JP3462218B2 - 糸状菌におけるヘムタンパク質生産を増加せしめるための方法 - Google Patents
糸状菌におけるヘムタンパク質生産を増加せしめるための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は、糸状菌におけるヘムタンパク質の生産方
法、及びヘムタンパク質を生産できる糸状菌に関する。
法、及びヘムタンパク質を生産できる糸状菌に関する。
関連技術の記載
ヘム、すなわちプロトポルフィリンIX及び鉄のキレー
ト錯体は、ヘムタンパク質の補欠分子族として作用す
る。プロトポルフィリンIXは、４個のメチル基、２個の
ビニル基及び２個のプロピオン酸基により置換されてお
り、ヘムを形成するために鉄原子を獲得するポルフィリ
ン環から成る。グリシン及びスクシニル−CoAからのヘ
ムの生合成は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（EC2.
3.1.37）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（EC4.2.1.2
4）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（EC4.3.1.8）、
ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（EC4.2.11.7
5）、ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ
（EC4.1.1.37）、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ（EC1.3.3.3）、プロトポルフィリノーゲンIXオ
キシダーゼ（EC1.3.3.4）及びフェロケラターゼ（EC4.9
9.1.1）により触媒される８種の酵素段階を包含する。
５−アミノレブリン酸シンターゼは、５−アミノレブリ
ン酸を形成するためにグリシン及びスクシニル−CoAの
縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンシンターゼ（５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼ又は５−アミノレブリ
ン酸デヒドラーゼとも呼ばれる）は、ポルホビリノーゲ
ンを形成するために５−アミノレブリン酸の２つの分子
の縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンデアミナーゼ
（ヒドロキシメチルビランシンターゼ又はウロＩシンタ
ーゼとも呼ばれる）は、プレウロポルフィリノーゲンへ
のピロールポルホビリノーゲンの四重合を触媒する。ウ
ロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（ウロIIIシンター
ゼ又はウロIIIコシンターゼとも呼ばれる）は、ウロポ
ルフィリノーゲンIIIを生成するためにプレウロポルフ
ィリノーゲンの第四環の転移、続く環化を触媒する。ウ
ロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ（ウロ又
はウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼとも呼ば
れる）は、コプロポルフィリノーゲンIIIを生成するた
めに、メチル基へのウロポルフィリノーゲンIIIのすべ
ての４個の酢酸側鎖の脱カルボキシル化を触媒する。コ
プロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ（コプロポル
フィリノゲナーゼとも呼ばれる）は、プロトポルフィリ
ノーゲンを生成するために、コプロポルフィリノーゲン
IIIのＡ及びＢ環上の位置２及び４での２つのプロピオ
ネート基のビニル基への酸化脱カルボキシル化を触媒す
る。プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼは、プロ
トポルフィリンIXを生成するためにプロトポルフィリノ
ーゲンIXの６個の電子酸化を触媒する。フェロケラター
ゼ（フェロリラーゼ、ヘムシンターゼ、又はプロトヘム
フェロリラーゼとも呼ばれる）は、ヘムを生成するため
にプロトポルフィリン中への鉄の挿入を触媒する。
ト錯体は、ヘムタンパク質の補欠分子族として作用す
る。プロトポルフィリンIXは、４個のメチル基、２個の
ビニル基及び２個のプロピオン酸基により置換されてお
り、ヘムを形成するために鉄原子を獲得するポルフィリ
ン環から成る。グリシン及びスクシニル−CoAからのヘ
ムの生合成は、５−アミノレブリン酸シンターゼ（EC2.
3.1.37）、ポルホビリノーゲンシンターゼ（EC4.2.1.2
4）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（EC4.3.1.8）、
ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（EC4.2.11.7
5）、ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ
（EC4.1.1.37）、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシ
ダーゼ（EC1.3.3.3）、プロトポルフィリノーゲンIXオ
キシダーゼ（EC1.3.3.4）及びフェロケラターゼ（EC4.9
9.1.1）により触媒される８種の酵素段階を包含する。
５−アミノレブリン酸シンターゼは、５−アミノレブリ
ン酸を形成するためにグリシン及びスクシニル−CoAの
縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンシンターゼ（５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼ又は５−アミノレブリ
ン酸デヒドラーゼとも呼ばれる）は、ポルホビリノーゲ
ンを形成するために５−アミノレブリン酸の２つの分子
の縮合を触媒する。ポルホビリノーゲンデアミナーゼ
（ヒドロキシメチルビランシンターゼ又はウロＩシンタ
ーゼとも呼ばれる）は、プレウロポルフィリノーゲンへ
のピロールポルホビリノーゲンの四重合を触媒する。ウ
ロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ（ウロIIIシンター
ゼ又はウロIIIコシンターゼとも呼ばれる）は、ウロポ
ルフィリノーゲンIIIを生成するためにプレウロポルフ
ィリノーゲンの第四環の転移、続く環化を触媒する。ウ
ロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ（ウロ又
はウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼとも呼ば
れる）は、コプロポルフィリノーゲンIIIを生成するた
めに、メチル基へのウロポルフィリノーゲンIIIのすべ
ての４個の酢酸側鎖の脱カルボキシル化を触媒する。コ
プロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ（コプロポル
フィリノゲナーゼとも呼ばれる）は、プロトポルフィリ
ノーゲンを生成するために、コプロポルフィリノーゲン
IIIのＡ及びＢ環上の位置２及び４での２つのプロピオ
ネート基のビニル基への酸化脱カルボキシル化を触媒す
る。プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼは、プロ
トポルフィリンIXを生成するためにプロトポルフィリノ
ーゲンIXの６個の電子酸化を触媒する。フェロケラター
ゼ（フェロリラーゼ、ヘムシンターゼ、又はプロトヘム
フェロリラーゼとも呼ばれる）は、ヘムを生成するため
にプロトポルフィリン中への鉄の挿入を触媒する。
ヘムタンパク質へのアポタンパク質の転換は、ヘム生
合成路により供給されるヘムの利用可性に依存する。ヘ
ムタンパク質のアポタンパク質形はヘムと結合してヘム
タンパク質を形成し、このヘムタンパク質は、アポタン
パク質よりもタンパク質分解攻撃に対してヘムタンパク
質を安定にするコンホメーションを獲得する。微生物に
より生成されるヘムの量が生成されるアポタンパク質の
量に対して低い場合、アポタンパク質は、蓄積し、そし
てタンパク質分解を受けて、活性ヘムタンパク質の生成
を低める。
合成路により供給されるヘムの利用可性に依存する。ヘ
ムタンパク質のアポタンパク質形はヘムと結合してヘム
タンパク質を形成し、このヘムタンパク質は、アポタン
パク質よりもタンパク質分解攻撃に対してヘムタンパク
質を安定にするコンホメーションを獲得する。微生物に
より生成されるヘムの量が生成されるアポタンパク質の
量に対して低い場合、アポタンパク質は、蓄積し、そし
てタンパク質分解を受けて、活性ヘムタンパク質の生成
を低める。
この問題を克服するために、Jensenは、発酵培地への
ヘム又はヘム含有材料の添加が、アスペルギラス・オリ
ザエ（Aspergillus oryzae）により生成されるペルオキ
シダーゼの生成の有意な上昇を導びくことを示した（WO
93/19195）。発酵培地へのヘム補充はヘムタンパク質の
収率の有意な改良をもたらすが、それは大規模的に実施
するためには不適切で、費用がかかり、且つ困難であ
る。
ヘム又はヘム含有材料の添加が、アスペルギラス・オリ
ザエ（Aspergillus oryzae）により生成されるペルオキ
シダーゼの生成の有意な上昇を導びくことを示した（WO
93/19195）。発酵培地へのヘム補充はヘムタンパク質の
収率の有意な改良をもたらすが、それは大規模的に実施
するためには不適切で、費用がかかり、且つ困難であ
る。
Wuなど．（1991,Journal of Bacteriology 173:325−
333）は、シロヘムの合成のために必要とされるウロポ
ルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼをコー
ドするサルモネラ・チピムリウム（Salmonella typhimu
rium）cysG遺伝子をプラスミドに導入することを含んで
成る、E.コリNADPH−亜硫酸レダクターゼ、すなわちシ
ロヘムタンパク質の過剰発現方法を開示する。
333）は、シロヘムの合成のために必要とされるウロポ
ルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼをコー
ドするサルモネラ・チピムリウム（Salmonella typhimu
rium）cysG遺伝子をプラスミドに導入することを含んで
成る、E.コリNADPH−亜硫酸レダクターゼ、すなわちシ
ロヘムタンパク質の過剰発現方法を開示する。
商業的に有意な量を生成するために糸状菌株における
ヘムタンパク質の生成を高めるための改良された方法を
提供することが本発明の目的である。
ヘムタンパク質の生成を高めるための改良された方法を
提供することが本発明の目的である。
発明の要約
本発明は、
（ａ）糸状菌細胞中に、
（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列
によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記
１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可
能に連結されており；及び／又は （ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーを導入し； （ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のため
に適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そ
して （ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク
質を回収する； ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関す
る。
によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記
１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可
能に連結されており；及び／又は （ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーを導入し； （ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のため
に適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そ
して （ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク
質を回収する； ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関す
る。
本発明はまた、糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸
配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、及び／又は
ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列
の１又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞に
も関する。
配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、及び／又は
ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列
の１又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞に
も関する。
図面の簡単な説明
図１は、プラスミドpSEO4の制限地図を示す。
図２は、アスペルギラス・オリザエ５−アミノレブリ
ン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2Kbのゲノムフラグメン
トの制限地図を示す。キロ塩基（Kb）での尺度が地図下
に示される。矢印は、遺伝子のオープンリーディングフ
レームの位置を表わす。
ン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2Kbのゲノムフラグメン
トの制限地図を示す。キロ塩基（Kb）での尺度が地図下
に示される。矢印は、遺伝子のオープンリーディングフ
レームの位置を表わす。
図３は、アスペルギラス・オリザエ５−アミノレブリ
ン酸シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定上の
アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１及び２）を示す。
潜在的に重要な転写部位、すなわちCCAATボックス及びT
ATAボックスは下線が引かれている。２つの保存された
推定上のHRMモチーフがボックス内にあり；ピリドキサ
ールリン酸補因子結合に関与するグリシンループが円内
にあり、そして重要なリシンが星印により示されてい
る。
ン酸シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定上の
アミノ酸配列（それぞれ、配列番号１及び２）を示す。
潜在的に重要な転写部位、すなわちCCAATボックス及びT
ATAボックスは下線が引かれている。２つの保存された
推定上のHRMモチーフがボックス内にあり；ピリドキサ
ールリン酸補因子結合に関与するグリシンループが円内
にあり、そして重要なリシンが星印により示されてい
る。
図４は、種々の５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝
子における保存されたヘム調節モチーフを示す。ペンタ
ペプチドモチーフがボックス内にある。
子における保存されたヘム調節モチーフを示す。ペンタ
ペプチドモチーフがボックス内にある。
図５は、アスペルギラス・オリザエ、アスペルギラス
・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、サッカロミ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）及び
ヒト赤芽からの５−アミノレブリン酸シンターゼについ
ての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号2,2
2,23及び24）を示す。保存されたアミノ酸はボックス内
にある。
・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、サッカロミ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）及び
ヒト赤芽からの５−アミノレブリン酸シンターゼについ
ての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号2,2
2,23及び24）を示す。保存されたアミノ酸はボックス内
にある。
図６は、プラスミドpBANe6の制限地図を示す。
図７は、プラスミドpSE31の制限地図を示す。
図８は、プラスミドpJVi9の構成を示す。
図９は、プラスミドpJeRS6の制限地図を示す。
図10は、プラスミドpJRoC50の制限地図を示す。
図11は、プラスミドpAJ005−１の制限地図を示す。
図12は、アスペルギラスオリザエポルホビリノーゲン
シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されるア
ミノ酸配列（それぞれ、配列番号３及び４）を示す。CA
ATボックスには下線が引かれており、そしてTATAボック
スはボックス内にある。推定上のイントロンは点下線に
より同定され、そして推定上の亜鉛フィンガードメイン
はダッシュ下線により同定される。ライブラリープルー
ブは黒実線により同定され、そして活性リシンは円によ
り示される。
シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されるア
ミノ酸配列（それぞれ、配列番号３及び４）を示す。CA
ATボックスには下線が引かれており、そしてTATAボック
スはボックス内にある。推定上のイントロンは点下線に
より同定され、そして推定上の亜鉛フィンガードメイン
はダッシュ下線により同定される。ライブラリープルー
ブは黒実線により同定され、そして活性リシンは円によ
り示される。
図13は、B.スブチリス（B.subtilis）、E.コリ、ヒ
ト、エンドウ、ラット、ホウレンソウ、酵母及びアスペ
ルギラス・オリザエからのポルホビリノーゲンシンター
ゼについての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列
番号25,26,27,28,29,30,31及び４）を示す。
ト、エンドウ、ラット、ホウレンソウ、酵母及びアスペ
ルギラス・オリザエからのポルホビリノーゲンシンター
ゼについての推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列
番号25,26,27,28,29,30,31及び４）を示す。
図14は、pAJO23の制限地図を示す。
図15は、プラスミドpSE7t1の制限地図を示す。
図16は、プラスミドpSE37の制限地図を示す。
図17は、プラスミドpSE39の制限地図を示す。
図18は、プラスミドpMT1612の制限地図を示す。
図19は、プラスミドpBANe13の制限地図を示す。
図20は、プラスミドpSE38の制限地図を示す。
図21は、プラスミドpJaL292の制限地図を示す。
図22は、プラスミドpKS6の制限地図を示す。
図23は、プラスミドpMHan37の制限地図を示す。
図24は、プラスミドpBANe8の制限地図を示す。
発明の詳細な記載
本発明は、
（ａ）糸状菌細胞中に、
（ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列
によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記
１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可
能的に連結されており；及び／又は （ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーを導入し； （ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のため
に適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そ
して （ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク
質を回収する； ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関す
る。
によりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令す
ることができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記
１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に操作可
能的に連結されており；及び／又は （ii）ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーを導入し； （ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のため
に適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そ
して （ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク
質を回収する； ことを含んで成る、ヘムタンパク質の製造方法に関す
る。
“ヘムタンパク質”とは、補欠分子族としてヘムを含
むタンパク質のいづれかのメンバー群として本明細書に
おいて定義される。ヘムタンパク質は、補欠分子族とし
てヘムを含む、グロビン、チトクローム、オキシドレダ
クターゼ、又はいづれか他のタンパク質であり得る。ヘ
ム含有グロビンは、ヘモグロビン及びミオグロビンを包
含する。ヘム含有チトクロームは、チトクロームp450、
チトクロームｂ、チトクロームc1、及びチトクロームｃ
を包含する。ヘム含有オキシドレダクターゼは、カタラ
ーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシ
ダーゼ及びペルオキシダーゼを包含するが、但しそれら
だけには限定されない。好ましい態様においては、オキ
シドレダクターゼはカタラーゼである。もう１つの好ま
しい態様においては、オキシドレダクターゼはオキシダ
ーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキ
シドレダクターゼはオキシゲナーゼである。もう１つの
好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはハロ
ペルオキシダーゼである。もう１つの好ましい態様にお
いては、オキシドレダクターゼはペルオキシダーゼであ
る。さらに好ましい態様においては、ペルオキシダーゼ
は、コプリナス（Coprinus）株、アルトロミセス（Arth
romyces）株、又はファネロカエト（Phanerochaete）株
から得られる。さらにより好ましい態様においては、ペ
ルオキシダーゼは、コプリナス・シネレウス（Coprinus
cinereus）株、たとえば、コプリナス・シネレウスIFO
8371、コプリナス・マクロリゾス（Coprinus macrorhi
zus）株、又はアルトロミセス・ラモサス（Arthromyces
ramosus）株から得られる。もう１つのさらに好ましい
態様においては、カタラーゼは、スシタリジウム（Scyt
alidium）株、アスペルギラス（Aspergillus）株、又は
ヒュミコラ（Humicola）株から得られる。もう１つのさ
らに好ましい態様においては、カタラーゼは、スシタリ
ジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）
株、たとえばスシタリジウムサーモフィラムCBS 117.6
5、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）株、
又はヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）
株から得られる。
むタンパク質のいづれかのメンバー群として本明細書に
おいて定義される。ヘムタンパク質は、補欠分子族とし
てヘムを含む、グロビン、チトクローム、オキシドレダ
クターゼ、又はいづれか他のタンパク質であり得る。ヘ
ム含有グロビンは、ヘモグロビン及びミオグロビンを包
含する。ヘム含有チトクロームは、チトクロームp450、
チトクロームｂ、チトクロームc1、及びチトクロームｃ
を包含する。ヘム含有オキシドレダクターゼは、カタラ
ーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシ
ダーゼ及びペルオキシダーゼを包含するが、但しそれら
だけには限定されない。好ましい態様においては、オキ
シドレダクターゼはカタラーゼである。もう１つの好ま
しい態様においては、オキシドレダクターゼはオキシダ
ーゼである。もう１つの好ましい態様においては、オキ
シドレダクターゼはオキシゲナーゼである。もう１つの
好ましい態様においては、オキシドレダクターゼはハロ
ペルオキシダーゼである。もう１つの好ましい態様にお
いては、オキシドレダクターゼはペルオキシダーゼであ
る。さらに好ましい態様においては、ペルオキシダーゼ
は、コプリナス（Coprinus）株、アルトロミセス（Arth
romyces）株、又はファネロカエト（Phanerochaete）株
から得られる。さらにより好ましい態様においては、ペ
ルオキシダーゼは、コプリナス・シネレウス（Coprinus
cinereus）株、たとえば、コプリナス・シネレウスIFO
8371、コプリナス・マクロリゾス（Coprinus macrorhi
zus）株、又はアルトロミセス・ラモサス（Arthromyces
ramosus）株から得られる。もう１つのさらに好ましい
態様においては、カタラーゼは、スシタリジウム（Scyt
alidium）株、アスペルギラス（Aspergillus）株、又は
ヒュミコラ（Humicola）株から得られる。もう１つのさ
らに好ましい態様においては、カタラーゼは、スシタリ
ジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）
株、たとえばスシタリジウムサーモフィラムCBS 117.6
5、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）株、
又はヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）
株から得られる。
ヘムタンパク質は、糸状菌に対して内因性か又は外因
性かであり得る。
性かであり得る。
制御配列及び／又は核酸配列は、当業界において知ら
れている方法により糸状菌中に導入され得る。たとえ
ば、前記配列は、前記配列の１又は複数のコピーが単一
の標的配列及び／又は複数の標的配列中に組込まれる相
同又は非相同組換えにより宿主ゲノム中に導入され、そ
して組込まれ得る。他方では、前記配列は、組込まれな
い発現ベクター、たとえば自己複製する染色体外プラス
ミドとして導入され、そして維持され得る。糸状菌中に
核酸配列を導入するための当業界における標準方法は、
それ自体知られている態様でのプロトプラスト形成、プ
ロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプ
ラストの細胞壁の再生を包含する（EP 238,023号及びMs
lardierなど.,1989,Gene 78:147−156を参照のこと）。
細胞は、好ましくは、糸状菌細胞の宿主ゲノム、好まし
くは染色体中に便利に組込まれる、ヘム生合成酵素をコ
ードする制御配列及び／又は核酸配列を含む核酸構造体
を含んで成るインテグレイティブベクターにより形質転
換される。用語“核酸構造体”とは、天然に存在する遺
伝子から単離されるか、又は天然に存在しない態様で組
合され、そして並置される核酸のセグメントを含むよう
に修飾された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する
ものとして本明細書においては定義される。
れている方法により糸状菌中に導入され得る。たとえ
ば、前記配列は、前記配列の１又は複数のコピーが単一
の標的配列及び／又は複数の標的配列中に組込まれる相
同又は非相同組換えにより宿主ゲノム中に導入され、そ
して組込まれ得る。他方では、前記配列は、組込まれな
い発現ベクター、たとえば自己複製する染色体外プラス
ミドとして導入され、そして維持され得る。糸状菌中に
核酸配列を導入するための当業界における標準方法は、
それ自体知られている態様でのプロトプラスト形成、プ
ロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプ
ラストの細胞壁の再生を包含する（EP 238,023号及びMs
lardierなど.,1989,Gene 78:147−156を参照のこと）。
細胞は、好ましくは、糸状菌細胞の宿主ゲノム、好まし
くは染色体中に便利に組込まれる、ヘム生合成酵素をコ
ードする制御配列及び／又は核酸配列を含む核酸構造体
を含んで成るインテグレイティブベクターにより形質転
換される。用語“核酸構造体”とは、天然に存在する遺
伝子から単離されるか、又は天然に存在しない態様で組
合され、そして並置される核酸のセグメントを含むよう
に修飾された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味する
ものとして本明細書においては定義される。
本発明の糸状菌細胞は、当業界において知られている
方法を用いて、ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生
成のために適切な栄養培地において培養される。たとえ
ば、細胞は、適切な培地において、及びヘムタンパク質
の発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される
実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培
養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッ
チ、又は固形状態発酵を包含する）により培養され得
る。培養は、当業界において知られている方法を用い
て、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地に
おいて行われる（たとえば、Bennett,J.W.and Lasure,
L.,eds.,More Gene Manipulations in Fungi,Academic
Press,CA,1991を参照のこと）。適切な培地は、商業的
供給者から入手でき、又は公開された組成（たとえば、
American Type Culture Collectionのカタログにおけ
る）を用いて調製され得る。ヘムタンパク質が栄養培地
中に分泌される場合、そのヘムタンパク質は培地から直
接的に回収され得る。糸状菌宿主細胞におけるヘムタン
パク質の分泌のためのシグナルペプチドコード領域は、
たとえばアスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝
子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リ
ゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギ
ン酸プロテイナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサ
（Humicola lanuginosa）セルラーゼ遺伝子、又はリゾ
ムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子から得られる。ヘムタ
ンパク質が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回
収される。
方法を用いて、ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生
成のために適切な栄養培地において培養される。たとえ
ば、細胞は、適切な培地において、及びヘムタンパク質
の発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される
実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培
養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッ
チ、又は固形状態発酵を包含する）により培養され得
る。培養は、当業界において知られている方法を用い
て、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地に
おいて行われる（たとえば、Bennett,J.W.and Lasure,
L.,eds.,More Gene Manipulations in Fungi,Academic
Press,CA,1991を参照のこと）。適切な培地は、商業的
供給者から入手でき、又は公開された組成（たとえば、
American Type Culture Collectionのカタログにおけ
る）を用いて調製され得る。ヘムタンパク質が栄養培地
中に分泌される場合、そのヘムタンパク質は培地から直
接的に回収され得る。糸状菌宿主細胞におけるヘムタン
パク質の分泌のためのシグナルペプチドコード領域は、
たとえばアスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝
子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リ
ゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギ
ン酸プロテイナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサ
（Humicola lanuginosa）セルラーゼ遺伝子、又はリゾ
ムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子から得られる。ヘムタ
ンパク質が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回
収される。
得られるヘムタンパク質は、当業界において知られて
いる方法により回収され得る。たとえば、ヘムタンパク
質は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴
霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定され
ない）により栄養培地から回収され得る。回収されたタ
ンパク質は、種々のクロマトグラフィー方法、たとえば
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様
の方法によりさらに精製され得る。
いる方法により回収され得る。たとえば、ヘムタンパク
質は、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴
霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定され
ない）により栄養培地から回収され得る。回収されたタ
ンパク質は、種々のクロマトグラフィー方法、たとえば
