FI113785B - Phaffia rhodozyman transformointi - Google Patents

Description

113785

Phaffia rhodozyman transformointi - Transformering av Phaffia rhodozyma Tämä keksintö koskee geenitekniikkaa. Tässä keksinnössä 5 tuodaan erityisemmin esille välineitä ja menetelmiä tiettyjen hiivakantojen transformoimiseksi ja haluttujen geenien yli-ilmentymisen aikaansaamiseksi näissä kannoissa. Tässä keksinnössä tuodaan esille transformoituja Phaffia rhodozyma -kantoja. Keksinnössä tuodaan esille myös mene-10 telmä Phaffia rhodozyma -kantojen transformoimiseksi.

Keksintö koskee myös vektoreita, jotka kykenevät transformoimaan näitä kantoja. Mainitut vektorit sisältävät ilmentymistä sääteleviä sekvenssejä, jotka ovat aktiivisia Phaffiässä, ja joita voidaan saada mistä tahansa so-15 pivasta organismista Phaffia mukaan lukien.

Vuonna 1972 Phaff et aJL.(Proc. IV IFS: Ferment. Technol. Today 759-774) kuvailivat ensimmäisinä uuden hiivalajin, joka oli eristetty leveälehtisistä puista Japanissa. Täl-20 le hiivalle oli tunnusomaista korkea karotenoidipitoisuus ja se seikka, että se oli ensimmäinen karotenoidia sisältävä hiiva, jonka todettiin fermentoivan useita sokereita. Koska kaikki kannat saatiin vuoristoalueilta Japanis-. ',· ta ja Alaskasta, Phaff et ai. ehdottivat nimeä Rhodozyma ' : : 25 montanae.

* · * ·*·*; Vuonna 1976 Miller et ai. (Int. J. Syst. Bacteriol.

j'.\ 26^:286-291) yrittivät antaa systemaattisemman kuvauksen tästä lajista ja ehdottivat nimeksi Phaf f ia rhodozyma.

30 , Phaffia rhodozyma on ainoa Phaffia-suvussa tunnettu laji tällä hetkellä.

i t ·

Andrewes et ai. 1976 (Phytochemistry 15:1003-1007) ja 35 Andrewes ja Starr 1976 (Phytochemistry .15:1009-1011) ovat .* , julkistaneet huolellisen analyysin tämän hiivan karo- tenoidipitoisuudesta. Havaittiin, että yksi tämän lajin ’·*· tärkeimmistä karotenoideista on astaksantiini. Astaksan- 2 113785 tiinin tiedettiin jo olevan värinmuodostuksen aiheuttaja esimerkiksi meriäyriäisessä ("krill", Euphasia) ja tästä johtuen kalojen värin aiheuttaja, kuten esimerkiksi taimenen, lohen ja merilahnan, joiden ilmoitetaan luonnossa 5 käyttävän ravinnoksi "krilli"-meriäyriäisiä.

Johnson et ai. (1977) (J. Fish. Res. Board Can. 34:2417-2421) ilmoittivat Phaffiän käyttämisestä ravintopigment-tilähteenä. Johnson et ai. päättelivät, että sekä lohika-10 loja että äyriäisiä voidaan värjätä Phaffiän avulla.

Yksi rajoittavista tekijöistä Phaffiän laajamittaiseen käyttöön osoittautui olevan alhainen astaksantiinipitoi-suus tässä hiivassa.

15

Danisco (kansainvälinen patenttihakemus W0 88/08025, välillä myönnetty eurooppalaisena patenttina EP 367 765B) ilmoitti ensimmäisen kerran Phaffia-soluIen lisääntyneestä astaksantiinipitoisuudesta, sen jälkeen kun oli 20 kasvatettu soluja, jotka oli mutatoitu.

• ,· Astaksantiinin tuottokyvyn maksimimäärä näyttää kuitenkin • olevan rajallinen, koska usean mutatointikierroksen jäl-keen ei enää voida havaita astaksantiinipitoisuuden li- , 25 sääntymistä (kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa ·’ EP 482 544 on ilmoitettu). Tämä voi osittain johtua hai- • ·* tallisista mutaatioista, joita esiintyy sattumanvaraisen ·' mutatoinnin aikana.

30 Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla voitaisiin luultavasti päästä tästä pullonkaulasta kannan kehittämisessä. Jotta .* . kuitenkin kyettäisiin saamaan aikaan yhdistelmäkantoja, tarvitaan tehokas transformaatioprosessi ja riittävästi ·’ ilmentymistä sääteleviä sekvenssejä.

35

Phaf f iän transformointia vaikeuttaa luja soluseinä, joka » · » myös vaikuttaa mahdollisuuteen saada aikaan Phaffiän pro- 3 113785 toplasteja. Sen lisäksi, geneettisiä työvälineitä, kuten plasmideja, promoottoreita ja merkkigeenejä, ei ole ollut saatavissa Phaffiälle tähän päivään mennessä. Phaffiän protoplastimuodostuksesta on äskettäin raportoitu (EP 482 5 544). Näitä protoplasteja voitiin edullisesti käyttää protoplastifuusiokokeissa ja niistä saatiin aikaan kantoja, joiden astaksantiinituotantokyky oli lisääntynyt.

Tähän päivään mennessä ei ole kuvailtu Phaffia-kantojen 10 transformaatiota.

Tässä keksinnössä tuodaan esille transformoituja Phaffia-kantoja, erityisesti transformoituja Phaffia rhodozyma -kantoj a.

15 Tässä keksinnössä tuodaan myös esille menetelmiä Phaffia rhodozyman transformoimiseksi.

Esille tuodaan myös vektoreita, jotka kykenevät transfor-20 moimaan näitä kantoja, ja jotka sisältävät Phaffiassa aktiivisia, ilmentymistä sääteleviä sekvenssejä. Nämä * ,· ilmentymistä säätelevät sekvenssit saadaan edullisesti

Phaffiasta. Esimerkkinä olevassa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa Phaf f iän aktiinipromoottoria käytetään ; ’ 25 säätelemään ilmentymistä.

: .’ Yleisesti tuodaan esille Phaffia-kanta, joka on transfor- ·' moitu vektorilla, joka sisältää halutun geenin kloonattu na Phaffiässä aktiivisen promoottorin alapuolella, ja ··· 30 valinnaisesti valikoitavan markkerin kloonattuna Phaf- fiassa aktiivisen promoottorin alapuolella.

; · Yksi tämän keksinnön mukaisista menetelmistä Phaffiän '*··* transformoimiseksi käsittää Phaffia-solujen kasvattamisen : 35 eksponentiaalivaiheeseen, protoplastien valmistamisen näistä soluista, vektorin lisäämisen, joka sisältää halutun geenin kloonattuna Phaffiässä aktiivisen promoottorin 4 113785 alapuolella ja valinnaisesti valikoitavan markkerin, pro-toplastien maljäämisen valikoivalle regeneraatioalustalle ja transformoitujen Phaffia-kantoien valikoimisen.

5 Toinen menetelmä Phaffia-kantoien transformoimiseksi on LiAc-menetelmä.

Ilmentymistä säätelevät sekvenssit voidaan kloonata sekä homologisten että heterologisten geenien yläpuolelle.

10 Tämä keksintö koskee siten välineitä ja menetelmiä haluttujen geenien ilmentymisen aikaansaamiseksi Phaffiässä♦ Phaffiaa voidaan siten käyttää heterologisten proteiinien tuottamiseen.

15

Kloonaamalla ja ilmentämällä geenejä, jotka ovat osallisina karotenoidibiosynteesireitillä, on myös mahdollista käyttää Phaffia rhodozymaa haluttujen karotenoidien saamiseksi. Haluttu karotenoidituotanto käsittää lisäänty-20 neen astaksantiinituotannon, sekä myös muiden karotenoidien tuotannon kuten zeaksantiinin, kantaksantiinin • . ja β-karoteenin tuotannon.

Kuvio 1. Restriktiokohtien kartoitus Phaffian aktiinigee- * · · ‘ 25 nin ympärillä. Kromosomaalisen DNA:n Southern blot -ana-' ·' lyysi pilkottuna usealla restriktioentsyymillä ja hybri- : '.· disoituna Phaf f iän aktiinigeenin 500 emäsparia (ep) si- V ·' sältävän Sall-BamHI -fragmentin kanssa. Kaista 1, kro- mosomaalinen DNA x Hpal; 2, x Kpnl; 3, x XhoI; 4, x Xbal; ··· 30 5, x EcoRV; 6, x BamHI; 7, x EcoRI/BamHI; 8, x Hindll- I/BamHI; 9, x Hindlll/Bqlll. Blotti hybridisoitiin liuok-,· _ sessa 6 x SSC, 5 x Denhardtin liuos, 0,1 % SDS, 100 ng/ml '· sillin sperman DNA 65°C:ssa ja pestiin liuoksella 1 x SSC- /0,1 % SDS 65°C:ssa.

35 5 113785

Kuvio 2. Restriktiokartta Phaffiän aktiinigeenin 5'-kohdasta. Käänteiseen PCR:ään suunnitellut oligonukleotidit on osoitettu.

5 -- aktiinin rakennegeeni (eksonit) CO aktiinigeenin 5'-yläpuolinen sekvenssi ja promootto- risekvenssi ___ aktiinigeenin introni --> <-- käänteisessä PCRrssä käytetyt oligonukleotidit 10

Kuvio 3. Phaffia rhodozyman aktiinigeenin rakenne. Kloonaukseen käytetyt restriktiokohdat on osoitettu.

-- aktiinin rakennegeeni (eksonit) 15 CD aktiinigeenin 5'-yläpuolinen sekvenssi ja promootto- risekvenssi === aktiinigeenin introni === 3'-puolen ei-koodittava aktiinisekvenssi Δ transkription aloituskohta 20

Kuvio 4. Kloonauskaavio aktiini-fleomysiini -fuusioraken- • f- teista.

LO Phaf f ia rhodozyman aktiinigeenin yläpuolinen sekvenssi *·’ 2 5 ja promoottorisekvenssi

• .* CT Ί Phaf f ia rhodozyman aktiinin ribosomaalinen DNA

: *.·’ -- Phaf f ia rhodozyman aktiinin rakennegeeni V · CO fleomysiinin (S.h.) geeni + syki. (hiivan) terminaat- tori ··· 30 Phaf f ia rhodozyman 3 '-pään ei-koodittavat aktiinisek- venssit

,· . ---pTZ18R

• » · >··* Kuvio 5. Aktiini-G418 -fuusiorakenteiden kloonauskaavio.

35 CD Phaffia rhodozyman aktiinigeenin yläpuolinen sekvenssi ja promoottorisekvenssi 6 113785 CD Phaffia rhodozyman aktiinin ribosomaalinen DNA -- Phaffia rhodozyman aktiinin rakennegeeni CD G418 ==== Phaffia rhodozyman 3'-pään ei-koodittavat aktiinisek-5 venssit

--- PTZ18R

Kuvio 6. Southern blot -analyysi kromosomaalisesta DNA: -sta, pilkottuna sekä BamHI:llä että EcoRI:llä ja eristet-10 tynä transformoiduista Phaffia-kannoista (esimerkki 11), kolmen eri koettimen kanssa so.

A) 430 ep BamHI-StuI -fleofragmentti, inkuboituna 72 tunnin ajan, 15 B) 1,8 ke (kiloemäs) BamHI-Sall aktiinipromoottorifragmentti, inkuboituna 3 tunnin ajan, C) pTZ18R, inkuboituna yli yön.

Kuvio 7A. Southern blot -analyysi BamHI:llä pilkotun kro-20 mosomaalisen DNA:n kanssa seuraavista (kaistat 1-20); pGB-Ph9, CBS6938, Ib, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2h, 2i, 2j, 3b, * .· 4a, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i. CBS6938, Ib ja 3b ovat negatiivisia kontrolleja; pGB-Ph9 on positiivinen kont-... rolli. Muut luvut ovat mahdollisia transformantteja. Hyb- . 25 ridisaatio PTZ-koettimen kanssa.

* I

• ·' Kuvio 7B. Selitys kuviossa 7A. Hybridisaatio G418-koetti- • · « · men kanssa.

,30 Kuvio 7C. Selitys kuviossa 7A. Hybridisaatio rDNA-koetti- : : : men kanssa.

* * *

Yleisimmässä muodossaan tässä keksinnössä kuvaillaan i : *.’· transformoituja Phaf f ia-solui a. Phaf f ia-solut ovat edul- 35 lisesti Phaf f ia rhodozvma -soluja. Tässä keksinnössä ku-: : väillään myös menetelmiä Phaffia-soluien transformoimi- seksi.

7 113785

Onnistunut transformaatio tuodaan esille käyttäen ilmennettävän geenin yläpuolelle kloonattua PhafJjLa-promoottoria, vaikka siihen ei olekaan rajoituttu.

5 Tämä keksintö osoittaa edelleen, että Phaffia-solut muiden hiivasolujen tapaan ovat herkkiä valikoiville aineille kuten G418:lle, hygromysiinille ja fleomysiinille melkoisella pitoisuusalueella. Phaffia-solujen transformoin-ti näillä geeneillä, jotka koodittavat proteiineja, jotka 10 antavat soluille resistenssin näille aineille, toteuttaa sopivan valikointisysteemin transformaatiolle.

Tämä kuvaus sisältää aineistoa, joka osoittaa, että voimakkaiden hiivapromoottoreiden käyttäminen, erityisesti 15 Saccharomvces cerevisiaesta ja Kluvveromyces lactiksesta saatujen promoottoreiden, erityisemmin ADH1-, GAPDH- ja TEF la -promoottoreiden, ei saa aikaan merkkigeenien ilmentymistä transformoiduissa Phaffia-soluissa. Itse asiassa on mahdotonta todistaa tapahtuiko transformaatiota 20 lainkaan.

