FI111957B - Menetelmä peroksidaasin tuottamiseksi - Google Patents

Description

111957

Menetelmä peroksidaasin tuottamiseksi - Ett förfafarade för framställnlng av peroxidas 5 Tämä keksintö liittyy menetelmään, jonka avulla valmistetaan heterologisia hemi-proteiineja rihmasienissä.

Erilaisten hemi-proteiinien kloonausta ja ekspressiota bakteereissa on aiemmin jos kuvattu. Esimerkiksi S.A. Ortlepp et ai, 10 J. Biotechn. 11:353-364, 1989, kuvaavat piparjuuriperoksidaasin C ekspressiota ja karakterisointia E. colissa. Entsyymi eks-pressoituu intrasellulaarisesti ja liukenemattomana aggregaattina, niin että se täytyy puhdistaa liuenneista soluista. Lisäksi entsyymi ei ekspressoidu aktiivisessa muodossa ja se täy-15 tyy laskostaa erikseen kun läsnä on hemi ja Ca2+, jotta siitä tulisi funktionaalinen. Myös A.T. Smith et ai, J. Biol. Chem. 265(22):13335-13343, 1990, kuvaavat piparjuuriperoksidaasi C:n ekspressiota E. colissa. Yhdistelmäentsyymi on vähemmän aktiivinen kuin natiivi piparjuuriperoksidaasi C ja sitä muodostuu 20 saannon ollessa 2-3 % (puhtaasta, aktiivisesta entsyymistä). S.

: ,·, Lopraser et ai, J. Bact. 171(9):4871-4875, 1989, raportoivat t ·

Bacillus stearothermophilus peroksidaasin A kloonaamisesta ja ekspressoitumisesta E. colissa. S.J. Hoffman et ai, Proc. Natl.

• · * * · s I

Acad.Sci. USA 87:8521-8525, kuvaavat ihmisen funktionaalisen 25 hemoglobiinin ekspressiota E. colissa. Z. Wang et ai, J.

Biotechn. 13:131-144, 1990, kuvaavat Streptomyces viridosporuk-,· · sen peroksidaasiligniinin kloonausta ja ekspressoitumista

Streptomyces lividansissa.

30 Ihmisen hemoglobiinien ekspressiota hiivassa (Saccharomyces ,cerevisiae) ovat kuvanneet M. Wagenbach et ai, Bio/Technology 9:57-61, 1991. Hiivassa hemoglobiini ekspressoituu avian koko-”·’ naisena hemin sisältävänä tetrameerinä. Proteiini ei kuitenkaan : : : erity hiivasoluista, vaan pysyy sytoplasmatilassa ja täytyy 35 puhdistaa siitä.

2 111957

Olisi siis edullista valita isäntäorganismi, esimerkiksi rih-masieni, joka hemi-proteiinien tuottamisen lisäksi pystyisi myös viemään ne solukalvon läpi aktiivisessa muodossa ja näin yksinkertaistamaan puhdistusprosesseja.

5

Viime aikoina on kehitetty menetelmiä rihmasienien, Aspergillus niger ja Aspergillus nidulans mukaan lukien, transformointiin. US-4885249 (Allelix) kuvaa yleistä menetelmää A. nigerin trans-formoimiseksi, esimerkkinä selektoitavia markkereita koodaavia 10 geenejä sisältävien plasmidien sisään vieminen. EP-215594 (Ge-necor) kuvaa erilaisten proteiinien ekspressiota ja erittymistä A. nidulansissa erilaisia Aspergillus-proteiinien signaalisek-venssejä käyttäen.

15 Missään näissä viitteistä ei tuoda esiin mahdollisuutta tuottaa hemi-proteiineja rihmasienissä. Sitä vastoin M. Saloheimo et ai, Gene 85:343-351, 1989, kuvaavat Phlebia radiatan ja Tricho-derma reesein ligniiniperoksidaasin kloonausta ja ekspressoitu-mista. Tekijät raportoivat, että vaikka ligniiniperoksidaasin 20 mRNA ekspressoituu T. reeseissä proteiinituottoa ei ollut ha-· väittävissä. Heidän mukaansa syynä saattaa olla intrasellulaa-j ’ : rinen proteaasidegradaatio, joka johtuu proteiinin väärän lai- ·;>·· sesta laskostumisesta koska läsnä ei ole hemiä tai koska sen translaatioon osallistuvilla RNA:illa on erilainen rakenne.

:v. 25 • »

Yllättäen on havaittu, että hemi-proteiineja voidaan tuottaa * # · rihmasienissä saannon ollessa hyvin paljon parempi kuin mitä .. , saavutetaan samalla proteiinilla hiivassa.

• · '··* 30 Tämä keksintö liittyy menetelmään, jossa ekstrasellulaarisesti ; f; tuotetaan peroksidaasia Aspergillus-lajin kannassa. Menetelmäs- sä (a) transformoidaan sopiva Aspergillus-laj in kanta yhdistelmä-3 5 DNA-vektorilla, jossa on peroksidaasia koodaava DNA-sekvenssi, joka voidaan johtaa Corprinus-lajista sekä DNA-sekvenssi, joka 3 111957 koodaa esialuetta (preregion), joka mahdollistaa ekspressoitu-neen peroksidaasiproteiinin erittymisen, ja (b) viljellään transformoitunutta Aspergillus-lajin kantaa 5 sopivassa viljelyväliaineessa olosuhteissa, jotka johtavat peroksidaasiproteiinin muodostumiseen.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

10 Tässä tekstissä "ekstrasellulaarisella (solunulkoisella) tuottamisella" tarkoitetaan, että toisin kuin tunnetuissa hemi-pro-teiinien tuottamisessa bakteereissa tai hiivoissa hemi-proteii-ni erittyy isäntäsolussta viljelyväliaineeseen ja voidaan hel-15 posti ottaa siitä talteen. Ilmeisesti yhdistelmäproteiini pystyy yhdistymään sieni-isännän hemi-syntetointireaktioreitin tuottamaan hemiin ja sen vuoksi erittymään isäntäsolusta aivan kokonaisena hemin sisältävänä proteiinina. Termillä "heterolo-ginen" tarkoitetaan proteiineja, joita kyseessä oleva isäntäor-20 ganismi ei luonnossa tuota. Termillä "hemi-proteiini” puoles-:.· · taan tarkoitetaan kaikkia hemin (esim. protoporfyriini IX) si-j ! : sältävien proteiinien ryhmän jäseniä proteettisena ryhmänä.