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様
の方法によりさらに精製され得る。
本発明の１つの観点においては、ヘムタンパク質は、
糸状菌細胞中に、前記糸状菌細胞に対して内因性の第１
核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指
令することができる、前記第１核酸配列に作用可能に連
結された１又は複数の第１制御配列を導入することによ
って、前記糸状菌細胞において多量に生成される。
糸状菌細胞中に、前記糸状菌細胞に対して内因性の第１
核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指
令することができる、前記第１核酸配列に作用可能に連
結された１又は複数の第１制御配列を導入することによ
って、前記糸状菌細胞において多量に生成される。
前記第１核酸配列は、５−アミノレブリン酸シンター
ゼ、ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲ
ンデアミラーゼ、ウロポリフィリノーゲンシンターゼ、
ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から
選択されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの糸状
菌核酸配列であり得、ここで前記第１核酸配列は、糸状
菌宿主細胞に対して内因性である。用語“内因性”と
は、糸状菌宿主細胞に起因するものとして本明細書にお
いては定義される。
ゼ、ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲ
ンデアミラーゼ、ウロポリフィリノーゲンシンターゼ、
ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から
選択されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの糸状
菌核酸配列であり得、ここで前記第１核酸配列は、糸状
菌宿主細胞に対して内因性である。用語“内因性”と
は、糸状菌宿主細胞に起因するものとして本明細書にお
いては定義される。
用語“制御配列”とは、第１核酸配列のコード配列の
発現のために必要であるか又は好都合であるすべての成
分を含むことを本明細書においては意味する。制御配列
は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して
内因性であり得、他の源から得られ、又は生来の及び外
来性の制御配列の組合せであり得る。外来性制御配列
は、そのコード配列に通常関連する天然の制御配列に対
して所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るた
めに、単に置換することができ、又は天然の制御配列に
付加され得る。そのような配列は、リーダー、ポリアデ
ニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナ
ル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそ
れらだけには限定されない。制御配列の指令下での発現
のためには、本発明に従って使用されるべき第１核配列
は、その第１核酸配列のコード配列の発現が制御配列と
適合できる条件下で達成されるような態様で制御配列に
作用可能に連結される。用語“コード配列”とは、本明
細書において定義される場合、上記で言及された制御配
列の制御下に配置される場合、mRNA中に転写され、そし
てヘム生合成酵素に翻訳される配列である。コード配列
の境界は、5'−末端での翻訳開始コドン及び3'−末端で
の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DN
A,cDNA、及び組換え核酸配列を包含することができる
が、但しそれらだけには限定されない。
発現のために必要であるか又は好都合であるすべての成
分を含むことを本明細書においては意味する。制御配列
は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列に対して
内因性であり得、他の源から得られ、又は生来の及び外
来性の制御配列の組合せであり得る。外来性制御配列
は、そのコード配列に通常関連する天然の制御配列に対
して所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るた
めに、単に置換することができ、又は天然の制御配列に
付加され得る。そのような配列は、リーダー、ポリアデ
ニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナ
ル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそ
れらだけには限定されない。制御配列の指令下での発現
のためには、本発明に従って使用されるべき第１核配列
は、その第１核酸配列のコード配列の発現が制御配列と
適合できる条件下で達成されるような態様で制御配列に
作用可能に連結される。用語“コード配列”とは、本明
細書において定義される場合、上記で言及された制御配
列の制御下に配置される場合、mRNA中に転写され、そし
てヘム生合成酵素に翻訳される配列である。コード配列
の境界は、5'−末端での翻訳開始コドン及び3'−末端で
の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、DN
A,cDNA、及び組換え核酸配列を包含することができる
が、但しそれらだけには限定されない。
第１制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち
第１核酸配列の発現のために糸状菌宿主により認識され
る核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ヘム生合
成酵素の発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性を示
すいづれかのプロモーター配列であり得、そして宿主細
胞に対して相同であるか、又は非相同である遺伝子から
得られる。糸状菌宿主における第１核酸配列の転写を指
令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギラ
ス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイア
スパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー
中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性
α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペル
ギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミ
ラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アス
ペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペル
ギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アス
ペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、及びそれ
らのハイブリッドをコードする遺伝子から得られるプロ
モーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAア
ミラーゼ、NA2−tpi（アスペルギラス・ニガー中性α−
アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモータ
ーのハイブリッド）、及びglaAプロモーターである。
第１核酸配列の発現のために糸状菌宿主により認識され
る核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ヘム生合
成酵素の発現を仲介する転写及び翻訳制御配列を含む。
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性を示
すいづれかのプロモーター配列であり得、そして宿主細
胞に対して相同であるか、又は非相同である遺伝子から
得られる。糸状菌宿主における第１核酸配列の転写を指
令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギラ
ス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイア
スパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー
中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性
α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペル
ギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミ
ラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アス
ペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペル
ギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アス
ペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、及びそれ
らのハイブリッドをコードする遺伝子から得られるプロ
モーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAア
ミラーゼ、NA2−tpi（アスペルギラス・ニガー中性α−
アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモータ
ーのハイブリッド）、及びglaAプロモーターである。
第１制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配
列、すなわち転写を終結するために糸状菌宿主により認
識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ヘ
ム生合成酵素をコードする第１核酸配列の3'末端に作用
可能に連結される。ターミネーター配列は、ヘム生合成
酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり
得、又は他の源、すなわち外来性ターミネーター配列か
ら得られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であ
るいづれかのターミネーターが、本発明において有用で
あるが、しかし特に好ましいターミネーターは、アスペ
ルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・
ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュラン
スアントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニ
ガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られ
る。
列、すなわち転写を終結するために糸状菌宿主により認
識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ヘ
ム生合成酵素をコードする第１核酸配列の3'末端に作用
可能に連結される。ターミネーター配列は、ヘム生合成
酵素をコードする第１核酸配列に対して内因性であり
得、又は他の源、すなわち外来性ターミネーター配列か
ら得られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であ
るいづれかのターミネーターが、本発明において有用で
あるが、しかし特に好ましいターミネーターは、アスペ
ルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・
ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュラン
スアントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニ
ガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られ
る。
第１制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち
糸状菌宿主による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳
領域でもあり得る。リーダー配列は、ヘム生合成酵素を
コードする第１核酸配列の5'末端に作用可能に連結され
る。リーダー配列は、第１核酸配列に対して内因性であ
り得、又は他の源、すなわち外来性リーダー配列から得
られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であるい
づれかのリーダー配列は、本発明において有用である
が、しかし特に好ましいリーダーは、アスペルギラス・
オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエ
トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から
得られる。
糸状菌宿主による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳
領域でもあり得る。リーダー配列は、ヘム生合成酵素を
コードする第１核酸配列の5'末端に作用可能に連結され
る。リーダー配列は、第１核酸配列に対して内因性であ
り得、又は他の源、すなわち外来性リーダー配列から得
られる。選択の糸状菌宿主細胞において機能的であるい
づれかのリーダー配列は、本発明において有用である
が、しかし特に好ましいリーダーは、アスペルギラス・
オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエ
トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から
得られる。
第１制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち
第１核酸配列の3'末端に作用可能に連結され、そして転
写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を
付加するために糸状菌宿主により認識される配列でもあ
り得る。ポリアデニル化配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第１核酸配列に対して内因性であり得、又は他の
源、すなわち外来性ポリアデニル化配列から得られる。
選択される糸状菌宿主において機能的であるいづれかの
ポリアデニル化配列は、本発明において有用であるが、
しかし特に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギ
ラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガ
ーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスア
ントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニガー
α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
第１核酸配列の3'末端に作用可能に連結され、そして転
写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を
付加するために糸状菌宿主により認識される配列でもあ
り得る。ポリアデニル化配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第１核酸配列に対して内因性であり得、又は他の
源、すなわち外来性ポリアデニル化配列から得られる。
選択される糸状菌宿主において機能的であるいづれかの
ポリアデニル化配列は、本発明において有用であるが、
しかし特に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギ
ラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガ
ーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスア
ントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギラス・ニガー
α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
第１制御配列はまた、特定の細胞区画へのヘム生合成
酵素の局在化を可能にする、ヘム生合成酵素のアミノ末
端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプ
チドコード領域でもあり得る。そのシグナルペプチドコ
ード領域は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列
に対して内因性であり得、又は外来性源から得られる。
第１核酸配列のコード配列の5'末端は、局在化されたヘ
ム生合成酵素をコードするコード領域のセグメントと翻
訳読み取り枠と整合して天然において連結されるシグナ
ルペプチドコード領域を本質的に含むことができる。他
方では、そのコード配列の5'末端は、局在化されたヘム
生合成酵素をコードするコード配列のその部分に対して
外来性であるシグナルペプチドコード領域をコードする
核酸を含むことができる。シグナルペプチドコード領域
は、ニューロスポラ クラサ（Neurospora crassa）ATP
アーゼ遺伝子（Viebrockなど.,1982,EMBO Journal 1:56
5−571）又はサッカロミセスセレビシアエチトクローム
ｃペルオキシダーゼ遺伝子（Kaputなど.,1982,Journal
of Biological Chemistry 257:15054−1508）から得ら
れる。しかしながら、選択の糸状菌宿主においてヘム生
合成酵素の局在化を可能にすることができるいづれかの
ペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
酵素の局在化を可能にする、ヘム生合成酵素のアミノ末
端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプ
チドコード領域でもあり得る。そのシグナルペプチドコ
ード領域は、ヘム生合成酵素をコードする第１核酸配列
に対して内因性であり得、又は外来性源から得られる。
第１核酸配列のコード配列の5'末端は、局在化されたヘ
ム生合成酵素をコードするコード領域のセグメントと翻
訳読み取り枠と整合して天然において連結されるシグナ
ルペプチドコード領域を本質的に含むことができる。他
方では、そのコード配列の5'末端は、局在化されたヘム
生合成酵素をコードするコード配列のその部分に対して
外来性であるシグナルペプチドコード領域をコードする
核酸を含むことができる。シグナルペプチドコード領域
は、ニューロスポラ クラサ（Neurospora crassa）ATP
アーゼ遺伝子（Viebrockなど.,1982,EMBO Journal 1:56
5−571）又はサッカロミセスセレビシアエチトクローム
ｃペルオキシダーゼ遺伝子（Kaputなど.,1982,Journal
of Biological Chemistry 257:15054−1508）から得ら
れる。しかしながら、選択の糸状菌宿主においてヘム生
合成酵素の局在化を可能にすることができるいづれかの
ペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
第１制御配列はまた、生化学的に活性的な成熟ポリペ
プチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードす
るプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリ
ペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多く
の場合、チモーゲン）として知られている。プロ酵素は
一般的に不活性であり、そしてプロ酵素からのプロペプ
チドの触媒的又は自己触媒的分解により成熟活性ポリペ
プチドに転換され得る。生化学的に活性的なポリペプチ
ドは、その天然の相対物の生化学活性を実施する活性形
で生成されるヘム生合成酵素として本明細書において定
義される。プロペプチド配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第１核酸配列に対して内因性であり、又は他の
源、すなわち外来性プロペプチド配列から得られる。プ
ロペプチドをコードする核酸配列は、サッカロミセス・
セレビシアエα−因子及びマイセリオプソラ・サーモフ
ィラム（Myceliophthora thermophilum）ラッカーゼを
コードする遺伝子から得られる。
プチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードす
るプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリ
ペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多く
の場合、チモーゲン）として知られている。プロ酵素は
一般的に不活性であり、そしてプロ酵素からのプロペプ
チドの触媒的又は自己触媒的分解により成熟活性ポリペ
プチドに転換され得る。生化学的に活性的なポリペプチ
ドは、その天然の相対物の生化学活性を実施する活性形
で生成されるヘム生合成酵素として本明細書において定
義される。プロペプチド配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第１核酸配列に対して内因性であり、又は他の
源、すなわち外来性プロペプチド配列から得られる。プ
ロペプチドをコードする核酸配列は、サッカロミセス・
セレビシアエα−因子及びマイセリオプソラ・サーモフ
ィラム（Myceliophthora thermophilum）ラッカーゼを
コードする遺伝子から得られる。
本発明のもう１つの観点においては、ヘムタンパク質
は、ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸
配列の１又は複数のコピーを糸状菌細胞中に導入するこ
とによって、糸状菌細胞において多量に生成される。前
記第２核酸配列は、５−アミノレブリン酸シンターゼ、
ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲンデ
アミナーゼ、ウロポルフィリノーゲンシンターゼ、ウロ
ポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から選択
されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの核酸配列
であり得る。第２核酸配列は、いづれかの微生物源から
得られる。第２核酸配列源の選択は、糸状菌宿主細胞に
依存するが、しかし好ましい源は菌類源、たとえば酵母
及び糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウ
ム（Acremomium）、アスペルギラス（Aspergillus）、
フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マ
イセリオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Muco
r）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（P
enicillium）、ファネロカエート（Phanerochaete）、
チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypoc
ladium）、及びトリコダーマ（Trichoderma）の種を包
含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい
酵母源は、カンジダ（Candida）、クルイベロミセス（K
luyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス
（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosacch
aromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）の種を包含す
るが、但しそれらだけには限定されない。さらに、第２
核酸配列は、糸状菌宿主細胞に対して内因性であり得
る。
は、ヘム生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸
配列の１又は複数のコピーを糸状菌細胞中に導入するこ
とによって、糸状菌細胞において多量に生成される。前
記第２核酸配列は、５−アミノレブリン酸シンターゼ、
ポルホビリノーゲンシンターゼ、ポルホビリノーゲンデ
アミナーゼ、ウロポルフィリノーゲンシンターゼ、ウロ
ポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、コプロポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ及びフェロケラターゼから成る群から選択
されたヘム生合成酵素をコードするいづれかの核酸配列
であり得る。第２核酸配列は、いづれかの微生物源から
得られる。第２核酸配列源の選択は、糸状菌宿主細胞に
依存するが、しかし好ましい源は菌類源、たとえば酵母
及び糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウ
ム（Acremomium）、アスペルギラス（Aspergillus）、
フサリウム（Fusarium）、ヒュミコラ（Humicola）、マ
イセリオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Muco
r）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（P
enicillium）、ファネロカエート（Phanerochaete）、
チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypoc
ladium）、及びトリコダーマ（Trichoderma）の種を包
含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい
酵母源は、カンジダ（Candida）、クルイベロミセス（K
luyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス
（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosacch
aromyces）、及びヤロウイア（Yarrowia）の種を包含す
るが、但しそれらだけには限定されない。さらに、第２
核酸配列は、糸状菌宿主細胞に対して内因性であり得
る。
第２核酸配列は、次のものからの１又は複数のもので
あり得る： 1. ５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子： a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Urban−Grimalなど.,1986,European Journal
of Biochemistry 156:511−59）； b.アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidula
ns）（Bradshawなど.,1993,Current Genetics 23:501−
507）； c.ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter spha
eroides）（Taiなど.,1988,Gene 70:139−152）； d.ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulat
us）（Hornbergerなど.,1990,Molecular General Gener
tcs 211:371−378）；及び e.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Drolet
など.,1989,Molecular General Generics 216:347−35
2）。
あり得る： 1. ５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子： a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Urban−Grimalなど.,1986,European Journal
of Biochemistry 156:511−59）； b.アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidula
ns）（Bradshawなど.,1993,Current Genetics 23:501−
507）； c.ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter spha
eroides）（Taiなど.,1988,Gene 70:139−152）； d.ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulat
us）（Hornbergerなど.,1990,Molecular General Gener
tcs 211:371−378）；及び e.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Drolet
など.,1989,Molecular General Generics 216:347−35
2）。
2. ポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Myersなど.,1987,Journal of Biological Ch
emistry 262:16822−16829）； b.スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus a
ureus）（Kafala and Sasarman,1994,Canadian Journal
of Microbiology 40:651−657）； c.ロドベクター・フファエロイデス（Rhodobacter spha
eroides）（Delaunayなど.,1991,Journal of Bacteriol
ogy 173:2712−2715）； d.エスミエリシア・コリ（Escherichia coli）（Echela
rdなど.,1988,Molecular General Genetics 214:503−5
08）；及び e.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
onなど.,1991,Journal of Bacteriology 173:2590−259
9）。
visiae）（Myersなど.,1987,Journal of Biological Ch
emistry 262:16822−16829）； b.スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus a
ureus）（Kafala and Sasarman,1994,Canadian Journal
of Microbiology 40:651−657）； c.ロドベクター・フファエロイデス（Rhodobacter spha
eroides）（Delaunayなど.,1991,Journal of Bacteriol
ogy 173:2712−2715）； d.エスミエリシア・コリ（Escherichia coli）（Echela
rdなど.,1988,Molecular General Genetics 214:503−5
08）；及び e.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
onなど.,1991,Journal of Bacteriology 173:2590−259
9）。
3. ポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Kengなど.,1992,Molecular General Generic
s 234:33−433）； b.ヒト（Yoo−など.,1993,Genomics 15:221−29;Raich
など.,1986,Nucleic Acids Research 14:5955−596
8）； c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Thomas
and Jordan,1986,Nucleic Acids Research 14:6215−6
226）；及び d.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Petri
cekなど.,1990,Journal of Bacteriology 172:2250−22
58）。
visiae）（Kengなど.,1992,Molecular General Generic
s 234:33−433）； b.ヒト（Yoo−など.,1993,Genomics 15:221−29;Raich
など.,1986,Nucleic Acids Research 14:5955−596
8）； c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Thomas
and Jordan,1986,Nucleic Acids Research 14:6215−6
226）；及び d.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Petri
cekなど.,1990,Journal of Bacteriology 172:2250−22
58）。
4. ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Amillet and Labbe−Bois,1995,Yeast 11:41
9−424）； b.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
onなど.,1991,Journal of Bacteriology 173:2590−259
9）；及び c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Jordan
など.,1987,Nucleic Acids Research.15:10583）。
visiae）（Amillet and Labbe−Bois,1995,Yeast 11:41
9−424）； b.バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
onなど.,1991,Journal of Bacteriology 173:2590−259
9）；及び c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Jordan
