primer TCC-Rev und JG4-5-Ord (für Amplification des 5'-Endes des tah1 cDNS-Gens). Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 3 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94°C, 10 s bei 70°C und 1 min bei 72°C. Es wurden PCR-Produkte von ca. 450 bp (für das 3'-Ende) und 300 bp (für das 5'-Ende) erhalten.
Die DNS-Fragmente wurden durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Die Vektor-DNA wurde aus transformierten E. coli isoliert und positive Klone durch DNS-Sequenzierung analysiert. Die Sequenzanalyse der erhaltenen Klone zeigte, daß die isolierten Fragmente überlappten, und daß sie neben der partiellen tah1-Sequenz auch den Anfang und das Ende des tah1-Gens enthielten. Die erhaltene Sequenzinformation wurde dazu verwendet, ein vollständiges tah1-cDNA Gen über PCR zu isolieren. Die dafür eingesetzten Primer, cTAH-FW (SEQ ID NO:22) und cTAH-RV (SEQ ID NO:23) hatten folgende Sequenzen:
cTAH-FW 5'-ACC ATG TCC GAG CAC ACT TAC-3' SEQ ID NO:22
cTAH-RV 5'-GA TCA TAC CAC CGT CTC TCC-3' SEQ ID NO:23
PCR-Reaktionen wurden mit Pwo-Polymerase (Roche, Penzberg) nach dem Stand der Technik durchgeführt. Eine 18 μl Reaktion enthielt 10 ng der pJG4-5 cDNA-Bank aus T. versicolor (hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben), den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und darüberhinaus 1 E Pwo Polymerase, 1,5 mmol/l MgCl₂, je 0,2 mmol/l der vier dNTPs und jeweils 100 pmol der Primer cTAH-FW und cTAH-RV. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 3 min bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94°C, 10 s bei 65°C und 1 min bei 70°C. Das resultierende PCR-Fragment von 224 bp wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt und in den Vektor pZErO kloniert. Die Vektor-DNA wurde aus transformierten
E. coli isoliert und positive Klone durch DNS-Sequenzierung analysiert.
Durch Sequenzanalyse positiver Klone wurden die cDNS Gene den genomischen Allelen tah1-1 und tah1-2 zugeordnet. Die cDNS-Sequenz von tah1-1 entspricht der Sequenz SEQ ID NO:1 von Position 59 bis einschließlich 277. Die cDNS-Sequenz von tah1-2 entspricht der Sequenz SEQ ID NO:3 von Position 59 bis einschließlich 277. Beide tah1 cDNS Gene kodieren für ein Protein mit der Sequenz SEQ ID NO:2. Das tah1-1 cDNS-Fragment wurde für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eingesetzt (beschrieben im Beispiel 7.1).
7. Beispiel
Herstellung von Expressionsvektoren für S. cerevisiae
Für die heterologe Expression der Trametes tah1 und cta1 Gene in der Hefe S. cerevisiae wurden zwei Hefe-Expressionsvektoren hergestellt, die eine starke konstitutive Co-Expression dieser Gene ermöglichte. Für die Expression in S. cerevisiae wurden die cDNS-Sequenzen von tah1-1 (SEQ ID NO:1) und cta1-1 (SEQ ID NO:7) eingesetzt.
7.1 Expressionsvektor für tah1-1
Für die Expression in S. cerevisiae wurde das im 6. Beispiel beschriebene tah1-1 cDNS-Gen verwendet. Für die weitere Klonierung wurde ein tah1-1 Klon verwendet, in dem das 5'-Ende des tah1 cDNS-Gens benachbart war zu einer Eco RI Schnittstelle und das 3'-Ende des tah1-1 cDNS-Gens benachbart zu einer Xho I Schnittstell im Vektor pZero.
Die ca. 230 bp große tah1 cDNS wurde mit EcoRI und XhoI aus dem Vektor pZErO herausgeschnitten, durch Gelelektrophorese gereinigt und in den mit EcoRI und SalI geschnittenen Hefeexpressionsvektor pAT kloniert. Der resultierende Vektor wurde als pATtah (2) bezeichnet. Das tah1-1 Gen steht in diesem Vektor unter der transkriptionellen Kontrolle des ADH1-Promotors und des ADH1-Terminators aus S. cerevisiae. Der Vektor pAT ist ein CEN-Plasmid und trägt für die Selektion in S. cerevisiae die TRPI Marke.
pAT ist ein Derivat des Expressionsvektors pRS304 (beschrieben in R. S. Sikorski and P. Hieter, Genes 122: 19 – 27 (1989)). Die Herstellung des sog. CEN-Vektors pAT ist beschrieben in H. Feldmann et al., J. Biol. Chem. 271:, 27765 – 27769 (1996). pAT wurde aus pRS304 hergestellt, indem die Expressionssignale (Promotor und Terminator der Transkription) des stark exprimierten ADH1-Gens (Alkoholdehydrogenase) aus S. cerevisiae in den Vektor pRS304 kloniert wurden. pAT ermöglicht so die Expression klonierter DNS-Gene unter der Kontrolle des starken ADH1-Promotors und des ADH1-Terminators. Als Selektionsmarke fungiert das TRP1-Gen.
7.2 Expressionsvektor für cta1
Für die Überexpression des cta1 cDNS-Gens in S. cerevisiae wurde der aus der funktionellen Komplementation einer Δccc2 Hefe-Mutante isolierte Vektor pAH-cta21 (in Beispiel 4 beschrieben) eingesetzt. In diesem Vektor steht die cta1 cDNS unter der transkriptionellen Kontrolle des ADH1 Promotors und des ADX1 Terminators. Als Selektionsmarke fungiert HIS3.
8. Beispiel
Herstellung von Expressionsvektoren für Trametes versicolor
Für die Überexpression von tah1-1 und cta1-1 in Trametes versicolor wurden zwei Expressionsvektoren konstruiert. Für die Überexpression in T. versicolor wurden die genomischen Sequenzen (SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:11) verwendet. Das tah1-1 Gen, wie auch das cta1-1 Gen stehen in diesen Vektoren unter der transkriptionellen Kontrolle des starken, konstitutiven gapDH-Promotors aus T. versicolor. Da beide Vektoren co-transformiert wurden, wurde die Selektionsmarke pyrF aus T. versicolor nur in einem Vektor, dem kleineren tah1-Expressionsvektor, inseriert.