•,* Muita voimakkaita promoottoreita on käytetty, kuten SV40- promoottoria, kanamysiinipromoottoria Tn903:sta, PGK-pro-moottoria P. chrysoqenumista ja GAPDH-promoottoria A.

; / 25 nidulansista. kaikki samalla (negatiivisella) tuloksella.

: Tämä antoi aihetta etsiä promoottoreita Phaffiasta. Ylei- ·’»* · sesti ottaen valikoitiin sellaisia geenejä, joiden otak sutaan olevan säilyneitä hiivalajeissa. Eristettiin sel-·;· 30 laisia koettimia, jotka edustavat erityisen säilyneitä alueita näissä geeneissä, ja näitä koettimia käytettiin . Phaffiän genomisen DNA:n hybridisointiin. Erityisiä gee- nejä vastaavia hybridisoituvia fragmentteja käytettiin *;·’ kokonaisten geenien tai ainakin geenien promoottorialuei- : 35 den eristämiseen. Siten eristetty promoottori kloonattiin sitten sopivaan transformaatio/ekspressiovektoriin re-portterigeenin yläpuolelle.

8 113785

Phaffiän protoplasteja valmistettiin käyttämällä va-kiomenetelmiä ja ne transformoitiin sen jälkeen transfor-maatio/ekspressiovektorilla. Lopuksi transformoidut Phaf-fia-protoplastit regeneroitiin ja valikoitiin sopivalla 5 valikoivalla alustalla.

Myös muita menetelmiä voidaan käyttää Phaffian promootto-reiden eristämiseksi. Sellaisia menetelmiä ovat ilmentyneen Phaffia-proteiinin eristäminen, tämän proteiinin 10 osan sekvensointi ja oligonukleotidikoettimen kehittäminen perustuen tähän sekvenssiin. Geeni voidaan valikoida sen jälkeen kun pilkottu ja elektroforesoitu DNA on hyb-ridisoitu tai Phaffiän genominen tai cDNA-kirjasto on seulottu. Tämän geenin promoottori voidaan sen jälkeen 15 paikantaa ja kloonata sopivalla tavalla.

Tämän keksinnön mukaisesti kuvaillaan seuraavien koetti-mien käyttöä hybridisointiin Phaffiän genomisen DNA:n kanssa; 20 - 1,7 ke ribosomaalinen DNA-fragmentti K. lactiksesta.

• . - TPI-geenin 800 ep PCR-fragmentti K. lactiksesta.

- 250 ep PCR-fragmentti K. lactiksen pidennystekijästä; • * - PKG-geenin 3 ke fragmentti pTZ18R:ssä S. cerevisiaesta ’;*/ 25 ja - K. lactiksen aktiinigeenin 5'-kooditusalueen 200 ep : V PCR-fragmentti.

t I « Kävi ilmi, että vain rDNA ja aktiinifragmentti hybri-• f. 30 disoituivat Phaf fian genomisen DNA:n kanssa, TPI-, PGK-ja pidennystekijäkoettimet, vaikka saatiinkin hyvin säilyneistä geeneistä, eivät hybridisoituneet matalatasoi-*· sissa tiukkuusolosuhteissa. Aktiinigeenin sisältävä geno- !...: minen DNA kloonattiin sen jälkeen ja hybridisoituvat •\· 35 kloonit sekvensoitiin. Sekvenssin todettiin vastaavan tunnettua aktiinisekvenssiä muista hiivoista. Sekvenssiä käytettiin myöhemmin spesifisenä koettimena kloonin il- 9 113785 maisemiseksi, joka sisältää aktiinipromoottorin Phaffia rhodozymasta. Tässä keksinnössä tuodaan siten esille eristetty ja puhdistettu DNA-fragmentti, joka sisältää Phaffiän promoottorin, edullisesti Phaffiän aktiinipro-5 moottorin koodin.

Sen jälkeen kun promoottori oli eristetty, sitä käytettiin kloonaukseen toimivalla tavalla halutun ilmennettävän geenin yläpuolelle. Sellainen haluttu geeni voi olla 10 mikä tahansa geeni. Sekä homologisia että heterologisia geenejä voidaan käyttää. Homologisia geenejä ovat karo-tenoidibiosynteesireitin geenit, näiden geenien käsittäessä rakennegeenejä samoin kuin säätelygeenejä. Heterologisia geenejä ovat kaikki kiinnostuksen kohteena olevat 15 geenit, joiden ekspressiotuotteet eivät ole letaaleja

Phaffiälle, sellaisten geenien käsittäessä geenejä, jotka koodattavat farmaseuttisia proteiineja, pesuaine-entsyymejä, elintarvike- ja rehuentsyymejä ja karotenoidisyn-teesiin osallistuvia proteiineja. Tässä patenttihakemuk-20 sessa on ilmaisemisen helpottamiseksi käytetty heterologisia G418- ja fleomysiiniresistenssiä koodattavia gee-< t· nejä. Nämä geenit voidaan täydellisesti sulauttaa halut tuun promoottoriin. On kuitenkin myös mahdollista toteuttaa fuusio geeniosan kanssa, joka tavallisesti seuraa t I · ' 25 promoottorin jälkeen, mistä on tuloksena fuusioproteiini.

• · * · « ί V Phaffia rhodozyman transformointi suoritettiin seuraaval- * * · V : la tavalla. Phaffia-protoplasteia valmistettiin käyttäen vakiomenetelmiä ja ne transformoitiin sen jälkeen trans-·;· 30 formaatiovektorilla. Transformoidut Phaf f ia-protoplastit regeneroitiin lopuksi ja valikoitiin sopivalla vali-, korvalla alustalla.

< »

Transformantteja saatiin myös käyttäen niin sanottua li-35 tiumasetaattimenetelmää. Tässä menetelmässä soluja inku- • » boidaan yli yön, kun läsnä on PEG:tä, litiumasetaattia ja transformoivaa DNA:ta. Inkuboinnin jälkeen solut malja- 10 113785 taan valikoiville maljoille. Vaikka keksijät ovat ensimmäisinä kuvailleet transformoituja Phaffia-solui a, tulee käsittää, että muita menetelmiä voi olla käytettävissä transformanttien aikaansaamiseksi, elektronipommituksen 5 kuuluessa näihin menetelmiin.

Tämän keksinnön mukaisesti tuodaan ensimmäistä kertaa esille vektori, jolla kyetään transformoimaan Phaffia ja samassa yhteydessä ilmentämään kloonattu geeni. Julkaistu 10 vektori sisältää aktiinipromoottorin ja merkkigeenin.

Phaffiän transformaatio todistettiin käyttäen valikoivaa alustaa. Aktiinipromoottoria käytettiin kloonattuna G418-ja fleomysiiniresistenssiä koodittavien geenien yläpuolelle. Phaffiän promoottoria voidaan käyttää myös muiden 15 kloonattujen geenien ilmentämiseksi. Vektori sisältää silloin halutun geenin ja valikoitavan merkkigeenin.

Sen jälkeen kun promoottori ja valikointisysteemi Phaf-fiälle on kehitetty, on mahdollista kloonata halutut gee-20 nit Phaffiässä. Sellaisia geenejä ovat kaikki heterologi-set geenit, jotka tuottavat käyttökelpoisia tuotteita • t. ilmetessään. Phaffia rhodozyma antaa kuitenkin muita kiinnostavia mahdollisuuksia.

. t · « « * » * 25 Laajimmassa merkityksessä tämän keksinnön mukainen mene- * ♦ « • telmä tekee mahdolliseksi kloonata ja ilmentää kloonattu- ! *,· ja heterologisia tai homologisia geenejä Phaf f iässä. Sel- V *’ laiset geenit voidaan kloonata episomaalisessa vektorissa tai ne voidaan integroida genomiin. Sen lisäksi, että '·· 30 Phaf f iaa käytetään tuotantoisäntänä halutuille tuotteil-

Mi» le, on mahdollista myös kloonata ja ilmentää karotenoidi- / t en biosynteesireitillä toimivia geenejä Phaffiässä esiin- * » » ' tyvien reittien muuttamiseksi tai kehittää uusia reittejä karotenoideille, jotka eivät normaalisti keräänny Phaffi-}’>,· 35 aan. Tuloksena olevat transformoidut solut voivat tuottaa karotenoidia, joka ei luonnostaan esiinny Phaffiassa. Se 11 113785 voi tuottaa lisääntyvässä määrin karotenoidia, jota esiintyy luonnollisena isäntäsolussa.

Esimerkki tästä on seuraavassa. Klassista mutatointia 5 käytetään sellaisten mutanttien aikaansaamiseksi, jotka tuottavat spesifisiä astaksantiinin prekursoreita, β-ka-roteenin ollessa edullinen esimerkki sellaisesta prekur-sorista. Toista karotenoidiprekursoria tuottava kanta voidaan saada aikaan samalla tavalla. Geeni siirretään 10 sen jälkeen Phaffia-kantaan, jonka ekspressiotuote käyttää kantaan klassisen mutatoinnin jälkeen kertyneen pre-kursorin substraattina, β-karoteenin ollessa substraattina sopiva geeni on esimerkiksi geeni, jonka proteiinituote syntetisoi zeaksantiinia (crtZ-geeni), joka 15 geeni on saatu Erwinia uredovorasta (Misawa et ad. 1990. J. Bacteriol. 172:6704-6712). Muita sellaisia geenejä voidaan saada esimerkiksi Flavobacterjumista (gram-posi-tiivinen bakteeri), Synechococcuksesta (syaanibakteeri) tai Chlamydomonaksesta tai Dunaliellasta (levä).

20

On mahdollista käyttää myös villityypin kantoja ilman • .* mutatointia. Ilmentämällä liikaa entsyymiä, joka käyttää prekursoria biosynteettisellä reitillä, tämä reitti voi- t * daan poikkeuttaa normaalista kulustaan ja saada aikaan , 25 toinen karotenoidituote, jota ei esiinny luonnollisena I » I, ; käytetyssä kannassa.

i * s f » t « V * Kloonattaessa ja ilmennettäessä liikaa geenejä, jotka osallistuvat suoraan astaksantiinituotantoon, tai geenejä t , 30 tai sekvenssejä, jotka toimivat säätelevästi astaksantii- ; ί ; nituotannossa, voi tuloksena olla lisääntynyt astaksan- . tiinituotanto.

’ t

Valittu geeni voidaan ilmentää episomaalisesti tai se | 35 voidaan integroida isäntäsolun genomiin. Voi olla hyödyk- : si käyttää geenin monistusta usean geenikopion aikaansaa- 12 113785 miseksi isäntäsolussa. Esillä olevat esimerkit osoittavat ARS:n läsnäolon rDNArssa Phaffia rhodozvmasta.

On mahdollista tuottaa muita karotenoidiprekursoreita 5 samalla tavalla, yleisesti ottaen kaikkia karotenoideja, joita voidaan saada entsymaattisesti astaksantiinin pre-kursoreista Phaffiassa. voidaan saada aikaan, spesifisten karotenoidien käsittäessä kantaksantiinin ja lykopeenin. β-karoteeni voidaan lisäksi muuntaa retinoliksi vastaa-10 valla tavalla.

Transformoituja Phaffia-soluja viljellään olosuhteissa, joissa ei muodostu alkoholia. Lämpötila on alueella 15-26°C. Lämpötila-alue on edullisesti 20-22°C. Fermentaatio 15 suoritetaan alustassa, joka sisältää sopivia ravinteita. Näitä ovat melassi tai sakkaroosi hiilenlähteenä ja ty-penlähteet kuten urea, ammoniumsuolat tai maissin liotus-vesi. Alustaan lisätään myös mikroravinteita. Sen lisäksi kasvatus suoritetaan aerobisissa olosuhteissa. Kasva-20 tusolosuhteiden, spesifisten ravinteiden valinnan ja substraattirajoituksen on ilmoitettu vaikuttavan Phaffia-solujen kasvuun. Kasvuolosuhteet ja prekursorilisäys so-. . vitetaan halutun proteiini- tai karotenoidituotteen mu- kaan.

25 '·' ' Transformoitujen Phaf f ia-solu ien viljelyn jälkeen solut f V otetaan talteen, sen jälkeen soluja voidaan käsitellä eri : ',· tavoin riippuen tuotteen tavoitellusta käytöstä tai for- : : : mulaatiosta. Käsittelyyn kuuluu; 30 • j. - solujen avaaminen, - solujen kuivaaminen, • ( - proteiini- tai karotenoidituotteen uuttaminen soluista.

« · 35 Karotenoideja sisältäviä hiivasoluja käytetään sellaise-j naan tai kuivatussa muodossa lisäaineina eläinten rehuis- sa tai elintarvikkeissa.

13 113785

Sen lisäksi hiivasolut sekoitetaan muiden yhdisteiden kuten proteiinien, hiilihydraattien tai öljyjen kanssa. Yleisesti ottaen, kaikkia menetelmiä, joita käytetään Phaffjoiden tekemiseksi sopiviksi rehuun tai elintarvik-5 keeseen lisäämistä varten, voidaan käyttää näihin transformoituihin kantoihin.

Karotenoidit voidaan eristää esimerkiksi kuten Johnson et ai. ovat kuvailleet (Appi. Environm. Microbiol. 35:1155-10 1159 (1978)).

Puhdistettuja karotenoideja käytetään väriaineina elintarvikkeissa ja/tai rehuissa. Karotenoideja on mahdollista käyttää myös kosmeettisissa aineissa tai farmaseutti-15 sissa koostumuksissa.

Edellä olevasta kuvauksesta käy selville, että esimerkit on tarkoitettu ainoastaan yleisperiaatteen valaisemiseksi eikä niitä ole siten tarkoitettu rajoittamaan keksintöä 20 mitenkään.