など.,1987,Nucleic Acids Research.15:10583）。
5. ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ遺
伝子： a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Gareyなど.,1992,European Journal of Bioc
hemistry 205:1011−1016）；及び b.ヒト（Romeoなど.,1986,Journal of Biological Chem
istry 261:9825−9831）。
伝子： a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Gareyなど.,1992,European Journal of Bioc
hemistry 205:1011−1016）；及び b.ヒト（Romeoなど.,1986,Journal of Biological Chem
istry 261:9825−9831）。
6. コプロホルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝
子： a.ヒト（Martasekなど.,1994,Proceedings of the Nati
onal Academy of Sciences USA 911:3024−3028）； b.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Troup
など.,1994,Journal of Bacteriology 176:673−68
0）；及び c.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Zaagorecなど.,1986,Journal of Biological
Chemistry 263;9718−9724）。
子： a.ヒト（Martasekなど.,1994,Proceedings of the Nati
onal Academy of Sciences USA 911:3024−3028）； b.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Troup
など.,1994,Journal of Bacteriology 176:673−68
0）；及び c.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Zaagorecなど.,1986,Journal of Biological
Chemistry 263;9718−9724）。
7. プロトポロフィリノーゲンIXオキシダーゼ遺伝子：
a.ヒト（Taketaniなど.,1995,Genomics 29:698−70
3）； b.バシラス スブチリス（Bacillus subtilis）（Daile
yなど.,1994,Journal of Biological Chemistry 269:81
3−815）；及び c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Sassrm
anなど.,1993,Canadian Journal of Microbiology 39:1
55−161）。
3）； b.バシラス スブチリス（Bacillus subtilis）（Daile
yなど.,1994,Journal of Biological Chemistry 269:81
3−815）；及び c.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Sassrm
anなど.,1993,Canadian Journal of Microbiology 39:1
55−161）。
8. フェロケラターゼ遺伝子：
a.サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）（Labbe−Bois,1990,Journal of Biological C
hemistry 265:7278−72883）； b.ウシ（Shibuyaなど.,1995,Biochimica Biophysica Ac
ta 1231:117−120）； c.ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium J
aponicum）（Frustaci and O'Brian,1993,Applied Envi
ronmental Microbiology 59:347−2351）； d.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Frusta
ci and O'Brian,1993,Journal of Bacteriology 175:21
54−2156）；及び e.バシラス スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
on and Hederstedt,1992,Journal of Bacteriology 17
4:8081−88093）。
visiae）（Labbe−Bois,1990,Journal of Biological C
hemistry 265:7278−72883）； b.ウシ（Shibuyaなど.,1995,Biochimica Biophysica Ac
ta 1231:117−120）； c.ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium J
aponicum）（Frustaci and O'Brian,1993,Applied Envi
ronmental Microbiology 59:347−2351）； d.エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Frusta
ci and O'Brian,1993,Journal of Bacteriology 175:21
54−2156）；及び e.バシラス スブチリス（Bacillus subtilis）（Hanss
on and Hederstedt,1992,Journal of Bacteriology 17
4:8081−88093）。
より好ましい態様においては、第２核酸配列は、アス
ペルギラスの種から得られる。さらにより好ましい態様
においては、第２核酸配列は、アスペルギラス・フィキ
ューム（Aspergillus ficuum）、アスペルギラス・ホエ
チダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジ
ャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラ
ス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス・
ニジュランス（Aspergillus nidulans）、又はアスペル
ギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られ
る。もう１つのさらに好ましい態様においては、第２核
酸配列はサッカロミセスの種から得られる。さらにより
好ましい態様においては、第２核酸配列は、サッカロミ
セス・セレビシアエ、サッカロミセス・カールスベルゲ
ンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミ
セス・ジアスタニカス（Saccharomyces diastaricu
s）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces dou
glasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyce
s kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccha
romyces norbensis）又はサッカロミセス・オビホルミ
ス（Saccharomyces oviformis）から得られる。
ペルギラスの種から得られる。さらにより好ましい態様
においては、第２核酸配列は、アスペルギラス・フィキ
ューム（Aspergillus ficuum）、アスペルギラス・ホエ
チダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジ
ャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラ
ス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス・
ニジュランス（Aspergillus nidulans）、又はアスペル
ギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られ
る。もう１つのさらに好ましい態様においては、第２核
酸配列はサッカロミセスの種から得られる。さらにより
好ましい態様においては、第２核酸配列は、サッカロミ
セス・セレビシアエ、サッカロミセス・カールスベルゲ
ンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミ
セス・ジアスタニカス（Saccharomyces diastaricu
s）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces dou
glasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyce
s kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccha
romyces norbensis）又はサッカロミセス・オビホルミ
ス（Saccharomyces oviformis）から得られる。
最とも好ましい態様においては、５−アミノレブリン
酸シンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギ
ラス・オリザエ株A1560（IFO4177）、たとえば配列番号
１に示される核酸配列から得られる。５−アミノレブリ
ン酸シンターゼをコードする第２核酸配列はまた、遺伝
子コードの縮重により配列番号１と異なる、配列番号２
に示されるアミノ酸配列を有する５−アミノレブリン酸
シンターゼをコードする核酸配列でもあり得る。もう１
つの最とも好ましい態様においては、ポルホビリノーゲ
ンシンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギ
ラス・オリザエ株A1560（IFO4177）、たとえば配列番号
３に示される核酸配列から得られる。ポルホビリノーゲ
ンシンターゼをコードする第２核酸配列はさらに、遺伝
子コードの縮重により配列番号３とは異なる、配列番号
４に示されるアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン
シンターゼをコードする核酸配列であり得る。本発明の
第２核酸配列はさらに、配列番号１及び３に示される両
ゲノム配列、及びそれらの対応するcDNA及びRNA配列を
包含する。用語“核酸配列”とは、本明細書において使
用される場合、合成DNAを包含するすべてのそのような
変形体を包含することが理解されるであろう。
酸シンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギ
ラス・オリザエ株A1560（IFO4177）、たとえば配列番号
１に示される核酸配列から得られる。５−アミノレブリ
ン酸シンターゼをコードする第２核酸配列はまた、遺伝
子コードの縮重により配列番号１と異なる、配列番号２
に示されるアミノ酸配列を有する５−アミノレブリン酸
シンターゼをコードする核酸配列でもあり得る。もう１
つの最とも好ましい態様においては、ポルホビリノーゲ
ンシンターゼをコードする第２核酸配列は、アスペルギ
ラス・オリザエ株A1560（IFO4177）、たとえば配列番号
３に示される核酸配列から得られる。ポルホビリノーゲ
ンシンターゼをコードする第２核酸配列はさらに、遺伝
子コードの縮重により配列番号３とは異なる、配列番号
４に示されるアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲン
シンターゼをコードする核酸配列であり得る。本発明の
第２核酸配列はさらに、配列番号１及び３に示される両
ゲノム配列、及びそれらの対応するcDNA及びRNA配列を
包含する。用語“核酸配列”とは、本明細書において使
用される場合、合成DNAを包含するすべてのそのような
変形体を包含することが理解されるであろう。
好ましい態様においては、第２核酸配列は、１又は複
数の第２制御配列に作用可能に連結され、糸状菌宿主中
に導入される。第２制御配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第２核酸配列に対して内因性であり、又は外来性
源から部分的に又は完全に得られる。外来性制御配列
は、コード配列に通常関連する天然の制御配列に対して
所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るために
天然の制御配列を単純に置換することができる。第２制
御配列配列は第１制御配列に関して上記に例示された制
御配列のいづれであってもよい。
数の第２制御配列に作用可能に連結され、糸状菌宿主中
に導入される。第２制御配列は、ヘム生合成酵素をコー
ドする第２核酸配列に対して内因性であり、又は外来性
源から部分的に又は完全に得られる。外来性制御配列
は、コード配列に通常関連する天然の制御配列に対して
所望のヘム生合成酵素の高められた生産性を得るために
天然の制御配列を単純に置換することができる。第２制
御配列配列は第１制御配列に関して上記に例示された制
御配列のいづれであってもよい。
本発明のもう１つの観点においては、１又は複数の第
１制御配列の１又は複数のコピー及び１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーが、糸状菌細胞中に導入
される。好ましくは、第２核酸配列は、１又は複数の第
２制御配列に作用可能に連結される。
１制御配列の１又は複数のコピー及び１又は複数の第２
核酸配列の１又は複数のコピーが、糸状菌細胞中に導入
される。好ましくは、第２核酸配列は、１又は複数の第
２制御配列に作用可能に連結される。
第１制御配列、第２核酸配列及び／又は第２制御配列
は同じ核酸構造体に含まれ得、又はそれらは異なった核
酸構造体に含まれ得る。個々の核酸構造体は、正確な位
置で菌類宿主のゲノム中への相同組換えにより組込みを
指令するための組込み要素を含んで成ることができる。
正確な位置での組込みの傾向を高めるためには、組込み
要素は好ましくは、相同組換えの確立を高めるために対
応する標的配列と高い相同性である、十分な数の核酸、
たとえば100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基
対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対の核酸を含
むべきである。組込み要素は、糸状菌宿主細胞のゲノム
における標的配列と相同であるいづれかの配列であり得
る。さらに、組込み要素は、非コード又はコード核酸配
列であり得る。他方では、個々の核酸構造体は、非相同
組換えにより糸状菌宿主細胞のゲノム中に組込まれ得
る。
は同じ核酸構造体に含まれ得、又はそれらは異なった核
酸構造体に含まれ得る。個々の核酸構造体は、正確な位
置で菌類宿主のゲノム中への相同組換えにより組込みを
指令するための組込み要素を含んで成ることができる。
正確な位置での組込みの傾向を高めるためには、組込み
要素は好ましくは、相同組換えの確立を高めるために対
応する標的配列と高い相同性である、十分な数の核酸、
たとえば100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基
対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対の核酸を含
むべきである。組込み要素は、糸状菌宿主細胞のゲノム
における標的配列と相同であるいづれかの配列であり得
る。さらに、組込み要素は、非コード又はコード核酸配
列であり得る。他方では、個々の核酸構造体は、非相同
組換えにより糸状菌宿主細胞のゲノム中に組込まれ得
る。
核酸構造体は適切なベクター中に挿入され得、又は第
２核酸配列は、当業界において知られている分子生物学
的技法を用いて、制御配列をすでに含むベクター中に直
接的に挿入され得る。前記ベクターは、組換えDNA方法
に便利にゆだねられ得、そして本発明の核酸配列の発現
をひき起こすことができるいづれかのベクターであり得
る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入され
る予定である糸状菌細胞と前記ベクターとの適合性に依
存するであろう。ベクターは、自律的に複製するベクタ
ー、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色
体外存在物、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ
染色体又は人工染色体として存在するベクターであり得
る。他方では、ベクターは、糸状菌中に導入される場
合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている
染色体と共に複製されるベクターであり得る。ベクター
系は、糸状菌宿主のゲノム中に導入される全DNAを一緒
に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベ
クター又はプラスミドであり得る。
２核酸配列は、当業界において知られている分子生物学
的技法を用いて、制御配列をすでに含むベクター中に直
接的に挿入され得る。前記ベクターは、組換えDNA方法
に便利にゆだねられ得、そして本発明の核酸配列の発現
をひき起こすことができるいづれかのベクターであり得
る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入され
る予定である糸状菌細胞と前記ベクターとの適合性に依
存するであろう。ベクターは、自律的に複製するベクタ
ー、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色
体外存在物、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ
染色体又は人工染色体として存在するベクターであり得
る。他方では、ベクターは、糸状菌中に導入される場
合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている
染色体と共に複製されるベクターであり得る。ベクター
系は、糸状菌宿主のゲノム中に導入される全DNAを一緒
に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベ
クター又はプラスミドであり得る。
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞
の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを
含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金
属に対する耐性、原栄養株〜栄養要求株、及び同様のも
のを提供する生成物の遺伝子である。選択マーカーは、
amdS,pyrG,argB,niaD,sC,trpC,bar及びhygBから成る群
から選択され得るが、但しそれらだけには限定されな
い。アスペルギラス細胞への使用のためには、アスペル
ギラスニジュランス又はアスペルギラスオリザエのamdS
及びpyrGマーカー、及びストレプトミセス ヒグロスコ
ピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbarマーカー
が好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが別々のベ
クターに含まれるWO91/17243に記載されるように、同時
形質転換により達成され得る。
の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを
含む。選択マーカーは、殺生物又はウィルス耐性、重金
属に対する耐性、原栄養株〜栄養要求株、及び同様のも
のを提供する生成物の遺伝子である。選択マーカーは、
amdS,pyrG,argB,niaD,sC,trpC,bar及びhygBから成る群
から選択され得るが、但しそれらだけには限定されな
い。アスペルギラス細胞への使用のためには、アスペル
ギラスニジュランス又はアスペルギラスオリザエのamdS
及びpyrGマーカー、及びストレプトミセス ヒグロスコ
ピカス（Streptomyces hygroscopicus）のbarマーカー
が好ましい。さらに、選択は、選択マーカーが別々のベ
クターに含まれるWO91/17243に記載されるように、同時
形質転換により達成され得る。
核酸構造体、プロモーター、ターミネーター及び他の
要素を連結するために使用される方法、及び複製のため
に必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入す
るために使用される方法は、当業者に良く知られている
（たとえば、Sambrookなど.,Molecular Cloning,A Labo
ratory Manual,2d,ed.,Cold Spring Harbor,New York,1
989を参照のこと）。
要素を連結するために使用される方法、及び複製のため
に必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入す
るために使用される方法は、当業者に良く知られている
（たとえば、Sambrookなど.,Molecular Cloning,A Labo
ratory Manual,2d,ed.,Cold Spring Harbor,New York,1
989を参照のこと）。
本発明の方法はさらに、ヘムタンパク質をコードする
１又は複数の第３核酸配列の１又は複数のコピーを、糸
状菌細胞中に導入することを含んで成る。ヘムタンパク
質をコードする第３核酸配列は、段階ａの前又は後に、
但し段階ｂの前に導入され得る。第３核酸配列は、第１
制御配列、第２核酸配列及び第２制御配列と同じベクタ
ーに含まれ得、又はそれらは異なったベクターに含まれ
得る。好ましくは、第３核酸配列は、第３制御配列に作
用可能に連結された。前記第１制御配列に関して上記に
例示される制御配列はまた、第３制御配列に適用でき
る。
１又は複数の第３核酸配列の１又は複数のコピーを、糸
状菌細胞中に導入することを含んで成る。ヘムタンパク
質をコードする第３核酸配列は、段階ａの前又は後に、
但し段階ｂの前に導入され得る。第３核酸配列は、第１
制御配列、第２核酸配列及び第２制御配列と同じベクタ
ーに含まれ得、又はそれらは異なったベクターに含まれ
得る。好ましくは、第３核酸配列は、第３制御配列に作
用可能に連結された。前記第１制御配列に関して上記に
例示される制御配列はまた、第３制御配列に適用でき
る。
本発明の方法はさらに、ヘム源、その類似体、又は１
又は複数の経路中間体を栄養培地に導入することを含ん
で成る。ヘム類似体及び経路中間体の列挙については、
Product Brochure of Porphyrin Products Inc.（Loga
n,UT）を参照のこと。たとえば、ヘム生合成路における
酵素の１つをコードする核酸配列が糸状菌細胞中に導入
される場合、１又は複数の前の段階における１又は複数
の経路中間体が律速となる。そのような場合、それらの
１又は複数の経路中間体により培養培地を補充すること
ができる。それらの経路中間体を細胞中に導入するため
には、細胞膜を半透過性にすることができる酵素、たと
えばNOVOZYM234TM（Novo Nordisk A/S）を使用できる。
又は複数の経路中間体を栄養培地に導入することを含ん
で成る。ヘム類似体及び経路中間体の列挙については、
Product Brochure of Porphyrin Products Inc.（Loga
n,UT）を参照のこと。たとえば、ヘム生合成路における
酵素の１つをコードする核酸配列が糸状菌細胞中に導入
される場合、１又は複数の前の段階における１又は複数
の経路中間体が律速となる。そのような場合、それらの
１又は複数の経路中間体により培養培地を補充すること
ができる。それらの経路中間体を細胞中に導入するため
には、細胞膜を半透過性にすることができる酵素、たと
えばNOVOZYM234TM（Novo Nordisk A/S）を使用できる。
本発明の方法はさらに、栄養培地中に鉄源を導入する
ことを含んで成る。他方では、本発明の方法はさらに、
ポルフィリン合成を誘発できるいづれかの他の金属イオ
ンを導入することを含んで成る。たとえば、Mametな
ど.,1996,BioMetals,9:73−77を参照のこと。
ことを含んで成る。他方では、本発明の方法はさらに、
ポルフィリン合成を誘発できるいづれかの他の金属イオ
ンを導入することを含んで成る。たとえば、Mametな
ど.,1996,BioMetals,9:73−77を参照のこと。
本発明はまた、糸状菌に対して内因性の第１核酸配列
によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令するこ
とができる１又は複数の第１制御配列、及び／又はヘム
生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１
又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞にも関
する。前記配列は、菌類細胞のゲノム中に組込まれ得、
又は自己−複製染色体外ベクターに含まれ得る。
によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指令するこ
とができる１又は複数の第１制御配列、及び／又はヘム
生合成酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１
又は複数のコピーを含んで成る組換え糸状菌細胞にも関
する。前記配列は、菌類細胞のゲノム中に組込まれ得、
又は自己−複製染色体外ベクターに含まれ得る。
本発明の糸状菌細胞はさらに、糸状菌細胞におけるヘ
ムタンパク質の発現を指令することができる第３制御配
列に作用可能に連結された、ヘムタンパク質をコードす
る第３核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成り、こ
こで前記ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列は菌
類細胞のゲノム中に組込まれ、又は自己−複製染色体外
ベクターに含まれる。
ムタンパク質の発現を指令することができる第３制御配
列に作用可能に連結された、ヘムタンパク質をコードす
る第３核酸配列の１又は複数のコピーを含んで成り、こ
こで前記ヘムタンパク質をコードする第３核酸配列は菌
類細胞のゲノム中に組込まれ、又は自己−複製染色体外
ベクターに含まれる。
糸状菌細胞の選択は、制御配列源、ヘム生合成酵素を
コードする核酸配列源及びヘムタンパク質源にかなりの
程度、依存するであろう。好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フ
サリウム、ヒュミコラ、マイセリオプソラ、ムコル、ニ
ューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラ
ジウム及びトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれ
らだけには限定されない。より好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス細胞である。もう
１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は
アクレモニウム細胞である。もう１つのより好ましい態
様においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞であ
る。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのより好ま
しい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリオプリ
ラ細胞である。もう１つのより好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞はムコル細胞である。もう１つのよ
り好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はニューロ
スポラ細胞である。もう１つのより好ましい態様におい
ては、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。もう
１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は
チエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞であ
る。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞はトリコダーマ細胞である。より好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス・フィキュ
ーム細胞、アスペルギラス・ホエチダス細胞、アスペル
ギラス・ジャポニカス細胞、アスペルギラス・ニガー細
胞、アスペルギラス・ニジュランス細胞、又はアスペル
ギラス・オリザエ細胞である。もう１つの最とも好まし
い態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・オ
キシスポラム細胞又はフサリウム・グラミネアラム細胞
である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞はヒューミコラ・インソレンス細胞又はヒ
ューミコララ・ヌギノサス細胞である。もう１つの最と
も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリ
オプソラサーモフィラム細胞である。もう１つの最とも
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はムコルミエ
ヘイ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様におい
ては、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ クラサ細胞で
ある。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状
菌宿主細胞はペニシリウムパープロゲニウム細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞はチエラビア・テレストリス細胞である。もう
１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞
は、トリコダーマ・ハルジアナム細胞、トリコダーマ・
コニンジ細胞、トリコダーマロンジブラキアタム細胞、
トリコダーマ・レセイ細胞、又はトリコダーマ・ビリデ
細胞である。
コードする核酸配列源及びヘムタンパク質源にかなりの
程度、依存するであろう。好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フ
サリウム、ヒュミコラ、マイセリオプソラ、ムコル、ニ
ューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラ
ジウム及びトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれ
らだけには限定されない。より好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス細胞である。もう
１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は
アクレモニウム細胞である。もう１つのより好ましい態
様においては、糸状菌宿主細胞はフサリウム細胞であ
る。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのより好ま
しい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリオプリ
ラ細胞である。もう１つのより好ましい態様において
は、糸状菌宿主細胞はムコル細胞である。もう１つのよ
り好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はニューロ
スポラ細胞である。もう１つのより好ましい態様におい
ては、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。もう
１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は
チエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞であ
る。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌宿
主細胞はトリコダーマ細胞である。より好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞はアスペルギラス・フィキュ
ーム細胞、アスペルギラス・ホエチダス細胞、アスペル
ギラス・ジャポニカス細胞、アスペルギラス・ニガー細
胞、アスペルギラス・ニジュランス細胞、又はアスペル
ギラス・オリザエ細胞である。もう１つの最とも好まし
い態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・オ
キシスポラム細胞又はフサリウム・グラミネアラム細胞
である。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞はヒューミコラ・インソレンス細胞又はヒ
ューミコララ・ヌギノサス細胞である。もう１つの最と
も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はマイセリ
オプソラサーモフィラム細胞である。もう１つの最とも
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞はムコルミエ
ヘイ細胞である。もう１つの最とも好ましい態様におい
ては、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ クラサ細胞で
ある。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状
菌宿主細胞はペニシリウムパープロゲニウム細胞であ
る。もう１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌
宿主細胞はチエラビア・テレストリス細胞である。もう
１つの最とも好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞
は、トリコダーマ・ハルジアナム細胞、トリコダーマ・
コニンジ細胞、トリコダーマロンジブラキアタム細胞、
トリコダーマ・レセイ細胞、又はトリコダーマ・ビリデ
細胞である。
本発明はさらに、次の例により記載されるが、しかし
それらは本発明の範囲を限定するものではない。
それらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
例1:アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNA抽出
アスペルギラス・オリザエ株A1560（IFO4177）を、0.