8.1 Expressionsvektor für tah1
8.1.1 Funktionelle Verknüpfung des Trametes versicolor gapDH-Promotors mit dem tah1-Gen aus Trametes versicolor
A) Einbau des T. versicolor gapDH-Promotors in pUC19
Die DNS-Sequenz des Promotors für das T. versicolor gapDH-Gen ist in DE-A-19814853 als SEQ ID NO:5, bp 1 – 1542 offenbart. Ein ca. 1 kb großes Promotorfragment des gapDH-Gens wurde als Sph I Fragment isoliert und in die Sph I-Schnittstelle des pUC19 Vektors kloniert. Nach Analyse durch Restriktion mit Hind III (im Polylinker von pUCl9 und im gapDH-Promoterfragment enthalten) wurde ein Klon ausgewählt, in dem die zwei Hind III Schnittstellen 889 bp voneinander entfernt waren. Der auf diese Weise hergestellte 3,7 kb große Vektor erhielt die Bezeichnung pUC-PgapM. Es wurde auch ein Klon erhalten, in dem der gapDH-Promotor in der umgekehrten Orientierung inseriert war, wie die 142 bp-Bande aus der Hind III-Restriktion zeigte. Dieser Klon wurde pUC-PgapP genannt und für die Konstruktion eines cta1-Expressionsvektors verwendet (siehe Beispiel 8.2)
B) Insertion des T. versicolor gapDH-Promotors aus pUC-PgapM in pZgTAH-N
Der Vektor pZgTAH-N, der das genomische tah1-Strukturgen trägt, wurde wie in Beispiel 5.2 beschrieben hergestellt. Der gapDH-Promotor aus dem Vektor pUC-PgapM wurde mit Eco RI und Bsp LU11I herausgeschnitten und direktional in den mit Eco RI und Nco I geschnittenen Vektor pZgTAH-N kloniert. Der Vektor pZgTAH-N wurde dazu zuerst partiell mit Nco I geschnitten, der linearisierte Vektor (3,9 kb) gelisoliert und anschliessend mit Eco RI geschnitten. In das so vorbereitete 3,9 kb große Vektor fragment wurde dann das gapDH-Promotorfragment kloniert. In dem resultierenden Vektor pZgTAH-Pgap befindet sich das T. versicolor genomische tah1 Strukturgen (SEQ ID NO:5 von Position 828 bis 1409) unter der Kontrolle des T. versicolor gapDH-Promotors.
8.1.2 Subklonierung des Trametes pyrF-Gens in den Vektor pUC19
Das pyrF-Gen aus T. versicolor, das für eine Orotsäure-Phosphoribosyltransferase kodiert, ist in DE 19934408.6 offenbart. Für die folgenden Klonierschritte wurde es aus dem dort beschriebenen Vektor pyrF61 in den Vektor pUCl9 umkloniert. Dazu wurde das Trametes pyrF-Gen inklusive Promotor und Terminator mit Xho I und Spe I aus dem Vektor pyrF6l herausgeschnitten. Das resultierende ca. 2,8 kb große Fragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt und in den mit Sal I und Xba I geschnittenen pUC19 inseriert. Der resultierende Vektor wurde als pUC-pyrF bezeichnet.
8.1.3 Herstellung eines Trametes tah1-Expressionsvektors mit dem Trametes pyrF-Gen als Selektionsmarke
Das durch den gapDH-Promotor kontrollierte tah1-Gen wurde mit Eco RI und Not I aus dem Vektor pZgTAH-Pgap (hergestellt wie in Beispiel 8.1.1 B beschrieben) herausgeschnitten und in den Vektor pUC-pyrF (hergestellt wie in Beispiel 8.1.2 beschrieben) kloniert. Dazu wurde der Vektor pZgTAH-Pgap zuerst mit Not I linearisiert und durch Behandlung mit der Klenow DNS-Polymerase (Roche, Penzberg) die überhängenden Enden aufgefüllt. Die anschließende Restriktion mit Eco RI produzierte ein 1,6 kb großes Fragment, in dem der gapDH-Promotor direkt vor dem tah1-Gen lokalisiert ist. Das tah1-Gen wird von der eigenen 3'-nicht-kodierenden Region flankiert. Das 1,6 kb große Fragment wurde über Gelelektrophorese gereinigt.
Für die Insertion dieses 1,6 kb Fragmentes wurde der Vektor pUC-pyrF mit Bam HI geschnitten und durch Klenow-Behandlung die überhängenden Enden aufgefüllt. Nach einer zweiten Restriktion mit Eco RI wurde der Vektor über eine Gelelektrophorese aufge reinigt. Das Pgap-tah1-Fragment wurde direktional in den vorbereiteten Vektor pUC-pyrF ligiert. Der resultierende Vektor wurde als pyrF-gapTAH bezeichnet (3). Dieser Vektor trägt als Selektionsmarke das Trametes pyrF-Gen, welches unter der transkriptionellen Kontrolle seines eigenen Promotors und Terminators steht. Gegenläufig zur Selektionsmarke befindet sich das Trametes tah1-Gen, das unter der transkriptionellen Kontrolle des Trametes gapDH-Promotors steht. Für die Selektion und Amplifikation in E. coli fungieren die Ampicillin-Marke und das ColE1 Replikon des pUC19 Vektors.
8.2 Expressionsvektor für cta1
8.2.1 Einfügen einer Nco I Schnittstelle vor das Startcodon des cta1 Strukturgens durch PCR
Das in Beispiel 5.4 beschriebene genomische cta1-1 Gen wurde für eine PCR-Reaktion mit den Primern pgCTA-Nco (SEQ ID NO:24), gCTA-RV (SEQ ID NO:17; Beispiel 5.4) und dem „High Fidelity PCR System" (Roche, Penzberg) verwendet. Der pgCTA-Nco Primer wurde so gewählt, daß durch eine Fehlpaarung (C statt T) an der zweiten Nucleotidposition eine Nco I Schnittstelle vor dem Startcodon des cta1-1 Gens inseriert wurde. pgCTA-Nco hatte die folgende Nucleotidsequenz (unterstrichen die Nco I Erkennungssequenz)
pgCTA-Nco: 5'-ACCATGGCGGGCCTTTC-3' SEQ ID NO:24
Das bei der PCR-Reaktion erhaltene DNS-Fragment wurde in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) subkloniert in E. coli transformiert. Der Klon der das PCR-Fragment mit der neu eingebauten Nco I Schnittstelle enthielt wurde als pATG-CTA bezeichnet.