Sambrook et ai. kuvailevat molekulaaristen kloonaustek-• ,· niikoiden yksityiskohtia: Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 2. painos ( 1989; Cold Spring Harbor Laboratory 25 Press). Näitä menetelmiä ovat DNA:n geelielektroforesoin-’ ti, Southern blot -hybridisaatio, DNA:n sekvensointi, 5'- ' ·’ päiden fosforylointi T4-polynukleotidikinaasin avulla ja : yhtenäisesti leimattujen DNA-koettimien synteesi käyttäen ·’ sattumanvaraisia alukkeita.

30 *;· Entsyymi-inkuboinnit suoritetaan noudattaen valmistajan kuvailemia ohjeita. Näitä inkubointeja ovat restriktio- ,* , entsymipilkonta ja ligaatio.

14 113785

Kannat

Escherichia coli JM109 recAl, endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, o(lacproAB), [F', traD36, proAB, lacIqZaM15] 5

Phaffia rhodozyma CBS 6938

Phaffia rhodozyma PF 11-12 talletettiin Centraal Bureau voor de Schimmelcultures'iin, Baarn, Hollanti, talletus-numerolla CBS 797.91, 16. joulukuuta 1991.

10

Kloonaukseen käytetyt plasmidit pTZ18R amp R (Pharmacia/LKB) pUCG418 amp R, genetisiini R (EP 301 670) pUT701 amp R, fleo R (Cayla) 15

Alustat LB: 10 g/1 bacto tryptonia, 5 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 NaCl:a.

LC1-maljat: 5 g/1 hiivauutetta, 10 g/1 bacto tryptonia, 8 20 g/1 NaCl:a, 0,025 g/1 tymiiniä, 1 g/1 MgS04x7H20:ta, 4 g/1 tärkkelystä, 20 g/1 bacto agaria.

YEPD: 10 g/1 hiivauutetta, 20 g/1 bacto peptonia 2 % glu-. . koosia, sisältää tarvittaessa genetisiiniä (G418) tai fleomysiiniä (maljat: + 20 g/1 bacto agaria).

25 YEPDS: + 1 M sorbitolia (maljat: + 20 g/1 bacto agaria).

: . ’ Muut menetelmät ·1 - E. colin transformointi suoritettiin käyttäen DMSO-me- 30 netelmää, Chung et ai. 1989. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2172-2175).

_ - Plasmidi-DNA:n eristäminen E. colista suoritettiin '· 1: käyttäen Qiagentm-pakkausta.

35 : - Kromosomaalisen DNA:n eristämistä Phaffiasta kuvaillaan .···. esimerkissä 3.

15 113785 - Kokonais-RNA:n eristäminen Phaffiesta suoritettiin kuten Lacy, R.L. ja Dickson, R.C. ovat kuvailleet 1981. Mol. Cell. Biol. 7:629.

5 - Pesäkepoiminta ja hybridisaatio suoritettiin the Colo- ny/Plaque Screentm -käsikirjan mukaisesti (NEF-978 Du

Pont).

- DNA-fragmentit eristettiin agaroosista käyttäen Gene-10 cleantm:ää.

- Polymeraasiketjureaktio (PCR).

PCR-reaktiot suoritettiin rutiininomaisesti seoksissa, 15 joissa oli seuraava koostumus: - 1 pg kromosomaalista DNA:ta tai 5 pg kokonais-RNA:ta, - 1 pM kutakin oligonukleotidikoetinta, - 200 pg kutakin dNTP:tä, 20 - 11 mM Tris-HCl:ää pH 8,3, - 50 mM KCl:ää, - 2 mM MgCl2:a, - 0,01 % paino/tilavuus gelatiinia, - 1 mM NaCl.a, 25 - 0,1 mM EDTA: ta, - 5 U ampli Taq-polymeraasia (Perkin-Elmer) ·' .* kokonaistilavuudessa 50 pl.

30 Ennen Taq-polymeraasin lisäämistä DNA:ta denaturoidaan 8 ·· min. ajan 94°C:ssa. Taq-polymeraasi lisätään sitten ja

• I I I

;*·"; pisara mineraaliöljyä lisätään haihtumista vastaan. Sen . jälkeen ajo aloitetaan.

’··** 35 Erilaisia PCR-menetelmän muunnelmia käytetään. Seuraavaa ajomallia käytetään kromosomaalinen DNA templaattina. 25 jaksoa: 2' 94°C, 2' 45°C, 5':ssa 72°C:seen, 3' 72°C.

16 113785 Käänteinen PCR on toinen käytetty PCR-menetelmä. Tässä menetelmässä templaatti-DNA pilkotaan ensin ja ligoidaan ennen sen käyttämistä PCR':ssä. Itse PCR suoritetaan seuraavasti: 25 jaksoa: 2' 94°C, 2' 55°C, 3' 72°C.

5

Kolmas PCR-menetelmä on käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) -menetelmä. Kokonais-RNA:ta käytetään templaattina ja käänteistranskriptaasireaktion on tapahduttava ennenkuin PCR aloitetaan. RNasiinia (20 U) ja M.MLV Reverse 10 Transcriptase -käänteiskopioijaa (50 U) lisätään normaaliin reaktiopuskuriin. Seosta inkuboidaan ensin 50°C:ssa 8 min. ajan, sen jälkeen tapahtuu käänteiskopiointireaktio. Denaturointi suoritetaan tavanomaiseen tapaan ja Taq-po-lymeraasin lisäämisen jälkeen normaali PCR-ajo voidaan 15 suorittaa 25 jaksossa: 1' 94°C, 1' 55°C, 1'30'' 72°C.

- Phaffia-hiivan transformointi litiumkloridin kanssa suoritettiin kuten Ito, H. ja Y. Fukuda ovat kuvailleet.

J. Bacteriol. 153:163-168.

20 - Phaffia-hiivan transformointi litiumasetaatin kanssa (PLATE-menetelmä) suoritettiin kuten Elble, R. on kuvail-’ .· lut 1992. Biofeedback 13 n:o 1 (saatavissa Reader Servi- cen kautta n:o: 11a 118), kuten jäljempänä kuvaillaan.

... 25 * · · .! . Liuokset:

IM LiAc x 2H20 (Sigma), 13,8 g/100 ml, 15' 110°C • ’.·* 45 % PEG 4000 (Brocacef), 90 g/200 ml, 15' 110°C

V : PLATE - 90 ml 45 % PEG 4000 30 - 10 ml 1 M LiAc *:· - 1 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5

;T; - 0,2 ml 0,5 M EDTA

Menetelmä: '·;·* 35 1. Otetaan 0,5 ml viljelmää (taustatiedot) ja sentrifu- goidaan 10 ' ' mikrosentrifugissa. Supernatantti dekantoi-daan kääntämällä putkea ja ravistamalla sitä kerran.

17 113785 2. Lisätään 10 μΐ kantaja-DNA:ta (100 pg hierrettyä sillin sperman DNA:ta) ja 1-10 pg transformoivaa DNA:ta. Pyörresekoitetaan (vortex).

3. Lisätään 0,5 ml PLATEa. Pyörresekoitetaan.

5 4. Inkuboidaan yli yön huoneen lämpötilassa pöydällä (ks.

taustatiedot).

5. Seos levitetään suoraan valikoiville maljoille (ks. taustatiedot).

10 Taustatiedot: 1. Sentrifugoitava tilavuus riippuu viljelmän optisesta tiheydestä. Parhaat tulokset saadaan, jos käytetään 107 solua.

4. Vähintään yli yön. Kontrollinäytteitä otetaan solujen 15 elinkykyisyyden tarkistamiseksi (elinkykyisyyskäyrä).

5. Maljättäessä enemmän kuin 0,2 ml transformaatioseosta valikoivaa maljaa kohti, pesäkekasvu hidastuu johtuen PEG-liuoksesta.

20 - RNA-analyysit 5'-alukepidennyksen yhteydessä suoritet tiin kuten Mertins, P. ja D. Gallwitz ovat kuvailleet 1987. (EMBO J. 5:1757-1763).

Lyhyesti esitettynä, määrällisesti 5 pg solun kokonais-25 RNA: ta seostettiin yhdessä + 106 c.p.m. (pulssia minuutis-, sa), sopivan 32P-päästäleimatun alukkeen kanssa, pestiin ^ | 70 %:isella EtOH:lla, kuivattiin ja liuotettiin 15 pl:aan • ·’’ liuosta 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 150 mM KC1, 7 mM MgCl2, *.· · 0,5 mM EDTA. Kuumennuksen jälkeen 2 min. 65°C:ssa nukle- 30 iininappoja pidettiin jäiden päällä 2 min. ja sen jälkeen h' kun oli lisätty 15 U RNasiinia, 5 pl dNTP:itä ja DTT:a (0,5 mM dATP:a, dCTP:a, dTTP:a ja dGTP:a; 1 mM DTT:a, . loppupitoisuus) ja 200 U M.MLV -käänteistranskriptaasia, reaktion annettiin jatkua 2 tunnin ajan 42°C:ssa. Reaktion 35 loputtua reaktioseosta säilytettiin -20°C:ssa. 5'-alukepi- dennyksen reaktiotuotteet analysoitiin denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä.

18 113785 - DNA:n eristäminen geelistä agaraasikäsittelyn avulla suoritettiin seuraavasti:

Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-vyöhyke leikataan irti 1 5 %:isesta LGT-agaroosigeelistä ja paino estimoidaan. Gee-lipalaa inkuboidaan 10:ssä tilavuudessa TE-puskuria (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) vähintään yhden tunnin aikana ja tasapainotetaan sen jälkeen TNE:tä vastaan (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Geelipala 10 sulatetaan 65°C:ssa 10 minuutin kuluessa ja sijoitetaan 37°C:iseen vesihauteeseen. Jäähdytyksen jälkeen 37°C:seen agaraasia (Sigma) lisätään pitoisuuteen 1 yksikkö/100 mg agaroosia.

15 Putkea inkuboidaan vähintään kahden tunnin ajan 37°C:ssa, edullisesti yli yön, laimennetaan sen jälkeen 4-kertai-sesti suolapitoisuuden alentamiseksi ja uutetaan yhtä suurella tilavuudella fenoli-kloroformia (lisäten ensin h tilavuutta fenolia, pyörresekoitetaan ja lisätään sitten 20 ½ tilavuutta kloroformia). Uuttaminen toistetaan kunnes rajapinta on hävinnyt.

' Viimeinen uutto suoritetaan lopuksi -½ tilavuudella kloro- formia ja supernatantti saostetaan lisäämällä 1/10 tila- « · 25 vuusosa 3 M natriumasetaattia ja kaksi tilavuusosaa 20°C:- .! , ista etanolia. Inkuboinin jälkeen -20°C:ssa 2 tunnin ajan, | DNA pelletoidaan sentrifugoimalla, kuivataan ja liuote- ' ·’ taan sopivaan tilavuuteen TE-puskuria.

t · · 30 Esimerkit

Esimerkki 1 * · 1 i -—— — : : ; Phaffia rhodozyman lääkeaineherkkyys

Phaffia rhodozyma CBS 6938 -kannan johdannaisesta, PF 11-35 12:sta, testattiin herkkyys usealle lääkeaineelle. Käy- tössä olivat G418, hygromysiini ja fleomysiini. Kokeet : / suoritettiin tuoreilla yli yön kasvaneilla YePD-viljel- 19 113785 millä (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % dekstroosia). Solut maljättiin erilaisina määrinä YePD-agarmaljoille, jotka sisälsivät edellä mainittuja lääkeaineita. G418 oli valikoiva pitoisuusalueella 5-20 pg/ml. Hygromysiini alu-5 eella 2,5-10 pg/ml ja fleomysiini alueella 0,1-0,4 pg/ml.

Phaffia rhodozyma -kannasta CBS 6938 testattiin myös G418- ja fleomysiiniherkkyys. G418 oli valikoiva alueella 5-100 pg/ml ja fleomysiini alueella 0,1-2,5 pg/ml.

10

Esimerkki 2

Phaffia rhodozyman protoplastitransformaatio käyttäen heteroloqisia promoottoreita 15 Phaffia rhodozyma -kannan CBS 6938 johdannainen, PF 11-12, joka saatiin klassisen mutatoinnin avulla, siirros-tettiin 100 ml:aan nestemäistä alustaa, joka sisälsi 2 % dekstroosia, 1 % hiivauutetta ja 2 % peptonia (YePD), ja kasvatettiin 21°C:ssa optisen tiheyden arvoon 0,3-0,8 600 20 nm:ssä (so. noin 5xl06 solua/ml). Solut kerättiin talteen sentrifugoimalla nopeudessa 5000 kierrosta minuutissa (rpm) (Hettich Rotana) 5 minuutin aikana huoneen lämpötilassa, ja pestiin kahdesti 0,7 M KC1-10 mM sitruunahapol-la pH 6,2. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 25 pesuseosta ja Novozyrntm 234:ää lisättiin loppupitoisuuteen » * · ..t. 2 mg/ml. Soluja inkuboitiin 25°C:ssa 20-40 minuutin aikana : (riippuen kannasta). Protoplastimuodostus varmistettiin I * · « f mikroskooppisen tarkastelun avulla. Protoplastit pestiin • » '·* ’ perusteellisesti 1 M sorbitolissa ja suspendoitiin uudel- 30 leen 2 ml:aan 1 M sorbitolia, joka sisälsi 50 mM kalsium-,,',Ι’ kloridia. 10-25 pg pilkkomatonta plasmidi-DNA: ta, jota on : : : kuvattu taulukossa 1, lisättiin 200 pl:aan protoplasteja ; ja inkuboitiin 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

Kokeet suoritettiin kantaja-DNA:n ollessa sekä läsnä että '[ 35 sen puuttuessa. Sen jälkeen lisättiin 2 ml liuosta, joka sisälsi 20 % - 40 % PEG 4000:a ja 50 mM kalsiumkloridia, : : sekoitetiin perusteellisesti ja inkuboitiin vielä toiset 20 113785 10-20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Protoplasteja sent-rifugoitiin nopeudessa 300 rpm (Heraeus Biofuge) 3 minuuttia huoneen lämpötilassa ja pelletti suspendoitiin 0,2 ml:aan 1 M sorbitolia.