5％酵母抽出物−２％グルコース（YEG）培地25mlにおい
て32℃及び250rpmで24時間、増殖せしめた。次に、菌糸
体を、Miracloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通して
の濾過により集め、そして10mMのトリス−1mMのEDTA（T
E）緩衝液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を菌
子体から排水し、続いて、その菌子体を液体窒素におい
て凍結した。凍結された菌糸体を電気コーヒーグライン
ダーにより細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を使い
捨てプラスチック製遠心分離管におけるTE緩衝液20ml及
び20％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）5mlに
添加した。その混合物を数回、軽く逆にし、混合を確保
し、そして等体積のフェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール（25:24:1;v/v/v）により２度抽出し
た。酢酸ナトリウム（3M溶液）を添加し、0.3Mの最終濃
度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを添加し、
核酸を沈殿せしめた。次に、核酸を、15,000×ｇで30分
間、前記管を遠心分離することによりペレット化した。
そのペレットを30分間、空気乾燥せしめ、続いて、TE緩
衝液0.5mlに再懸濁した。DNアーゼ−フリーのリボヌク
レアーゼＡを添加し、100μg/mlの濃度にし、そしてそ
の混合物を37℃で30分間インキュベートした。次に、プ
ロテイナーゼＫを200μg/mlの濃度で添加し、そしてそ
の混合物を37℃でさらに１時間インキュベートした。最
終的に、前記混合物を、フェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（25:24:1;v/v/v）により２度、抽
出し、その後、前記のようにして、酢酸ナトリウム及び
エタノールによりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真
空下で乾燥せしめ、TE緩衝液に再懸濁し、そしてさらな
る使用まで、４℃で貯蔵した。
5％酵母抽出物−２％グルコース（YEG）培地25mlにおい
て32℃及び250rpmで24時間、増殖せしめた。次に、菌糸
体を、Miracloth（Calbiochem,La Jolla,CA）を通して
の濾過により集め、そして10mMのトリス−1mMのEDTA（T
E）緩衝液25mlにより１度洗浄した。過剰の緩衝液を菌
子体から排水し、続いて、その菌子体を液体窒素におい
て凍結した。凍結された菌糸体を電気コーヒーグライン
ダーにより細かな粉末に粉砕し、そしてその粉末を使い
捨てプラスチック製遠心分離管におけるTE緩衝液20ml及
び20％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）5mlに
添加した。その混合物を数回、軽く逆にし、混合を確保
し、そして等体積のフェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール（25:24:1;v/v/v）により２度抽出し
た。酢酸ナトリウム（3M溶液）を添加し、0.3Mの最終濃
度にし、続いて2.5体積の氷冷却エタノールを添加し、
核酸を沈殿せしめた。次に、核酸を、15,000×ｇで30分
間、前記管を遠心分離することによりペレット化した。
そのペレットを30分間、空気乾燥せしめ、続いて、TE緩
衝液0.5mlに再懸濁した。DNアーゼ−フリーのリボヌク
レアーゼＡを添加し、100μg/mlの濃度にし、そしてそ
の混合物を37℃で30分間インキュベートした。次に、プ
ロテイナーゼＫを200μg/mlの濃度で添加し、そしてそ
の混合物を37℃でさらに１時間インキュベートした。最
終的に、前記混合物を、フェノール：クロロホルム：イ
ソアミルアルコール（25:24:1;v/v/v）により２度、抽
出し、その後、前記のようにして、酢酸ナトリウム及び
エタノールによりDNAを沈殿せしめた。DNAペレットを真
空下で乾燥せしめ、TE緩衝液に再懸濁し、そしてさらな
る使用まで、４℃で貯蔵した。
例2:プラスミドpSE04の構成
ゲノムDNAを、例１に記載される同じ方法を用いて、
アスペルギラス・ニジュランス株A26（Fungal Genetics
stock Center,Kansas City,KS）から得た。プラスミド
pSE04を、アスペルギラス・ニジュランスA26ゲノムDNA
を含む増幅反応からのPCRフラグメントの連結により構
成した。前記増幅反応は、次の成分を含んだ:50ngのア
スペルギラス・ニジュランスA26ゲノムDNA、100μＭの
個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP（Boehringer Mannheim,
Indianapolis,IN）、50pモルのプラスミド及びALAS3d
5′−TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC−３′（配列番
号５）及びALAS4e 5′−CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTG
G−３′（配列番号６）、２単位のTaq DNAポリメラーゼ
（Perkin−Elmer Corp.,Branchburg,NJ）、及び１×Taq
DNAポリメラーゼ緩衝液（Perkin−Elmer Corp.,Branch
burg,NJ）。前記反応物を、それぞれ95℃で１分間、55
℃で１分間、及び72℃で90秒間、30サイクルの間プログ
ラムされたPerkin−Elmer Thermal Cycler（Perkin−El
mer Corp.,Branchburg,NJ）においてインキュベートし
た。2kbのPCR生成物を、1.1％の低溶融温度アガロース
ゲル（FMC,Rockland,ME）及び40mMのトリス−酢酸塩−1
mMのジナトリウムEDTA（TAE）緩衝液を用いての電気泳
動の後での切断により単離し、そして製造業者の説明書
に従って、pCR IIベクター（Invitrogen,San Diego,C
A）中にサブクローン化し、pSE04を生成した（図１）。
アスペルギラス・ニジュランス株A26（Fungal Genetics
stock Center,Kansas City,KS）から得た。プラスミド
pSE04を、アスペルギラス・ニジュランスA26ゲノムDNA
を含む増幅反応からのPCRフラグメントの連結により構
成した。前記増幅反応は、次の成分を含んだ:50ngのア
スペルギラス・ニジュランスA26ゲノムDNA、100μＭの
個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP（Boehringer Mannheim,
Indianapolis,IN）、50pモルのプラスミド及びALAS3d
5′−TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC−３′（配列番
号５）及びALAS4e 5′−CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTG
G−３′（配列番号６）、２単位のTaq DNAポリメラーゼ
（Perkin−Elmer Corp.,Branchburg,NJ）、及び１×Taq
DNAポリメラーゼ緩衝液（Perkin−Elmer Corp.,Branch
burg,NJ）。前記反応物を、それぞれ95℃で１分間、55
℃で１分間、及び72℃で90秒間、30サイクルの間プログ
ラムされたPerkin−Elmer Thermal Cycler（Perkin−El
mer Corp.,Branchburg,NJ）においてインキュベートし
た。2kbのPCR生成物を、1.1％の低溶融温度アガロース
ゲル（FMC,Rockland,ME）及び40mMのトリス−酢酸塩−1
mMのジナトリウムEDTA（TAE）緩衝液を用いての電気泳
動の後での切断により単離し、そして製造業者の説明書
に従って、pCR IIベクター（Invitrogen,San Diego,C
A）中にサブクローン化し、pSE04を生成した（図１）。
例3:アスペルギラス・オリザエ株A1560 DNAライブラリ
ー、及びALAシンターゼ（hemA）クローンの同定 アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラ
リーを、組換えバクテリオファージのプレート化及び精
製のための宿主としてE.コリY1090ZL細胞、及び個々のp
ZL1−hemAクローンの切断のためのE.コリDH10Bzipを用
いて、製造業者の説明書に従って、バクテリオファージ
クローニングベクターλZipLox（Life Technologies,Ga
ithersburg,MD）を用いて構成した。例１に記載される
ようにして調製された全細胞DNAを、Tsp509Iにより部分
的に消化し、そして50mMのトリス−50mMの硼素酸塩−1m
MのジナトリウムEDTA（TBE）緩衝液を用いて１％アガロ
ースゲル上でサイズ分別した。４〜7kbのサイズ範囲に
移動するDNAフラグメントを、Prep−ａ−Gene試薬（Bio
Rad Laboratories,Hercules,CA）を用いてゲルから切断
し、そして溶離した。その溶離されたDNAフラグメント
を、EcoR I−切断され、そして脱リン酸化されたλZipL
oxベクターアームと共に連結し、そしてその連結混合物
を市販のパッケージング抽出物（Stratagene,La Jolla,
CA）を用いてパッケージングした。そのパッケージされ
たDNAライブラリーを、E.コリY1090ZL細胞にプレート化
し、そして増幅した。増幅されていないゲノムライブラ
リーは、１×106pfu/mlを含んだ。
ー、及びALAシンターゼ（hemA）クローンの同定 アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラ
リーを、組換えバクテリオファージのプレート化及び精
製のための宿主としてE.コリY1090ZL細胞、及び個々のp
ZL1−hemAクローンの切断のためのE.コリDH10Bzipを用
いて、製造業者の説明書に従って、バクテリオファージ
クローニングベクターλZipLox（Life Technologies,Ga
ithersburg,MD）を用いて構成した。例１に記載される
ようにして調製された全細胞DNAを、Tsp509Iにより部分
的に消化し、そして50mMのトリス−50mMの硼素酸塩−1m
MのジナトリウムEDTA（TBE）緩衝液を用いて１％アガロ
ースゲル上でサイズ分別した。４〜7kbのサイズ範囲に
移動するDNAフラグメントを、Prep−ａ−Gene試薬（Bio
Rad Laboratories,Hercules,CA）を用いてゲルから切断
し、そして溶離した。その溶離されたDNAフラグメント
を、EcoR I−切断され、そして脱リン酸化されたλZipL
oxベクターアームと共に連結し、そしてその連結混合物
を市販のパッケージング抽出物（Stratagene,La Jolla,
CA）を用いてパッケージングした。そのパッケージされ
たDNAライブラリーを、E.コリY1090ZL細胞にプレート化
し、そして増幅した。増幅されていないゲノムライブラ
リーは、１×106pfu/mlを含んだ。
７×104個のプラークからのバクテリオファージDNA
を、円状Nytran Plus膜（Schleicher ＆ Schuell,Keen
e,NH）を重複するために移行し、そして例２に記載され
るプラスミドpSE04からのアスペルギラスニジュランスh
emAゲノムDNAのPCR増幅により調製された、ジゴキシゲ
ニン（DIG）−ラベルされたプローブによりプローブし
た。前記増幅反応は次の成分を含んだ:1×DIGプローブ
合成混合物（Boehringer Mannheim,Indianapolis,I
N）、100μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP、50pモ
ルの例２に記載されるプライマーALAS3d及びプライマー
ALAS4e、２単位のTaq DNAポリメラーゼ、及び１×Taq D
NAポリメラーゼ緩衝液。前記反応物を、それぞれ95℃で
１分間、55℃で１分間、及び72℃で２分間、30サイクル
の間プログラムされたPerkin−Elmer Thermal Cyclerに
おいてインキュベートした。変性されたプローブを、2n
g/mlの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、
そしてプレハイブリダイズされた膜と共に一晩インキュ
ベートした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションは、５×SSC,0.1％のサルコシル、0.02
％のSDS,1％のGeniusブロッキング剤（Boehringer Mann
heim,Indianapolis,IN）、及び30％ホルムアミド溶液に
おいて42℃で行なわれた。膜を、５×SSC−0.1％ SDSに
より２度、続いて２×SSC−0.1％ SDSにより２度洗浄し
た。個々の洗浄は室温で15分間、実施された。洗浄され
た膜を、室温で約２時間、Kodak X−OMAT ARフィルムに
露光し、続いて、製造業者の説明書に従って、Konica Q
X−70自動フィルム処理機を用いて現像した。主要プラ
ークを精製し、そして二度目に、スクリーンした。５個
のクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Research
Laboratories,Inc.,Gaithersburg,MD）に従って、同定
し、そしてpZL誘導体中に切り出した。pZL誘導体を、E.
コリDH5α pSE11,pSE13,pSE15,pSE17及びpSE20と命名し
た。それらのクローンは、制限地図が図２に示される、
4.2kbの領域をオーバーラップし、そして及ぶことが見
出された。
を、円状Nytran Plus膜（Schleicher ＆ Schuell,Keen
e,NH）を重複するために移行し、そして例２に記載され
るプラスミドpSE04からのアスペルギラスニジュランスh
emAゲノムDNAのPCR増幅により調製された、ジゴキシゲ
ニン（DIG）−ラベルされたプローブによりプローブし
た。前記増幅反応は次の成分を含んだ:1×DIGプローブ
合成混合物（Boehringer Mannheim,Indianapolis,I
N）、100μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP、50pモ
ルの例２に記載されるプライマーALAS3d及びプライマー
ALAS4e、２単位のTaq DNAポリメラーゼ、及び１×Taq D
NAポリメラーゼ緩衝液。前記反応物を、それぞれ95℃で
１分間、55℃で１分間、及び72℃で２分間、30サイクル
の間プログラムされたPerkin−Elmer Thermal Cyclerに
おいてインキュベートした。変性されたプローブを、2n
g/mlの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、
そしてプレハイブリダイズされた膜と共に一晩インキュ
ベートした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションは、５×SSC,0.1％のサルコシル、0.02
％のSDS,1％のGeniusブロッキング剤（Boehringer Mann
heim,Indianapolis,IN）、及び30％ホルムアミド溶液に
おいて42℃で行なわれた。膜を、５×SSC−0.1％ SDSに
より２度、続いて２×SSC−0.1％ SDSにより２度洗浄し
た。個々の洗浄は室温で15分間、実施された。洗浄され
た膜を、室温で約２時間、Kodak X−OMAT ARフィルムに
露光し、続いて、製造業者の説明書に従って、Konica Q
X−70自動フィルム処理機を用いて現像した。主要プラ
ークを精製し、そして二度目に、スクリーンした。５個
のクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Research
Laboratories,Inc.,Gaithersburg,MD）に従って、同定
し、そしてpZL誘導体中に切り出した。pZL誘導体を、E.
コリDH5α pSE11,pSE13,pSE15,pSE17及びpSE20と命名し
た。それらのクローンは、制限地図が図２に示される、
4.2kbの領域をオーバーラップし、そして及ぶことが見
出された。
例4:5−アミノレブリン酸シンターゼ（hemA）プローブ
によるアスペルギラスオリザエ株A1560ゲノムDNAのサザ
ンハイブリダイゼーション 例１に記載のようにして調製されたアスペルギラス・
オリザエ株A1560ゲノムDNA（10μｇ）を、BamH I又はEc
oR Iのいづれかにより制限消化した。フラグメントを、
１％アガロース−TBEゲル上での電気泳動により分離し
た。DNAを、製造業者の説明書に従ってTurboBlot装置
（Schleicher ＆ Schuell,Keene,NH）を用いて、0.4Nの
NaOHにおけるNytran Plus膜に移した。膜を、Hybaidオ
ーブン（Labnet,Woodbridge,NJ）における５×SSC,0.1
％サルコシル、0.02％ SDS,1％ Geniusブロッキング剤
（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）及び50％ホ
ルムアミド溶液において42℃で２時間、プレハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションを、例３に記載のよ
うにしてPCR増幅により生成される、DIG−ラベルされた
hemAプローブにより実施したが、但し、hemAクローンpS
E17を、プライマーhemA 5′ 5′−TCATTTAAATGATGGAGTC
TCTTCTCC−３′（配列番号７）及びプライマーhemA 3′
5′−TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG−３′（配列番号
８）と共に鋳型として使用した。DIG−ラベルされたhem
Aプローブ（1ngのプローブ/mlの溶液）を、新鮮なハイ
ブリダイゼーション緩衝液に添加し、そして前記膜と共
に42℃で一晩インキュベートした。続いて、膜を、室温
で５×SSC−0.1％ SDSにより15分間２度、続いて同じ条
件下で２×SSC−0.1％ SDSにより２度洗浄した。洗浄さ
れた膜をKodak X−OMAT ARフィルムに室温で２時間、露
光し、続いて製造業者の説明書に従って、Konica QX−7
0自動フィルム処理機を用いて現像した。
によるアスペルギラスオリザエ株A1560ゲノムDNAのサザ
ンハイブリダイゼーション 例１に記載のようにして調製されたアスペルギラス・
オリザエ株A1560ゲノムDNA（10μｇ）を、BamH I又はEc
oR Iのいづれかにより制限消化した。フラグメントを、
１％アガロース−TBEゲル上での電気泳動により分離し
た。DNAを、製造業者の説明書に従ってTurboBlot装置
（Schleicher ＆ Schuell,Keene,NH）を用いて、0.4Nの
NaOHにおけるNytran Plus膜に移した。膜を、Hybaidオ
ーブン（Labnet,Woodbridge,NJ）における５×SSC,0.1
％サルコシル、0.02％ SDS,1％ Geniusブロッキング剤
（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）及び50％ホ
ルムアミド溶液において42℃で２時間、プレハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションを、例３に記載のよ
うにしてPCR増幅により生成される、DIG−ラベルされた
hemAプローブにより実施したが、但し、hemAクローンpS
E17を、プライマーhemA 5′ 5′−TCATTTAAATGATGGAGTC
TCTTCTCC−３′（配列番号７）及びプライマーhemA 3′
5′−TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG−３′（配列番号
８）と共に鋳型として使用した。DIG−ラベルされたhem
Aプローブ（1ngのプローブ/mlの溶液）を、新鮮なハイ
ブリダイゼーション緩衝液に添加し、そして前記膜と共
に42℃で一晩インキュベートした。続いて、膜を、室温
で５×SSC−0.1％ SDSにより15分間２度、続いて同じ条
件下で２×SSC−0.1％ SDSにより２度洗浄した。洗浄さ
れた膜をKodak X−OMAT ARフィルムに室温で２時間、露
光し、続いて製造業者の説明書に従って、Konica QX−7
0自動フィルム処理機を用いて現像した。
アスペルギラス・オリザエhemAプローブによるアスペ
ルギラス・オリザエゲノムDNAのサザンブロットハイブ
リダイゼーションは、単一の遺伝子コピー数と適合する
ハイブリダイゼーションシグナルの存在を示した。BamH
Iレーンに観察される1.7kbのバンドが制限地図から示
された（図２）。
ルギラス・オリザエゲノムDNAのサザンブロットハイブ
リダイゼーションは、単一の遺伝子コピー数と適合する
ハイブリダイゼーションシグナルの存在を示した。BamH
Iレーンに観察される1.7kbのバンドが制限地図から示
された（図２）。
例5:アスペルギラス・オリザエA1560 ５−アミノレブ
リン酸シンターゼ（hemA）遺伝子の特徴化 例３に記載されるE.コリDH5α pSE17を、次の方法に
従ってDNA配列決定にゆだねた。両鎖のDNA配列決定を、
M13逆方向（−48）及びM13前方向（−20）プライマー
（New England Biolabs,Beverly,MA）及び配列決定され
るDNAに対して独得なプライマーを用いて、色素−ター
ミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法（Pr
imer walking technique）（Gieseckeなど.,1992,Journ
al of Virol.Methds 38:47−60）を用いるApplied Bios
ystems Model 373A Automated DNA Sequencer（Applied
Biosystems,Inc.,Foster City,CA）により実施した。
リン酸シンターゼ（hemA）遺伝子の特徴化 例３に記載されるE.コリDH5α pSE17を、次の方法に
従ってDNA配列決定にゆだねた。両鎖のDNA配列決定を、
M13逆方向（−48）及びM13前方向（−20）プライマー
（New England Biolabs,Beverly,MA）及び配列決定され
るDNAに対して独得なプライマーを用いて、色素−ター
ミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法（Pr
imer walking technique）（Gieseckeなど.,1992,Journ
al of Virol.Methds 38:47−60）を用いるApplied Bios
ystems Model 373A Automated DNA Sequencer（Applied
Biosystems,Inc.,Foster City,CA）により実施した。
クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列は、図３
に示されるような1911個のヌクレオチドの読取り枠を示
した（配列番号１）。そのコード配列は、cDNAクローニ
ング、及びその５′末端で１つのイントロンを含むアス
ペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子に対照しての配列
分析により確認されたいづれのイントロンも含まない
（Bradshawなど.,1993,Current Genetics 23:501−50
7）。５′末翻訳配列は、他の菌類遺伝子におけるよう
ないくつかのピリミジンに富んでいる領域及びATに富ん
でいる領域（Currなど.,1987,Kinghorn,J.R.（ed.）,Ge
ne Stracture in Eukaryotic Microbes,pp.93−139,IRL
Press,Oxford）、位置−249でのCCAAT配列、及び位置
−35で位置する推定上のTATAボックスを含む。CCAAT配
列は、酸素に応答して転写を調節する転写レギュレータ
ー、たとえば酵母及びヒトにおけるHap2/3/4転写調節複
合体のためのコンセンサス結合部位である（Olesen and
Guarente,1990,Molecular and Cellular Biology 12:2
302−2314）。この調節複合体はまた、哺乳類において
も保存され、そしてCCAAT−結合活性はアスペルギラス
ニジュランスにおいても同定されている（Davisなど.,1
993,Genetics 90:133−145）。アスペルギラス・オリザ
エhemA遺伝子におけるこの配列の重要性は知られておら
ず、そして制限された配列情報のために、アスペルギラ
スニジュランスhemA 5′領域においては確認されていな
い（Bradshawなど.,1993、前記）。酸素に応答してのア
スペルギラスオリザエhemA遺伝子の転写調節は現在知ら
れていないが、しかしアスペルギラス・ニジュランスhe
mA遺伝子は酸素制限の条件下でさえ転写的に調節される
とは思われない（Bradshawなど.,1993、前記）。興味あ
ることには、酵母HEM1遺伝子はまた、構成的に発現され
るが、しかしその発現は陽性及び陰性調節部位間のバラ
ンスにより制御される（Keng and Guarente,1987,Proce
edings of the National Academy of Sciences USA 84:
9113−9117）。（AC）35反復モチーフは３′末翻訳領域
に存在する。類似する反復体はまた、哺乳類及び酵母遺
伝子のサブテロマー、イントロン及びプロモーター領域
においても観察され、そしてそれらは遺伝子増幅現象に