·:*: Termillä "rihmasieni" tarkoitetaan kaikkia ryhmiin Phycomyce- ·:. tes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes kuuluvia sieniä 25 samoin kuin Deuteromycetes, mukaanlukien Hyphomycetes kuten , lajit Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium ja Humi- * * cola.

Vektori saisi edullisesti sisältää DNA-sekvenssejä, jotka koo-··’ 30 daavat geeniekspressiota helpottavia funktioita, tyypillisesti promoottoreita, transkription aloituskohtia, transkription lo-petuskohtia sekä polyadenylointifunktioita.

Promoottori, jota ennen ylävirtaan voi olla aktivoivia sekvens-35 sejä ja tehostinsekvenssejä alalla tunnettuun tapaan voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, jolla ilmenee voimakasta transkrip- 4 111957 tioaktiviteettia rihmasienissä, ja joka voidaan johtaa geenistä, joka koodaa solunulkoista tai solunsisäistä proteiinia kuten amylaasia, glukoamylaasia, proteaasia, lipaasia, sellulaa-sia tai glykolyyttistä entsyymiä.

5

Sopivia promoottoreita ovat esimerkiksi sellaiset, jotka on johdettu geenistä, joka koodaa jotain seuraavista: A. oryzaen TAKA-amylaasi, Rhizomucor miehein asparagiiniproteinaasi, A. nigerin α-amylaasi, A. nigerin happostabiili α-amylaasi, A.

10 nigerin glukoamylaasi, Rhizomucor miehein lipaasi, A. oryzaen alkaliiniproteaasi ja A. oryzaen trioosifosfaatti-isomeraasi.

Rihmasieni-isäntäorganismi voi edullisesti olla sellainen, jota on jo aiemmin käytetty isäntänä rekombinanttiproteiinien tuot-15 tamisessa, esimerkiksi jokin Aspergillus-lajin kanta kuten A. niger, A. nidulans tai A. oryzae. A. oryzaen käyttöä yhdistel-mäproteiinien tuottamisessa on laajalti kuvattu, ks. esim. EP-238023.

20 Erityisesti kun isäntäorganismi on A. oryzae tämän keksinnön : menetelmässä käytettäväksi suositeltava promoottori on A. ory- ,· zaen TAKA-amylaasipromoottori, sillä se osoittaa voimakasta transkriptioaktiviteettia A. oryzaessa. TAKA-amylaasipromoot-·· torin sekvenssin tuo esiin EP-238023.

25 .Lopetus- ja polyadenylointisekvenssit voidaan hyvin johtaa samoista lähteistä kuin promoottori.

Tekniikkoja sieni-isäntäsolun transformoimiseksi voidaan saada *;‘’ 30 esimerkiksi menetelmistä, joilla transformoidaan A. nidulans ja jota kuvaavat esim. Yelton et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1470-1474, 1984, tai EP-215594, tai menetelmistä A. nigerin transformoimiseksi, joita kuvaavat esim. Buxton et ai, Gene ;t| 37:207-215, 1985, tai US-4885249, tai menetelmästä transformoi- '·' 35 da A. oryzae, jota kuvaa EP-238023. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä isäntäsolu voidaan transformoida vektorisysteemil- 5 111957 lä, jossa on DNA-sekvenssi, joka koodaa selektiomarkkeria, joka voidaan sisällyttää transformoitavan isäntäorganismin genomiin, mutta joka joko ei ekspressoidu isännässä ennen transformointia tai joka ekspressoituu määrinä, jotka eivät ole riittävät 5 kasvun mahdollistamiseen selektiivisissä olosuhteissa. Sitten voidaan valita transformantteja ja eristää ne ei-transforman-teista sisällytetyn selektiomarkkerin perusteella.

Sopivat selektiomarkkerit voidaan johtaa A. nidulans tai A.

10 niger argB-geenistä, A. nidulans trpC-geenistä, A. nidulans amdS-geenistä, Neurospora orassa pyr4 - tai DHFR-geeneistä tai A. niger tai A. oryzae niaD-geenistä.

Tähän keksintöön suositeltavia selektiomarkkereita ovat sellai-15 set, jotka on johdettu A. nidulansin tai A. nigerin amdS- tai argB-geeneistä. Tavalliset villin tyypin A. oryzaen kannat ovat ArgB* (joka tarkoittaa, että argB-geeni ekspressoituu A. oryzaessa). Jos siis selektriomarkkeriksi valitaan argB isän-täorganismina täytyy käyttää A. oryzaen ArgB-mutanttikantaa 20 (joka ei ekspressoidu ArgB-geenissä). Toisaalta amdS-geeniä · voidaan käyttää selektiomarkkerina villin tyypin A. oryzae kan-töihin, jotka eivät ekspressoi tätä geeniä riittävässä määrin :··: kasvun mahdollistamiseksi selektiivisissä olosuhteissa.

\\ 25 Esialue, joka on lisätty vektoriin takaamaan ekspressoituneen ·;·. tuotteen tehokkaan suuntautumisen isäntäsolun eritysreaktio- • · reittiin voi olla luonnossa esiintyvä signaali tai johtopeptidi , . tai sen funktionaalinen osa tai synteettinen sekvenssi, joka saa proteiinia erittymään solusta. Esialue voidaan johtaa gee-;·’ 30 nistä, joka koodaa mistä tahansa lähteestä johdettua erittyvää proteiinia.

Erityisesti esialue voi olla johdettu geenistä, joka koodaa Aspergillus sp. amylaasia tai glukoamylaasia, geeni, joka koo- ·' 35 daa Rhizomucor miehei lipaasia tai proteaasia taikka geeni, joka koodaa Coprinus sp. peroksidaasia.