5

Erilaisia määriä sijoitettiin suotimille, jotka asetettiin osmoottisesti stabiloitujen (1 M sorbitoli) YePD-agarmaljojen pinnalle regeneraation aikaansaamiseksi. Erilaisia regenerointiaikoja käytettiin, esim. 4 ja 24 10 tuntia, ennen suodinten siirtämistä stabiloidulle (1 M sorbitoli) valikoivalle YePD-agaralustalle.

Plasmideja, jotka pohjautuivat PTZ 18/19 -perusrakenteeseen, käytettiin transformoitaessa Phaffia rhodozvma 15 -kannan CBS 6938 johdannainen (PF 11-12 saatuna klassisella mutatoinnilla). Plasmideissa läsnäolevia, ilmaistavia reportterigeenejä on käytetty menestyksellä transformaatio- ja valintatutkimuksissa monessa eri organismissa. Keksinnön mukaisesti käytettiin kanamysiini (G418) -gee-20 nejä transposoneista Tn 5 ja Tn 903, hygromysiinigeeniä E. colista ja fleomysiinigeeniä S. hindustanuksesta.

Reportterigeenit kloonattiin Phaffialle heterologisten promoottorisekvenssien alapuolelle, esim. S. cerevisiaen 25 ADH 1-, GPDH- ja TEF la -promoottoreiden, SV40-promootto- ♦ » · ,!. rin, E. colin kanamvsiinipromoottorin Tn 903:sta. P.

i » * I,[ chrysoqenumin PGK-promoottorin ja A. nidulansin GAPDH- t · · • ·’ promoottorin alapuolelle. Plasmidit eristettiin ja puh- ' distettiin Qiagentni-menetelmän mukaan, jota toimittaa 30 Stratagenetm.

: : : Transformaatiokokeet Phaffiällä suoritettiin eri DNA- ·' ; näytteillä, so. CsCl-puhdistetun DNA:n CCC-muoto, Sacl:- llä lineaariseksi tehty DNA ja kooste olemassa olevista I * 35 CCC-muotoisista plasmideista puhdistettuna Qiagen-kolon-'/! neilla. Olemassa olevat plasmidit sisälsivät heterologis- i · 21 113785 ten promoottorisekvenssien erilaisia yhdistelmiä fleomysiinigeenin kanssa (taulukko 1).

5 plasmidi merkkigeeni promoottori promoottori- lähde pDD 08 fleomysiini IPNS Penicillium pAN 8-1 GPD Aspergillus pUT 771 ? Trichoderma pRB 03 PGK Penicillium 10 pUT 332 TEF-Ια Saccharomvces pTZHyg B hygromysiini GAPDH Saccharomvces pAN 7-1 B GAPDH Aspergillus pUC G418 genetisiini ADH 1 Saccharomvces pCR 1 (G418) Tn 903 E. coli 15 pSV 2 SV 40 SV 40 -virus

Taulukko 1. Yhteenveto olemassa olevista plasmideista, joita käytettiin protoplastien transformaatiokokeissa.

20 Ensimmäiset kokeet näillä plasmideilla, joissa käytettiin ·'**; kaksikerrosmaljoja valikointiin, 30 minuutin protoplasti- muodostusaikoja ja esitettyjä kantoja, eivät tuoneet ilmi selvää eroa pesäkeluvuissa kontrollimaljojen ja transfor-maatiomaljojen välillä (tuloksia ei esitetty), ja joiden-25 kin potentiaalisten transformanttien analysoinnin jälkeen transformaatiota ei kyetty osoittamaan.

*··; Yksikään edellä mainituista transformaatiokokeista ei *.' ‘ johtanut pesäkkeisiin, jotka ovat resistenttejä G418:lle, 30 hygromysiinille tai fleomysiinille. Voitiin päätellä, että (ilmaistavia) transformantteja ei oltu saatu.

9 i

t t I

9 t I « I · 22 113785 Tämä innosti uuteen lähestymiseen, joka perustui Phaf-fiälle homologisen promoottorin (ja muiden ilmentymistä säätelevien sekvenssien) käyttöön.

5 Esimerkki 3

Hvbridisointi geenien ilmaisemiseksi Phaffia rhodozvmasta

Phaffia rhodozyma -soluja (kanta CBS 6938) viljeltiin 100 ml:ssa alustaa, joka sisälsi 2 % (paino/tilavuus) glukoo-10 siä, 1 % (paino/tilavuus) hiivauutetta ja 2 % (paino/tilavuus) bacto-peptonia (YePD) 20°C:ssa. Solut kerättiin talteen 3 päivän kuluttua (OD600 = ± 5) sentrifugoimalla. Pelletti suspendoitiin uudestaan 20 ml:aan hajotuspusku-ria (60 mM EDTA, 1,2 M sorbitoli, 100 mM Na-sitraatti pH 15 7,0) ja Novozymetm 234:ää lisättiin loppupitoisuuteen 2 mg/ml. Seosta inkuboitiin 30°C:ssa suunnilleen 3 tunnin ajan, jona aikana protoplastien muodostuminen varmistettiin mikroskooppisen tarkastelun avulla. Protoplastit kerättiin talteen sentrifugoimalla 5 minuutin ajan no-20 peudessa 4000 rpm (Heraeus, Minifuge RF) ja pelletti suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan 50 mM Tris-HCl:a pH 7,0; 20 mM EDTA:a. Sen jälkeen lisättiin SDS:ää loppupitoisuuteen 1 %. Soluhajotuksen ja sitä seuraavan nelinkertaisen , laimentamisen jälkeen TE-puskuriin suoritettiin useita i * 25 fenoli/kloroformiuuttoja. DNA saostettiin 0,1 tilavuus- i · .! , osalla 3 M NaAc:a ja 2 tilavuusosalla kylmää etanolia.

i · / j DNA otettiin talteen pyörittämällä siirrostusneulan ympä- l k * • rille ja liuotettiin 4 ml:aan H20:ta. RNaasi-käsittelyn i * * ’·’ ' jälkeen liuos uutettiin useita kertoja fenoli/klorofor- 30 millä. DNA saostettiin jälleen 3 M NaAc:n ja etanolin * avulla ja liuotettiin 3 ml:aan H20:ta.

< i » I ( » ; Kromosomaalista DNA:ta eristettiin eri lajeista; K. lac- * s i !,/ tiksesta ja S. cerevisiaesta (Cryer et ai. (1975) Methods 35 in Cell Biology 12.:39, Prescott, D.M. (edit.) Academic

1 I

' ’ > Press, New York), Penici 11 jumista (Bainbridge et ai.

/ I (1990) FEMS Microbiol. 66:113-118) ja Phaffia rhodozymas- 23 113785 ta CBS 6398 kuten edellä on kuvailtu. Eristetty DNA pilkottiin Hindlll:11a. DNA-fragmentit erotettiin 0,7 %:-isella agaroosigelillä ja blotattiin nitroselluloosasuo-timelle. Blotit hybridisoitiin liuoksessa 6 x SSC, 0,1 % 5 SDS, 5 x Denhardtin liuos, 100 pg/ml sillin sperman DNA, 50°C: ssa.

Seuraavia koettimia käytettiin erillisissä blottauksissa; 10 - ribosomaalinen DNA

K. lactiksen 1,7 ke Clal DNA -fragmentti (18S) pG7-rDNA#4:stä (Maleszka ja Clark-Walker. 1990. Nucl. Acids Res. 18:1889).

15 - TPI-geeni (trioosifosfaatti-isomeraasi) K. lactiksen 800 ep PCR-fragmentti (oligot: 2192-2193,

Sekvenssi 1 ja 2) - Klef-geeni (K. lactiksen pidennystekijä) 20 K. lactiksen 250 ep EcoRI-PvuII DNA -fragmentti pTZ18RKlef:sta (jäljempänä) - PGK-geeni (fosfoglyseraattikinaasi) S. cerevisiaen 3 ke Hindlll DNA -fragmentti PGK-2:sta ... 25 (Hitzeman et ai-. 1982. Nucl. Acids Res. 10:7791-7808).

24 113785

pYEF46 (Nagata, S. et al. 1984. EMBO J. 3:1825-1830). EF

K. lactlksesta havaittiin 3,5 ke insertissä pUC13:ssa, kloonissa pKLEF52. 359 ep Hpal-EcoRI -fragmentti KLEF:n kooditusalueesta pKLEF52:sta kloonattiin pTZ18R:n Hindlll 5 (täytettyyn) - EcoRI -kohtaan, mikä johti pTZ18RKlef: iin, josta saatua 250 ep EcoRI-PvuII DNA -fragmenttia käytettiin koettimena.

K. lactiksen aktiinin 200 ep PCR DNA -fragmentti synte-10 tisoitiin oligonukleotidien avulla perustuen K. lactik-sesta julkaistuun aktiinigeenisekvenssiin (Deshler, J.O., Garrett, P.L. ja Rossi, J.J. (1989), Kluyveromyces lactis maintains Saccharomyces cerevisiae intron-encoded splicing signals. Mol. Cell. Biol. 19.:2208-2213). Ak-15 tiinioligonukleotidit vastaavat spesifisesti K. lactiksen julkaistun sekvenssin emäspareja 830-847 ja 1011-1030.

DNA-fragmentit leimattiin 32P:llä sattumanvaraisen syn-teesialoituksen yhteydessä. Koettimia käytettiin erilli-20 sissä blottauksissa. Useita hybridisaatio- ja pesulämpö-tiloja käytettiin, mikä johti erilaisiin signaaleihin filmeillä riippuen käytetystä koettimesta.

Yli yön kestäneen hybridisaation jälkeen blottaukset pes-·;·, 25 tiin 3 x SSCrllä huoneen lämpötilassa. Autoradiografeja .1 . valotettiin 3 päivän ajan 2:n vahvistusvarjostimen avulla ). ; -80°C:ssa.

*·' " Ainoa voimakas hybridisaatiosignaali filmillä valotuksen 30 jälkeen havaittiin, kun ribosomaalista 1,7 ke DNA-frag-.,!** menttia käytettiin koettimena.

.·, ·, Koettimet (TPI, Klef ja PGK) eivät tuottaneet hybridisaa- tiosignaalia Phaf f iän DNA:n kanssa ei-tiukan hybridisaa-35 tion (3xSSC, 5xDenhardtin liuos, 0,1 % SDS, 100 pg/ml » » sillin sperman DNA huoneen lämpötilassa) ja pesun jälkeen :>(t.‘ (lxSSC, 0,1 % SDS huoneen lämpötilassa).

25 113785

Filmit osoittivat, että K. lactiksen 200 ep aktiinisek-venssi tuotti heikon spesifisen signaalin kaistalla, jolla oli Phaffian kromosomaalinen DNA. Blotti, joka hybri-disoitui aktiinigeenifragmentin kanssa, osoitti seuraavat 5 vyöhykkeet vähenevässä voimakkuusjärjestyksessä. K. lactiksen otaksuttu 1,3 ke aktiinivyöhyke, S. cerevisiaen >10 ke vyöhyke, Phaffiän 7-8 ke vyöhyke, Penicilliumin 6 ke vyöhyke. Voimakkuuksiltaan erilaisia vyöhykkeitä saatiin, minkä voidaan katsoa johtuvan eroavuuksista ident-10 tisyydessä K. lactiksen aktiinikoettimen kanssa.

PCR-tekniikkaa käyttämällä yritettiin valmistaa 100 %:-isesti homologinen koetin. Oligonukleotidejä, jotka pohjautuivat säilyneisiin alueisiin GAPDH-geenissä, TPI-gee-15 nissä ja aktiinigeenissä, käytettiin PCR-fragmentin syn-tetisoimiseen Phaffiän kromosomaalinen DNA templaattina.

Mikään oligoasetelmista ei synnyttänyt DNA-fragmenttia, joka hybridisoitui spesifisesti.

20

Esimerkki 4

Phaffian ribosomaalisen DNA-fragmentin kloonaus . Ribosomaalista DNA: ta käytetään usein integraatiokohtana 25 transformaation jälkeen (Szostak, J.W. ja R. Wu (1979).

;· . Plasmid 2:536, ja Lopes et ai. (1989) Gene 79:199-206).

! Siitä johtuen päätettiin kloonata hybridisoituva ri- • · * bosomaalinen DNA-f ragmentti . Southern blottaus suoritet-·' * tiin Phaffian DNA:n kanssa, joka oli pilkottu usealla 30 restriktioentsyymillä.

:t·' · Sacl: llä pilkottu kromosomaalinen DNA tuotti hybridisaa- ,·. : tiosignaalin DNA-fragmentista, jonka pituus oli + 3 ke, käytettäessä K. lactiksen rDNArta koettimena. Sacl:llä "* 35 pilkottu kromosomaalinen DNA-fraktio ligoitiin Sacl:llä pilkotun pUCG418:n kanssa. Ligaatioseos transformoitiin kompetentteihin E. coli JM109 -soluihin. Useita Phaffian 26 113785 ribosomaalisia DNA-inserttejä sisältäviä pUCG418-plasmi-deja voitiin havaita transformanttien pesäkehybridisaati-on jälkeen käyttäen 1,7 ke Clal ribosomaalista DNA-frag-menttia K. lactiksesta koettimena. Plasmidia pUCG418, 5 joka sisältää 3 ke insertin ribosomaalista Phaffiän DNA:-ta, nimitetään tunnuksella pGB-Phll.