おいて包含されるが、既知の機能を有さない（Passanan
tiなど.,1987,EMBO Journal 6:1697−1703）。
に示されるような1911個のヌクレオチドの読取り枠を示
した（配列番号１）。そのコード配列は、cDNAクローニ
ング、及びその５′末端で１つのイントロンを含むアス
ペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子に対照しての配列
分析により確認されたいづれのイントロンも含まない
（Bradshawなど.,1993,Current Genetics 23:501−50
7）。５′末翻訳配列は、他の菌類遺伝子におけるよう
ないくつかのピリミジンに富んでいる領域及びATに富ん
でいる領域（Currなど.,1987,Kinghorn,J.R.（ed.）,Ge
ne Stracture in Eukaryotic Microbes,pp.93−139,IRL
Press,Oxford）、位置−249でのCCAAT配列、及び位置
−35で位置する推定上のTATAボックスを含む。CCAAT配
列は、酸素に応答して転写を調節する転写レギュレータ
ー、たとえば酵母及びヒトにおけるHap2/3/4転写調節複
合体のためのコンセンサス結合部位である（Olesen and
Guarente,1990,Molecular and Cellular Biology 12:2
302−2314）。この調節複合体はまた、哺乳類において
も保存され、そしてCCAAT−結合活性はアスペルギラス
ニジュランスにおいても同定されている（Davisなど.,1
993,Genetics 90:133−145）。アスペルギラス・オリザ
エhemA遺伝子におけるこの配列の重要性は知られておら
ず、そして制限された配列情報のために、アスペルギラ
スニジュランスhemA 5′領域においては確認されていな
い（Bradshawなど.,1993、前記）。酸素に応答してのア
スペルギラスオリザエhemA遺伝子の転写調節は現在知ら
れていないが、しかしアスペルギラス・ニジュランスhe
mA遺伝子は酸素制限の条件下でさえ転写的に調節される
とは思われない（Bradshawなど.,1993、前記）。興味あ
ることには、酵母HEM1遺伝子はまた、構成的に発現され
るが、しかしその発現は陽性及び陰性調節部位間のバラ
ンスにより制御される（Keng and Guarente,1987,Proce
edings of the National Academy of Sciences USA 84:
9113−9117）。（AC）35反復モチーフは３′末翻訳領域
に存在する。類似する反復体はまた、哺乳類及び酵母遺
伝子のサブテロマー、イントロン及びプロモーター領域
においても観察され、そしてそれらは遺伝子増幅現象に
おいて包含されるが、既知の機能を有さない（Passanan
tiなど.,1987,EMBO Journal 6:1697−1703）。
アスペルギラス・オリザエ株A1560遺伝子生成物の推
定されるアミノ酸配列は図３に示されている（配列番号
２）。そのヌクレオチド配列は、68kDaの分子量を有す
る636個のアミノ酸の予測されるタンパク質をコードす
る。この酵素はミトコンドリアに位置するので、そのＮ
−末端はミトコンドリアリーダー配列を含むことが予測
される。実際、最初の35個のアミノ酸は、ミトコンドリ
アリーダーとしての機能と適合する、セリン、トレオニ
ン、リシン及びアルギニン残基に富んでいる。可能性あ
るヘム調節モチーフ（HRM）は、アスペルギラス・ニジ
ュランス及びアスペルギラス・オリザエhemA配列（図
４）の両者の推定されるミトコンドリアリーダー配列に
おいて存在する。リーダー配列に局在化されるHRMは、
ヘムとの直接的な相互作用を通してマウスにおけるミト
コンドリア中への５−アミノレブリン酸シンターゼタン
パク質の輸送を妨げると思われる（Lathrop and Timko,
1993,Science 259:522−525;Zhang and Guarente,1995,
EMBO Journal 14:313−320）。第２の可能性あるHRMは
また、推定上の成熟タンパク質配列の開始部にも存在す
る。HRMは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の調節
において役割を演じると思われる。興味あることには、
サッカロミセス・セレビシアエ５−アミノレブリン酸シ
ンターゼタンパク質配列は、いづれの推定上のHRMも含
まず、そして酵母ヘム生合成におけるキー調節段階であ
るとは思われない（Labbe−Bois and Labbe,In Daley,H
arry A.,ed.,Biosynthesis of Heme and chlorophylls,
1990,McGraw Hill Publishers,New York,pp.235−28
5）。
定されるアミノ酸配列は図３に示されている（配列番号
２）。そのヌクレオチド配列は、68kDaの分子量を有す
る636個のアミノ酸の予測されるタンパク質をコードす
る。この酵素はミトコンドリアに位置するので、そのＮ
−末端はミトコンドリアリーダー配列を含むことが予測
される。実際、最初の35個のアミノ酸は、ミトコンドリ
アリーダーとしての機能と適合する、セリン、トレオニ
ン、リシン及びアルギニン残基に富んでいる。可能性あ
るヘム調節モチーフ（HRM）は、アスペルギラス・ニジ
ュランス及びアスペルギラス・オリザエhemA配列（図
４）の両者の推定されるミトコンドリアリーダー配列に
おいて存在する。リーダー配列に局在化されるHRMは、
ヘムとの直接的な相互作用を通してマウスにおけるミト
コンドリア中への５−アミノレブリン酸シンターゼタン
パク質の輸送を妨げると思われる（Lathrop and Timko,
1993,Science 259:522−525;Zhang and Guarente,1995,
EMBO Journal 14:313−320）。第２の可能性あるHRMは
また、推定上の成熟タンパク質配列の開始部にも存在す
る。HRMは５−アミノレブリン酸シンターゼ活性の調節
において役割を演じると思われる。興味あることには、
サッカロミセス・セレビシアエ５−アミノレブリン酸シ
ンターゼタンパク質配列は、いづれの推定上のHRMも含
まず、そして酵母ヘム生合成におけるキー調節段階であ
るとは思われない（Labbe−Bois and Labbe,In Daley,H
arry A.,ed.,Biosynthesis of Heme and chlorophylls,
1990,McGraw Hill Publishers,New York,pp.235−28
5）。
全体的には、図５に示されるような推定されるアミノ
酸配列は、アスペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子
（配列番号22）と81％の同一性を共有し、サッカロミセ
ス・セレビシアエHEM1遺伝子（配列番号23;Urban−Grim
al,1986,European Journal of Biochemistry 156:511−
519）と57％の同一性を共有し、そしてヒト赤芽hem1（A
LAS2）遺伝子（配列番号24;Bishop,1990,Nucleic Acids
Research 18:7187−7188）と51％の同一性を共有する
（Applied Biosystems GeneAssistプログラム（blosum6
2.mat matrix）を用いて決定された）。しかしながら、
最高の程度の保存性が、触媒ドメインを含むタンパク質
のＣ末端の2/3において存在する。さらに、他の５−ア
ミノレブリン酸シンターゼ酵素における触媒活性及びピ
リドキサールリン酸補因子結合のために重要なリシン及
びグリシン−ループ（Ferreiraなど.,1995,Journal of
Bioenergetics and Biomembrances 27:151−159;Ferrei
ra,1995,Protein Science 4:1001−1006）はまた、高く
保存される。
酸配列は、アスペルギラス・ニジュランスhemA遺伝子
（配列番号22）と81％の同一性を共有し、サッカロミセ
ス・セレビシアエHEM1遺伝子（配列番号23;Urban−Grim
al,1986,European Journal of Biochemistry 156:511−
519）と57％の同一性を共有し、そしてヒト赤芽hem1（A
LAS2）遺伝子（配列番号24;Bishop,1990,Nucleic Acids
Research 18:7187−7188）と51％の同一性を共有する
（Applied Biosystems GeneAssistプログラム（blosum6
2.mat matrix）を用いて決定された）。しかしながら、
最高の程度の保存性が、触媒ドメインを含むタンパク質
のＣ末端の2/3において存在する。さらに、他の５−ア
ミノレブリン酸シンターゼ酵素における触媒活性及びピ
リドキサールリン酸補因子結合のために重要なリシン及
びグリシン−ループ（Ferreiraなど.,1995,Journal of
Bioenergetics and Biomembrances 27:151−159;Ferrei
ra,1995,Protein Science 4:1001−1006）はまた、高く
保存される。
例6:プラスミドpSE31の構成
プラスミドpSE31を、pBANe6中へのPCR−増幅されたア
スペルギラスオリザエhemA DNAの直接的なクローニング
により構成した（図６）。PCR増幅反応を、例３に記載
されるhemAクローンE.コリDH5α pSE17からのDNAを用い
て行ない、ここで前記反応は次の成分を含んだ:50ngのp
SE17、２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Bi
olabs,Beverly,MA）、１×Vent DNAポリメラーゼ緩衝液
（New England Biolabs,Beverly,MA）、400μＭの個々
のdATP,dCTP,dGTP、及びdTTP（Boehringer Mannheim,In
dianapolis,IN）、及び50pモルのプライマーhemA 5′
5′−TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC−３′（配列番号
７）及びプライマーhemA 3′ 5′−TCTTAATTAATCAGCTCA
CATGCGGG−３′（配列番号８）。前記反応物を、それぞ
れ95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で90秒間、30サ
イクルの間プログラムされたPerkin−Elmer Thermal Cy
clerにおいてインキュベートした。プライマーhemA 5′
は、Swa I部位（下線）を含み、そしてプライマーhemA
3′はPac I部位（下線）を含み、それらはpSE31を生成
するために、Swa I及びPac Iにより消化されたpBANe6中
へのクローニングのために使用された（図７）。
スペルギラスオリザエhemA DNAの直接的なクローニング
により構成した（図６）。PCR増幅反応を、例３に記載
されるhemAクローンE.コリDH5α pSE17からのDNAを用い
て行ない、ここで前記反応は次の成分を含んだ:50ngのp
SE17、２単位のVent DNAポリメラーゼ（New England Bi
olabs,Beverly,MA）、１×Vent DNAポリメラーゼ緩衝液
（New England Biolabs,Beverly,MA）、400μＭの個々
のdATP,dCTP,dGTP、及びdTTP（Boehringer Mannheim,In
dianapolis,IN）、及び50pモルのプライマーhemA 5′
5′−TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC−３′（配列番号
７）及びプライマーhemA 3′ 5′−TCTTAATTAATCAGCTCA
CATGCGGG−３′（配列番号８）。前記反応物を、それぞ
れ95℃で１分間、55℃で１分間及び72℃で90秒間、30サ
イクルの間プログラムされたPerkin−Elmer Thermal Cy
clerにおいてインキュベートした。プライマーhemA 5′
は、Swa I部位（下線）を含み、そしてプライマーhemA
3′はPac I部位（下線）を含み、それらはpSE31を生成
するために、Swa I及びPac Iにより消化されたpBANe6中
へのクローニングのために使用された（図７）。
例7:アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18Aの構成
プラスミドpJROC50を含むアスペルギラスオリザエ株J
RoC50.3.18Aを、次のようにして構成した。コプリナス
シネレウス（Coprinus cinereus）IFO8371ペルオキシ
ダーゼcDNAフラグメントを、コプリナス マクロリザス
（Coprinus macrothizus）ペルオキシダーゼのアミノ酸
配列（Baunsgaardなど.,1993,European Journal of Bio
chemistry 213:605−611）に基づいて構成された、下記
に示される特定のオリゴヌクレオチドプライマー（Saik
iなど.,1988,Science 239:487−491）を用いてのPCRに
より調製した： PCRを、Gene Amp Kit及び装置（Perkin Elmer Cetas,
Norwalk,CT）を用いて製造業者の説明書に従って実施
し、但し、反応は、第１鎖cDNA（コプリナスシネレウス
株IFO8371から得られるmRNAから調製された）への良好
なハイブリダイゼーションを得るために、PCRの最初の
３サイクルの間28℃で、及び続いて30サイクルの間65℃
で行なわれた。
RoC50.3.18Aを、次のようにして構成した。コプリナス
シネレウス（Coprinus cinereus）IFO8371ペルオキシ
ダーゼcDNAフラグメントを、コプリナス マクロリザス
（Coprinus macrothizus）ペルオキシダーゼのアミノ酸
配列（Baunsgaardなど.,1993,European Journal of Bio
chemistry 213:605−611）に基づいて構成された、下記
に示される特定のオリゴヌクレオチドプライマー（Saik
iなど.,1988,Science 239:487−491）を用いてのPCRに
より調製した： PCRを、Gene Amp Kit及び装置（Perkin Elmer Cetas,
Norwalk,CT）を用いて製造業者の説明書に従って実施
し、但し、反応は、第１鎖cDNA（コプリナスシネレウス
株IFO8371から得られるmRNAから調製された）への良好
なハイブリダイゼーションを得るために、PCRの最初の
３サイクルの間28℃で、及び続いて30サイクルの間65℃
で行なわれた。
プライマーを次のようにして組合した:1と2;3と4;5と
7;6と7;1と4;及び３と７。PCRフラグメントを、５′末
端でのEcoR I部位及び３′末端でのBamH I部位により延
長した。反応を１％アガロース−TBEゲル上で分析し、
ここで予測されるサイズのバンドがすべての反応におい
て見出された。バンドがペルオキシダーゼ−特異的配列
に対応することを確証するために、ゲルをサザンブロッ
トにゆだね、そしてプライマー３と４との間に位置する
次の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズした： ５′−GT（CT）TC（GA）AT（GA）TAGAA（CT）TG−
３′（配列番号16）。
7;6と7;1と4;及び３と７。PCRフラグメントを、５′末
端でのEcoR I部位及び３′末端でのBamH I部位により延
長した。反応を１％アガロース−TBEゲル上で分析し、
ここで予測されるサイズのバンドがすべての反応におい
て見出された。バンドがペルオキシダーゼ−特異的配列
に対応することを確証するために、ゲルをサザンブロッ
トにゆだね、そしてプライマー３と４との間に位置する
次の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにハイブ
リダイズした： ５′−GT（CT）TC（GA）AT（GA）TAGAA（CT）TG−
３′（配列番号16）。
前記プローブは、約130bp,420bp,540bp及び240bpのバ
ンドにハイブリダイズすることが見出され、従って観察
されるDNAバンドがペルオキシダーゼ配列に対応するこ
とを確認した。
ンドにハイブリダイズすることが見出され、従って観察
されるDNAバンドがペルオキシダーゼ配列に対応するこ
とを確認した。
種々のPCR反応からのDNAを、EcoR I及びBamH Iにより
消化し、そしてプラスミドpUC19（New England BioLab
s,Beverly,MA）中にクローン化した。正しいPCRフラグ
メントを含むコロニーを、上記オリゴヌクレオチドプロ
ーブ（配列番号16）を用いてのハイブリダイゼーション
により同定した。陽性コロニーからのDNAを、Sangerな
ど．（1977,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74:5463−5467）により記載されるように
して制限マッピング及び部分DNA配列分析により分析し
た。プライマー１及び４を用いることによって得られ
た、クローンの１つからの430bpフラグメントを用い
て、下記のようにしてコプリナスシネレウスcDNAライブ
ラリーをスクリーンした。
消化し、そしてプラスミドpUC19（New England BioLab
s,Beverly,MA）中にクローン化した。正しいPCRフラグ
メントを含むコロニーを、上記オリゴヌクレオチドプロ
ーブ（配列番号16）を用いてのハイブリダイゼーション
により同定した。陽性コロニーからのDNAを、Sangerな
ど．（1977,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74:5463−5467）により記載されるように
して制限マッピング及び部分DNA配列分析により分析し
た。プライマー１及び４を用いることによって得られ
た、クローンの１つからの430bpフラグメントを用い
て、下記のようにしてコプリナスシネレウスcDNAライブ
ラリーをスクリーンした。
全RNAを、Boelなど．（1984,EMBO Journal 3:1097−1
102）及びChirgwinなど．（1979,Biochemistry 18:5294
−5299）により記載される方法に従って、最大のペルオ
キシダーゼ活性の時点で集められた、均質化されたコプ
リナス・シネレウス株IFO8371菌糸体から抽出した。ポ
リ（Ａ）−含有RNAを、Ariv and Leder（1972,Proceedi
ngs of the National Academy of Science USA 69:1408
−1412）により記載のようにして、オリゴ（dT）−セル
ロース上での２サイクルの親和性クロマトグラフィーに
より得た。cDNAを、cDNA Synthesis Kit（Invitrogen,S
an Diego,CA）により製造業者の説明書に従って合成し
た。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約
50,000個のE.コリ組換え体を、Whatman 540紙フィルタ
ーに移した。コロニーを、Gergerなど．（1979,Nucleic
Acids Research 7:2115−2135）により記載のようにし
て、溶解し、そして固定した。フィルターを、0.2×SSC
−0.1％ SDSにおける32P−ラベルされた430bpペルオキ
シダーゼ−特異的プローブによりハイブリダイズした。
フィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を65℃で
実施し、続いて、増強装置スクリーンにより24時間オー
トラジオグラフィー処理した。オートラジオグラフィー
の後、フィルターを上昇する温度で洗浄し、続いて、増
強装置スクリーンにより24時間オートラジオグラフィー
処理した。この場合、50個以上の陽性クローンを同定し
た。MiniprepプラスミドDNAを、標準方法（Birnboim an
d Doly,1979,Nucleic Acids Research 7:1513−1523）
によりハイブリダイズするコロニーから単離し、そして
cDNA挿入体のDNA配列を、Sangerジデオキシ方法（Sange
rなど.,1977,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74:5463−5467）により決定した。コロ
ニーの１つを選択し、そしてpCipと命名した。ペルオキ
シダーゼcDNAフラグメントを、BamH I/Xho Iによる切断
によりベクターから切り出し、そしてアガロースゲル電
気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応のた
めに容易にした。cDNAフラグメントを、BamH I/Xho Iに
より消化されたpHD414に連結し、pJV19を生成し、ここ
でcDNAは、図８に示されるように、アスペルギラスオリ
ザエからのTAKAプロモーター及びアスペルギラスニガー
からのAMGTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaed,Denmark）タ
ーミネーターの転写制御下に存在した。
102）及びChirgwinなど．（1979,Biochemistry 18:5294
−5299）により記載される方法に従って、最大のペルオ
キシダーゼ活性の時点で集められた、均質化されたコプ
リナス・シネレウス株IFO8371菌糸体から抽出した。ポ
リ（Ａ）−含有RNAを、Ariv and Leder（1972,Proceedi
ngs of the National Academy of Science USA 69:1408
−1412）により記載のようにして、オリゴ（dT）−セル
ロース上での２サイクルの親和性クロマトグラフィーに
より得た。cDNAを、cDNA Synthesis Kit（Invitrogen,S
an Diego,CA）により製造業者の説明書に従って合成し
た。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約
50,000個のE.コリ組換え体を、Whatman 540紙フィルタ
ーに移した。コロニーを、Gergerなど．（1979,Nucleic
Acids Research 7:2115−2135）により記載のようにし
て、溶解し、そして固定した。フィルターを、0.2×SSC
−0.1％ SDSにおける32P−ラベルされた430bpペルオキ
シダーゼ−特異的プローブによりハイブリダイズした。
フィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を65℃で
実施し、続いて、増強装置スクリーンにより24時間オー
トラジオグラフィー処理した。オートラジオグラフィー
の後、フィルターを上昇する温度で洗浄し、続いて、増
強装置スクリーンにより24時間オートラジオグラフィー
処理した。この場合、50個以上の陽性クローンを同定し
た。MiniprepプラスミドDNAを、標準方法（Birnboim an
d Doly,1979,Nucleic Acids Research 7:1513−1523）
によりハイブリダイズするコロニーから単離し、そして
cDNA挿入体のDNA配列を、Sangerジデオキシ方法（Sange
rなど.,1977,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74:5463−5467）により決定した。コロ
ニーの１つを選択し、そしてpCipと命名した。ペルオキ
シダーゼcDNAフラグメントを、BamH I/Xho Iによる切断
によりベクターから切り出し、そしてアガロースゲル電
気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応のた
めに容易にした。cDNAフラグメントを、BamH I/Xho Iに
より消化されたpHD414に連結し、pJV19を生成し、ここ
でcDNAは、図８に示されるように、アスペルギラスオリ
ザエからのTAKAプロモーター及びアスペルギラスニガー
からのAMGTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaed,Denmark）タ
ーミネーターの転写制御下に存在した。
コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼをコードす
るcDNAを、BamH I−Xho Iフラグメントとしてプラスミ
ドpJVi9から切り出し、そしてプラスミドpJeRS6（図
９）中にクローン化し、選択マーカーとしてのpyrG、TA
KAプロモーター及びamdSターミネーターを含むプラスミ
ドpJRoC50（図10）を生成した。
るcDNAを、BamH I−Xho Iフラグメントとしてプラスミ
ドpJVi9から切り出し、そしてプラスミドpJeRS6（図
９）中にクローン化し、選択マーカーとしてのpyrG、TA
KAプロモーター及びamdSターミネーターを含むプラスミ
ドpJRoC50（図10）を生成した。
アスペルギラスオリザエ株HowB425の形質転換体を、
次の変更を伴って、下記のようにして５μｇの精製され
たプラスミドpJRoC50を用いて製造した。寒天被膜を除
去し、そしてプロトプラストを最少培地プレート上に直
接的にプレートした。形質転換を、２×107個のプロト
プラスト/mlの濃度でプロトプラストにより実施した。1
00μｌのプロトプラストを、５μｇのDNAと共に氷上に3
0分間プレートした。1mlのSPTC（40％のPEG 4000、0.8M
のソルビトール、0.05Mのトリス、pH8.0、0.05MのCaC
l2）を添加し、そしてプロトプラストを34℃で20分間イ
ンキュベートした。形質転換体を、最少培地を含むプレ
ート上に直接的にプレートした。最少培地（pH6.5）
は、１当たり、6gのNaNO3,0.52gのKCl,1.52gのKH2P
O4,1mlの微量金属、1gのグルコース、500mgのMgSO4・7H
2O,342.3gのスクロース、及び20gのNoble寒天から構成
された。微量金属溶液（1000×）は、１当たり、22g