6 111957

Edullisesti esialue johdetaan geenistä, joka koodaa A. oryzae TAKA-amylaasia, A. niger neutraalia α-amylaasia, A. niger hap-postabiilia α-amylaasia, A. niger glukoamylaasia tai Coprinus 5 macrorhizus tai cinereus -peroksidaasia.

Peroksidaasia, esialuetta, promoottoria ja terminaattoria koodaava DNA-sekvenssi voidaan insertoida selektiomarkkerin sisältävään vektoriin, tai se voidaan insertoida erilliseen 10 vektoriin isäntäsoluun vietäväksi. Vektori tai vektorit voivat olla lineaarisia tai suljettuja rengasmaisia molekyylejä. Eräässä tämän keksinnön mukaisessa toteutusmuodossa isäntä-soluun voidaan viedä kaksi vektoria, toinen, jossa on selektio-markkeria koodaava DNA-sekvenssi, ja toinen, jossa on hemi-pro-15 teiinia, esialuetta ja geeniekspressiota edistäviä funktioita koodaavat DNA-sekvenssit.

Eräässä suositeltavassa toteutusmuodossa peroksidaasia koodaava DNA-sekvenssi johdetaan Coprinus sp.:sta, erityisesti Coprinus 20 macrorhizuksesta tai cinereuksesta.

• ‘ Hakemuksessa on kuvattu DNA-rakenne, joka sisältää kuvioissa ·;·*; IA - IB nähtävän Coprinus sp. peroksidaasia tai sen sopivaa ·· muunnelmaa koodaavan DNA-sekvenssin.

:V. 25 » ·

Esimerkkejä sopivista DNA-sekvenssin modifikaatioista ovat nuk- » · · leotidisubstituutiot, jotka eivät saa aikaan toista peroksidaa- .. . sin aminohapposekvenssiä, mutta jotka vastaavat kodonitapaa ’ · · , , isäntäorganismissa, johon DNA-rakenne viedään, tai nukleotidi-30 substituutiot, jotka saavat aikaan erilaisen aminohapposekvens-: ; : sin ja sen myötä mahdollisesti erilaisen proteiinirakenteen, joka voi johtaa peroksidaasimutanttiin, joka on omaisuuksiltaa erilainen kuin natiivi entsyymi. Muita esimerkkejä mahdollisis-ta muunnelmista ovat yhden tai useamman nukleotidin insertointi ’ 35 sekvenssiin, yhden tai useamman nukleotidin lisääminen sekvens- 7 111957 sin päihin sekä yhden tai useamman nukleotidin deletointi sekvenssin päistä tai sekvenssin sisältä.

Peroksidaasia koodaava DNA-rakenne voidaan valmistaa tunnetuin 5 standardimenetelmin synteettisesti, esim. fosfoamidiittimene-telmällä, jota kuvaavat S.L. Beaucage ja M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22:1859-1869, 1981, tai menetelmällä, jota kuvaavat Matthes et ai, EMBO Journal 3:801-805, 1984. Fosfoami-diittimenetelmässä syntetoidaan oligonukleotidejä, esimerkiksi 10 automaattisella DNA-syntetisaattorilla, puhdistetaan, lämpökä-sitellään, ligatoidaan ja kloonataan sopiviin vektoreihin.

DNA-rakenne voi olla myös genomi- tai cDNA-peräinen, saatuna esimerkiksi valmistamalla genominen tai cDNA-kirjasto ja seu-15 lomalla esiin koko peroksidaasia tai osia siitä koodaavia DNA-sekvenssejä hybridisaation avulla käyttämällä synteettisiä oligonukleotidikoettimia standarditekniikoin (vrt. C.F. Sam-brook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor, 1989). Tässä tapauksessa peroksidaasia 20 koodaava genominen tai cDNA-sekvenssi voidaan modifioida koh-:.: : dassa, joka vastaa kohtaa tai kohtia, joissa halutaan suorittaa aminohapposubstituutioita, esim. suunnatulla mutageneesillä ·; käyttämällä hyvin tunnetuin tavoin synteettisiä oligonukleoti- ··· dejä, jotka koodaavat haluttua aminohapposekvenssiä homologi- 25 rekombinaatiota varten.

Lopuksi voidaan mainita, että DNA-rakenne voi olla sekä synteettinen että genominen, sekä synteettinen että cDNA-peräinen tai sekä genomista että cDNA-peräistä valmistettuna ligatoimal-30 la standarditekniikoin synteettisiä, genomisia tai cDNA-peräi-siä (parhaiten sopivia) fragmentteja, jotka vastaavat koko DNA-rakenteen eri osia. DNA-rakenne voidaan valmistaa myös polymeraasiketjureaktiolla käyttämällä spesifisiä alukkeita kuten kuvaavat esimerkiksi US-4683202 ja R.K. Saiki et ai, Science 7 35 239:487-491, 1988.

8 111957 Tässä on kuvattu myös yhdistelmäekspressiovektori, johon DNA-rakenne insertoidaan. Tämä voi olla mikä tahansa vektori, joka helposti soveltuu yhdistelmä-DNA-tekniikoihin, ja vektorin valinta riippuu usein isäntäsolusta, johon se viedään. Vektori 5 voi siis olla autonomisesti replikoituva vektori, ts. vektori, joka on olemassa ekstrakromosomaalisena kokonaisuutena ja jonka replikoituminen riippuu kromosomaalisesta replikoitumisesta, esim. plasmidi. Vaihtoehtoisesti vektori voi olla sellainen, joka isäntäsoluun vietynä sulautuu isäntäsolun genomiin ja 10 replikoituu yhdessä kromosomin tai kromosomien kanssa, joihin se on integroitu.