8.2.2 Funktionelle Subklonierung des cta1-1 Strukturgens in den Vektor pUC-PgapP
Aus dem für die Herstellung von pUC-PgapM und pUC-PgapP verwendeten pUC19 Vektor war vorher eine singuläre BspLU11 I Schnitt stelle entfernt worden, die bei der weiteren Vektorkonstruktion störend gewesen wäre. Dies erfolgte, indem der pUC19 Vektor mit BspLU11 I geschnitten und der dadurch linearisierte Vektor mit Klenow DNA-Polymerase (Roche, Penzberg) behandelt wurde. Dadurch wurden die nach dem BspLU11 I Verdau versetzten Enden des pUCl9 Vektors aufgefüllt. Anschließende Ligation und Transformation von E. coli ergab Klone, die einen modifizierten pUC19 Vektor ohne BspLU11 I Schnittstelle enthielten. Der Vektor pUC-PgapP ist ein modifiziertes Derivat dieses pUCl9 Vektors.
A) Klonierung des 5'-Bereichs von cta1-1
Aus dem Konstrukt pATG-CTA aus Beispiel 8.2.1 wurde der 1236 bp große 5'-Bereich des cta1-1 Gens einschließlich des Startcodons durch Nco I Verdau herausgeschnitten und in den Vektor pUC-PgapP, der vorher durch BspLU11I linearisiert worden war, ligiert. Die Schnittstellen von Nco I und BspLU11 I sind kompatibel. Die anschließende Transformation in E. coli ergab Klone, die das Fragment in beiden Orientierungen im Vektor pUC-PgapP enthielten. Die Orientierung des klonierten Fragments wurde durch einen Restriktionsverdau mit EcoR I und Fsp I überprüft und ein Klon gewählt, bei dem das Startcodon an den gapDH-Promotor anschließt. Dieses Konstrukt wurde als pgapCTA-A bezeichnet.
B) Einfügen des 3'-Bereichs von cta1
Aus dem Konstrukt pATG-CTA wurde durch Restriktion mit Spe I und Nae I der 3421 bp große 3'-Bereich herausgeschnitten und in das mit Spe I und Sma I geschnittene Konstrukt pgapCTA-A ligiert. Nach Transformation in E. coli wurde die Orientierung des ligierten Fragments durch Restriktion mit Sal I und EcoR I überprüft. Es wurde ein Klon ausgewählt, der das genomische cta1-1 Strukturgen (SEQ ID NO:11 von Position 898 bis einschließlich Position 4980) einschließlich der eigenen 3'-nicht-kodierenden-Sequenz so inseriert hatte, daß es unter der transkriptionellen Kontrolle des Trametes gapDH-Promotors steht. Dieser Vektor wird als pgapCTA bezeichnet (4).
9. Beispiel
Expression des cta1-1 cDNS-Gens in Pichia pastoris
Es wurde ein kommerziell erhältliches Expressionssystem der Fa. Invitrogen mit den dazugehörenden Expressionsvektoren pPICZ und pGAPZ und dem Pichia pastoris Stamm KM71 verwendet. Der Pichia pastoris Stamm KM71 ist Histidin auxotroph. Für die Co-Transformation des Laccase III cDNS Gens aus T. versicolor und cta1-1 wurde ein KM71-Stamm verwendet, der bereits mit der Laccase III cDNS transformiert worden war (Stamm KM71-145). Die Herstellung eines solchen Stammes ist in DE 19724039.9 (entspricht der US-Anmeldung mit der Serial number 09/445381) offenbart. Das Laccase III cDNS Gen ist aus dem in DE 19814853 A1 , SEQ ID NO:2 offenbarten genomischen Gen abgeleitet, indem die dort angegebene DNS dazu verwendet wurde, um das entsprechende Laccase III cDNS Gen auf einer dem Fachmann geläufigen Art und Weise aus einer T. versicolor cDNS Genbank zu isolieren. Die Herstellung einer cDNS Genbank ist im 3. Beispiel beschrieben. Das Genbank Screening ist im 5. Beispiel beschrieben. Die cDNS Sequenz der Laccase III aus T. versicolor ist in SEQ ID NO:25 aufgeführt.
Der Expressionsvektor pPICZ enthielt den Promotor und Terminator des Alkoholoxidasegens AOX1 aus Pichia pastoris. Der Expressionsvektor pGAPZ enthielt den Promotor des gapDH-Gens (Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase) aus Pichia pastoris und den Terminator des Alkoholoxidasegens AOX1 aus Pichia pastoris. Zwischen Promotor und Terminator wurde jeweils das cta1-1 cDNS Gen kloniert. Für die Selektion in E. coli und in Pichia pastoris enthielten die Vektoren das Resistenzgen für das Antibiotikum Zeocin (Invitrogen).
A: Konstruktion der cta1-1 Expressionsvektoren pCTAaox und pCTAgap
Zur Herstellung der Expressionsvektoren wurde das Plasmid pAH-cta21 verwendet, welches das cta1-1 cDNS Gen enthielt (4. Beispiel). pAH-cta21 wurde zuerst mit Hind III geschnitten und der auf diese Weise linearisierte Vektor mit Pfu-Polymerase (Stra tagene) behandelt, um die überhängenden Enden aus dem Verdau mit Hind III aufzufüllen. Anschließend wurde der so vorbereitete DNS-Vektor mit Eco RI geschnitten. Dabei entstanden ein 6,7 kb DNS-Fragment und ein 3,3 kb großes, das cta1-1 cDNS Gen enthaltendes Fragment, das durch Agarosegelelektrophorese isoliert wurde.
Die Expressionsvektoren pPICZ und pGAPZ wurden jeweils mit Eco RI und Pml I geschnitten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. In die so vorbereiteten Vektoren wurde das 3,3 kb große cta1-1 cDNS Fragment ligiert und mit dem Ligationsansatz jeweils E. coli Top 10F' Zellen (Invitrogen) transformiert. Von Zeocin-resistenten Klonen wurde die Plasmid DNS isoliert und positive Klone durch Restriktionsverdau mit Eco RI identifiziert. Positve Klone hatten eine Grösse von 6,6 kb (Vektor pPICZ), bzw. 6,3 kb (Vektor pGAPZ). Die so erhaltenen Vektoren wurden mit den Namen pCTAaox (5), bzw. pCTAgap (6) bezeichnet. In pCTAaox steht das cta1-1 cDNS Gen unter Kontrolle des induzierbaren Alkoholoxidase Promotors aus Pichia pastoris. In pCTAgap steht das cta1-1 cDNS Gen unter Kontrolle des konstitutiven gapDH Promotors aus Pichia pastoris.