のZnSO4・7H2O,11gのH3BO3,5gのMnCl2・4H2O,5gのFeSO4
・7H2O,1.6gのCoCl2・5H2O,1.6gの（NH4）6Mo7O24、及
び50gのNa4EDTAから構成された。プレートを34℃で５〜
７日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプ
レートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベート
した。
次の変更を伴って、下記のようにして５μｇの精製され
たプラスミドpJRoC50を用いて製造した。寒天被膜を除
去し、そしてプロトプラストを最少培地プレート上に直
接的にプレートした。形質転換を、２×107個のプロト
プラスト/mlの濃度でプロトプラストにより実施した。1
00μｌのプロトプラストを、５μｇのDNAと共に氷上に3
0分間プレートした。1mlのSPTC（40％のPEG 4000、0.8M
のソルビトール、0.05Mのトリス、pH8.0、0.05MのCaC
l2）を添加し、そしてプロトプラストを34℃で20分間イ
ンキュベートした。形質転換体を、最少培地を含むプレ
ート上に直接的にプレートした。最少培地（pH6.5）
は、１当たり、6gのNaNO3,0.52gのKCl,1.52gのKH2P
O4,1mlの微量金属、1gのグルコース、500mgのMgSO4・7H
2O,342.3gのスクロース、及び20gのNoble寒天から構成
された。微量金属溶液（1000×）は、１当たり、22g
のZnSO4・7H2O,11gのH3BO3,5gのMnCl2・4H2O,5gのFeSO4
・7H2O,1.6gのCoCl2・5H2O,1.6gの（NH4）6Mo7O24、及
び50gのNa4EDTAから構成された。プレートを34℃で５〜
７日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地のプ
レートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベート
した。
66の形質転換体を次の酵素アッセイを用いて、ペルオ
キシダーゼ活性についてアッセイした:180μｌの基質緩
衝液｛20μｌの0.1Mリン酸カリウム−0.01％ Tween−8
0,pH7.0,250μｌの2,2′−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホネート）（ABTS）溶液（22mg
/ml）及び２μｌの30％過酸化水素｝を、1:900に希釈さ
れた培養物上清液20μｌに添加し、続いてすぐに、Mole
cular Devices Thermomax Microplate Reader（Molecul
ar Devices,Sunnyvale,CA）を用いて25℃で、405nmでの
吸光度を測定した。測定値は、混合しながら２分間にわ
たって10秒ごとに記録され、そしてVmax値はSOFTmaxプ
ログラム（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて
計算された。1ml当たりのペルオキシダーゼ単位（POX
U）を、標準として既知量のコプリナスシネレウスペル
オキシダーゼにより構成された標準曲線を用いて推定し
た。POXUを、30℃で１分当たり、0.88μＭのH2O2,1.67m
MのABTS,0.1Mのリン酸（pH7.0）の溶液1.0μＭの転換を
触媒する酵素の量として定義した。最高レベルを発現す
る４種の形質転換体は、上記と同じ条件下で同じプレー
トを用いて胞子を画線培養し、そして単離されたコロニ
ーを採取することによって精製された胞子であった。
キシダーゼ活性についてアッセイした:180μｌの基質緩
衝液｛20μｌの0.1Mリン酸カリウム−0.01％ Tween−8
0,pH7.0,250μｌの2,2′−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホネート）（ABTS）溶液（22mg
/ml）及び２μｌの30％過酸化水素｝を、1:900に希釈さ
れた培養物上清液20μｌに添加し、続いてすぐに、Mole
cular Devices Thermomax Microplate Reader（Molecul
ar Devices,Sunnyvale,CA）を用いて25℃で、405nmでの
吸光度を測定した。測定値は、混合しながら２分間にわ
たって10秒ごとに記録され、そしてVmax値はSOFTmaxプ
ログラム（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）を用いて
計算された。1ml当たりのペルオキシダーゼ単位（POX
U）を、標準として既知量のコプリナスシネレウスペル
オキシダーゼにより構成された標準曲線を用いて推定し
た。POXUを、30℃で１分当たり、0.88μＭのH2O2,1.67m
MのABTS,0.1Mのリン酸（pH7.0）の溶液1.0μＭの転換を
触媒する酵素の量として定義した。最高レベルを発現す
る４種の形質転換体は、上記と同じ条件下で同じプレー
トを用いて胞子を画線培養し、そして単離されたコロニ
ーを採取することによって精製された胞子であった。
最終評価を、個々の形質転換体の約５×106個の胞子
が、１％酵母抽出物、2.5％マルトース、0.2％尿素、及
び１×MY塩（pH6.5）を含む25mlのMY25培地中に接種さ
れている振盪フラスコにおいて実施した。１×MY塩は、
2gのMgSO4・7H2O,2gのK2PO4,10gのKH2PO4,2gのクエン
酸、0.5mlの微量金属溶液及び1mlの10％ CaCl2・2H2O
（１当たり）から構成された。微量金属溶液は、１
当たり13.9gのFeSO4・7H2O,8.5gのMnSO4・H2O,14.28gの
ZnSO4・7H2O,1.63gのCuSO4,0.24gのNiCl2・6H2O及び3.0
gのクエン酸から構成された。ヘミンを、50mMのNaOHに
おいて調製された新鮮な10mg/ml原液から添加し、0.01m
g/mlの最終濃度にした。振盪フラスコを、34℃及び200r
pmで７〜８日間インキュベートした。最良のペルオキシ
ダーゼ生成体を、JRoC50.3.18Aと命名した。
が、１％酵母抽出物、2.5％マルトース、0.2％尿素、及
び１×MY塩（pH6.5）を含む25mlのMY25培地中に接種さ
れている振盪フラスコにおいて実施した。１×MY塩は、
2gのMgSO4・7H2O,2gのK2PO4,10gのKH2PO4,2gのクエン
酸、0.5mlの微量金属溶液及び1mlの10％ CaCl2・2H2O
（１当たり）から構成された。微量金属溶液は、１
当たり13.9gのFeSO4・7H2O,8.5gのMnSO4・H2O,14.28gの
ZnSO4・7H2O,1.63gのCuSO4,0.24gのNiCl2・6H2O及び3.0
gのクエン酸から構成された。ヘミンを、50mMのNaOHに
おいて調製された新鮮な10mg/ml原液から添加し、0.01m
g/mlの最終濃度にした。振盪フラスコを、34℃及び200r
pmで７〜８日間インキュベートした。最良のペルオキシ
ダーゼ生成体を、JRoC50.3.18Aと命名した。
例8:pSE31によるアスペルギラス・オリザエJRoC50.3.18
Aの形質転換 アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18AをpSE31に
より形質転換し、hemA遺伝子の過剰発現がペルオキシダ
ーゼ生成を高めるかどうかを決定した。
Aの形質転換 アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18AをpSE31に
より形質転換し、hemA遺伝子の過剰発現がペルオキシダ
ーゼ生成を高めるかどうかを決定した。
形質転換を、1ml当たり２×107個のプロトプラストの
濃度でプロトプラストにより行なった。100μｌのプロ
トプラストを34℃で、30分間、10μｇのDNA及び60％ PE
G4000−10mMのHEPES−10mMのCaCl2溶液200μｌと共にイ
ンキュベートした。3mlのSPTC（40％ PEG4000、0.8Mの
ソルビトール、0.05Mのトリス、pH8.0、0.05MのCaCl2）
を添加し、そしてプロトプラストを、amdS形質転換のた
めにCOVE形質転換プレート（１当たり:0.52gのKCl、
0.52gのMgSO4・7H2O,1.52gのKH2PO4、例７に記載のよう
な微量金属溶液1ml,342.3gのスクロース、25gの貴ガ
ス、1Mのアセトアミド10ml、及び3MのCsCl 10ml）上に
直接的にプレートした。プレートを34℃で５〜７日間イ
ンキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに
移し、そして34℃で３〜５日間インキュベートした。次
に、形質転換体を、同じ条件下で同じプレートを用い
て、胞子を画線培養し、そして単離されたコロニーを採
取することによって精製した。
濃度でプロトプラストにより行なった。100μｌのプロ
トプラストを34℃で、30分間、10μｇのDNA及び60％ PE
G4000−10mMのHEPES−10mMのCaCl2溶液200μｌと共にイ
ンキュベートした。3mlのSPTC（40％ PEG4000、0.8Mの
ソルビトール、0.05Mのトリス、pH8.0、0.05MのCaCl2）
を添加し、そしてプロトプラストを、amdS形質転換のた
めにCOVE形質転換プレート（１当たり:0.52gのKCl、
0.52gのMgSO4・7H2O,1.52gのKH2PO4、例７に記載のよう
な微量金属溶液1ml,342.3gのスクロース、25gの貴ガ
ス、1Mのアセトアミド10ml、及び3MのCsCl 10ml）上に
直接的にプレートした。プレートを34℃で５〜７日間イ
ンキュベートした。形質転換体を同じ培地のプレートに
移し、そして34℃で３〜５日間インキュベートした。次
に、形質転換体を、同じ条件下で同じプレートを用い
て、胞子を画線培養し、そして単離されたコロニーを採
取することによって精製した。
例9:hemA形質転換体によるペルオキシダーゼ生成
例８からの形質転換体を、0.25％の酵母抽出物、0.63
％のマルトース及び0.05％の尿素（pH6.5）並びに１×M
Y塩（例７を参照のこと）から構成されるMY25培地1mlを
含む24ウェル−マイクロタイタープレートの個々のウェ
ル中に約１×105個の胞子／ウェルで接種した。マイク
ロタイタープレートを34℃及び100rpmで５日間、保湿チ
ャンバーにおいてインキュベートした。
％のマルトース及び0.05％の尿素（pH6.5）並びに１×M
Y塩（例７を参照のこと）から構成されるMY25培地1mlを
含む24ウェル−マイクロタイタープレートの個々のウェ
ル中に約１×105個の胞子／ウェルで接種した。マイク
ロタイタープレートを34℃及び100rpmで５日間、保湿チ
ャンバーにおいてインキュベートした。
ペルオキシダーゼ生成レベルを、例７に記載される酵
素アッセイを用いて決定した。マイクロタイタープレー
ト試験の結果は、hemA形質転換体の平均POXU/mlがベク
ターのみの形質転換体の平均よりも1.4倍高く、そして
最良のhemA形質転換体がペルオキシダーゼ生成において
1.6倍の上昇率を示したことを示す。
素アッセイを用いて決定した。マイクロタイタープレー
ト試験の結果は、hemA形質転換体の平均POXU/mlがベク
ターのみの形質転換体の平均よりも1.4倍高く、そして
最良のhemA形質転換体がペルオキシダーゼ生成において
1.6倍の上昇率を示したことを示す。
少数脈（39％）のhemA形質転換体は、ベクターのみの
対照の多数脈に類似するペルオキシダーゼレベルを示
す。個々の形質転換体から例１に記載されるようにして
単離されたゲノムDNA 50ngを用いてのPCR増幅を、例２
に記載のようにして実施したが、但しプライマーhemA
3′（例４を参照のこと）及びプライマー５′−TCTCTTC
CTTCCTGAATCCTC−３′（配列番号17）を使用した。この
分析は、hemA形質転換体が発現カセットを含むことを示
した。
対照の多数脈に類似するペルオキシダーゼレベルを示
す。個々の形質転換体から例１に記載されるようにして
単離されたゲノムDNA 50ngを用いてのPCR増幅を、例２
に記載のようにして実施したが、但しプライマーhemA
3′（例４を参照のこと）及びプライマー５′−TCTCTTC
CTTCCTGAATCCTC−３′（配列番号17）を使用した。この
分析は、hemA形質転換体が発現カセットを含むことを示
した。
上記で得られた11の最良hemA形質転換体を振盪フラス
コにおいて培養し、ペルオキシダーゼ生成に対する効果
を最良に評価した。振盪フラスコ評価のためには、個々
の形質転換体の約５×106個の胞子を、１％酵母抽出
物、2.5％のマルトース、0.2％の尿素、及び１×MY塩
（pH6.5）（例７を参照のこと）を含むMY25培地25ml中
に接種した。振盪フラスコを34℃及び200rpmで７〜８日
間インキュベートした。ペルオキシダーゼアッセイを上
記のようにして実施した。
コにおいて培養し、ペルオキシダーゼ生成に対する効果
を最良に評価した。振盪フラスコ評価のためには、個々
の形質転換体の約５×106個の胞子を、１％酵母抽出
物、2.5％のマルトース、0.2％の尿素、及び１×MY塩
（pH6.5）（例７を参照のこと）を含むMY25培地25ml中
に接種した。振盪フラスコを34℃及び200rpmで７〜８日
間インキュベートした。ペルオキシダーゼアッセイを上
記のようにして実施した。
その結果は、５種の形質転換体SE01−15,SE01−20,SE
01−26,SE01−28及びSE01−32がベクターのみの対照株
よりも高いペルオキシダーゼレベルを生成し、そして３
種の形質転換体が平均の対照ペルオキシダーゼレベルよ
りも1.9倍高いレベルでペルオキシダーゼを発現するこ
とを示した。残る６種のhemA形質転換体は、対照レベル
に相当できるペルオキシダーゼレベルを示した。
01−26,SE01−28及びSE01−32がベクターのみの対照株
よりも高いペルオキシダーゼレベルを生成し、そして３
種の形質転換体が平均の対照ペルオキシダーゼレベルよ
りも1.9倍高いレベルでペルオキシダーゼを発現するこ
とを示した。残る６種のhemA形質転換体は、対照レベル
に相当できるペルオキシダーゼレベルを示した。
形質転換体SE01−28及び対照株SE05−18（pBANe6ベク
ターのみの形質転換体）を、炭素源として高マルトース
シロップを有する標準供給バッチプロトコールを用い
て、２の発酵において増殖した。前記バッチ及び供給
物を、FeCl3により補充し、約0.4mMの濃度にした。陽性
の溶解された酸素状態を、３日目から８日目まで約2gの
サッカリド／／時の速度で添加される供給物により両
培養物において維持した。このレベルは、２日目及び３
日目で段階的に達成された。両培養物におけるバイオマ
スは、発酵の期間、ほぼ等しかった。
ターのみの形質転換体）を、炭素源として高マルトース
シロップを有する標準供給バッチプロトコールを用い
て、２の発酵において増殖した。前記バッチ及び供給
物を、FeCl3により補充し、約0.4mMの濃度にした。陽性
の溶解された酸素状態を、３日目から８日目まで約2gの
サッカリド／／時の速度で添加される供給物により両
培養物において維持した。このレベルは、２日目及び３
日目で段階的に達成された。両培養物におけるバイオマ
スは、発酵の期間、ほぼ等しかった。
ペルオキシダーゼ活性の対照株SE05−18に対する２倍
の上昇率がSE01−28により観察された。対照株SE05−18
に対する、SE01−28のためのポリペプチドレベルの２倍
の上昇率がまた存在した。
の上昇率がSE01−28により観察された。対照株SE05−18
に対する、SE01−28のためのポリペプチドレベルの２倍
の上昇率がまた存在した。
それらの全体の結果は、hemA遺伝子の過剰発現がペル
オキシダーゼ生成において２倍の上昇率をもたらしたこ
とを示した。データは、hemAが、遺伝子操作に基づい
て、ヘミン補充の不在下でヘムタンパク質生成を改良す
ることができる糸状菌におけるヘム生合成の間キー調節
点を示すことができることをさらに示唆した。
オキシダーゼ生成において２倍の上昇率をもたらしたこ
とを示した。データは、hemAが、遺伝子操作に基づい
て、ヘミン補充の不在下でヘムタンパク質生成を改良す
ることができる糸状菌におけるヘム生合成の間キー調節
点を示すことができることをさらに示唆した。
例10:PCRによるゲノムhemBプローブの生成
縮重PCRプライマーを、アスペルギラスオリザエから
の126bpのhemBフラグメント（Jesper Vind,1994,Ph.D.D
issertation,University of Copenhagen,Copenhagen,De
nmark）及び酵母及びヒトhemBクローンの相同領域（Mye
rsなど.,1987,Journal of Biological Chemistry 262:1
6822−16829;Wetmurなど.,1986,Proceedings of the Na
tional Academy of Science USA 83:7703−7707）を端
に有するアミノ酸配列に基づいて企画した。オリゴヌク
レオチドプライマーを、Applied Biosystems Model 394
DNA/RNA Synthesizerを用いて合成した。センス５′−
GT（AGCT）GC（AGCT）CC（AGCT）（AT）（CG）（AGCT）
GA（CT）ATGATGGA−３′（配列番号18）及びアンチセン
ス５′−GC（AG）TC（AGCT）CG/T（AG）AA（AGCT）CC
（AG）TA−３′（配列番号19）プライマーが、鋳型とし
てpJVi60（Vind,1994、前記）を用いてhemBフラグメン
トをPCR増幅するために使用された。そのPCR反応物（50
μｌ）は、10mMのトリス−HCl,pH8.3,50mMのKCl,1.5mM
のMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、200μＭの個々のdA
TP,dCTP,dGTP及びdTTP,500ngのpJVi60及び50pモルの上
記の個々のPCRプライマーから構成された。反応物を95
℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。
次に、５単位のTaqポリメラーゼを添加した。反応物
を、それぞれ95℃で30秒間、45℃で１分間及び72℃で１
分間、35サイクルの間プログラムされたPerkin−Elmer
9600 Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。最
後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキュ
ベートした。予測される126bpのhemB PCR生成物をPCR I
Iベクター中にクローン化し、プラスミドpAJ005−１
（図11）を生成した。
の126bpのhemBフラグメント（Jesper Vind,1994,Ph.D.D
issertation,University of Copenhagen,Copenhagen,De
nmark）及び酵母及びヒトhemBクローンの相同領域（Mye
rsなど.,1987,Journal of Biological Chemistry 262:1
6822−16829;Wetmurなど.,1986,Proceedings of the Na
tional Academy of Science USA 83:7703−7707）を端
に有するアミノ酸配列に基づいて企画した。オリゴヌク
レオチドプライマーを、Applied Biosystems Model 394
DNA/RNA Synthesizerを用いて合成した。センス５′−
GT（AGCT）GC（AGCT）CC（AGCT）（AT）（CG）（AGCT）
GA（CT）ATGATGGA−３′（配列番号18）及びアンチセン
ス５′−GC（AG）TC（AGCT）CG/T（AG）AA（AGCT）CC
（AG）TA−３′（配列番号19）プライマーが、鋳型とし
てpJVi60（Vind,1994、前記）を用いてhemBフラグメン
トをPCR増幅するために使用された。そのPCR反応物（50
μｌ）は、10mMのトリス−HCl,pH8.3,50mMのKCl,1.5mM
のMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、200μＭの個々のdA
TP,dCTP,dGTP及びdTTP,500ngのpJVi60及び50pモルの上
記の個々のPCRプライマーから構成された。反応物を95
℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。
次に、５単位のTaqポリメラーゼを添加した。反応物
を、それぞれ95℃で30秒間、45℃で１分間及び72℃で１
分間、35サイクルの間プログラムされたPerkin−Elmer
9600 Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。最
後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキュ
ベートした。予測される126bpのhemB PCR生成物をPCR I
Iベクター中にクローン化し、プラスミドpAJ005−１
（図11）を生成した。
例11:アスペルギラス・オリザエ株A1560 DNAライブラリ
ー、及びポルホビリノーゲンシンターゼ（hemB）クロー
ンの同定 アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラ
リーを、例３に記載のようにして構成した。
ー、及びポルホビリノーゲンシンターゼ（hemB）クロー
ンの同定 アスペルギラス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラ
リーを、例３に記載のようにして構成した。
約８×104個のプラークからのバクテリオファージDNA
を、二重環状Nytran Plus膜（Schleicher ＆ Schuell,K
eene,NH）に移し、そしてMertz and Rashtchian（1994,
Analytical Biochemistry 221:160−165）に従って、pA
J005−１（例10を参照のこと）のhemBフラグメントを増
幅することによって誘導された32P−ラベルされたPCR生
成物によりプローブした。増幅反応物（50μｌ）は次の
成分を含んだ:10mMのトリス−HCl,pH8.3,50mMのKCl,1.5
mMのMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、0.04mMの個々のd
ATP,dCTP,dGTP、及びdTTP,5μｌの32P−dCTP（3000Ci/m
モル、3.3μM;Amersham,Arlington Heights,IL）、及び
50pモルの個々のセンスプライマー5'−GTGGCTCCGAGTGAT
AT−3'（配列番号20）及びアンチセンスプライマー5'−
GCATCGCGAAAAGGACCG−3'（配列番号21）。反応物を95℃
に３分間加熱し、続いて５単位のTaqポリメラーゼを添
加した。次に、反応物を、95℃で１分間、55℃で１分間
及び72℃で１分間、30サイクルプログラムされたPerkin
−Elmer Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。
反応溶液をSephadex G50カラム（Pharmacia,Alameda,C
A）に通し、組込まれていないヌクレオチドを除去し、
そして次に、変性し、そしてハイブリダイゼーション緩
衝液に添加した。変性されたプローブ（106cpm/ml）を
ハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そしてプレハ
イブリダイズされた膜と共に一晩インキュベートした。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ンを42℃で、５×SSC,50mMのリン酸ナトリウムpH7,5×D
enhardts溶液、0.1％（w/v）のSDS,5mMのEDTA,pH8,10μ
g/mlの変性されたサケ精子DNA、及び50％ホルムアミド
溶液において実施した。膜を0.1×SSC,0.1％ SDSにより
42℃で15分間、４度洗浄した。陽性シグナルを付与する
一次プラークを２度スクリーンし、そして製造業者の説
明書に従って精製した。陽性シグナルを生成する10のゲ
ノムクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Researc
h Laboratories,Inc.,Bethesda,MD）に従って、pZL誘導
体としてλZipLoxベクターから切除し、そしてHattori
and Sakaki（1986,Analytical Biochemistry 152:232−
237）の方法に従って配列決定した。pZL誘導体はpAJ007
−１からpAJ007−10まで命名した。クローンE.コリDH5
αpAJ007−６は、制限マッピングに基づいて3.7kbのゲ
ノムフラグメントを含み、そしてさらに分析した。
を、二重環状Nytran Plus膜（Schleicher ＆ Schuell,K
eene,NH）に移し、そしてMertz and Rashtchian（1994,
Analytical Biochemistry 221:160−165）に従って、pA
J005−１（例10を参照のこと）のhemBフラグメントを増
幅することによって誘導された32P−ラベルされたPCR生
成物によりプローブした。増幅反応物（50μｌ）は次の
成分を含んだ:10mMのトリス−HCl,pH8.3,50mMのKCl,1.5
mMのMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、0.04mMの個々のd
ATP,dCTP,dGTP、及びdTTP,5μｌの32P−dCTP（3000Ci/m
モル、3.3μM;Amersham,Arlington Heights,IL）、及び
50pモルの個々のセンスプライマー5'−GTGGCTCCGAGTGAT
AT−3'（配列番号20）及びアンチセンスプライマー5'−
GCATCGCGAAAAGGACCG−3'（配列番号21）。反応物を95℃
に３分間加熱し、続いて５単位のTaqポリメラーゼを添