Vektorissa peroksidaasia koodaava DNA-sekvenssi saisi edullisesti olla liitetty sopivaan promoottori- ja terminaattorisek-15 venssiin. Promoottori voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, joka osoittaa transkriptioaktiviteettia valitussa isäntäsolussa ja voidaan johtaa geeneistä , jotka koodaavat isäntäsoluun nähden joko homologisia tai heterologisia proteiineja. Sopivia esi-merkkipromoottoreita ovat edellä luetellut. Menetelmät, joilla 20 peroksidaasia, promoottoria ja terminaattoria koodaavat DNA-i sekvenssit, ligatoidaan ja insertoidaan ne sopiviin vektoreihin ovat alaan perehtyneelle hyvin tuttuja (vrt. esimerkiksi Sambrook et ai, op. cit.).

v. 25 Tässä on kuvattu myös isäntäsolu, joka on transformoitu ekspressiovektorilla. Isäntäsolu on rihmasienisolu ja edullisesti Aspergillus sp. solu kuten edellä tuotiin esiin.

* Väliaine, jossa transformoituja isäntäsoluja viljellään voi *’ 30 olla mikä tahansa tavallinen väliaine, joka sopii rihmasienien : kasvattamiseen. Transformantit ovat tavallisesti stabiileja ja niitä voidaan viljellä ilman selektiopainetta. Jos transfor-manttien kuitenkin havaitaan olevan epästabiileja selektointiin voidaan käyttää soluihin vietyä selektiomarkkeria. Yllättäen on *' 35 havaittu, että jos väliaineeseen lisätään hemiini- tai hemi- pitoista ainetta (esim. hemoglobiini tai veren punasolut) hemi- 9 111957 proteiinin tuottto voidaan saada huomattavasti lisääntymään (vrt. esimerkit 3-6 jäljempänä).

Isäntäsoluista erittyvä kypsä peroksidaasi voidaan helposti 5 ottaa talteen viljelyväliaineesta tunnetuin menetelmin, joita ovat esimerkiksi solujen erottaminen väliaineesta sentrifugoi-malla tai suodattamalla ja saostamalla proteiinipitoiset komponentit väliaineesta jonkin suolan kuten ammoniumsulfatin avulla, ja suorittamalla sen jälkeen kromatografointi, esimer-10 kiksi ioninvaihtokromatografiällä, affiniteettikromatografiällä tai vastaavalla.

Keksintö kuvataan seuraavin esimerkein, joihin liittyvissä kuvioissa: 15 kuvio 1 tuo esiin Coprinus cinereus peroksidaasia koodaavan cDNA-sekvenssin ja kuvio 2 on vektorin pHD414 kartta.

20 i Keksintöä kuvaavat myös seuraavat esimerkit, joiden ei katsota ; ',· millään tavoin rajoittavan keksinnön patenttivaatimuksien suo-

* | | I I

japuriä.

• t · 25 ESIMERKKI 1 ;·. Coprinus cinereus -peroksidaasia koodaavan cDNA:n kloonaaminen , . Koettimen kokoaminen PCR:n avulla • ;·’ 30 Peroksidaasi-cDNA-fragmentteja valmistettiin polymeraasiketju-: : reaktion (PCR) avulla käyttämällä spesifisiä oligonukelotida- lukkeita (R.K. Saiki et ai, Science 239:487-491, 1988) koottuna 10 111957

Coprinus macrorhizus -peroksidaasin aminohapposekvenssin perusteella. PCR toteutettiin käyttämällä Gene Amp -pakkausta ja laitteita (saatavilla: Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti, paitsi että reaktio toteutet-5 tiin lämpötilan ollessa 28°C ensimmäisen kolmen syklin aikana, niin että saatiin parempi hybridisaatio ensimmäisen säikeen cDNA:lle (valmistettuna Coprinus cineruksesta saadusta mRNA:-sta, IFO 8371), ja sitten 65°C:ssa 30 PCR-syklin ajan. PCR:ssa käytettiin seuraavia spesifisiä alukkeita: 10

T T

1. 5'-GCGCGAATTCGTNGGNATNAACCACGG-3'

15 AA

2. 3'-TACAGNTTGACGGGNGGCCTAGGCG-5'

A TT

3. 5'-GCGAATTCACNCCNCAGGTNTTCGACAC-3' 20

A TA

4. 3 '-GGNAAGGGNCCNCTCAAGCCTAGGCG-5' ·! * ·

: A

25 5. 5'-GCGCGAATTCTGGCAGTCNAC-3'

Λ ’. A

. ':'. 6. 5'-GCGCGAATTCTGGCAGAGNATG-3'

30 T

7. 3'-CGNTACCGNTTCTACAGCCTAGG-5' .,* "N" tarkoittaa kaikkien neljän nukleotidin sekoitusta.

35 Alukkeet yhdistettiin seuraavasti: 1 ja 2, 3 ja 4, 5 ja 7, 6 ja 7, 1 ja 4, 1 ja 7 sekä 3 ja 7. PCR-fragmentit pidennettiin 111957 i i näin EcoRI-kohdalla 5'-päässä ja BamHI-kohdalla 3'-päässä. PCR-reaktioita analysoitiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Tarkastettaessa, että vyöhykkeet vastasivat peroksidaasispesi-fisiä sekvenssejä geelille suoritettiin Southern blotting -ana-5 lyysi ja hybridoitiin oligonuleotidikoettimeen, jonka sekvenssi oli T A A A T 10 5'-GTCTCGATGTAGAACTG-3'

T

joka sijaitsee PCR-alukkeiden 3 ja 4 välillä. Koettimen havaittiin hybridisoituvan noin 130, 420, 540 ja 240 emäsparin 15 vyöhykkeiksi ja se vahvisti näin, että havaitut DNA-vyöhykkeet vastasivat peroksidaasisekvenssejä.

Eri PCR-reaktioista saatava DNA hajotettiin EcoRIrlla ja Bam-HI:lla ja kloonattiin plasmidiin pUC19 (C. Yanisch-Perron et 20 ai, Gene 33:103-119, 1985). Oikeanlaisia PCR-fragmentteja sisältävät pesäkkeet identifioitiin hybridisaation avulla käyttä-, , mällä yllä spesifioitua oligonukleotidikoetinta. Positiivisten pesäkkeiden DNA analysoitiin restriktioentsyymikartoituksella 1 ·’ ja partiaalisella DNA-sekvenssiaanalyysillä jota ovat kuvanneet i 25 Sanger et ai, Proc. Natl. Acad. Sei USA 74:5463-5467, 1977.