B: Transformation von Pichia pastoris
Der Laccase III exprimierende Stamm KM71-145 wurden zuerst in 5 ml YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Dextrose) bei 30°C über Nacht kultiviert. Mit je 0,2 ml dieser Vorkultur wurden zwei Hauptkulturen von je 250 ml YPD-Medium inokuliert und wiederum bei 30°C über Nacht bis zu einer optischen Dichte (OD600 nm) von 1,3 – 1,5 kultiviert. Die Hefezellen einer 250 ml Hauptkultur wurden daraufhin abzentrifugiert (5 min 1500 × g), zweimal mit je 200 ml H₂O und einmal mit 10 ml 1 M Sorbitol gewaschen und schließlich in 0,5 ml 1 M Sorbitol aufgenommen.
Plasmid DNS der Vektoren pCTAaox und pCTAgap wurde jeweils mit Bgl II linearisiert, mit Ethanol gefällt und in H₂O in einer Konzentration von 1μg DNS/μl aufgenommen.
Ein Transformationsansatz enthielt 80 μl Pichia pastoris Zellen und 10 μg linearisierte Vektor-DNS. Transformation erfolgte durch Elektroporation bei 1500 V, 25 μF und 200 Ohm (BioRad Gene Pulser). Die Entladungszeit betrug ca. 4,2 msec. Der Transformationsansatz wurde mit 1 ml 1 mol/l Sorbitol versetzt, 30 min auf Eis inkubiert und anschließend in Aliquots zu je 0,3 ml auf YPDS-Platten mit 100 μg/ml Zeocin ausplattiert. YPDS-Platten enthielten 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 mol/l Sorbitol, 2 % Dextrose und 2 % Agar. Zeocin-resistente Transformanten erschienen nach 3 – 5 Tagen Inkubation bei 30°C. Transformanten wurden durch Ausstreichen auf YPDS-Platten mit 100 μg/ml Zeocin gereinigt. Laccase produzierende Cta1-1 Transformanten wurden auf MM-Indikatorplatten identifiziert. MM-Indikatorplatten enthielten 1,34 % YNB, 4 × 10^-5 % Biotin, 0,5 Methanol, 1,5 % Agar, 1 mmol/l ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Ethyl-Benzothiazolin-6-Sulfonat, Sigma, Deisenhofen) und 0,1 mmol/l CUSulfat. Der Induktor Methanol wurde im Deckel der Petrischalen vorgelegt und täglich erneuert, um eine Versorgung der Kolonien mit Methanol durch Diffusion zu gewährleisten. Laccaseproduzenten erzeugten durch Oxidation von ABTS nach 2 – 3 Tagen Inkubation bei 30°C einen grünen Hof. Es wurden die Transformanten mit der intensivsten Hofbildung für die Expressionsanalyse in Schüttelkolben ausgewählt.
C: Expression in Schüttelkolben:
50 ml BMGY Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 0,1 mol/l K-Phosphat, pH 6,0, 1,34 % YNB, 4 × 10^-5 % Biotin, 1 % Glycerin) wurden mit einer Laccase produzierenden Pichia pastoris Cta1-1 Transformante inokuliert und 48 h bei 28°C und 300 rpm auf einem Schüttler kultiviert. Als Kontrolle diente der nicht mit dem cta1-1 cDNS Gen transfromierte Ausgangsstamm KM71-145.
Die Zellen aus der Vorkultur wurden durch Zentrifugation (10 min 1500 × g) isoliert und in 10 ml Hauptkulturmedium (MMY, 1 Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1,34 % YNB, 4 × 10^-5 % Biotin, 3 % Methanol) suspendiert. MMY-Medium wurde mit 0,5 mmol/l CuSulfat supplementiert und die Hauptkultur bei Raumtemperatur und 300 rpm auf einem Schüttler weiterkultiviert. In Abständen von 24 h wurde die Hauptkultur mit Methanol (0,3 ml/10 ml Medium) supplementiert. Es wurde die Produktion von rekombinanter Laccase verfolgt, welche nach 24 h einsetzte. Die Laccaseaktivität wurde durch den im 12. Beispiel beschriebenen ABTS-Enzymtest bestimmt. Durch die Co-Expression von Cta1-1 wurde eine Steigerung der Laccaseproduktion um max. 67 % relativ zum Kontrollstamm KM71-145 erzielt (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1: Laccaseproduktion in cta1-1 exprimierenden Stämmen von Pichia pastoris KM71-145
10. Beispiel:
Transformation eines Laccase-exprimierenden S. cerevisiae-Stammes mit pAH-cta21 und pAT-tah1
Der Labor-Hefestamm CM3260 (Genotyp: MAT alpha trp1-63 leu2-3,112 gcn4-101 his3-609 ura3-52) ist beschrieben in A. Dancis et al., Cell (1994) 76: 393 – 402 und wurde als Rezipient für die Co-Expression der Trametes Kupferhomeostasegene tah1-1 und cta1-1 mit dem Laccase III cDNS Gen aus T. versicolor (SEQ ID NO:25) verwendet. Zur Expression in S. cerevisiae wurde das Laccase III cDNS Gen in den Hefe Expressionsvektor pYEX-S1 (ClonTech, Heidelberg) kloniert. Der auf diese Weise erhaltene Vektor wurde als placP2 (7) bezeichnet. In placP2 steht das Laccase III cDNS Gen unter Kontrolle der 5'- und 3'-Hefe- Regulationssequenzen des S. cerevisiae Phosphoglyceratkinase-Gens.
Der S. cerevisiae Stamm CM3260 wurde zuerst mit dem Vektor placP2 transformiert und eine Laccase exprimierende Transformante ausgewählt. Für die Co-Transformation wurde die Laccaseexprimierende Transformante von CM3260 mit den Vektoren pAT-tah (2, Beispiel 7.1) und pAHcta21 (Beispiel 7.2) nach dem Stand der Technik transformiert. Als Kontrollen wurden die zugrundeliegenden Leervektoren transformiert, so daß folgende Transformationsansätze durchgeführt wurden:

1) pAT + pAH (Laccase III Expression, Kontrolle)
2) pAT-tah + pAH (Co-Expression Laccase III/tah1)
3) pAT + pAHcta21 (Co-Expression Laccase III/cta1)
4) pAT-tah + pAHcta21 (Co-Expression Laccase III/tah1/cta1)

Für die Co-Transformation wurden die Hefezellen über Nacht in YNB-Medium ohne Uracil angezogen (Selektion auf das Laccase-Expressionsplasmid placP2). Das YNB-Medium hatte die im 4. Beispiel angegebene Zusammensetzung, allerdings ohne Agar und ohne Uracil, jedoch mit Histidin. Die Kultur wurde auf eine OD₆₀₀ von 0,1 in 10 ml YNB Medium (ohne Uracil) verdünnt und bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6 angezogen. Die Zellen wurden dann sedimentiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet mit 2,4 ml 50% PEG 4000 überschichtet. Auf die PEG 4000 Schicht wurde dann je 1 μg der zu transformierenden Plasmide in 500 μl Wasser, 250 μl Salmon Sperm DNS (2 mg/ml, GIBCO BRL) und 360 μl 1 mol/l Lithiumchlorid gegeben und der ganze Ansatz durch vortexen gemischt. Das Gemisch wurde dann 30 min bei 30°C inkubiert und dann ein Hitzeschock von 25 bis 30 min bei 42°C durchgeführt. Danach wurden die Zellen wieder sedimentiert und dann in 10 ml Wasser aufgenommen und auf Selektionsmedium transformiert (Beispiel 11).