加した。次に、反応物を、95℃で１分間、55℃で１分間
及び72℃で１分間、30サイクルプログラムされたPerkin
−Elmer Thermal Cyclerにおいてインキュベートした。
反応溶液をSephadex G50カラム（Pharmacia,Alameda,C
A）に通し、組込まれていないヌクレオチドを除去し、
そして次に、変性し、そしてハイブリダイゼーション緩
衝液に添加した。変性されたプローブ（106cpm/ml）を
ハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そしてプレハ
イブリダイズされた膜と共に一晩インキュベートした。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ンを42℃で、５×SSC,50mMのリン酸ナトリウムpH7,5×D
enhardts溶液、0.1％（w/v）のSDS,5mMのEDTA,pH8,10μ
g/mlの変性されたサケ精子DNA、及び50％ホルムアミド
溶液において実施した。膜を0.1×SSC,0.1％ SDSにより
42℃で15分間、４度洗浄した。陽性シグナルを付与する
一次プラークを２度スクリーンし、そして製造業者の説
明書に従って精製した。陽性シグナルを生成する10のゲ
ノムクローンを、製造業者の説明書（Bethesda Researc
h Laboratories,Inc.,Bethesda,MD）に従って、pZL誘導
体としてλZipLoxベクターから切除し、そしてHattori
and Sakaki（1986,Analytical Biochemistry 152:232−
237）の方法に従って配列決定した。pZL誘導体はpAJ007
−１からpAJ007−10まで命名した。クローンE.コリDH5
αpAJ007−６は、制限マッピングに基づいて3.7kbのゲ
ノムフラグメントを含み、そしてさらに分析した。
例12:ポルホビリノーゲンシンターゼ（hemB）遺伝子の
特徴化 例11に記載されるE.コリDH5αpAJ007−６を、例11に
記載される方法に従ってDNA配列決定にゆだねた。
特徴化 例11に記載されるE.コリDH5αpAJ007−６を、例11に
記載される方法に従ってDNA配列決定にゆだねた。
クローン化されたアスペルギラスオリザエA1560hemB
遺伝子のヌクレオチド配列は、図12（配列番号４）に示
されるような40kDaの推定される分子量を有する374個の
アミノ酸ペプチドをコードする、図12（配列番号３）に
示されるような1308個のヌクレオチドの読取り枠を示し
た。前記ヌクレオチドは、スプライス部位コンセンサス
配列を端に有する１つの48bpの推定上のイントロンを含
み、そしてUnkles,1992,Applied Molecular Genetics o
f Filamentous Fungi,Chapter 2,J.R.Kinghorn and G.T
urner,editors,Blackie Academic and Professional Pu
blicationsにより推定されるような内部コンセンサス配
列を含む。前記3'スプライス部位（TAG）はMetの254bp
下流に位置し、5'スプライス部位（GTCCGC）は前記3'ス
プライス部位の46bp下流に位置し、そして内部コンセン
サス配列（TCTAAC）は前記5'スプライス部位の30bp下流
に位置する。5'未翻訳領域は、位置−377及び−233で２
つのCAATモチーフを含み、そして転写調節において重要
な役割を果たすことができる（Gurrなど.,1987、前
記）。さらに、いくつかの推定上のTATA様ボックスが3'
未翻訳領域（−117,−208,−650）に見出される。予測
されるように、hemBは、植物を除く他の生物の細胞質に
存在するので、そのＮ−末端でリーダー配列を含むよう
に思われない（Bottemley and Muller−Eberhard,1988,
Seminars in Hematology 25:282−302）。
遺伝子のヌクレオチド配列は、図12（配列番号４）に示
されるような40kDaの推定される分子量を有する374個の
アミノ酸ペプチドをコードする、図12（配列番号３）に
示されるような1308個のヌクレオチドの読取り枠を示し
た。前記ヌクレオチドは、スプライス部位コンセンサス
配列を端に有する１つの48bpの推定上のイントロンを含
み、そしてUnkles,1992,Applied Molecular Genetics o
f Filamentous Fungi,Chapter 2,J.R.Kinghorn and G.T
urner,editors,Blackie Academic and Professional Pu
blicationsにより推定されるような内部コンセンサス配
列を含む。前記3'スプライス部位（TAG）はMetの254bp
下流に位置し、5'スプライス部位（GTCCGC）は前記3'ス
プライス部位の46bp下流に位置し、そして内部コンセン
サス配列（TCTAAC）は前記5'スプライス部位の30bp下流
に位置する。5'未翻訳領域は、位置−377及び−233で２
つのCAATモチーフを含み、そして転写調節において重要
な役割を果たすことができる（Gurrなど.,1987、前
記）。さらに、いくつかの推定上のTATA様ボックスが3'
未翻訳領域（−117,−208,−650）に見出される。予測
されるように、hemBは、植物を除く他の生物の細胞質に
存在するので、そのＮ−末端でリーダー配列を含むよう
に思われない（Bottemley and Muller−Eberhard,1988,
Seminars in Hematology 25:282−302）。
他のhemB遺伝子に対するアスペルギラスオリザエhemB
遺伝子（配列番号４）のアミノ酸配列が図13に示され
る。酵母（配列番号31;Myersなど.,1987、前記）、ヒト
（配列番号27;Wetmurなど.,1986、前記）、ラット（配
列番号29;Bishopなど.,1989,Nucleic Acids Research 1
4:10115）及びE.コリ（配列番号26;Liなど.,2989,Gene
75:177−184）からの推定されるhemBアミノ酸配列は、
アスペルギラスオリザエhemBアミノ酸配列に対してそれ
ぞれ、63％,55％,55％及び40％の同一性を有する。エン
ドウ（配列番号28;Bseseなど.,1991,Journal of Biolog
ical Chemistry 266:17060−17066）、バシラススブチ
リス（配列番号25;Hanssonなど.,1991,Journal of Bact
eriology 173:2590−2599）及びホウレンソウ（配列番
号30;Scharmburg and Schneider−Poetsch,1991,EMBL D
ata Library）からの推定されるhemBアミノ酸配列は低
い類似性を有する（それぞれ、40％,39％及び33％の同
一性）。しかしながら、エンドウ及びホウレンソウhemB
アミノ酸配列の両者はＮ−末端クロロプラストシグナル
配列を含むので、アスペルギラスオリザエhemBに対する
それらの類似性は、それらが成熟ポリペプチドとして整
列される場合、有意に上昇するであろう。それらの整列
に基づけば、アスペルギラスオリザエhemBの活性リシン
部位はアミノ酸299に位置し（Jaffe,1995,Journal of B
ioenergetics and Biomembranes 27:169−179）、そし
てBerg（1986,Nature 319:264−265）により推定される
ような保存された亜鉛−フィンガー様ドメインはアミノ
酸166−180に位置する。亜鉛−フィンガーは、Zn2+を結
合することによってその活性部位でのスルフヒドリル基
の酸化を妨げることが示されている（Jaffe,1995、前
記）。植物hemBにおけるその対応するドメインは、Zn2+
よりもむしろMg2+を結合すると思われる（Bseseなど.,1
991、前記）。興味あることには、hemBフィンガードメ
インの最初の残基は、植物金属−結合ドメインのこの位
置に保存されるThr（位置166での）である。しかしなが
ら、hemB亜鉛フィンガードメインにおける残りの位置は
保存される。
遺伝子（配列番号４）のアミノ酸配列が図13に示され
る。酵母（配列番号31;Myersなど.,1987、前記）、ヒト
（配列番号27;Wetmurなど.,1986、前記）、ラット（配
列番号29;Bishopなど.,1989,Nucleic Acids Research 1
4:10115）及びE.コリ（配列番号26;Liなど.,2989,Gene
75:177−184）からの推定されるhemBアミノ酸配列は、
アスペルギラスオリザエhemBアミノ酸配列に対してそれ
ぞれ、63％,55％,55％及び40％の同一性を有する。エン
ドウ（配列番号28;Bseseなど.,1991,Journal of Biolog
ical Chemistry 266:17060−17066）、バシラススブチ
リス（配列番号25;Hanssonなど.,1991,Journal of Bact
eriology 173:2590−2599）及びホウレンソウ（配列番
号30;Scharmburg and Schneider−Poetsch,1991,EMBL D
ata Library）からの推定されるhemBアミノ酸配列は低
い類似性を有する（それぞれ、40％,39％及び33％の同
一性）。しかしながら、エンドウ及びホウレンソウhemB
アミノ酸配列の両者はＮ−末端クロロプラストシグナル
配列を含むので、アスペルギラスオリザエhemBに対する
それらの類似性は、それらが成熟ポリペプチドとして整
列される場合、有意に上昇するであろう。それらの整列
に基づけば、アスペルギラスオリザエhemBの活性リシン
部位はアミノ酸299に位置し（Jaffe,1995,Journal of B
ioenergetics and Biomembranes 27:169−179）、そし
てBerg（1986,Nature 319:264−265）により推定される
ような保存された亜鉛−フィンガー様ドメインはアミノ
酸166−180に位置する。亜鉛−フィンガーは、Zn2+を結
合することによってその活性部位でのスルフヒドリル基
の酸化を妨げることが示されている（Jaffe,1995、前
記）。植物hemBにおけるその対応するドメインは、Zn2+
よりもむしろMg2+を結合すると思われる（Bseseなど.,1
991、前記）。興味あることには、hemBフィンガードメ
インの最初の残基は、植物金属−結合ドメインのこの位
置に保存されるThr（位置166での）である。しかしなが
ら、hemB亜鉛フィンガードメインにおける残りの位置は
保存される。
例13:pAJ023の構成
プラスミドpAJ023（図14）を、アスペルギラス・オリ
ザエhemBコード領域をPCR増幅し、そしてそれをアスペ
ルギラス・オリザエ発現ベクターpBANE6中にサブクロー
ニングすることによって構成した。増幅生成物を、pBAN
e6中へのクローニングを促進するために5'Swa I及び3'P
ac I制限部位を含むように企画した。増幅反応物（50μ
ｌ）は、次の成分を含んだ:10mMのトリス−HCl,pH8.3,5
0mMのKCl,1.5mMのMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、200
μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,200ngのpAJ007−
6 DNA、及び50pモルの下記に示される個々のPCRプライ
マー:PBG10（センス）:5'−GCATATTTAAATGATGTCCTTTTCT
AATCTCGT−3'（配列番号38）及びPBG11A（アンチセン
ス）:5'−ATATTAATTAATCCATCTAGCTAAATCATT−3'（配列
番号39）。PBG10及びPBG11の下線領域は、それぞれクロ
ーニング制限配列Swa I及びPac Iを含んだ。反応物を95
℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。
５単位のPWO（BM）ポリメラーゼを添加した。反応物
を、それぞれ95℃で30秒間、57℃で１分間及び72℃で１
分間、30サイクルの間のプログラムされたPerkin−Elme
r 9600 Thermo−Cyclerにおいてインキュベートした。
最後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキ
ュベートした。最終PCR生成物を、ゲル精製し、Swa I及
びPac Iにより消化し、そしてSwa I及びPac Iにより消
化されているベクターpBANe6中に連結し、pAJ023を創造
した。
ザエhemBコード領域をPCR増幅し、そしてそれをアスペ
ルギラス・オリザエ発現ベクターpBANE6中にサブクロー
ニングすることによって構成した。増幅生成物を、pBAN
e6中へのクローニングを促進するために5'Swa I及び3'P
ac I制限部位を含むように企画した。増幅反応物（50μ
ｌ）は、次の成分を含んだ:10mMのトリス−HCl,pH8.3,5
0mMのKCl,1.5mMのMgCl2,0.01％（w/v）のゼラチン、200
μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,200ngのpAJ007−
6 DNA、及び50pモルの下記に示される個々のPCRプライ
マー:PBG10（センス）:5'−GCATATTTAAATGATGTCCTTTTCT
AATCTCGT−3'（配列番号38）及びPBG11A（アンチセン
ス）:5'−ATATTAATTAATCCATCTAGCTAAATCATT−3'（配列
番号39）。PBG10及びPBG11の下線領域は、それぞれクロ
ーニング制限配列Swa I及びPac Iを含んだ。反応物を95
℃で３分間インキュベートし、そして80℃に冷却した。
５単位のPWO（BM）ポリメラーゼを添加した。反応物
を、それぞれ95℃で30秒間、57℃で１分間及び72℃で１
分間、30サイクルの間のプログラムされたPerkin−Elme
r 9600 Thermo−Cyclerにおいてインキュベートした。
最後のサイクルに続いて、反応物を72℃で５分間インキ
ュベートした。最終PCR生成物を、ゲル精製し、Swa I及
びPac Iにより消化し、そしてSwa I及びPac Iにより消
化されているベクターpBANe6中に連結し、pAJ023を創造
した。
例14:pAJ023によるアスペルギラス・オリザエJRoC50.3.
18Aの形質転換 アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18AをpAJ023に
より形質転換し、アスペルギラス・オリザエhemB遺伝子
の過剰発現がペルオキシダーゼ生成を高めるかどうかを
決定した。対照として、pBANe6がまた、アスペルギラス
・オリザエJRoC50.3.18Aを形質転換するために使用され
た。形質転換を、1ml当たり２×107個のプロトプラスト
の濃度でプロトプラストにより行なった。100μｌのプ
ロトプラストを、10μｇのDNAと共に30分間、氷上に配
置した。1mlのSPTCを添加し、そしてプロトプラストを3
4℃で20分間インキュベートした。形質転換物0.25mlの
アリコートを、COVE形質転換プレート上にプレートする
前、15mlのCOVE寒天被膜（例８を参照のこと）に添加し
た。プレートを室温で５〜７日間インキュベートした。
形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして37℃で
３〜５日間インキュベートした。
18Aの形質転換 アスペルギラス・オリザエ株JRoC50.3.18AをpAJ023に
より形質転換し、アスペルギラス・オリザエhemB遺伝子
の過剰発現がペルオキシダーゼ生成を高めるかどうかを
決定した。対照として、pBANe6がまた、アスペルギラス
・オリザエJRoC50.3.18Aを形質転換するために使用され
た。形質転換を、1ml当たり２×107個のプロトプラスト
の濃度でプロトプラストにより行なった。100μｌのプ
ロトプラストを、10μｇのDNAと共に30分間、氷上に配
置した。1mlのSPTCを添加し、そしてプロトプラストを3
4℃で20分間インキュベートした。形質転換物0.25mlの
アリコートを、COVE形質転換プレート上にプレートする
前、15mlのCOVE寒天被膜（例８を参照のこと）に添加し
た。プレートを室温で５〜７日間インキュベートした。
形質転換体を同じ培地のプレートに移し、そして37℃で
３〜５日間インキュベートした。
例15:hemB一次形質転換体によるペルオキシダーゼ生成
合計20のアスペルギラス・オリザエhemB形質転換体及
び42の対照形質転換体（アスペルギラスオリザエhemBを
伴わないでアスペルギラスオリザエ発現ベクターによる
JRoC50.3.18Aの形質転換体）を、24ウェルプレートにお
いて増殖し、そして例７に記載のようにしてペルオキシ
ダーゼ生成についてアッセイした。
び42の対照形質転換体（アスペルギラスオリザエhemBを
伴わないでアスペルギラスオリザエ発現ベクターによる
JRoC50.3.18Aの形質転換体）を、24ウェルプレートにお
いて増殖し、そして例７に記載のようにしてペルオキシ
ダーゼ生成についてアッセイした。
ペルオキシダーゼアッセイの結果は、対照の形質転換
体に対してより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を生
成する形質転換体の数の上昇を示さなかった。
体に対してより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を生
成する形質転換体の数の上昇を示さなかった。
例16:pSE37及びpSE38の構成
pSE7t1（図15）を、PCR II（Invitrogen,San Diego,C
A）中にアスペルギラス・オリザエA1560 hemA読取り枠
のPCR増幅された領域を製造業者の説明書に従って連結
することによって構成した。hemA読取り枠を、例６に記
載される同じPCR条件（但し、個々のdNTPの濃度は50μ
Ｍであった）に従って、pSE17（例３）からの例４に記
載されるプライマーhemA5'（配列番号７）及びhemA3'
（配列番号８）を用いてPCR増幅した。プラスミドpSE37
（図16）を、pSE7t1からのhemAコード領域を含む1940bp
のSwa I−Pac IフラグメントをSwa I−Pac Iにより切断
されたpSE39（図17）中に連結することによって構成し
た。
A）中にアスペルギラス・オリザエA1560 hemA読取り枠
のPCR増幅された領域を製造業者の説明書に従って連結
することによって構成した。hemA読取り枠を、例６に記
載される同じPCR条件（但し、個々のdNTPの濃度は50μ
Ｍであった）に従って、pSE17（例３）からの例４に記
載されるプライマーhemA5'（配列番号７）及びhemA3'
（配列番号８）を用いてPCR増幅した。プラスミドpSE37
（図16）を、pSE7t1からのhemAコード領域を含む1940bp
のSwa I−Pac IフラグメントをSwa I−Pac Iにより切断
されたpSE39（図17）中に連結することによって構成し
た。
pSE39を、Bastaに対する耐性を付与するbar選択マー
カーによりpyrG選択マーカーを置換されたpBANe13（図1
9）のブラント化されたNsi IフラグメントのpMT1612
（図18）からのブラント化された2033bpのHind III−Ec
oR Iフラグメントの連結により構成した。プラスミドpS
E38（図20）を、pAJ23（図14）からのhemB読取り枠を含
む1137bpのSwa I−Pac Iフラグメントを、Swa I−Pac I
により切断されたpSE39（図17）中に連結することによ
って構成した。
カーによりpyrG選択マーカーを置換されたpBANe13（図1
9）のブラント化されたNsi IフラグメントのpMT1612
（図18）からのブラント化された2033bpのHind III−Ec
oR Iフラグメントの連結により構成した。プラスミドpS
E38（図20）を、pAJ23（図14）からのhemB読取り枠を含
む1137bpのSwa I−Pac Iフラグメントを、Swa I−Pac I
により切断されたpSE39（図17）中に連結することによ
って構成した。
例17:コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼ生成に
対するhemA及びhemB同時過剰発現の効果 例９に記載されるアスペルギラス・オリザエ株SE01−
28を、例８に記載される方法に従って、アスペルギラス
・オリザエSE27と称する新しい形質転換体を創造するた
めにpSE38により形質転換したが、但し、Basta耐性が選
択のために使用され、そして２〜８μｇのNde I消化さ
れたpSE38が、約５単位の酵素が形質転換混合物に含ま
れるように反応から直接的に形質転換当たり添加され
た。Basta選択のための培地は、20mlのCOVE塩、1Mのス
クロース、25g/のNoble寒天、10mMの尿素、及び形質
転換のための5mg/mlのBasta（Hoechst Schering,Rodovr
e,Denmark）又は形質転換体を維持するための10mg/mlの
Bastaのいづれかを含んだ。COVE塩は、脱イオン水１
当たり、26gのKCl,26gのMgSO4・7H2O,76gのKH2PO4、及
び50mlのCOVE微量元素から構成された。COVE微量元素
は、脱イオン水１当たり、0.04gのNa2B4O7・10H2O,0.
4gのCuSO4・5H2O,1.2gのFeSO4・7H2O,0.7gのMnSO4・H
2O,0.8gのNa2MoO2・H2O,10gのZnSO4・7H2Oから構成され
た。マルトースを、指摘される場合、添加し、2.5％の
最終濃度にした。Basta選択層培地は上記と同じであっ
たが、但し、Bastaを使用の前、添加した。
対するhemA及びhemB同時過剰発現の効果 例９に記載されるアスペルギラス・オリザエ株SE01−
28を、例８に記載される方法に従って、アスペルギラス
・オリザエSE27と称する新しい形質転換体を創造するた
めにpSE38により形質転換したが、但し、Basta耐性が選
択のために使用され、そして２〜８μｇのNde I消化さ
れたpSE38が、約５単位の酵素が形質転換混合物に含ま
れるように反応から直接的に形質転換当たり添加され
た。Basta選択のための培地は、20mlのCOVE塩、1Mのス
クロース、25g/のNoble寒天、10mMの尿素、及び形質
転換のための5mg/mlのBasta（Hoechst Schering,Rodovr
e,Denmark）又は形質転換体を維持するための10mg/mlの
Bastaのいづれかを含んだ。COVE塩は、脱イオン水１
当たり、26gのKCl,26gのMgSO4・7H2O,76gのKH2PO4、及
び50mlのCOVE微量元素から構成された。COVE微量元素
は、脱イオン水１当たり、0.04gのNa2B4O7・10H2O,0.
4gのCuSO4・5H2O,1.2gのFeSO4・7H2O,0.7gのMnSO4・H
2O,0.8gのNa2MoO2・H2O,10gのZnSO4・7H2Oから構成され
た。マルトースを、指摘される場合、添加し、2.5％の
最終濃度にした。Basta選択層培地は上記と同じであっ
たが、但し、Bastaを使用の前、添加した。
２種の対照集団、すなわちhemA過剰発現集団（pSE39
により形質転換されたアスペルギラス・オリザエSE01−
28＝アスペルギラスオリザエSE28株）及びベクター形質
転換された集団（pSE39により形質転換されたアスペル
ギラス・オリザエJRoC50.3.18A＝アスペルギラスオリザ
エSE22株）をまた、上記と同じ方法を用いて構成した。
により形質転換されたアスペルギラス・オリザエSE01−
28＝アスペルギラスオリザエSE28株）及びベクター形質
転換された集団（pSE39により形質転換されたアスペル
ギラス・オリザエJRoC50.3.18A＝アスペルギラスオリザ
エSE22株）をまた、上記と同じ方法を用いて構成した。
次に、形質転換体を、1/4強度のMY25培地1mlを含む24
−ウェルマイクロタイタープレートのウェル当たり約１
×105個の胞子で個々のウェル中に接種した。マイクロ
タイタープレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び
100rpmで５日間インキュベートした。ペルオキシダーゼ
生成レベルを、例７に記載される酵素アッセイを用いて
決定した。
−ウェルマイクロタイタープレートのウェル当たり約１
×105個の胞子で個々のウェル中に接種した。マイクロ
タイタープレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び
100rpmで５日間インキュベートした。ペルオキシダーゼ
生成レベルを、例７に記載される酵素アッセイを用いて
決定した。
前記結果は、２種の対照集団、すなわちアスペルギラ
ス・オリザエSE28株（hemA過剰発現集団）及びアスペル
ギラス・オリザエSE22株（ベクター形質転換された集
団）に比較される場合、アスペルギラス・オリザエSE27
株の集団によるペルオキシダーゼ活性の分布において高
レベルの方への劇的なシフトを示した。hemA/hemB同時
過剰発現株は、非構築株（SE22）よりも約４倍の平均上
昇率を示し、そしてhemA過剰発現株（SE28）よりも1.8
倍の平均上昇率を示した。
ス・オリザエSE28株（hemA過剰発現集団）及びアスペル
ギラス・オリザエSE22株（ベクター形質転換された集
団）に比較される場合、アスペルギラス・オリザエSE27
株の集団によるペルオキシダーゼ活性の分布において高
レベルの方への劇的なシフトを示した。hemA/hemB同時
過剰発現株は、非構築株（SE22）よりも約４倍の平均上
昇率を示し、そしてhemA過剰発現株（SE28）よりも1.8
倍の平均上昇率を示した。
次に、いくつかの最高のペルオキシダーゼ生成形質転
換体（アスペルギラスオリザエ形質転換体SE27−3,SE27
−8,SE27−12及びSE27−13）を、振盪フラスコにおいて
培養した。約５×106個の胞子を25mlのMY25培地中に接
種し、そして34℃,200rpmで５日間インキュベートし
た。他方では、菌子体プラグを、25mlのMY25培地及び0.