, · Yhden kloonin 430 emäsparin fragmenttia käytettiin seulomaan » · i ; Coprinus cinereus -cDNA-kirjastoa seuraavassa kuvattuun tapaan.

ϊ >

Coprinus cinereus -cDNA-kiriaston kokoaminen E. colissa 30 Kokonais-RNA ekstrahoitiin homogenoidusta Coprinus cinereus (IFO 8371) myceliumista, koottuna peroksidaasin maksimaalisen . aktiviteetin aikana menetelmillä, joita ovat kuvanneet Boel et ai, (EMBO J., 3:1097-1102, 1984) sekä Chirgwin et ai. (Bioche-’ , mistry (Wash), 18:5294-5299, 1979). Poly(A):ta sisältävä RNA : 35 saatiin kun on suoritettu kaksi sykliä affineettikromatografiaa oligo(dT)-selluloosalle tavalla, jota ovat kuvanneet Aviv ja > i • i » 12 111957

Leder (PNAS, USA 69:1408-1412, 1972). cDNA syntetoitiin Invit-rogenin cDNA-syntetointipakkauksen avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Noin 50.000 E. coli -rekombinanttia Coprinus cine-reus -cDNA-kirjastosta siirrettiin Whatman 540 paperisuodatti-5 mille. Pesäkkeet liuotettiin ja immobilisoitiin tavalla, jota ovat kuvanneet Gergen et ai. (Nucleic Acids Res. 7:2115-2135, 1979). Suodattimet hybridoitiin 32P-leimatulla 430 emäsparin peroksidaasispesifisellä koettimella 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Suoritettiin hybridointi ja suodattimien pesu 65°C:ssa ja sen 10 jälkeen autoradiografia, 24 tuntia vahvistusvarjostimella.

Autoradiografiän jälkeen suodattimet pestiin kasvavissa lämpötiloissa ja sen jälkeen suoritettiin autoradiografia, 24 tuntia vahvistusvarjostimella. Näin saatiin identifioitua yli 50 positiivista kloonia. Miniprep plasmidi-DNA eristettiin hybri-15 disaatiopesäkkeistä standardimenetelmin (Birnboim and Doly Nucleic Acids Res. 7:1513-1523, 1979), ja cDNA-insertin DNA-sek-venssi määritettiin Sangerin dideoksimenetelmällä (Sanger et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467, 1977). Peroksi-daasi-cDNA-fragmentti ekskisoitin vektorista hajottamalla 20 Hindlll/XhoI:n avulla ja puhdistettiin agaroosigeelielektrofo-reesilla, elektroeluoitiin ja valmistettiin ligaatioreaktioita varten. cDNA-fragmentti ligatoitiin HindIII/XhoI-hajotettuun : pHD414:ään, jolloin saatiin pCip, jossa cDNA on Aspergillus oryzaen TAKA-promoottorin ja Aspergillus nigerin AMG-terminaat-....25 torin transkriptionaalisen säätelyn alaista.

!'! Aspergillus ekspressiovektorin pHD414 kokoaminen

Vektori pHD414 on johdettu plasmidista p775 (kuvattu patentissa ' EP-238023). Toisin kuin p775 pHD414:ssä on uniikkien restrik- 30 tiokohtien säie promoottorin ja terminaattorin välillä.

Plasmidi koottiin poistamalla noin 200 emäsparia pitkä frag-: ·’: mentti (joka sisälsi ei-toivottuja restriktiokohtia) terminaat- torin 3'-päästä, ja sitten poistettiin noin 250 emäsparia pitkä .:.35 fragmentti promoottorin 5'päästä, joka myös sisälsi ei-toivot-tuja restriktiokohtia. 200 emäsparin alue poistettiin p775:stä 13 111957 hajottamalla Narl:llä (sijoitettuna pUC-vektoriin) ja Xbal:llä (sijoitettuna juuri 3' terminaattoriin nähden), ja täytettiin sitten näin luodut päät Klenowin DNA-polymeraasi + dNTPrllä, puhdistettiin vektorifragmentti geelillä ja uudelleenligatoi-5 tiin vektorifragmentti. DNA transformoitiin E. coli MC1061:een aiemmin kuvattuun tapaan. Valikoitiin 10 pesäkettä (pHD413-l ... -10) ja analysoitiin restriktioentsyymianalyysin avulla. Restriktioentsyymianalyysissä yhtä odotetun vyöhykekuvion osoittavista klooneista käytettiin pHD414:n kokoamiseen.

10 pHD414 katkaistiin Stulrllä (sijoitettuna promoottorin 5'-päähän) ja PvuIIrlla (sijoitettuna pUC-vektoriin) ja fraktioitiin geelillä. Vektorifragmentti puhdistettiin, uudelleenligatoi-tiin ja transformoitiin E. coli MC1061:een. Valikoittin 12 15 pesäkettä ja analysoitiin restriktioentsyymianalyysillä. Kaikki 12 kloonia muodostivat odotetun vyöhykekuvion. Plasmidi pHD414 on näytetty kuviossa 2.

Asperiaillus oryzaen tai Aspergillus niaerin transformointi 20 (yleismenettely1

Inokuloitiin 100 ml YPD-elatusainetta (Sherman et ai, Methods • in Yeast Genetics, Cold Spring Laboratory, 1981) A. oryzae- tai A. niger -itiöillä ja inkuboitiin samalla sekoittaen 37°C:ssa 2 ,...:25 päivän ajan. Rihmasto harvestoitiin suodattamalla miracloth-; suotimien läpi ja pestiin 200 ml:11a 0,6 M MgS04. Rihmasto sus-pensoitiin 15 ml:aan 1,2 M MgS04. 10 mM NaH2P04, pH = 5,8. Sus-pensio jäähdytettiin jäillä ja lisättiin 1 ml puskuriainetta, ’·’ ’ jossa oli 120 mg Novozym" 234:ää, erä 1687. Viiden minuutin 30 kuluttua lisättiin 1 ml 12 mg/ml BSA:ta (Sigma, tyyppi H25) ja inkubointia varovasti sekoittaen jatkettiin 1,5 - 2,5 tuntia 37°C:ssa kunnes mikroskoopilla tarkastellussa näytteessä näkyi : · : paljon protoplasteja.