11. Beispiel:
Selektion von S. cerevisiae Transformanten, die die Trametes-Gene cta1-1, tah1 und Laccase III co-exprimieren
Die Transformationsansätze (siehe Beispiel 10) wurden auf YNB-Selektionsplatten (YNB-Trp-His-Ura) ausplattiert, um auf Zellen zu selektionieren, die alle drei Plasmide (pATtah bzw. pAT, pAHcta21 bzw. pAH und placP2) enthalten. Das verwendete YNB-Trp-His-Ura Medium hatte die im 4. Beispiel angegebene Zusammensetzung, jedoch ohne Tryptophan, ohne Histidin und ohne Uracil. Von jedem Transformationsansatz wurden je fünf unabhängige Transformanten, die auf YNB-Ura-His-Trp wachsen konnten, für die weitere Charakterisierung ausgewählt (Beispiel 12)
12. Beispiel:
Verwendung von Trametes tah1 und cta1 für die Herstellung von Laccase-überexprimierenden S. cerevisiae-Stämmen
Die erhaltenen Hefe-Transformanten (unter Beispiel 11 beschrieben) wurden auf ihre Laccase-Expression in Abhängigkeit von der Kupferversorgung hin untersucht. Von jedem Transformationsansatz wurde für je fünf Klone die Laccaseproduktion in Parallelanzuchten untersucht. Es wurden jeweils Vorkulturen über Nacht angezogen. Dann wurden die Vorkulturen in neues Medium überführt, so daß alle Ansätze die gleiche Anfangs-Zellkonzentration aufwiesen. Mit diesen Kulturen wurden Mikrotiterplatten (Merck, Darmstadt) mit frischem YNB-Trp-His-Ura Flüssigmedium (YNB-Trp-His-Ura Medium ohne Agar) und variierenden Kupferkonzentrationen (von 1 μmol/l bis 1000 μmol/l CuSO₄) über Nacht bei 30°C angezogen.
Das Wachstum der Hefestämme war vergleichbar (ähnliche OD₆₀₀ Werte). Die Zellen wurden abzentrifugiert und von den Überständen wurde die Laccaseaktivität photometrisch mit dem Substrat ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Ethyl-Benzothiazolin-6-Sulfonat, Sigma, Deisenhofen) bei 420 nm gemessen (OD₄₂₀, Tab. 2). In Tab. 2 sind Mittelwerte aus je fünf Parallelanzuchten aufgeführt. Wie aus Tab. 2 ersichtlich, wird die Laccaseproduktion in Hefe positiv duch die Co-Expression von Trametes-Kupferhomeostasefaktoren beeinflußt. Bei den höheren Kupferkonzentrationen (ab 100 μmol/l CuSO₄) ist der Einfluß von tah1-1 und cta1-1 auf die Laccaseexpression vergleichbar. Bei niedrigeren Kupferkonzent rationen (10 μmol/l CuSO₄) wirkt sich die Überexpression von cta1-1 stärker als die von tah1-1 auf die Laccaseproduktion aus.
Tab. 2: Co-Expression von Trametes Kupferhomeostase-Genen tah1-1 und cta1-1 zusammen mit der Laccase III in dem Hefestamm CM3260
Der Einfluß von cta1-1 und tah1-1 auf die Laccaseproduktion ist additiv, was besonders deutlich wird bei der Expression bei den niedrigeren Kupferkonzentrationen (10 μmol/l CuSO₄). Dieser Wert liegt über dem maximal erreichbaren Wert der Hefestämme ohne Kupferhomeostasegene.
Wie aus Tab. 2 zu ersehen, ist die Laccaseproduktion in den Hefestämmen, die beide Trametes Kupferhomeostasefaktoren exprimieren um den Faktor 10,5 (bei Anzucht auf 10 μmol/l CuSO₄) bzw. um den Faktor 2,8 (bei Anzucht auf 400 μmol/l CuSO₄) im Vergleich zum Kontrollstamm erhöht.
13. Beispiel:
Transformation von Trametes versicolor mit pyrF-gapTAH und pgapCTA
Für die Transformation von T. versicolor werden zunächst Protoplasten hergestellt (Beispiel 13.1). Diese werden dann mit den im 8. Beispiel beschriebenen Trametes-Expressionsvektoren pyrF- gapTAH (3) und pgapCTA (4) co-transformiert (Beispiel 13.2).
13.1 Herstellung von Trametes Protoplasten und Regenerierung von Pilzkolonien
Für die Gewinnung von Protoplasten verwendet wurde der monokaryotische Stamm Trametes versicolor F2 100 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11972) sowie der von diesem Stamm abgeleitete Uridin-auxotrophe Stamm F2 100C2-1. Die Herstellung des Stammes F2 100C2-1 ist in DE 19934408.6 offenbart. Mycel von Trametes versicolor wurde zuerst durch Anzucht für 7 Tage bei 28°C auf Malzagarplatten (3 Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, 1,5 % Agar-Agar, pH 5,0) gewonnen. Von den Malzagarplatten wurden drei Stücke ausgestanzt und damit 100 ml steriles Malzextrakt Medium (3 Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, pH 5,0) in 500 ml Erlenmeyerkolben, bzw. 125 ml des sterilen Mediums in 162 cm² Zellkulturgefäßen, angeimpft. Die Kultur wurde ohne Schütteln für 7 Tage bei 28°C inkubiert, bis die Kulturflüssigkeit dicht mit einer Mycelmatte bewachsen war. Die Kulturflüssigkeit wurde dekantiert und frisches Medium zugegeben (30 ml für das Mycel einer 100 ml Anzucht). Das Mycel wurde mit einem Ultra Turrax (9500 rpm, 4 min) homogenisiert und unter Schütteln bei 100 rpm für weitere 18 h bei 28°C inkubiert.