Esimerkki 5

Aktiiniqeenin kloonaus Phaffiasta 10

Phaffia rhodozyma -kannasta CBS 6938 eristetty kro-mosomaalinen DNA pilkottiin usealla restriktioentsyymil-lä. DNA-fragmentit erotettiin, blotattiin ja hybridisoi-tiin kuten edellä on kuvailtu. Autoradiografi valotettiin 15 16 tunnin ajan -80°C:ssa 2:11a varjostimella. Filmissä esiintyi eri pituisia DNA-fragmentteja pilkottuina eri restriktioentsyymeillä, jotka hybridisoituvat K. lactik-sen aktiinigeenin 200 ep PCR-fragmentin kanssa.

20 EcoRI:llä ja Sali:lä pilkottu kromosomaalinen DNA tuotti hybridisaatiosignaalin DNA-fragmentista, jonka pituus oli 3,8 ke.

3,5-4,5 ke kromosomaalinen DNA-fraktio, joka oli pilkottu 25 EcoRI: llä ja Sali: llä. eristettiin 0,7 %:isesta aga- ;· . roosigeelistä ja ligoitiin EcoRI-SalI:llä pilkotun • · !. ! pTZl8R:n kanssa. Ligaatioseos transformoitiin kompetent- ><t· teihin E. coli JMl09-soluihin. Solut maljattiin LC+-aga- *·’ * rille, joka sisälsi 100 pg amp:ia ja 0,1 mM IPTGrtä, 50 30 pg/ml X-gal:ia. Kaksi rinnakkaista suodinta valkoisista pesäkkeistä preparoitiin ja seulottiin K. lactiksen ak-*·,· : tiinigeenin 200 ep fragmentin kanssa käyttäen samanlaisia .·, ; hybridisaatio- ja pesuolosuhteita kuin Southern blot -hybridisaatioissa.

35

Useita positiivisia pesäkkeitä voitiin havaita. Yhden !(t>: kloonin pTZ18R:ssa sisältämä insertti sekvensoitiin osit- 27 113785 tain. Yhden klooneista havaittiin sisältävän osan Phaffia rhodozyman aktiinigeenistä perustuen sekvenssivertailuun tunnettujen aktiinigeenien kanssa. pTZ18R-kloonia, joka sisältää 3,8 ke Phaffia-insertin, nimitetään tunnuksella 5 pGB-Phl, insertin sekvenssi esitetään Sekvenssiluettelos-sa (Sekvenssi 13, jossa Sali-kohta alkaa paikasta 587 ja EcoRI-kohta paikasta 4315). 3,8 ke EcoRI-Sall -fragmentti, kloonattuna plasmidissa pTZ18R E. colissa JM109, talletettiin the Centraal Bureau voor de Schimmelcultures’-10 iin Baarnissa Hollannissa 5. lokakuuta 1992, talletusnu-merolla CBS 442.92

Kloonattu sekvenssi ei sisältänyt aktiinigeenin 5'-osaa eikä sen promoottoria, jonka osoitti DNA-sekvenssin ver-15 taaminen tunnettuihin aktiinigeenisekvensseihin (Deshler et ai. 1989. Mol. Cell. Biol. 9:2208-2213, ja NG, R. ja J. Abelson, 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77:3912-3916). Sen vuoksi päätettiin poimia ja kloonata toinen DNA-fragmentti geenikloonin, aktiinipromoottorikloonin, 20 5'-päästä.

Esimerkki 6 •\ Phaffiän aktiinipromoottorin kloonaus käänteis-PCR:n .·;. avulla 25 * % *

. Phaf f ia rhodozyman (kanta CBS 6938) kromosomaalinen DNA

* * I.! pilkottiin XhoI:llä. 100 ng:n määrä kromosomaalista ko- 1 · t konais-DNA:ta x XhoI ligoitiin 50 μ1:η tilavuudessa 1,9 '·’ U:n kanssa T4-ligaasia (BRL) ligaatiopuskurissa (BRL).

30 Ligaatioseos väkevöitiin etanolisaostuksella ja DNA liuo- ,,0’ tettiin 10 pl:aan H20:ta.

: Xhol-pilkonta valittiin perustuen tietoihin Phaffian kloonatun aktiinigeenin restriktiokartasta ja pilkotun 35 kromosomaalisen DNA:n hybridisaatiotutkimuksista (kuvio v-j i)· * * > « 28 113785

Xhol:llä pilkotusta DNA:sta, hybridisoituna aktiinikloo-nin 500 ep Sall-BamHI -fragmentin kanssa, oli tuloksena 3,1 ke hybridisoituva vyöhyke. 3,1 ke Xhol-vyöhyke sisältää tunnetun 1,4 ke Sall-XhoI -fragmentin ja 1,7 ke frag-5 mentin Sali-kohdan vieressä 5’-puolella. Oligot suunniteltiin perustuen tunnettuun sekvenssiin, toinen 60 ep Sali-kohdan alapuolella ja toinen 60 ep Xhol-kohdan yläpuolella (kuvio 2).

10 Phaffian DNA pilkottiin Xhol:llä, uutettiin fenolilla, saostettiin EtOH:lla ja liuotettiin pitoisuuteen 50 mg/ml. Kaikkiaan < 100 ng 50 pl:ssa ligoitiin yli viikonlopun 14°C:ssa ja käytettiin lähtöaineena PCR-reaktioihin.

15 Käänteisessä PCR:ssä (polymeraasiketjureaktio) käytettiin 10-40 ng Xhol:llä pilkottua ja ligoitua kromosomaalista DNA:ta ja 0,5 pg kutakin oligoa (n:o 3390, 3391, Sekvenssit 5 ja 6). PCR suoritettiin kuten edellä on kuvailtu, PCR-olosuhteiden ollessa 2 min. 94°C, 2 min. 55°C, 3 min. 20 72°C, 25:ssä jaksossa, ja toinen pidennysvaihe 7 min. ajan 72°C: ssa.

' Pituudeltaan odotettu 1,8 ke PCR-tuote havaittiin. DNA

.eristettiin geeliytymispisteeltään alhaisesta agaroosi-

25 geelistä Magic PCR prep -pakkauksen avulla (Promega). DNA

.! . pilkottiin Sali:llä ja Xhol:llä ja liitettiin pTZl8R:n I.; Sali-kohtaan. Ligaatioseos transformoitiin kompetenttei- < · * *’ hin E. coli JM109 -soluihin. Kompetenttien solujen prepa- ♦ · * *·’ ’ rointi suoritettiin DMSO-menetelmällä ja solut maljättiin

30 LC*-maljoille, jotka sisälsivät 100 pg amp:ia ja 0,1 mM

IPTG:tä/50 pg/ml X-gal:ia. Plasmidi-DNA eristettiin vai- • I ( : ; : korsista pesäkkeistä ja insertit kartoitettiin restrik- ; tioanalyysin avulla. Aktiinipromoottorifragmentin sisäl- * I t tävä klooni pGB-Ph2 sekvensoitiin osittain (Sekvenssi-35 luettelo, Sekvenssi 13, alusta Sali-kohtaan paikassa 587).

t * 29 113785

Aktiinigeeni ja -promoottori kloonattiin kahdessa fragmentissa. Aktiinipromoottorifragmentti päättyy Sali-kohtaan ja aktiinigeenifragmentti alkaa Sali-kohdasta. Koska tämän Sali-kohdan viereisiä sekvenssejä ei kloonattu, ei 5 oltu varmoja, että Sali-kohtia oli vain yksi. On mahdollista, että Sali-kohtia on kaksi tai useampia lyhyessä sekvenssipalassa. Sen varmistamiseksi, että näin ei ole asianlaita, Sali;n viereiset alueet kloonattiin suorittamalla PCR kromosomaalisella DNA:11a. Kahta oligoa (n:o 10 3457, 3475, Sekvenssit 7 ja 8) käytettiin, jotka monisti vat 660 ep kromosomaalisen DNA-fragmentin (kuvio 2). Tämä PCR-tuote kloonattiin tasapäisenä pTZ18R:n Smal-kohdassa ja sekvensoitiin. Sekvenssi osoitti, että on vain yksi Sali-kohta, ja että promoottori- ja geeniklooni sopivat 15 yhteen täydellisesti.

Esimerkki 7

Aktiiniqeenin karakterisointi 1

Aktiinipromoottori ja -geeni ovat läsnä kloonatussa Phaf-fiän 5,6 ke DNA-sekvenssissä. Perustuen homologiaan K. lactiksen ja S. cerevisiaen aktiinisekvenssien kanssa • · (Deshler et a_l. 1989. Mol. Cell. Biol. £:2208-2213, ja NG, R. ja J. Abelson 1980. Proc. Natl. Acad. Sei. USA.

,, 25 £7:3912-3916) ja tunnettuun silmukointikohdan konsensus- **' * sekvenssiin (Rambosek, J. ja J. Leach, 1987. Crit. Rev.

! Biotechnol. 6:357-359, ja J.L. Woolford, 1989. Yeast » * * I 5:439-457), intronit ja mahdollinen ATG-aloituskohta pää- V * teltiin.

30 ··· Näiden olettamusten varmistamiseksi 5'-pään alukepiden- nyskoe (kokeellinen osa) suoritettiin Phaf f iän RNA:lla / t 32P-leimatun oligon n:o 3457 kanssa (Sekvenssi 7) ja S.

* ' cerevisiaen RNA:11a aktiinioligon n:o 3538 kanssa (Sek- ’ 35 venssi 10) positiivisena kontrollina. Alukepidennystuot- : teet analysoitiin sekvensointigeelillä lähinnä tunnettua , ’", sekvenssiä. Tunnetun sekvenssin pituuden perusteella alu- 30 113785 kepidennystuotteiden pituus voidaan laskea. S. cere-visiaen positiivisen kontrollin pituudeksi todettiin 185 ep ATG:n edessä. Pituus 140 + 30 ep on kuvailtu (Ng ja Abelson, sit. edellä), joka on samalla alueella. Phaffia-5 aktiinin RNA-ohjaussekvenssi ATG:n etupuolella käsitti noin + 115 ep.

Huolellisen DNA-analyysin avulla havaittiin oletettu ATG-aloituskodoni. Tämä oletettu oikea ATG tarkistettiin 10 PCR:n avulla. Useita oligoja suunniteltiin, jotka sijaitsivat introneissa ja eksoneissa otaksutun ATG:n alueilla. PCR suoritettiin normaalin PCR-ohjeiston avulla Phaffiästä eristetyllä RNA:11a. Tuloksena saatiin eripituiset DNA-vyöhykkeet (taulukko 2).

15 oli- templaat- PCR-vyö- templaat- PCR-vyö- gonumerot ti DNA hyke ti RNA hyke (ep) (ep) 3457-3500 820 kyllä ? ei 3457-3475 640 kyllä +220 ei 20 3457-3619 611 kyllä 176 kyllä ' t : 3457-3618 539 kyllä 104 kyllä • ? t H 1111 -..-.-Jl——.1 I . I» ill.—.... I· Il· Il n ,1 ί / Taulukko 2. PCR-kokeiden tulokset Phaffia-aktiinin ATG- I « r j '/ aloituskohdan identifioimiseksi.

;T: 25 f

Oligoasetelma 3457-3500 (Sekvenssit 7 ja 9), joka sijait-si oletetussa intronissa, ei tuottanut PCR-vyöhykettä RNA ,-;, templaattina. Oligoasetelma 3457-3475 (Sekvenssit 7 ja 8) ' kykeni pariutumaan cDNA:han RNA-ohjaussekvenssin pituuden i * * 30 mukaan ( 5 '-alukepidennys) mutta ei tuottanut PCR-vyöhy-kettä RNA templaattina. Eksonisekvenssin perusteella : suunnitellut oligot 3618 ja 3619 (Sekvenssit 11 ja 12) ,···, pariutuvat sekä DNA että RNA templaattina.

I I I

31 113785

Aktiinigeeni sisältää 4 intronia (kuvio 3) ja sen pituus on 375 aminohappoa (emäsparit ja aminohapposekvenssi Sekvensseissä 13 ja 14), tämän poiketessa selvästi K. lac-tiksen ja S. cerevisiaen aktiinigeeneistä, joissa on vain 5 1 introni, ja jotka sisältävät 375 aminohappoa ja vastaa vasti 374 aminohappoa.

Homologia K. lactiksen aktiinin kanssa on 85 % proteiinitasolla mutta 3'-kohta on vähemmän homologinen kuin 10 5'-kohta, jossa vain 5 aminohappoa sadasta ensimmäisestä aminohaposta eroavat toisistaan.

Esimerkki 8

Plasmidikonstruoinnit käyttäen aktiinipromoottoria 15

Ongelmien välttämiseksi optimaalisten rakenteiden valmistuksessa, joissa on tarkka yhteys promoottorisekvenssien ja merkkigeeni(e)n välillä, ja Phaffiän lopetussignaalien kloonauksessa, päätettiin konstruoida fuusiogeenejä. Kir-20 jallisuudessa sellaisia rakenteita on kuvailtu G418:n osalta (Chen, X.J. ja H. Fukuhara. 1988. Gene 69., 181-192) ja IacZ-geenin ja fleomysiinigeenin välillä (Baron •.· et ai. 1992, Gene 114:239-243). Nämä fuusiot ilmensivät merkkigeenin hyvin tehokkaasti.