,',,35 Suspensio suodatettiin miracloth-suotimilla, suodos siirrettiin ·’/ steriiliin putkeen ja peitettiin 5 ml:11a 0,6 M sorbitolia ja 14 111957 100 ml :11a Tris-HCl, pH = 7,0. Sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 100 g, ja protoplastit koottiin MgSO„-kerroksen pinnalta. Protoplastisuspensioon lisättiin 2 tilavuutta STCrtä (1,2 m sorbitolia, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2) , ja 5 seosta sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 1000 x g. Proto-plastipallukka uudelleensuspensoitiin 3 mlraan STCrtä ja uudel-lenpallukoitiin. Tämä toistettiin. Lopuksi protoplastit uudelleensuspensoitiin 0,1-1 mlraan STCrtä.

10 100 μΐ protoplastisuspesiota sekoitettiin 5-25 Mg:n kanssa sopivaa DNA:ta 10 Mlrssa STCrtä. Kantojen argB protoplastit sekoitettiin pSal43 DNA:n kanssa (A. nidulans argB-geenin sisältävä plasmidi) ja argB+-kannan protoplastit sekoitettiin p3SR2:n kanssa (A. nidulans amdS-geenin sisältävä plasmidi). Seoksen 15 annettiin olla huoneen lämmössä 25 minuuttia. Lisättiin 0,2 ml 60-prosenttista PEG 4000 (BDH 29576), 10 ml CaCl2 ja 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5. ja sekoitettiin huolellisesti (kahdesti) ja lopuksi lisättiin 0,85 ml samaa liuosta ja sekoitettiin huolellisesti. Seoksen annettiin olla huoneen lämmössä 25 minuutin 20 ajan, lingottiin nopeudella 2500 x g 15 minuutin ajan ja pallukka uudelleensuspensoitiin 2 mlraan 1,2 M sorbitolia. Toisen sedimentoinnin jälkeen protoplastit levitettiin sopiville alus-•töille. pSal43:lla transformoidut argB-kantojen protoplastit levitettiin minimaalialustoille (Cove Biochem.Biophys.Acta ,...:25 113:51-56, 1966) glukoosi ja urea hiili- ja typpilähteinä sisältäen 1,2 M sorbitolia osmottiseen stabilointiin. p3SR2:lla transformoitujen argB-kantojen protoplastit levitettiin mini-maalialustoille (Cove Biochem.Biophys.Acta 113:51-56, 1966) ' jotka sisälsivät 1,0 M sukroosia, pH = 7,0, 10 mM asetamidia 30 typpilähteenä sekä 20 mM CsCl taustakasvun ehkäisemiseksi. Kun oli inkuboitu 4-7 päivää 37°C:ssa otettiin itiöitä, suspensoi-tiin steriiliin veteen ja levitettiin yksittäisiksi pesäkkeik-si. Tämä toistettiin, ja yksittäisestä pesäkkeestä toisen uu-delleen eristämisen jälkeen otettuja itiöitä pantiin talteen ,:.35 määritettyinä transformantteina.

111957 1 5

Yhdistelmä- Coprinus cinereus -peroksidaasin tuottaminen A. oryzae -kannassa pCip transformoitiin A. oryzae A1560:een (IFO 4177) yhteis-5 transformoinnilla p3SR2:n kanssa, joka sisälsi A. nidulansista saadun amds-geenin yllä kuvattuun tapaan seoksena, joka sisälsi yhtä paljon pCiprtä ja p3SR2:ta (noin 5μς kumpaakin). Trans-formantit, jotka pystyivät käyttämään asetamidia ainoana typpi-lähteenään uudelleeneristettiin kahdesti. Kun oli kasvatettu 10 kolme päivää YPD-väliaineessa (Sherman et ai, 1981) viljely-supernatantit analysoitiin peroksidaasiaktiviteettia etsien käyttämällä ABTSrää (ks. jäljempänä). Parhaimmat transforman-tit valittiin jatkotutkimuksiin.

15 Peroksidaasin tuottaminen S. cereviasiaessa

Peroksidaasigeeni eristettiin pCip:stä ja vietiin hiivaekspres-siovektoriin pYHD5, jossa cDNA oli Gal 1-10 promoottorin ja a-faktoriterminaattorin transkriptionaalisessa säätelyssä. Transformoitiin URA3-mutanttihiivakanta hiivaekspressioplasmi-20 dilla LiAc-menetelmällä (Yeast: A Practical Approach, I. Campbell and 0.H Duffus (eds.), IRL Press, 1988, p. 115). Valikoitiin transformantit minimaaliagaralustoille, jotka eivät sisäl-: täneet urasiilia, sitten suoritettiin replikointilevitys mini- maaliagaralustoille, joissa ei ollut urasiilia, mutta joihin .,..:25 oli lisätty galaktoosia (promoottorin indusoimiseksi), ja tut-kittiin peroksidaasiekspressiota Western blotting -menetelmällä !!'! ja mittaamalla entsyymiaktiivisuus.

ESIMERKKI 2 30 Saantovertailu: villin tyypin Coprinus cinereusta fermentoimal-la saatu Coprinus cinereus -peroksidaasi ja transformoitua S. cerevisiaeta ja A. oryzaeta fermentoimalla saatu yhdistelmä-Coprinus cinereus -peroksidaasi (rCip) 16 111957

Kaikkia tässä kokeessa käytettyjä kantoja kasvatettiin optimoiduissa olosuhteissa ja optimoidussa väliaineessa ravistus-kolvi viljelynä.