Die auf diese Weise hergestellte Mycelsuspension wurde durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 rpm (2000 × g) geerntet und das dabei erhaltene Mycel dreimal durch suspendieren mit 0,1 M MgSO₄, 0,6 M Saccharose, 0,1 M Phosphat, pH 5,8 (OMT-Medium) und anschließendes Zentrifugieren gewaschen. Das isolierte Mycel wurde gewogen und bis zur Behandlung mit lytischem Enzym bei 4°C aufbewahrt.
Protoplasten wurden folgendermaßen hergestellt: In einem sterilen Erlenmeyerkolben wurde Mycelium eines Kolbens in 15 ml einer frisch hergestellten und sterilfiltrierten Lösung des lyti schen Enzymgemisches Novozym 234 (3 mg/ml, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark) in OMT-Medium suspendiert. Das in der Enzymlösung resuspendierte Mycelium wurde bei geringer Drehzahl (80 rpm) auf einem Schüttelinkubator (Infors) für 1 bis 3 h bei 30°C inkubiert. Während der Inkubation wurde die Bildung der Protoplasten im Mikroskop beobachtet. Frei bewegliche Protoplasten waren üblicherweise nach 1 h zu sehen. Der Endpunkt der Protoplastierung wurde durch visuelle Inspektion im Mikroskop bestimmt und die Protoplasten durch Filtration über Glaswolle in einem Glasfilter von restlichem Mycelium abgetrennt. Die Glaswolle wurde sorgfältig mit eisgekühltem OMT-Medium gewaschen. Protoplasten wurden durch Zentrifugation der Suspension in einem sterilen Probengefäß isoliert (2000 rpm; 2500 × g, 4°C, 10 min). Die weitere Bearbeitung der Zellen erfolgte bei 4°C. Das Protoplastenpellet wurde durch suspendieren in OMT-Medium gewaschen und durch Zentrifugation reisoliert. Bei Bedarf wurde der Waschschritt wiederholt. Die Konzentration von Protoplasten wurde unter dem Mikroskop in einer Zählkammer bestimmt. Die Protoplastensuspension wurde für Experimente zur Protoplastenregenerierung oder für Transformationen auf eine Konzentration von 1 × 10⁸ Protoplasten/ml eingestellt.
Für Regenerierungsexperimente wurden von der Protoplastensuspension Verdünnungsreihen hergestellt und auf Agarplatten ausplattiert, die 1,5 % Malzextrakt, 0,1 % Trypticase Pepton, 2 % Glucose, 1,5 % Agar und zur osmotischen Stabilisierung 0,4 mol/l Mannitol enthielten. Auf diese Weise wurde der Anteil an überlebensfähigen Zellen bestimmt und getestet, ob die erhaltenen Protoplasten zu mycelartigem Wachstum regeneriert werden konnten. Auf die gleiche Weise wurde auf osmotisch nicht stabilisierten Platten (ohne Mannitol) der Anteil an osmotisch stabilen Zellen (z. B. Mycelfragmente) bestimmt. Nach Inkubation bei 28°C für 7 Tage wurden die erhaltenen Kolonien gezählt. Der Anteil überlebensfähiger Zellen aus einer Reihe von Protoplastenpräparationen betrug ca. 0,5 %. Diese Ergebnisse zeigen, daß von Trametes versicolor überlebensfähige und regenerierbare Protoplasten für Transformationsexperimente hergestellt werden können.
13.2 Co-Transformation von pyrF-defizienten Trametes versicolor Stämmen mit dem tah1-1 Gen, dem cta1-1 Gen und dem pyrF-Gen aus Trametes versicolor
A: Isolierung von Transformanten
Protoplasten von T. versicolor F2 100C2-1 wurden nach dem im Beispiel 13.1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dabei war das Anzuchtsmedium für den auxotrophen Stamm mit 10 mmol/l Uridin supplementiert worden. Es wurde mit den Vektoren pyrF-gapTAH (beschrieben im Beispiel 8.1.3 und 3) und pgapCTA (beschrieben im Beispiel 8.2 und 4) co-transformiert.
Wie im Beispiel 13.1 beschrieben, wurden Protoplasten von Trametes versicolor F2 100C2-1 hergestellt und in einer Endkonzentration von 10⁸/ml suspendiert. In Inkubationsgefäßen von 12 ml Volumen wurden 0,1 ml Aliquots der Protoplasten mit je 10 μg DNS des betreffenden Plasmids gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde langsam und unter wiederholtem mischen 1,25 ml einer PEG4000 Lösung zum Transformationsansatz gegeben.

Nach weiteren 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsgefäße mit dem im Beispiel 13.1 beschriebenen OMT-Medium aufgefüllt, gemischt und 10 min bei 4°C bei 2000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden resuspendiert und auf osmotisch stabilisierten MMS-Platten ohne Uridin ausplattiert. Das MM-Medium setzt sich wie folgt zusammen:

Glucose	20 g/l
Agar	15 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat	1 g/l
Magnesiumsulfat	0,5 g/l
Dinatriumhydrogenphosphat	0,1 g/l
Adenin	27,5 mg/l
DL-Phenylalanin	0,15 g/l
L-Asparagin	2,5 g/l
Thiamin	0,48 mg/l
Calciumchlorid	10 mg/l
Eisensulfat	10 mg/l
Kupfersulfat	2 mg/l
Zinksulfat	1 mg/l
Mangansulfat	1 mg/l

pH 5,0, mit Schwefelsäure eingestellt.

Für die osmotische Stabilisierung von Protoplasten wurde das MM-Medium mit 0,6 mol/l Saccharose supplementiert (MMS-Medium). Die Platten wurden bei 28°C für 14 Tage inkubiert und auf Wachstum von Kolonien überprüft. Bei verschiedenen Experimenten wurden Transformationsraten von 0,5 – 3 Transformanten/μg Plasmid DNS erzielt.
B: Reinigung der Transformanten
Mycel der erhaltenen Transformanten wurde gepickt und durch Ausplattieren auf frische Platten mit MM-Medium gereinigt. Dabei wurde das Inokulum punktförmig in der Mitte der Platte aufgebracht. Nach Inkubation für ca. 7 Tage bei 28°C konnte radiales Mycelwachstum beobachtet werden. Dieser Reinigungsvorgang wurde wiederholt, wobei das Mycel für das Inokulum vom Rand der ersten Reinigungsplatte entnommen wurde. MM-Platten wurden dann erneut mit Inokulum der zweiten Reinigungsplatte inokuliert und bei 28°C inkubiert, bis die Platten vollständig mit Mycel bewachsen waren. Diese "Masterplatten" dienten als Ausgangsmaterial für die Analyse der Transformanten.