.1:·! 25 ,| . Merkkiqeenien kloonaus » * ·

Plasmidi pGB-Phl pilkottiin BamHI:llä tai XhoI:llä, lai-

• M

V · mennettiin ja ligoitiin plasmidien aikaansaamiseksi, 30 joissa on erilaisia deleetioita rakenteellisessa ak-.1· tiinigeenissä. Tästä oli tuloksena plasmidi pGB-Ph3, jos- sa on 3246 ep BamHI-deleetio ja plasmidi pGB-Ph4, jossa . on 2048 ep XhoI-deleetio aktiinigeenin rakenteellisissa ja 3 '-pään ei-koodittavissa sekvensseissä (kloonauskaavi-35 ot kuvioissa 4 ja 5).

32 113785

Plasmideja pUCG418 ja pUT701 käytettiin luovuttajaplasmi-deina 1,1 ke G418 BamHI-fragmentin ja vastaavasti 0,9 ke fleo BamHI-Bglll -fragmentin osalta. Fragmentit eristettiin elektroforeesin ja agaraasikäsittelyn avulla kuten 5 kokeellisessa jaksossa on kuvailtu.

Plasmidit pGB-Ph3 ja pGB-Ph4 pilkottiin BamHI:llä ja vastaavasti Bglll;11a, jotka ovat tunnusomaisia näissä plas-mideissa.

10

Fleo-fragmentti (mukaanlukien sen oma ATG-aloituskodoni) liitettiin aktiinin rakennegeenin BamHI-kohtaan paikassa 472 pGB-Ph3:ssa, ja G418-fragmentti (mukaanlukien sen oma ATG-aloituskodoni) liitettiin aktiinin rakennegeenin 15 BqlII-kohtaan paikassa 934 pGB-Ph4:ssä. E. coliin trans-formoinnin jälkeen kiinnostuksen kohteena olevan plasmi-din sisältävät pesäkkeet seulottiin hybridisaation avulla . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Restriktioanalyysit ilmaisivat odotetut plasmidit pGB-Ph5 2 (G418) ja pGB-Ph6 (fleo). Sekvensointi varmisti, että 3 fuusiot olivat oikeita.

4 « · 5

Aktiinipromoottorin kloonaus fuusiorakenteiden eteen 6 7

Plasmidi pGB-Ph2, joka sisälsi aktiinipromoottorin ja lisäksi yläpuolisia sekvenssejä, ja plasmidi pGB-Ph5, 8 joka sisälsi aktiini-G418 -fuusion, pilkottiin kumpikin 9 i : : 10 * Hindlll:11a ja Sali:llä. Kiinnostavat fragmentit, so. 1,8 11 ke aktiinipromoottorifragmentti ja 5,2 ke fuusio-runko- fragmentti eristettiin kuten on kuvailtu ja ligoitiin.

12 V ·’ Tästä oli tuloksena plasmidi pGB-Ph7 (kuvio 5).

13 * · » 14 • * 15 ,···, E. coli -transformanteista eristetty DNA sisälsi odotetun 16 pituisen plasmidin. Restriktioanalyysi Hindlll x Sali:-*V': 11a, BamHI: llä ja EcoRV: llä varmisti, että saatu plasmidi oli oikea.

33 113785

Fleo-rakenteen saamiseksi kumpikin plasmideista pGB-Ph2 ja pGB-Ph6 pilkottiin EcoRI:llä ja Sali:llä ja fragmentit, so. 1,4 ke fuusiofragmentti ja 4,6 ke promoottori-runkofragmentti, eristettiin ja ligoitiin. Transformoin-5 nin jälkeen E. coliin DNA eristettiin sattumanvaraisesti valituista pesäkkeistä ja analysoitiin pilkkomalla rest-riktioentsyymeillä. Tällä tavalla identifioitiin plasmidi pGB-Ph8 (kuvio 4).

10 P. rhodozyman 3 ke Sacl rDNA -fragmentin uudelleen- kloonaus

Jotta saataisiin plasmideja, jotka sisältävät muita Phaf-fia-sekvenssejä, 3 ke Sacl rDNA -fragmentti kloonattiin, 15 josta oli tuloksena plasmidi pGB-Phll kuten edellä kuvailtiin .

Tästä plasmidista eristettiin uudelleen rDNA-fragmentti ja liitettiin pGB-Ph7:n ja 8:n Sacl-hydrolysaatteihin.

20 Transformoinnin jälkeen E. coliin plasmidit pGB-Ph9 ja 10 eristettiin. Plasmidien pGB-Ph7 - 10 restriktiokartat kuvioissa 4 ja 5. (pGB-Ph9:n sisältävä E. coli talletettiin the Centraal Bureau voor de Schimmelcultures'iin ♦ ·

Baarnissa, Hollannissa 23. kesäkuuta 1993, talletusnume- 25 rolla CBS 359.93).

! Esimerkki 9 • ·

Transformaatiokokeita käyttäen Phaffian aktiinigeeniä ’·’ yhdistettynä fleo-resistenssimarkkeriin 30

Kuten taulukosta 3 voidaan havaita, transformantteja · kyettiin saamaan aikaan hyvin alhaisella esiintymisti- ,·. : heydellä sillä toteutustavalla, jossa käytettiin Phaffian λ/ aktiinigeeniä yhdistettynä fleo-markkeriin. Transformaa- 35 tio suoritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvailtu seuraa-·.**: vin muunnoksin.

34 113785 - 0,7 M KC1 - 10 mM sitruunahappo pH 6,2 korvattiin 1 M sorbitolilla, - inkubointiaika Novozym 234:n kanssa oli 10 - 20 mi-5 nuuttia, - plasmidit tehtiin lineaarisiksi ennen transformointia, - ennen maljausta protoplastit suspendoitiin uudelleen 10 0,5 ml:aan YePDS-alustaa ja inkuboitiin 1-2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Protoplastit laimennettiin 5 ml:aan 0,7 %:ista alhaisessa lämpötilassa geeliytyvää agaroosia/ 1 M sorbitolia (pi-15 detty 37°C:ssa) ja kaadettiin välittömästi osmoottisesti stabiloiduille (1 M sorbitoli) valikoiville agarmaljoil-le.

Protoplastit maljättiin vaihtoehtoisesti kaksikerrosmal-20 jojen pinnalle, so. 15 ml YEPD-alusagaria, joka sisältää valikoivan määrän tarvittavaa antibioottia ja 1 M sorbitolia + jähmettymisen jälkeen 15 ml YEPD-agaria, joka , ',· sisältää 1 M sorbitolia ilman antibioottia. 1 i :

Keksinnön mukaisesti käytettiin myös lyhempää protoplas-tien muodostamis jaksoa, joka lisäsi regeneraatiota + 0,5 %:sta 5-10 %:tiin. Transformaation todentamiseksi ko-konais-DNA:ta eristettiin (kuten on kuvailtu) useista transformanteista viidestä itsenäisestä transformaatioko-. 30 keesta, kasvatettuna valikoivissa olosuhteissa, so. YEPD- ·;;· :ssä + 0,1-0,2 pg fleomysiiniä/ml.

35 113785 DNA Koe 1 Koe 2 Koe 3 Koe 4 Koe 5* pGB-Ph8 ccc 19 6 1 5 e.t.

pGB-Ph8xSacI 7 0 0 e.t. 1 5 pGB-PhlO ccc e.t. e.t. e.t. 9 e.t.

0 0 0 0 0

Taulukko 3. Transformanttien lukumäärä eri transformaa-tiokokeissa 4-5 päivän inkuboinnin jälkeen valikoivilla 10 agarmaljoilla (1 pg fleomysiiniä/ml).

-- = DNA:ta ei lisätty, e.t. = ei tehty, * = protoplaste-ja ei kaadettu agaroosiin ja valikoitu 5 pg/ml fleossa kaksikerrosagarmalj oilla.

15

Kromosomaalinen DNA pilkottiin sekä BamHI:llä että Eco-RI:llä ja yli yön kestäneen elektroforesoinnin jälkeen blotattiin nitroselluloosalle ja hybridisoitiin kolmen eri koettimen kanssa, so. pTZl8R, 430 ep BamHI-StuI - • .· 20 fleofragmentti ja 1,8 ke BamHI-Sall -aktiinipromoottori- fragmentti. Kuten kuviosta 6 voidaan havaita, kolme tut-kituista DNA-näytteistä antaa spesifisen signaalin pTZ18R-koettimen kanssa ja ainakin yksi DNA antaa selvän ·' ·* signaalin fleo-koettimen kanssa. Aktiinikoettimella saa- • ·* 25 daan odotettu 2,2 ke vyöhyke ja joitakin muita selittä- V mättömiä vyöhykkeitä.

*:* Esimerkki 10 :‘‘: Phaffian kokonais-DNA:n transformointi transformanteista , 30 E. coliin l·;·* E. coli JM109 transformoitiin kokonais-DNA-eristyksistä joistakin esimerkin 9 mukaisista transformanteista.

:Transformantteja havaittiin yllättäen E. colissa joiden- 36 113785 kin DNA-näytteiden kohdalla. Yhdessä tapauksessa saatiin transformantteja E. colissa kokonais-DNA -valmisteen kanssa, jossa ei esiinny hybridisaatiosignaalia pTZ18R:n ja fleomysiinin suhteen. Plasmidi-DNA:t eristettiin Qia-5 gen-menetelmällä ja analysoitiin restriktion ja hybri-disaation avulla.

Tulokset osoittavat, että eristetyt plasmidit olivat uudelleenjärjestelyjä. Kahdessa tapauksessa kolmesta plas-10 midi sisälsi enemmän (samoja) aktiinifragmentteja ja oli vailla fleomysiinisekvenssiä.

Kokonaispituus oli 11 ke, joka on + 5 ke pitempi kuin plasmidi, jota käytettiin transformaatioon. Kolmas plas-15 midi ei enää sisältänyt fleomysiini- eikä aktiinisek-venssejä ja oli 1 ke pienempi.

Voidaan päätellä, että fleo-plasmidit ovat rakenteellisesti pysymättömiä, jotka transformoitiin Phaffiaan.

20

Esimerkki 11

Phaffian transformointi aktiini-G418 -fuusiorakenteilla . käyttäen litiummenetelmää lineaariseksi tehtyjen plasmi- '.* · dien kanssa 25 : ‘ : Useita transformaatiokokeita suoritettiin käyttäen LiCl- menetelmää siten kuin sitä käytetään transformoitaessa S. cerevisiae ja K. lactis (kokeellinen osa). Käytetty rakenne oli pGB-Ph7, joka oli tehty lineaariseksi EcoRV:llä 30 promoottorisekvenssin alueella (kuvio 6).

Linearisointi suoritettiin promoottorisekvenssissä integ-*./.j roitumisen mahdollistamiseksi aktiinilokuksessa Phaffian i genomissa. Transformoinnin jälkeen solut maljattiin YEPD- . 35 maljoille, jotka sisälsivät G418:a. Vakiomenetelmällä ei !,. saatu transformantteja Phaf f ia CBS 6938 -kannalla. Trans- 37 113785 formaatio suoritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvailtu seuraavin muunnoksin.

- 0,7 M KC1 - 10 mM sitruunahappo pH 6,2 korvattiin 1 M 5 sorbitolilla, - inkubointi Novozym 234:n kanssa kesti 10-20 minuuttia, - plasmidit tehtiin lineaarisiksi ennen transformointia, 10 - ennen maljaarnista protoplastit suspendoitiin uudelleen 0,5 mitään YePDS-alustaa ja inkuboitiin 1-2 tuntia huoneen lämpötilassa, 15 - hygromysiiniä ei käytetty valintamarkkerina.

Protoplastit laimennettiin 5 ml:aan 0,7 %:ista alhaisessa lämpötilassa geeliytyvää agaroosia/ 1 M sorbitolia (pidetty 37°C:ssa) ja kaadettiin välittömästi osmoottisesti 20 stabiloiduille (1 M sorbitoli) valikoiville agarmaljoil-le.

Protoplastit maljattiin vaihtoehtoisesti kaksikerrosmal-" jojen pinnalle, so. 15 ml YEPD-alusagaria, joka sisältää '·' 25 valikoivan määrän tarvittavaa antibioottia ja 1 M sorbi- .· tolia + jähmettymisen jälkeen 15 ml YEPD-agaria, joka : V sisältää 1 M sorbitolia ilman antibioottia.

(': * :

LiAc-menetelmää (PLATE-menetelmä, kokeellinen osa) pää-30 tettiin käyttää ja vaihdella eri tekijöitä toimintaoh- jeissa; tässä ohjeistossa PEG- ja litiuminkubointi suoritetaan samanaikaisesti ja yli yön tai pitempään.

Seuraavia tekijöitä vaihdeltiin; : 35 G418-pitoisuus, solujen määrä, DNA-pitoisuus, solutiheys talteenottovaiheessa, YEPD-inkubointiaika.

38 113785

Taulukon 4 mukaiset transformaatiokokeet suoritettiin plasmidi pGB-Ph9:llä.

5 Ajo A((n=) B(OD) C(pg) D(pg- E(h) T(lu- /ml) kum. ) 1 7 0,8 0 50 0 4 2 7 0,8 10 50 2 10 3 7 0,8 0 100 2 14 4 7 0,8 10 100 2 95 10

Taulukko 4. Tulokset transformaatiokokeista käyttäen pGB-Ph9: ää ja PLATE-menetelmää. A = 10" solua/koe, B = OD600, C = DNA (plasmidi) -määrä, D = G418-pitoisuus, E = YEPD-inkubointiaika, T = transformanttien määrä.