5 Coprinus cinereus (IFQ 83711 : Väliaine: 3 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 peptonia, 0,2 g/1 FeS04.7H20, 1 g/1 MgS04.7H20, 20 g/1 glukoosia, pH = 7,0 Kasvuolosuhteet : 30°C, 180 rpm, 10 7 päivää S. cerevisiae frCip! : Väliaine: 10 g/1 hiivauutetta, 20 g/1 peptonia, 10 g/1 glukoosia, 10 g/1 galak- 15 toosia, 0,1 g/1 FeS04.7H20, pH = 5,0

Kasvuolosuhteet : 30°C, 250 rpm, 4 päivää 20 A. oryzae frCipl : Väliaine: 5 g/1 hiivauutetta, 2 g/1 KC1, 1 g/1 NaH2P04.H20, 2 g/1 Na2S04, 1 g/1 MgCl2.6H20, 2 g/1 ureaa, 2 g/1 sitruunahappoa, i 4 * · 0,2 g/1 FeS04.7H20, 20 g/1 ,,,,25 maltoosia, pH = 6,0 . Kasvuolosuhteet : 37°C, 300 rpm, i 4 päivää » · « · » » 30 Peroksidaasiaktiviteetti mitattiin suodatetusta viljelynäytteestä tekniikalla (kuvanneet R.E. Childs ja W.G. Bardsley, Biochem. J. 145:93-103, 1975), johoin kuuluu ABTS:n (2,2'-atsi-no-bis( 3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihappo, valmistaja Boehringer Mannheim, diammoniumsuolana) vetyperoksidihapetus ,;,35 pH-arvossa 7,5 tarkasteltuna 418 nm:ssa. Vetyperoksidipitoi-suus oli 1 mM.

» .1.7 111957

Kanta Ekstrasellulaarisen peroksidaasin saanto

Coprinus cinereus (IFO 8371) 100% 5 rCip f S. cerevisiae) 2-5 % rCip 10 (A. oryzae) 500 % A. oryzaen käyttäminen Coprinus cinereus -peroksidaasin valmistamiseen on vieläkin edullisempaa syöttöeräfermentoinnissa, 15 jossa suhteellinen saanto Coprinus cinereuksesta saatuun verrattuna on yli 2000 %.

ESIMERKKI 3

Yhdistelmä- Coprinus cinereus -peroksidaasin valmistaminen A.

20 oryzae -kannassa hemiiniä sisältävässä fermentointivällaineessa pCip transformoitiin A. oryzae A1560:een (IFO 4177) yhteis-;·’; transformoinnilla p3SR2:n kanssa, joka sisälsi A. nidulansista » » r * saadun amdS-geenin yllä kuvattuun tapaan seoksena, joka sisälsi ,,,,:25 yhtä paljon pCip:tä ja p3SR2:ta (noin 5μg kumpaakin). Trans- i . formantit, jotka pystyivät käyttämään asetamidia ainoana typpi-lähteenään uudelleeneristettiin kahdesti.

> * Ί 4 » ’·’ 300 ml:n ravistuspulloja, jotka sisälsivät 50 ml ASP03 väli- 30 ainetta, jonka kooostumus oli:

Hiivauute 1 g/1 : ·’ Meripihkahappo 10 g/1 4 i ;:* MgCl2.6H20 0,82 g/1 ,‘,.35 KC1 1,83 g/1 ;; NaH2P04.2H20 1,01 g/1 18 111957

NaS04 1,8 g/1

Urea 2 g/1

Sitruunahappo 2 g/l.

Hivenmetalliliuos 0,5 ml/1 5 Pluronic 0,1 ml/1

Vettä kunnes 1000 ml pH säädettynä arvoon 6,00 NaOH:lla 10 autoklavoitu 121°C:ssa 60 minuutin ajan, lisätty 20 g/1 maltodekstriiniä ja vaihtelevat määrät hemiiniä (Sigma H-2250) liuotettuna 0,01 M NaOH ja steriilisuodatettu pulloihin 0,2 μηι mem-braanin läpi alkalisessa pH:ssa (12), inokuloitiin 1 ml:11a itiöliuosta (noin 106 itiötä/ml) A. oryzae -transformantteja ja 15 inkuboitiin 34 °C:ssa 72 tuntia 300 rpm.

Tulokset näkyvät alla olevassa taulukossa. Peroksidaasiaktivi-teetti mitattiin PODU/ml (1 PODU (peroksidaasiyksikkö) määritetään entsyymimääräksi, joka katalysoi 1 μπιοί H202 konvertoitumi-20 sen per minuutti systeemissä, jossa 2,2'-atsinobis[3-etyyli bentsotiatsoliini-6-sulfonaatti] hapetetaan kun läsnä on 1 iM H202, pH 7,0, lämpötila 25°C.

Hemiinipitoisuus Peroksidaasiaktiviteetti '.25 väliaineessa 72 tunnin kuluttua 0 mg/1 300 PODU/ml 1 - 360 : 10 - 680 ·.: : loo - looo 30 1000 - 1029

Taulukosta nähdään, että hemiinilisäys elatusväliaineeseen li-’..i sää huomattavasti peroksidaasisaantoa.

ί 9 111957 ESIMERKKI 4

Yhdistelmä- Coprinus cinereus -peroksidaasin valmistaminen A. oryzae -kannassa hemiiniä ja pinta-aktiivista ainetta sisältävässä fermentointivällaineessa 5

Yllä kuvattuun tapaan saatuja A. oryzae -transformantteja viljeltiin esimerkin 2 tapaan väliaineessa, johon oli lisätty Gla-napon DG 160:a (saatavana: Bussetti) pinta-akitiivisena aineena ennen autoklavointia. Tulokset näkyvät alla olevasta taulukos-10 ta.

Hemi-pitoisuus Glanapon-pit. POD 72 tunnin kuluttua 0 mg/1 0 ml/1 300 PODU/ml 15 1 - 0 - 360 10 - 0 - 680 0 - 5 - 380 1 - 5 - 521 10 - 5 - 1480 20

Taulukosta ilmenee, että Glanaponilla on erinomainen synergis-tinen vaikutus peroksidaasisaantoon hemiinin kanssa.

/25 ESIMERKKI 5 "" Yhdistelmä- Coprinus cinereus -peroksidaasin tuottaminen A.