C: Analyse der Transformanten mittels PCR und Laccase-Aktivitätsbestimmung
Die auf MM-Medium wachsenden Transformanten von T. versicolor, haben den Vektor pyrF-gapTAH auf eine Art in das Genom integriert, daß das pyrF-Gen funktionell ist und somit den Transformanten das Wachstum auf MM-Medium ermöglicht.
Um potentielle Co-Transformanten zu identifizieren, die sowohl pyrF-gapTAH als auch pgapCTA derart in das Genom integriert haben, daß die zu exprimierenden Gene auch funktionell sind (d. h. Integration über den pUCl9 Vektoranteil, nicht über die Trametes Expressionskassetten), wurden die T. versicolor Transformanten einer PCR-Analyse unterzogen. Die PCR-Analyse eignet sich, um mit relativ wenig genomischer DNS nicht nur potentielle Co-Transformanten zu identifizieren, sondern auch solche Transformanten, die die jeweiligen funktionellen vollständigen Expressionskassetten tragen.
Um den Aufwand für diese erste Auswahl gering zu halten, wurden die PCR-Ansätze simultan mit drei verschiedenen Primern durch geführt: Der Primer Pgap (SEQ ID NO:27) ist homlog zu einem internen Bereich des gapDH-Promotors, der Primer ctaA (SEQ ID NO:28) ist revers komplementär zum Anfang des cta1-1Gens, und der Primer tahE (SEQ ID NO:29) ist revers komplementär zum 3'-Ende des tah1-1 Gens.
Pgap 5'-CGCTGGGCGGGTAGCGT-3' SEQ ID NO: 27
ctaA 5'-CCGATGATCTTGTCTGCATC-3' SEQ ID NO:28
tahE 5'-TTCGAACACGGGAACCTATC-3' SEQ ID NO:29
Transformanten-DNS, die in diesem PCR-Screening zwei Banden der Größen 690 bp und 460 kb ergaben, wurden einer genaueren Southern-Analyse unterzogen (Beispiel 13.2 D). Diese Banden deuten zum einen darauf hin, daß der Vektor pgapCTA vorhanden ist, da die Primerkombination Pgap + ctaA ein 460 bp-großes PCR-Fragment entsteht. Zum anderen deutet die 690 bp-PCR-Bande darauf hin, daß die Integration des Vektors pyrF-gapTAH nicht über die gapDH-Promotor-tah1-Expressionskassette erfolgt ist, und somit das tah1-Gen exprimiert werden kann.
In der Positivkontrolle (zur Kontrolle der PCR) wurde Trametes-DNS mit den Primern Pgap und gapA (SEQ ID NO:30), die das interne gapDH-Gen als 255 bp-Bande nachweisen, in die PCR eingesetzt. Als Negativkontrollen fungierte die DNS des nichttransformierten T. versicolor Stammes F2 100C2-1, die zusammen mit den drei Primern eingesetzt wurde. Primer gapA hatte folgende Sequenz:
gapA 5'-CGGATTGGGCGAGATTAGG-3' SEQ ID NO:30
Die PCR wurde unter Standardbedingungen unter Einsatz von Taq-Polymerase (Roche, Penzberg) durchgeführt (siehe Beispiel 5.2). Als Annealingtemperatur wurde 65°C gewählt.
Von insgesamt 102 Uridin-prototrophen Transformanten, die in der PCR mit drei Primern analysiert wurden, zeigten 23 Klone die zwei charakteristischen Banden von 690 bp und 460 bp. Alle 23 Klone wurden auf eine große quadratische Petrischale (12 × 12 cm) mit Malz-Agar transferiert, der mit 10 μmol/l Cu-SO₄ und 40 μmol/l DABA supplementiert war. Als Vergleichsstamm wurde der nicht-transformierte Rezipientenstamm F2 10002-1 inokuliert. Die DABA-Konzentration wurde so gewählt, daß die Lac-casebildung nur limitiert induziert war. Von jeder der 23 Transformanten wurden je zwei 3 × 3 mm große Agar-Stücke von der Masterplatte herausgestochen und auf zwei der 12 × 12 cm Petrischalen mit dem supplementierten Agar transferiert (doppelte Ansätze). Nach einem Tag wurden die Petrischalen mit Overlay-Agar überschichtet, dem Mac Illvaine Puffer pH 4,5 und 100 μmol/l ABTS zugesetzt waren. Die Mehrzahl der Transformanten zeigte eine größere Hofbildung (verstärkte Grünfärbung) im Vergleich zum nicht-transformierten Rezipientenstamm, was auf eine verbesserte Laccaseexpression hindeutete. Die vier Transformanten mit der größten Hofbildung, TV tc 7, TV tc 9, TV tc 17 und TV tc 21, wurden mittels Southernblot Analyse detaillierter untersucht (siehe Beispiel 13.2 D)
D: Analyse der Transformanten durch Southern-Blot Analyse
Die unter 13.2 D erhaltenen vier Transformanten von T. versicolor wurden mittels Southernblot Analyse genauer auf die Integration der Plasmide pyrF-gapTAH und pgapCTA untersucht. Dazu wurde von den vier unter 13.2 C ermittelten Transformanten und als Kontrolle von dem pyrF-defizienten Stamm F2 10002-1 Zellmycel in Flüssigkultur hergestellt (siehe 1. Beispiel, Malzextraktmedium, für F2 100C2-1 mit 10 mmol/l Uridin versetzt). Von dem isolierten Mycel wurde chromosomale DNS isoliert wie im 1. Beispiel beschrieben.
Von den vier Transformanten und dem nicht transformierten, Uridin-auxotrophen Ausgangsstamm F2 100C2-1 wurde chromosomale DNS isoliert wie im 1. Beispiel beschrieben und je 10 μg der chromosomalen DNS mit Kpn I einzelverdaut oder mit BamH I und Nsi I doppelverdaut. Als Kontrollen wurden von dem Vektor pyrF-gapTAH 10 ng mit Kpn I geschnitten, und von dem Vektor pgapCTA 10 ng mit BamH I + Nsi I doppelverdaut. Die mit Kpn I geschnittene DNS und die mit BamH I/Nsi I doppelverdaute DNS wurde anschließend auf zwei seperaten Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonfilter (Amersham) geblottet. Als DNS-Sonde für den Blot mit den Kpn I- Restriktionen wurde das mit Nco I und Nsi I aus dem Vektor pZgTAH-N herausgeschnittene 480 bp-große tah1-Fragment verwendet. Als DNS-Sonde für den Blot mit den BamH I/Nsi I-Restriktionen fungierte ein mit Sph I und Cla I aus dem Vektor pgCTA-EX (Beispiel 5.4) herausgeschnittenes ca. 3,7 kb-großes Fragment eingesetzt, das fast das gesamte cta1-Gen enthält.