15

Viljelmät kromosomaalisia DNA-eristyksiä varten tehtiin: 2 pesäkettä CBS 6938:sta 2 pesäkettä CBS 6938:sta ilman G418:a 2 pesäkettä ajosta 1 (on negatiivinen kontrolli) 20 10 pesäkettä ajosta 2 2 pesäkettä ajosta 3 (on negatiivinen kontrolli) ,’;*t 10 pesäkettä ajosta 4 \ Kaikki pesäkkeet kasvatettiin 20 ml:ssa YEPD-alustaa, * ·' 25 joka sisälsi 25 pg/ml G418:a (paitsi CBS 6938:n kohdal- '·* ' la). Neljän päivän kuluttua huoneen lämpötilassa jotkut pesäkkeistä eivät olleet kasvaneet tai vain vaivoin kas- « ,,*·* vaneet: * » t ; 30 3a/3b (vaivoin)/4b/4d (vaivoin)/4i (vaivoin)/4j/CBS 6938 * · · (G418 :11a ).

i ;

Kromosomaaliset DNA-eristykset preparoitiin kaikista kas-! : vaneista tai niukasti kasvaneista viljelmistä. 2e:n DNA

35 oli hajonnut. Southern blottauksia varten kaikki DNA:t 39 113785 pilkottiin BamHI;llä ja blotattiin. Tällä tavalla tehtiin kolme blottia. Ne hybridisoitiin eri koettimien kanssa. Blotti 1: PTZ-koetin (kuvio 7A)

Blotti 2: G418-koetin (kuvio 7B) 5 Blotti 3: rDNA-koetin (kuvio 7C)

Blottaustulokset esitetään kuvioissa.

PTZ-koettimen kanssa hybridisoituneen blotin (kuvio 7A) 10 tulisi transformanttien ollessa kysymyksessä ilmaista + 2,8 ke vyöhyke. Viidestätoista mahdollisesta transforman-tista 12 tuotti oikean signaalin. Muut kolme eivät antaneet signaalia lainkaan. Kolme negatiivista kontrollia eivät antaneet signaalia (CBS 6938, Ib ja 3b).

15 G418-koettimen kanssa hybridisoituneen blotin (kuvio 7B) tulisi ilmaista transformanttien ollessa kysymyksessä + 2,4 ke vyöhyke. Samat 12 kuin PTZ-koettimen kanssa tuottivat oikean vyöhykkeen. Muut 3 eivät antaneet signaalia. 20 Negatiiviset kontrollit eivät myöskään antaneet signaalia .

» • ·' Hybridisoitaessa rDNA-koettimen kanssa (kuvio 7C), 12 · DNA:ta, jotka tuottivat oikeat vyöhykkeet kahden muun ·' 25 koettimen kanssa, ilmaisivat kaikki + 8,5 ke ja + 5,2 ke ; · : vyöhykkeet. Muut kolme ja negatiiviset kontrollit il- maisevat vain + 8,5 ke vyöhykkeen kuten odotettiin.

> < « f i » ' I »

Edellä mainituissa transformaatiokokeissa käytetty plas-30 midi (pGB-Ph9) sisälsi G418-geenin Phaffian aktiinipro-moottorin ohjauksessa. Tämä plasmidi sisältää lisäksi * 1 *

Phaffiän rDNA-sekvenssin. Korkea transformanttisaanto viittaa siihen, että plasmidi ylläpidetään ekstrakro-'» ' : mosomaalisesti. Tämä viittaa siihen, että rDNA-sekvenssi ’. 35 sisältää ARS:n. Tämä vastaisi havaintoa, jonka mukaan S.

cerevisiaen rDNA-sekvenssi sisältää ARS:n.

40 113785 pGB-Ph9:llä transformoitu Phaffia rhodozvma talletettiin the Centraal Bureau voor de Schimmelcultures'iin Baarnis-sa, Hollannissa 15. toukokuuta 1993, talletusnumerolla CBS 303.93.

* i · II· * · « « * 1 * · I 1 · < · · 1 1 ! 1 1 * » 4 1 · • t 1 1 * » 41 113785

Sekvenssiluettelo (1) Yleistiedot (i) Hakija: (A) Nimi: Gist-brocadesb.v.

(B) Katuosoite: Wateringseweg 1 (C) Kaupunki: Delft (E) Maa: Hollanti

(F) Postinro: 2611 XT

(ii) Keksinnön nimitys: Pfaffia rhodozyman transfor-mointi (iii) Sekvenssien lukumäärä: i*f (2) Informaatio Sekvenssi l:lle: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 48 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB2192 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi l:lle:

. GCCTGACTCG TCGACCTCGA GTTAGTTTCT AGAGTTGATG ATATCAAC

* (2) Informaatio Sekvenssi 2: lie: <*,·, (i) Sekvenssin ominaisuudet: ' (A) Pituus: 45 emäsparia jV. (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen ' t* *’ (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) ;;; (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: ; *.i (C) Yksittäinen eristys: AB2193 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 2:lie:

V ; CCCAGTCACG TCGACATGGC TAGAACTTTC TTTGTCGGTG GTAAC

(2) Informaatio Sekvenssi 3:lie: 42 113785 (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 29 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB2557 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 3:lie:

GCGGGAATT CGGCATCACA CCTTCTACA

(2) Informaatio Sekvenssi 4:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 36 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: - f» (C) Yksittäinen eristys: AB2558 • · 'J‘. (xi ) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 4:lle:

_·* ·* CTTAAATTCT CAGGAATACA CAATACCAGT GGTTCT

» « * I * · ; «’ (2) Informaatio Sekvenssi 5:lie: t * · < < (i) Sekvenssin ominaisuudet: V · (A) Pituus: 22 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen ;· (D) Topologia: lineaarinen ·,· * (il) Molekyylityyppi: DNA (genominen) * i (iii) Hypoteettisuus: ei 1 t ’> ·' (vi) Alkuperäinen lähde: • . (C) Yksittäinen eristys: AB3390 ! ^ t (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 5:lie: s ‘ » 43 113785

CGCCATCTTC TATAACAATA CC

(2) Informaatio Sekvenssi 6:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 22 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB3391 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 6:lie:

GCATCAAGGA GAAGCTCTGC TA

(2) Informaatio Sekvenssi 7:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei • ·’ (vi ) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB3457 ·. · (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 7: lie: ACGGCTCGGG GAGCATCATC TCCGGCG ·<_ (2) Informaatio Sekvenssi 8: lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 30 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen V * (D) Topologia: lineaarinen ·, ·; (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) *;·’ (iii) Hypoteettisuus: ei • (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB 3475 44 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 8:lie: 113785 GTTACCGAAT TCCCTCTTTC TCTTCTTCCT (2) Informaatio Sekvenssi 9:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 19 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB3500 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 9:lie:

GATGGGATGG AAGATGCCT

(2) Informaatio Sekvenssi 10:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 27 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) • ·* (iii) Hypoteettisuus: ei ... (vi) Alkuperäinen lähde: · (C) Yksittäinen eristys: AB3538 \ ; (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 10:lie:

ACCGGCTTTA CACATACCAG AACCGTT

(2) Informaatio Sekvenssi 11:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 17 emäsparia ' (B) Tyyppi: nukleiinihappo . (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen ·;· (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) ’· *· (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: 45 113785 (C) Yksittäinen eristys: AB3618 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 11:lie:

ACAGTCTAGC CCACCAT

(2) Informaatio Sekvenssi 12:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 19 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) (iii) Hypoteettisuus: ei (vi) Alkuperäinen lähde: (C) Yksittäinen eristys: AB3619 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 12:lie:

GACCACCACT CACTCTTAC

(2) Informaatio Sekvenssi 13:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 4320 emäsparia (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: kaksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen • ·’ (ii) Molekyylityyppi: DNA (genominen) ... (iii) Hypoteettisuus: ei (iii) "Anti-sense" (koodittava juoste): ei * : (vi) Alkuperäinen lähde: <;_ (A) Organismi: Phaf f ia rhodozyma :·: : (B) kanta: CBS 6938 (ix) Yksityiskohta: _ '' (A) Nimi/Selitys: eksoni /;·. (B) Sijainti: 581..582 . ( ix ) Yksityiskohta: ·. ; (A) Nimi/Selitys: introni (B) Sijainti: 583..920 ; (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: eksoni ; ; (B) Sijainti: 921..942 46 113785 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: introni (B) Sijainti: 943..1040 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: eksoni (B) Sijainti: 1041..1111 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: introni (B) Sijainti: 1112..1288 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: eksoni (B) Sijainti: 1289..1357 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: introni (B) Sijainti: 1358..1428 (ix) Yksityiskohta: (A) Nimi/Selitys: eksoni (B) Sijainti: 1429..2392 (ix) Yksityiskohta:

(A) Nimi/Selitys: CDS

(B) Sijainti: liitos (581..582, 921..942, 1041..1111, 1289..1357, 1429..2392) (D) Muu informaatio: /tuote= "aktiini" 47 (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 13:lie: 113785 AGCCATCGTA KGATftCAGGT AACTAGCTAG ACACACAAGA AGAGATGTGT GCATTGATGK 60 TCCTGAGCAT AACTTAGGCG tacaagagca ttacacccta tatgtgaatg GAAGTGAGAG 120 GTGGAAGTCA GCCTCCAGAC GAGTTGTACG GTCTKATCAG GGAAGAGCTG GTCCAGAACC 180 AAATAAAATC TTACTTCCGG TOCCATATTA ACTTAGATAA AGGTATAACA TAGTATCGAT 240 TGAAATGACT CTCTCTGTGA GAAGATATGA CTGAGAGCAC ACAAGATGGG ATGGAAGATG 300 CCTCTGTGGA CTTGACTGAT GGATTAGCTG GAGGTCTAAC CGCACGGCTT AGTCAGCTAG 360 CCTTCACGTG GTTACGACTG CGATCGAATT ATATTCTAAA TTKCAGCCGT AATTTAGCCG 420 TCAACACAAC CGTCCGTGCC CAGGCCCCAT CTCTTTATTT CCCTCCTCTT TCTCTTCTTC 480 CTTCCTTCTT CCCGACCACC ACTCACTCTT ACTCTCTCTT TCTCTCAAAA CAAAACTCCC 540 gtacctcctc cacctttaaa aagaaacagt ctagcccacc at gtacgtcgac 592

Met ATCCTTTCTT tctctttctg aagtgtatgc CTGTCCTATT GTTATAGAAG ATGGCCATCG 652 GAAAGGCTCA TCGCCTCCTT TTTCTTTTTC ACTTCATCTG CGTTTCGCCT CTTTTTTTTT 712 TAAATCATCA TTTCTTCGTC TTTTTTGACA CTTGATTGTG CACTGCCCGT TTCTTTTTCT 772 CTTGCTTACG TCTTTCTCCT TCCCCGTCTT TGGATTTACC TCGGCCATCT TATAATCAAT 632 • ·' TCACTCTACC CTATTGACTG CGGCCTTATC ATCCATCCTT TTTTTTCCAT ATCGTGTGAT 892 • · · ·' GGATATGCGA tggattcttc aactctag g gat GAT GAA CTT GCC GCC CTC 942

Asp Asp Glu Vai Ala Ala Leu *.· · 5 ’ ·’ GTATGTGTTT ctaaatatct tcatgatgcg aattcgctcc ttggctcata TCCCCTTTCT 1002 : ·’ TCGTTGTCTC TTGTAATGGT TTTCTTATCA TTCATTAG GTG ATT GAT AAC GGA 1055

Vai Ile Asp Asn Gly 10 TCC GGA AT G TGC AAG GCC GGA TTC GCC GGA GAT CAT GCT CCC CGA GCC 1103 .I. Ser Gly Met Cye Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala ··- IS 20 25 ’ GTC TTC CC GTAAGTACTA GTATCGTTTC GTCGAGCTTG GTTAAATTCA 1151 , Vai Phe Pro ; ·,: 30 : : TGACAGAGCA AAAGCGATCC AAGAACATGC TTCACGTCTC AGTCTTGATA TTCCTAAAGA 1211 48 113785 CGGAGTGGCA ACTCCTTGTA TGGATGACCC AACT0C7GAT CGTACCTCTT TCTGAATTGG 1271 TTAACCAATC TTCACAG C TCC ATT GTT GGA CGA CCC CGA CAC CAG GGT GTT 1322

Ser Ile Vai Gly Arg Pro Arg Hie Gin Gly vai 35 40 ATG GTC GGT ATG GGA CAG AAG GAC TCC TAC GTT GO GTTCGTATCT 1367

Ket Vai Gly Ket Gly Gin Lye Aep Ser Tyr Vai Gly 45 50 55 TTCACATC7C TTGATGTCGT AACCGGCTCT TGTTATTAAC CTGATGTCTT CTATCCGGCA 1427 G T GAC GAG G CT CAG TCC AAG CGA GGT ATT CTT ACC CTC AAG TAC CCT 1474

Asp Glu Ala Gin 6er Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro 60 65 70 ATC GAG CAC GGA ATC GTC ACC AAT TGG GAC GAT ATG GAG AAG ATC TGG 1522

Ile Glu Hia Gly Ile Vai Thr Asn Trp Asp Aep Het Glu Lys Ile Trp 75 80 85 CAC CAC ACC TTT TAC AAC GAG CTT CGA GTT CCC CCT GAG GAG CAC CCC 1570 HLe Hie Thr Phe Tyr Aen Glu Leu Arg Vai Ala Pro Glu Glu Hie Pro 90 95 100 GTC CTT CTT ACT GAG GCT CCT CTA AAC CCC AAG GCT AAC AGA GAG AAG 1618

Vai Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Aan Pro Lys Ala Aan Arg Glu Lys 105 110 115 ATG ACC CAG ATC ATG TTC GAG ACC TTC AAC GCT CCC GCT TTC TAC GTT 1666

Ket Thr Gin Ile Ket Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Vai 120 125 130 CCC ATT CAG GCC GTG CTT TCT TT G TAC GCC TCT GGT CGA ACC ACC GGT 1714