:· oryzae -kannassa hemiiniä, hemoglobiinia tai punasoluja sisäl-tävässä fermentointivällaineessa 30 Yllä kuvattuun tapaan saatuja A. oryzae -transformantteja viljeltiin esimerkin 2 tapaan väliaineessa, johon oli lisätty hemiiniä, hemoglobiinia (Merck Art 4300) tai punasoluja (sumutus-kuivattuja sian ja naudan punasoluja, elintarvikelaatu) (ennen * ' autoklavointia tai sen jälkeen). Hemoglobiini ja punasolut 35 liuotettin pH 10,5 :ssä (NaOH) ennen autoklavointia ja sterii-lisuodatusta. Tulokset näkyvät alla olevasta taulukosta.

2 0 111957

Peroksidaasiaktiviteetti 72 tunnin kuluttua

Hemi- Steriili- Autoklavointi

lähde suodatus 20 min. 121°C

5 ----------------------------------------------------------------

Hemiini 800 PODU/ml 448 PODU/ml (10 mg/1.)

Hemoglobiini 1020 - 958 10 (1 g /1)

Punasolut 930 -

(i g/D

15

Taulukosta ilmenee, että hemilähteet, joissa hemi-ryhmä on sitoutunut globiiniin lisäävät huomattavasti peroksidaasisaantoa. Lisäetu on, että niitä on edullisesti saatavilla ja että hemi-ryhmä on suojattu hajoamiselta lämpösteriloinnin aikana.

20 ESIMERKKI 6

Yhdistelmä- Coprinus cinereus -peroksidaasin tuottaminen A.

. oryzae -kannassa 2 litran fermentorissa hemoglobiinia sisältä-;·/ vässä ferraentointivällaineessa ‘!25 ' ' Yllä kuvattuun tapaan saatuja A. oryzae -transformantteja fer-mentoitiin 2 litran laboratoriofermentoreissa syöttöeräproses-; '/ sissa seuraavaan tapaan: 30 Säiliöväliaine:

MgS0„.7H20 2 g/1 KH2P04 2 g/1 ;Vt K2S04 3 g/1

Sitruunahappo 4 g/1 :35 Hivenmetallit

Hiivauute 1 g/1 : : : Pluronic 0,2 ml/1 21 111957

Elatusväliaine:

Maltoosi 250 g/1

Hiivauute 7 g/1

FeSO„. 7H20 1 g/1 5 Urea 20 g/1

Pluronic 2 ml/1

Fermentointiolosuhteet: 2,0 1 fermentorit 10 Lämpötila 34°C pH =7,8 p02 > 20 % lisättäessä sekoitusnopeutta. ilmastus: 1WM 15

Syöttöprofiili: 3 g/lxh 0-24 tuntia 6 g/lxh 24-144 - 20 Inukulointi 50 ml:11a 24 tuntia vanhaa ASP03 ravistuskolviviljelystä.

;·· Steriloinnin aikana pH nostettiin 10,5:een säiliöväliaineessa •‘25 ja/tai syöttöväliaineessa (jos siinä oli hemoglobiinia). Hemo-: globiinia autoklavoitiin 121°C:ssa 40 minuutin ajan, pH 10,5.

/*' Ennen fermentointia pH säädettiin arvoon 7,8.

> » t

Tulokset näkyvät alla olevasta taulukosta.

• · * > · » r *

* I I

111957

Fermentointi Hemoglobiinipitoisuus Peroksidaasisaanto no. säiliö- / syöttöväliaine 144 tunnin kuluttua (%)* 5 74 0 g/1 0 g/1 100 78 1 g/1 0 g/1 117 79 5 g/1 5 g/1 250 115 ( punasolut ) 5 g/1 10 g/1 300 10 26 (hemiinisteriilisuod.) 117 50 g/1 * Peroksidaasisaanto väliaineessa ilman hemoglobiinilisäystä on 15 sattumanvaraisesti asetettu arvoon 100 %

Taulukosta ilmenee, että peroksidaasisaantoa voidaan lisätä huomattavasti lisäämällä hemoglobiinia fermentointiväliainee-seen. Samaa saantotasoa ei ole ollut mahdollista saavuttaa 20 hemiinillä.

« · * · I · * » · * » * » • I *

t I

I I

Claims (6)

111957 Pat entt ivaat imukset

1. Menetelmä peroksidaasin tuottamiseksi ekstrasellulaarisesti Aspergillus-lajin kannassa, tunnettu siitä, että menetelmä kä- 5 sittää sen, että (a) transformoidaan sopiva Aspergillus-lajin kanta yhdistelmä-DNA-vektorilla, jossa on peroksidaasia koodaava DNA-sekvenssi, joka voidaan johtaa Coprinus-lajista, ja DNA-sekvenssi, joka 10 koodaa esialuetta, joka mahdollistaa ekspressoituneen peroksi-daasiproteiinin erittymisen, ja (b) viljellään transformoitua Aspergillus-lajin kantaa sopivassa viljelyväliaineessa olosuhteissa, jotka johtavat peroksidaa- 15 siproteiinin muodostumiseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Aspergillus-laji on Aspergillus oryzae.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, : että esialue johdetaan geenistä, joka koodaa amylaasia tai '/· glukoamylaasia Aspergillus-laj ista, geenistä, joka koodaa lipaasia tai proteaasia Rhizomucor mieheistä, tai geenistä, ··· joka koodaa peroksidaasia Coprinuksesta. 25 , 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esialue johdetaan geenistä, joka koodaa TAKA-amylaasia A. oryzaesta, asparagiiniproteaasia Rhizomucor mieheistä, neutraa-lia a-amylaasia A. nigeristä, happostabiilia a-amylaasia A. 30 nigeristä, glukoamylaasia A. nigeristä, tai peroksidaasia, jota : tuottaa Coprinus cinereus tai macrorhizus.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peroksidaasia koodaava DNA-sekvenssi johdetaan Coprinus 35 macrorhizuksesta tai cinereuksesta. 111957

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (b) transformoidun Aspergillus-lajin kannan avulla tuotettu peroksidaasi otetaan myöhemmin talteen viljelmästä . 5