Die Sonden wurde radioaktiv markiert wie im 2. Beispiel beschrieben. Mit diesen DNS-Sonden konnten sowohl das tah1-Gen (mit dem 480 bp-Fragment auf dem Blot mit den Kpn I Restriktionen), sowie das cta1-Gen (mit dem 3,7 kb-großen Fragment auf dem Blot mit den BamH I/Nsi I -Restriktionen) nachgewiesen werden.
Die Hybridisierungstemperatur für die auf Nylonfilter geblottete DNS mit der radioaktiv markierten DNS-Sonde betrug 65°C. Ansonsten wurden die in der Fachlitertur beschriebenen Bedingungen für Southernblots eingehalten. Southernblots wurden durch Autoradiographie ausgewertet.
In allen Klonen (d. h. sowohl in den vier Transformanten, als auch in dem Rezipientenstamm) ergab die Hybridisierung mit der tah1-Sonde eine 2,0 kb-große Kpn I-Bande, die das Wildtyp-tah1-Gen darstellt. Die Transformanten haben zusätzlich zu dieser 2,0 kb-Bande noch eine ca. 2,4 kb Bande, die der 2,4 kb kreuzreagierende Bande des mit KpnI restringierten Vektors pyrF-gapTAH entspricht. Die 2,4 kb-große Bande der Transformanten bestätigt das Vorhandensein des Vektors pyrF-gapTAH und zeigt die Integrität der gapDH-Promotor-tah1-Gen-Expressionskassette.
In allen Klonen die mit BamH I/Nsi I doppelverdaut wurden ergab die Hybridisierung mit der cta1-Sonde neben einer 1,9 kb Bande eine charakteristische 2,7 kb-große Bande, die das mit BamH I gespaltene Wildtyp cta1-1 Gen darstellt. In Transformanten mit zusätzlich integrierten Kopien von cta1 konnte zusätzlich noch eine charakteristische 3,2 kb Bande nachgewiesen werden. Die 3,2 kb-große Bande der Transformanten bestätigt das Vorhanden sein des Vektors pgapCTA und zeigt die Integrität der gapDH-Promotor/cta1-Gen-Expressionskassette.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß bei der Transformation des Uridin-auxotrophen Stammes Trametes versicolor F2 100C2-1 die Plasmide pgapCTA und pyrF-gapTAH beide über ihr pUC19-Rückrad in das Genom integriert worden waren, und die Expressionskassetten der Gene cta1 und tah1 korrekt integriert worden waren. Zudem ist das pyrF'-Gen funktionell, wodurch die Uridin Auxotrophie dieses Stammes komplementiert wurde.
14. Beispiel
Untersuchung der Lacccaseproduktion in tah1-1 und cta1-1 überproduzierenden Stimmen von Trametes versicolor durch Anzucht im Schüttelkolben
Es wurden die im 13. Beispiel beschriebenen Stämme TVtc-7, TVtc-9, TVtc-19 und TVtc-21 und als Kontrolle der Wildtypstamm F2 100 für die Schüttelkolbenanzucht verwendet. Es wurden 2 cm² Mycel aus einer voll bewachsenen Platte ausgestochen, steril zerkleinert und damit eine Vorkultur von 50 ml (in einem 250 ml Erlenmeyerkolben) Malzextrakt-Medium (siehe 1. Beispiel) beimpft. Die Vorkultur wurde sechs Tage bei 28°C unter Schütteln bei 120 rpm inkubiert. Am sechsten Tag wurde die Vorkultur mit einem Ultra Turrax für 30 s bei 9500 rpm homogenisiert und damit 250 ml Hauptkulturmedium (Zusammensetzung siehe MM-Medium im 13. Beispiel) in einem 1 1 Erlenmeyerkolben beimpft. Die Hauptkultur wurde dann wieder bei 28°C unter Schütteln bei 120 rpm inkubiert. Am zweiten Tag der Anzucht wurde jeder Ansatz durch Zugabe von 2,5-Xylidin (1,5 mmol/l Endkonzentration) induziert. Die Laccaseproduktion wurde ab dem dritten Tag der Anzucht täglich gemessen. Laccaseaktivität wurde photometrisch mit dem Substrat ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Ethyl-Benzthiazolin-6-Sulfonsäure) bei 420 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von ABTS bei 420 nm ε₄₂₀ 3,6 × 10⁴ [1 × mol^-1 × cm^-1]). Dabei entsprach 1 E Laccaseaktivität dem Umsatz von 1 μmol ABTS/min bei 37°C und einem pH von 4,5. Das Maximum der Laccaseproduktion in Schüttelkolbenanzuchten wurde 10 Tage nach Beginn der Hauptkultur erreicht. Tabelle 3 zeigt einen Vergleich verschiedener Transformanten mit dem nicht transformierten Ausgangsstamm Trametes versicolor F2 100.
Wie aus Tabelle 3 zu ersehen, ist die Laccaseproduktion im Schüttelkolben bei den besten Transformanten des Stammes F2-100 gegenüber dem nichttransformierten Ausgangsstamm um den Faktor 3,5 (bei Anzucht auf 10 μmol/l CuSO₄), bzw. um den Faktor 2,5 (bei Anzucht auf 600 μmol/l CuSO₄) erhöht.
Tabelle 3: Einfluß der Kuperhomeostasefaktoren Cta1-1 und Tah1-1 auf die Laccaseexpression in Trametes versicolor in Abhängigkeit von der Kupferkonzentration des Mediums.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Expressionssystem zur Überexpression von Kupfer-abhängigen sekretierten Proteinen in eukaryontischen Zellen ausgewählt aus der Gruppe der Ascomyceten, Basidiomyceten und mitosporen Pilze, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gen welches für eine Laccase kodiert, sowie mindestens eines der Kupferhomeostase Gene tah1-Gen, cta1-Gen und ihrer Homologe enthält.
Expressionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Kupferhomeostase Gen sowohl ein tah1-Gen als auch ein cta1-Gen aufweist.