Ala Ile Gin Ala Vai Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly

135 140 145 ISO

ATC GTG CTC GAC TCT GGA GAC GGA GTC AGT CAC ACT GTT CCT ATC TAC 1762

Ile Vai Leu Asp Ser Gly Asp Gly Vai Ser Hie Thr Vai Pro Ile Tyr 15S 160 165 . ’.· GAG GGT TTC GCC CTT CCC CAC GCC ATC CTC CGA TTG GAC TTG GCC GGT 1810 ... Glu Gly Phe Ala Leu Pro Hie Ala Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala. Gly ·* 170 175 100 CGA GAC TTG ACC GGG TAC CTT GTC AAG TGC TTG ATG GAG CGA GGA TAC 1858 ·· · Arg Asp Leu Thr Gly Tyr Leu Vai Ly6 Cve Leu Met Glu Arg Gly Tyr 185 190 ' 195 : CCT TTC ACC ACC ACT GCC GAG CGA GAG ATT GTT CGA GAC ATC AAG GAG 1906 ... Pro Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Vai Arg Aep Ile Lya Glu V : 200 205 210 AAG CTC TGC TAC GTA GCT CTC GAT TTC GAG CAG CAG ATG CAG ACC GCC 1954 . Lye Leu Cys Tyr Vai Ala Leu Asp Phe Glu Gin Glu Ket Gin Thr Ala 215 220 225 230 ·’ GCT CAG TCT TCC CAG CTC GAG AAG TCG TAC GAG CTT CCC GAC GGA CAC 2002 • Ala Gin Ser Ser Gin Leu Glu Ly3 Ser Tyr Glu Leu Pro Aep Gly Gin ././. 235 240 245 GTT ATC ACC ATT GGA AAC GAG CGA TTC CGA TGC CCT GAA GCT CTC TTC 2050

Vai Ile Thr Ile Gly Aan Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Ala Leu Phe , 2S0 255 260 I,,' CAG CCC TCT TTC CTC GGA CTC GAG GCC GCC GGT ATT CAC GAG ACC ACC 2098 ; .* Gin Pro Ser Phe Leu Gly Leu Glu Ala Ala Gly Ile His Glu Thr Thr 265 270 275 49 113785 TAC AAC TCG ATC ATG AAG TGT GAT CTT GAT ATC CGA AAG GAT CTC TAC 2146

Tyr Aan Ser Ile Met Lys Cys Asp Leu Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr 280 285 290 CGA AAC GTC GTC CTT TCC CGA GGA ACC ACC ATG TAC TCT GGT ATT GCC 2194

Gly Aan Vai Vai Leu Ser Gly Gly Thr The Met Tyr Ser Gly Ile Ala 295 300 305 310 GAT CGA ATG CAG AAG GAG ATT ACT TCC CTT GCC CCG TCG TCG ATG AAC 2 242

Asp Arg Met Gin Lys Glu Ile Thr Ser Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys 315 320 325 GTC AAG ATT G TT GOT CCT CCT GAG AGG AAG TAC TCC GTC TGG ATT GGA 2 290

Vai Lys Ile Vai Ala Pro Pro Glu Arg Lye Tyr Ser Vai Trp Ile Gly 330 335 340 GGA TCC ATC TTG GCT TCC CTC AGC ACT TTC CAA TCT ATG TGG ATC TCA 2338

Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Ser Met Trp Ile Ser 345 350 355 AAG CAG GAG TAC GAC GAG GCT GGA CCT TCC ATC GTC CAC CGA AAG TGC 2386

Lye Gin Glu Tyr Aap Glu Ala Gly Pro Ser Ile Vai Hie Arg Lys Cya 360 365 370 TTC TAAGTCAACA AAGTCTTTCT ATCCTTTAAG GCAGAACGGT TTCTTTTCTT 2439

Phe 375 ACGATAGAGG CACCCTTGGC GGTCTTTCGC CAGCGGTGGT TTTCTCACTC TTTTTCCAAT 2499 ATTTTCACCG ACGTTTTTGC TCGCGTGTAT GTTTTTCTCT ACTTGATGCT ATCAATATCA 2559 TGGCTTTTAC GTTCCGTTGT ATTATCATCT TCTGCGCCCT TCTCACTCAG ATATCGAAAT 2619 CGTTACAACA CAACACATAT AAAAATGAGA TTTATTCAAC TACTAAATAA CGATACATTA 2679 GACGTAATAA ATAGATTCAT AGACAGGCCC GAATCTTGAT CGATCAAAGA CTTTAAACGT 2739 AATTGCGACA TTCTCCAAAA CCCCAAGCCG AACTCTTTCC ATCACCTATT TGTTCCCAAA 2799 • ·' TTTCGAAACA TCCACTCTCT TTCTGAAGCT CAGTATCACC TCGAGAACGG ATCTTCAATC 2859 • · XXXAGGGCGT GTCTTTTTCC GGTCTTATCT TGAATTTGTT ATCGTCATTC GATATAGATC 2919 '.* ' TCCCTTATTG TATTCTATCC TTCGAACGCG TTTTKTACGT ATCAACCCTC GACCATGCCG 2979 TCCGATTCAT CCCATCGAGC CTCACGATCT GGTTCATCAC- ACAAGAACAG GTCGAATACA 3039 : / AACGGTCCAT CAGCTCAGTC TTCGTCTCTG TTCTCCGGAT CAGCTTCACC TCCGGCAGGT 3099 .1 ‘ GCGTTGTTTT CAGCGCCAGG AACGCCGGTA GAGGCAATCA AGATTGATAT GATTATCAGN 3159 TCAGCCGGAT ATCCTTCCGC CTGGGAATAT CGAATTGCAT CCTGAAGAGA AGCGAAACTC 3219 GCAGTCAAAG CAGAAAAATT TACATCTATT AAAAGAAAGA ATGGANGACA CCCCAAACGA 3279 ' GGTGAACCAC GTTCAGGATT TGGANGCGNA NGNTANNCNG AGTTCGCGTA TCTCTGCGGC 3339 TACACAAGCG CAGTCACCAA ACCTTTCACT CTTCATCCAC TTCAAAGCCC AGACACGAAC 3399 CCATGATACG TCAAAGGATT GAAGGACCAG GAACAGAAGA GGAAGAGGAA GGGGAAGACC 3459 * ; AAGCGCATCT ACATGGACCA GTAAAGAAGC CAAGATTAGA CCAAGACCAA GAAGGAAAGA 3519 ’ AGATATTACT GGATAAATTG CACCNGCCAC CATTCACCAC CGTCOATGGA GGAGACATAT 3579 CGGATCATCT GCTAAAAGCC CAGCTGGCGG ATACTATTGA CTCTGCTGAT TGCGTTCGTC 3639 CTCCCTTCTT CTTCTCTGGC TTCATCTTGC CCCCTCCTCT TCTAGAACAC CTACATGTTG 3699 113785 50 TACAAATTGA CTTCCTGTTG TGTTATCATG TCTCCGCGCT CTTGAAACAG GAAGATTTAT 3759 TAGAGAAAGA GGAATCAGAA CTTCAATCTT ATGAAAGTAG GCTAGATGAT CTTCGGTGGT 3819 TTCAGTGGCA GGGTATGTCG CTCTTGTTTA TCTCACAGTA TGCATGGAAT GTGTTTGTTG 3379 CTAAGTAGTT CTTCTATCAA TAACGCCTGT GAATGTTCAG CGATTAATCG GTTTTCAGAT 3939 GAGGACATCG AAACAATGAC GGCCTACTTG AAAGAGAAAG GTGAATCTCG AGTATTGGAA 3999 AACGAGACAT CAATAACCCT CGAGTGCCTT GCTGAGCATT GTTTTTCTTG TTATTGTGGA 4059 TTGTGTGCTC TCTTGAGGCT TGTTGAATTT TGTCAAGCGA TATGTGATCG AGCTGAAGTT 4119 CTCGGTACTT CGGTTATTGA ACGCTTTCCA AATGAAGGTT GTGCGTTTAA ACTCTTCTAT 4179 CTTCTCACTT CCGTTCGACG TTACAGACCA CATATCTGAC TTGTTATACG AACCTCTTTC 4239 TGTCTTCATT TGGTATTCTT TATTTAAATG AACATCATAC AACAGCCAAC TTATTACAGG 4299 GATCCAAATC TCGATGAATT C 4320 (2) Informaatio Sekvenssi 14:lie: (i) Sekvenssin ominaisuudet: (A) Pituus: 375 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen • .· (ii) Molekyyli tyyppi: proteiini * « » • * · f * * *: » · · t » (xi) Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 14:lie: 51 113785

Met Asp Asp Glu Vai Ala Ala Leu vai Ile Asp Asn Gly Ser Gly Met 15 10 15

Cya Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Vai Phe Pro 20 25 30

Ser Ile Vai Gly Arg Pro Arg Hie Gin Gly Vai Hat Vai Gly Met Gly 35 40 45

Gin Lys Asp Ser Tyr Vai Gly Asp Glu Ala Gin Ser Lye Arg Gly Ile SO 55 60

Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu Hie Gly Ile Vai Thr Asn Trp Asp 65 70 75 Θ0

Asp Het Glu Lys Ile Trp Hia His Thr Phe Tyr Αδη Glu Leu Arg Vai 85 90 95

Ala Pro Glu Glu His Pro Vai Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro 100 105 110

Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gin Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn 115 120 125

Ala Pro Ala Phe Tyr Vai Ala Ile Gin Ala Vai Leu Ser Leu Tyr Ala 130 135 140

Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Vai Leu Asp Ser Gly Asp Gly Vai Ser 145 150 155 160

His Thr Vai Pro Ile Tyr Glu Gly Phe Ala Leu Pro Hia Ala Ile Leu 165 170 175

Arg Leu Aap Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr GLy Tyr Leu Vai Lys Cys 160 185 190

Leu Met Glu Arg Gly Tyr Pro Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile • · 19S 200 205 * * · ·’ ' Vai Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cya Tyr Vai Ala Leu Asp Phe Glu 210 215 220

Gin Glu Met Gin Thr Ala Ala Gin Ser Ser Gin Leu Glu Lye Ser Tyr ; 225 230 235 240 ' ·’ Glu Leu Pro Asp Gly Gin Vai Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg 245 250 255

Cye Pro Glu Ala Leu Phe Gin Pro Ser Phe Leu Gly Leu Glu Ala Ala 260 265 270 i.. Gly Ile Hie Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lye Cye Asp Leu Asp 275 280 285 i ’ Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Vai Vai Leu Ser Gly Gly Thr Thr

: ·,; 290 295 30Q

. Met Tyr Ser Gly Ile Ala Aap Arg Met Gin Lya Glu Ile Thr Ser Leu ·; 30S 310 335 320

Ala p~° Ser Ser Met LYe iye Ile Vai Ala Pro Pro Glu Arg Lye 325 330 335

Tyr Ser Val Trp Ile Gly Cly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe 340 345 350

Gin Ser Met Trp Ile Ser Lys Gin Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Pro Ser 355 360 y 365

Ile Vai Hia Arg Lys Cys Phe 370 375

Claims (12)

113785

1. DNA:11a transformoitu Phaffia-solu,tunnettu siitä, että mainittu DNA käsittää 5 a) halutun mainitussa Phaffia-solussa ekspressoitavan geenin, b) mainitulle halutulle ekspressoitavalle geenille heterologisen ja sen kanssa operatiivisesti 10 kytketyn Phaffia-promoottorin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen Phaffia-solu, tunnettu siitä, että Phaffia-promoottori on aktiinipromoottori.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen Phaffia-solu, tunnettu siitä, että mainittu DNA lisäksi käsittää vaiintamarkkerin.

4. Phaffia rhodozyma CBS 303.93. 20

5. E. coli CBS 3 59.93.

: 6. E. coli CBS 442.92. • > s • > ·'· 25

7. Menetelmä Phaf f iän transformoimiseksi, tunnettu siitä, että \ - Phaf f ia-soluja viljellään eksponentiaaliseen vaiheeseen, . .· - protoplasteja valmistetaan näistä soluista, 30. lisätään vektori, joka sisältää halutun geenin kloonattuna alavirtaan sille heterologisesta Phaffia-promoottorista, • - protoplastit maljataan valikoivalle regeneraatioalustalle, 113785 - valikoidaan transformoidut Phaffia-solut.

8. Menetelmä Phaffiän transformoimiseksi, tunnettu siitä, että 5 - Phaffia-soluja viljellään haluttuun tiheyteen, solut kerätään talteen, soluja inkuboidaan litiumasetaatin läsnäollessa transformoivan DNA:n kanssa, joka DNA käsittää halutun 10 geenin kloonattuna alavirtaan Phaffia-promoottorista, seos levitetään valikoiville maljoille, - valikoidaan transformoidut Phaffia-solut.

9. Menetelmä Phaffia-solujen tuottamiseksi, jotka sisältävät 15 jonkin määrän haluttua proteiinia tai karotenoidia, tunnettu siitä, että - Phaffia-soluja transformoidaan vektorilla, joka sisältää halutun geenin, joka voi olla proteiinia koodittava 20 geeni tai säätelygeeni, kloonattuna alavirtaan Phaffia- ,· promoottorista, transformoidut solut valikoidaan, *; - transformoituja soluja viljellään sopivissa olosuhteissa halutun proteiinin tai karotenoidin tuottamiseksi. V .* 25

10. Menetelmä halutun tuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksen 1-3 » mukaisia transformoituja Phaffia-soluja sopivissa olosuhteissa mainitun halutun tuotteen valmistamiseksi. 30

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haluttu tuote on proteiini. * « » „ 113785

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haluttu tuote on karotenoidi. » t 55 1 13 7 8 5