002％のNovozyme 234を含むフラスコ中に接種し、そし
て34℃,200rpmで２日間インキュベートした。この培養
物4mlを用いて、25mlのMY25培地を含む三重振盪フラス
コを接種し、34℃,200rpmで５日間インキュベートし
た。次に、サンプルを除き、そしてMiraclothを通して
濾過し、菌子体フラグメントを除去し、その後、ペルオ
キシダーゼ活性についての酵素アッセイを実施した。
換体（アスペルギラスオリザエ形質転換体SE27−3,SE27
−8,SE27−12及びSE27−13）を、振盪フラスコにおいて
培養した。約５×106個の胞子を25mlのMY25培地中に接
種し、そして34℃,200rpmで５日間インキュベートし
た。他方では、菌子体プラグを、25mlのMY25培地及び0.
002％のNovozyme 234を含むフラスコ中に接種し、そし
て34℃,200rpmで２日間インキュベートした。この培養
物4mlを用いて、25mlのMY25培地を含む三重振盪フラス
コを接種し、34℃,200rpmで５日間インキュベートし
た。次に、サンプルを除き、そしてMiraclothを通して
濾過し、菌子体フラグメントを除去し、その後、ペルオ
キシダーゼ活性についての酵素アッセイを実施した。
アスペルギラス・オリザエ形質転換体SE27−3,SE27−
8,SE27−12及びSE27−13の振盪フラスコ培養物のペルオ
キシダーゼアッセイは、対照株アスペルギラスオリザエ
SE22及びSE28に比較される場合、すべてが高いペルオキ
シダーゼ活性を生成したことを示した。株SE27−12及び
SE27−８は、SE22対照株よりも４倍高い活性及びSE28対
照株よりも２倍高い活性を示した。
8,SE27−12及びSE27−13の振盪フラスコ培養物のペルオ
キシダーゼアッセイは、対照株アスペルギラスオリザエ
SE22及びSE28に比較される場合、すべてが高いペルオキ
シダーゼ活性を生成したことを示した。株SE27−12及び
SE27−８は、SE22対照株よりも４倍高い活性及びSE28対
照株よりも２倍高い活性を示した。
アスペルギラスオリザエSE27−12及び対照としてアス
ペルギラス・オリザエSE22を、炭素源として高マルトー
スシロップを有する標準の供給−バッチプロトコールを
用いて、ヘモグロビンの添加を伴って及び伴わないで、
２の発酵において増殖した。バッチ−供給物を、FeCl
3により補充し、約0.4mMにした。陽性の溶解された酸素
状態を、約2gのサッカリド／／時の速度で添加される
供給物により両培養物において３日目から８日目まで維
持した。このレベルは、２日目及び３日目にわたって段
階的態様で達成された。両培養におけるバイオマスは、
発酵の期間、ほぼ等しかった。発酵をまた、ヘモグロビ
ンの存在下で行なった。ヘモグロビンを添加し、30mg/m
lバッチ培地の濃度にした。
ペルギラス・オリザエSE22を、炭素源として高マルトー
スシロップを有する標準の供給−バッチプロトコールを
用いて、ヘモグロビンの添加を伴って及び伴わないで、
２の発酵において増殖した。バッチ−供給物を、FeCl
3により補充し、約0.4mMにした。陽性の溶解された酸素
状態を、約2gのサッカリド／／時の速度で添加される
供給物により両培養物において３日目から８日目まで維
持した。このレベルは、２日目及び３日目にわたって段
階的態様で達成された。両培養におけるバイオマスは、
発酵の期間、ほぼ等しかった。発酵をまた、ヘモグロビ
ンの存在下で行なった。ヘモグロビンを添加し、30mg/m
lバッチ培地の濃度にした。
その結果は、192時間の発酵の後、SE22よりもペルオ
キシダーゼ生成において６倍の上昇率が存在したことを
示した。SE22に比較してSE27−12からのペルオキシダー
ゼ生成におけるさらなる３倍の上昇率が、発酵培地にヘ
モグロビンが添加される場合に観察された。添加される
ヘモグロビンを伴わないでの非構築株に比較して、ヘモ
グロビンの存在下で増殖されたhemA/hemB構築された株
を用いてのペルオキシダーゼ生成における全体の上昇率
は10倍であった。
キシダーゼ生成において６倍の上昇率が存在したことを
示した。SE22に比較してSE27−12からのペルオキシダー
ゼ生成におけるさらなる３倍の上昇率が、発酵培地にヘ
モグロビンが添加される場合に観察された。添加される
ヘモグロビンを伴わないでの非構築株に比較して、ヘモ
グロビンの存在下で増殖されたhemA/hemB構築された株
を用いてのペルオキシダーゼ生成における全体の上昇率
は10倍であった。
それらの結果は、hemA及びhemBの過剰発現がペルオキ
シダーゼ生成を相乗的に改良したことを示した。
シダーゼ生成を相乗的に改良したことを示した。
例18:スシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ生成
に対するhemA/hemB同時過剰発現の効果 スシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ遺伝子
（WO96/34962）を含み、そしてDLM14.24と命名されたア
スペルギラス・オリザエ株How B411を、hemA及びhemBを
同時過剰発現するよう構築し、その同時過剰発現がカタ
ラーゼ生成を高めるかどうかを決定した。アスペルギラ
ス・オリザエ株DLM14.24をそれぞれ10μｇのpSE37及びp
SE38により、例17に記載されるのと同じ条件下で同時形
質転換し、アスペルギラス・オリザエSE32と称する形質
転換体を創造した。アスペルギラス・オリザエSE24と称
する対照株を、例17に記載される同じ条件下でpSE39に
よりアスペルギラスオリザエDLM14.24を形質転換するこ
とによって生成した。
に対するhemA/hemB同時過剰発現の効果 スシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ遺伝子
（WO96/34962）を含み、そしてDLM14.24と命名されたア
スペルギラス・オリザエ株How B411を、hemA及びhemBを
同時過剰発現するよう構築し、その同時過剰発現がカタ
ラーゼ生成を高めるかどうかを決定した。アスペルギラ
ス・オリザエ株DLM14.24をそれぞれ10μｇのpSE37及びp
SE38により、例17に記載されるのと同じ条件下で同時形
質転換し、アスペルギラス・オリザエSE32と称する形質
転換体を創造した。アスペルギラス・オリザエSE24と称
する対照株を、例17に記載される同じ条件下でpSE39に
よりアスペルギラスオリザエDLM14.24を形質転換するこ
とによって生成した。
SE32形質転換体及び対照株を、50gのマルトデキスト
リン、2gのMgSO4・7H2O,2gのKH2PO4・4gのクエン酸、8g
の酵母抽出物、2gの尿素、0.5gのCaCl2・2H2O及び1mlの
微量元素を１当たりに含んで成るM400Da（pH6.0）培
地1mlを含む24−ウェルマイクロタイタープレートの個
々のウェル中に約１×105個の胞子／ウェルで接種し
た。微量金属溶液は、１当たり13.9gのFeSO4・7H2O,
8.5gのMnSO4・H2O,14.28gのZnSO4・7H2O,1.63gのCuSO4,
0.24gのNiCl2・6H2O及び3.0gのクエン酸から構成され
た。マイクロタイタープレートを34℃及び100rpmで保湿
チャンバーにおいて５日間インキュベートした。カタラ
ーゼ生成レベルを、WO96/34962に記載される酵素アッセ
イを用いて決定した。CIUは、25℃で12mMの過酸化水素
−50mMのリン酸カリウム（pH7.0）緩衝液において１μ
モルの過酸化水素を１分当たりに分解するカタラーゼの
量として定義される。
リン、2gのMgSO4・7H2O,2gのKH2PO4・4gのクエン酸、8g
の酵母抽出物、2gの尿素、0.5gのCaCl2・2H2O及び1mlの
微量元素を１当たりに含んで成るM400Da（pH6.0）培
地1mlを含む24−ウェルマイクロタイタープレートの個
々のウェル中に約１×105個の胞子／ウェルで接種し
た。微量金属溶液は、１当たり13.9gのFeSO4・7H2O,
8.5gのMnSO4・H2O,14.28gのZnSO4・7H2O,1.63gのCuSO4,
0.24gのNiCl2・6H2O及び3.0gのクエン酸から構成され
た。マイクロタイタープレートを34℃及び100rpmで保湿
チャンバーにおいて５日間インキュベートした。カタラ
ーゼ生成レベルを、WO96/34962に記載される酵素アッセ
イを用いて決定した。CIUは、25℃で12mMの過酸化水素
−50mMのリン酸カリウム（pH7.0）緩衝液において１μ
モルの過酸化水素を１分当たりに分解するカタラーゼの
量として定義される。
最初に分析されるアスペルギラス・オリザエSE32 he
mA/hemB同時形質転換体の集団は、より高いカタラーゼ
生成の方にわずかにシフトされるカタラーゼ分布を示し
た。同時形質転換体集団の平均CIU/mlは、対照集団の平
均CIU/mlよりも1.3倍高かった。
mA/hemB同時形質転換体の集団は、より高いカタラーゼ
生成の方にわずかにシフトされるカタラーゼ分布を示し
た。同時形質転換体集団の平均CIU/mlは、対照集団の平
均CIU/mlよりも1.3倍高かった。
次に、最良のアスペルギラス・オリザエ同時形質転換
体SE32−3a,SE32−4a,SE32−6b及びSE32−32aを、25ml
のM400Da培地を含む振盪フラスコにおいて34℃及び200r
pmで６日間培養し、そして前記のようにしてカタラーゼ
活性について分析した。
体SE32−3a,SE32−4a,SE32−6b及びSE32−32aを、25ml
のM400Da培地を含む振盪フラスコにおいて34℃及び200r
pmで６日間培養し、そして前記のようにしてカタラーゼ
活性について分析した。
最良の株、すなわちアスペルギラス・オリザエSE32−
32aは、対照株に比較してカタラーゼ生成において1.8培
の上昇率を示した。
32aは、対照株に比較してカタラーゼ生成において1.8培
の上昇率を示した。
例19:アスペルギラスオリザエHow B430の構成
pBANe8を、TAKA/NA2−tpiリーダーハイブリッドプロ
モーター、LipolaseTM遺伝子、AMGターミネーター、及
び選択マーカーとしての十分な長さのアスペルギラス・
ニジュランスamdS遺伝子を含むように構成した。Lipola
seTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark）は、ヒュ
ーミコラ・ラヌギノサスからのリパーゼである。
モーター、LipolaseTM遺伝子、AMGターミネーター、及
び選択マーカーとしての十分な長さのアスペルギラス・
ニジュランスamdS遺伝子を含むように構成した。Lipola
seTM（Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark）は、ヒュ
ーミコラ・ラヌギノサスからのリパーゼである。
PCRが、製造業者の説明書に従って、Applied Biosyst
ems Model 394 DNA/RNA synthesizerにより合成された
下記に記載されるプライマー１〜４を用いて、所望する
制限部位を挿入するために使用された： 増幅反応物（100μｌ）を、鋳型として次のプラスミ
ドの１つ約0.2μｇを用いて調製した:pToC90プラスミド
DNA（Christensenなど.,1988,Biotechnology 6:1419−1
422）を、十分な長さのamdS遺伝子上にNsi Iフランキン
グ部位を挿入するためにプライマー１及び２と共に鋳型
として使用した。pJaL292プラスミドDNA（図21）を、NA
2−tpiリーダーハイブリッドプロモーターの5'末端でEc
oR I部位及び3'末端でSwa I部位を挿入するためにプラ
イマー３及び４と共に鋳型として使用した。個々の反応
物は次の成分を含んだ:0.2μｇのプラスミドDNA,48.4p
モルの前方向プライマー、48.4pモルの逆方向プライマ
ー、１μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1×Taqポ
リメラーゼ緩衝液、及び2.5UのTaqポリメラーゼ。反応
物を、95℃で５分間の１サイクル、続いて、95℃で１分
間、55℃で１分間及び72℃で２分間、30サイクルについ
てプログラムされたEricomp Thermal Cyclerにおいてイ
ンキュベートした。
ems Model 394 DNA/RNA synthesizerにより合成された
下記に記載されるプライマー１〜４を用いて、所望する
制限部位を挿入するために使用された： 増幅反応物（100μｌ）を、鋳型として次のプラスミ
ドの１つ約0.2μｇを用いて調製した:pToC90プラスミド
DNA（Christensenなど.,1988,Biotechnology 6:1419−1
422）を、十分な長さのamdS遺伝子上にNsi Iフランキン
グ部位を挿入するためにプライマー１及び２と共に鋳型
として使用した。pJaL292プラスミドDNA（図21）を、NA
2−tpiリーダーハイブリッドプロモーターの5'末端でEc
oR I部位及び3'末端でSwa I部位を挿入するためにプラ
イマー３及び４と共に鋳型として使用した。個々の反応
物は次の成分を含んだ:0.2μｇのプラスミドDNA,48.4p
モルの前方向プライマー、48.4pモルの逆方向プライマ
ー、１μＭの個々のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1×Taqポ
リメラーゼ緩衝液、及び2.5UのTaqポリメラーゼ。反応
物を、95℃で５分間の１サイクル、続いて、95℃で１分
間、55℃で１分間及び72℃で２分間、30サイクルについ
てプログラムされたEricomp Thermal Cyclerにおいてイ
ンキュベートした。
PCR生成物を続いて、TA Cloning Kit（Invitrogen,Sa
n Diego,CA）を用いて、製造業者の説明書に従ってPCR
II中にサブクローン化した。次に、形質転換体を、QIA
well−8 Plasmid Kit（Qiagen Inc.,Chatsworth,CA）を
用いて製造業者の説明書に従って、形質転換体からプラ
スミドを抽出し、正しい大きさのフラグメントの存在を
確かめるためにプラスミドDNAを制限消化し、そしてPCR
生成物を確かめるために次の方法に従ってDNAを配列決
定することによってスクリーンした。DNA配列決定を、M
13逆方向（−48）及びM13前方向（−20）プライマー（N
ew England Biolabs,Beverly,MA）及び配列決定されるD
NAに対してユニークであるプライマー用いて、色素−タ
ーミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法
（Gieseckeなど.,1992、前記）を用いて、両鎖に対して
Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequen
cerにより実施した。次に、正しい形質転換体からのプ
ラスミドを、それらが消化される制限酵素により消化
し、１％アガロースゲル上で分離し、そしてFMC SpinBi
nd Kit（FMC,Rockland,ME）を用いて、製造業者の説明
書に従って精製した。
n Diego,CA）を用いて、製造業者の説明書に従ってPCR
II中にサブクローン化した。次に、形質転換体を、QIA
well−8 Plasmid Kit（Qiagen Inc.,Chatsworth,CA）を
用いて製造業者の説明書に従って、形質転換体からプラ
スミドを抽出し、正しい大きさのフラグメントの存在を
確かめるためにプラスミドDNAを制限消化し、そしてPCR
生成物を確かめるために次の方法に従ってDNAを配列決
定することによってスクリーンした。DNA配列決定を、M
13逆方向（−48）及びM13前方向（−20）プライマー（N
ew England Biolabs,Beverly,MA）及び配列決定されるD
NAに対してユニークであるプライマー用いて、色素−タ
ーミネーター化学と共にプライマーウォーキング技法
（Gieseckeなど.,1992、前記）を用いて、両鎖に対して
Applied Biosystems Model 373A Automated DNA Sequen
cerにより実施した。次に、正しい形質転換体からのプ
ラスミドを、それらが消化される制限酵素により消化
し、１％アガロースゲル上で分離し、そしてFMC SpinBi
nd Kit（FMC,Rockland,ME）を用いて、製造業者の説明
書に従って精製した。
NA2−tpiリーダーを、それらの末端上に配置されるEc
oR I及びSwa I制限部位を有するpJaL292（図21）からPC
R増幅した。TAKAプロモーター、ポリリンカー、AMGター
ミネーター及びアスペルギラスニジュランスpyrG遺伝子
を含むpKS6（図22）を、TAKAプロモーターの一部を除去
するために、EcoR I及びSwa Iにより消化した。この領
域をNA2−tpi PCR生成物により置換し、pBANe13（図1
9）を生成した。
oR I及びSwa I制限部位を有するpJaL292（図21）からPC
R増幅した。TAKAプロモーター、ポリリンカー、AMGター
ミネーター及びアスペルギラスニジュランスpyrG遺伝子
を含むpKS6（図22）を、TAKAプロモーターの一部を除去
するために、EcoR I及びSwa Iにより消化した。この領
域をNA2−tpi PCR生成物により置換し、pBANe13（図1
9）を生成した。
両端上にNsi I部位を有する十分な長さのamdS遺伝子
をPCR増幅した。pBANe13をNsi Iにより消化し、アスペ
ルギラスニジュランスpyrG遺伝子を除去した。この領域
を十分な長さのamdS遺伝子により置換し、pBANe6（図
６）を生成した。
をPCR増幅した。pBANe13をNsi Iにより消化し、アスペ
ルギラスニジュランスpyrG遺伝子を除去した。この領域
を十分な長さのamdS遺伝子により置換し、pBANe6（図
６）を生成した。
下記に示されるオリゴヌクレオチドプライマーを、PC
R増幅によりリパーゼ遺伝子を端に有する制限部位を挿
入するために、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA
Synthesizerを用いて、製造業者の説明書に従って合成
した： 増幅反応物（100μｌ）を、プライマー５及び６と共
に約0.2mgのpMHan37（図23）を用いて調製した。その反
応物は次の成分を含んだ:0.2μｇのpMHan37,48.4pモル
のプライマー5,48.4pモルのプライマー6,1μＭの個々の
dATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1×Taqポリメラーゼ緩衝液、
及び2.5UのTaqポリメラーゼ。反応物を、95℃で５分
間、１サイクル、続いて、95℃で１分間、55℃で１分間
及び72℃で２分間、30サイクルに関してプログラムされ
たEricompt Thermal Cyclerにおいてインキュベートし
た。2mlの反応物をアガロースゲル上で電気泳動し、約9
00bpのリパーゼ生成物の増幅を確認した。
R増幅によりリパーゼ遺伝子を端に有する制限部位を挿
入するために、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA
Synthesizerを用いて、製造業者の説明書に従って合成
した： 増幅反応物（100μｌ）を、プライマー５及び６と共
に約0.2mgのpMHan37（図23）を用いて調製した。その反
応物は次の成分を含んだ:0.2μｇのpMHan37,48.4pモル
のプライマー5,48.4pモルのプライマー6,1μＭの個々の
dATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1×Taqポリメラーゼ緩衝液、
及び2.5UのTaqポリメラーゼ。反応物を、95℃で５分
間、１サイクル、続いて、95℃で１分間、55℃で１分間
及び72℃で２分間、30サイクルに関してプログラムされ
たEricompt Thermal Cyclerにおいてインキュベートし
た。2mlの反応物をアガロースゲル上で電気泳動し、約9
00bpのリパーゼ生成物の増幅を確認した。
PCR増幅されたリパーゼ遺伝子を、TA Cloning Kitを
用いて、製造業者の説明書に従って、pCR II中にサブク
ローン化した。次に、形質転換体を、QIA well−8 Plas
mid Kitを用いて製造業者の説明書に従って、形質転換
体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAを制限消
化し、そしてPCR生成物を確認するために上記方法に従
ってDNAを配列決定することによってスクリーンした。
用いて、製造業者の説明書に従って、pCR II中にサブク
ローン化した。次に、形質転換体を、QIA well−8 Plas
mid Kitを用いて製造業者の説明書に従って、形質転換
体からプラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAを制限消
化し、そしてPCR生成物を確認するために上記方法に従
ってDNAを配列決定することによってスクリーンした。
リパーゼ遺伝子を、Swa I及びPac Iにより消化するこ
とによってpCR IIから切出し、そして続いて、pBANe6中
にサブクローン化し、pBANe8（図24）を得た。形質転換
体を、QIA well−8 Plasmid Kitを用いて製造業者の説
明書に従って形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、
プラスミドDNAを制限消化し、そして生成物を確かめる
ために上記方法に従ってDNAを配列決定することによっ
てスクリーンした。
とによってpCR IIから切出し、そして続いて、pBANe6中
にサブクローン化し、pBANe8（図24）を得た。形質転換
体を、QIA well−8 Plasmid Kitを用いて製造業者の説
明書に従って形質転換体からプラスミドDNAを抽出し、
プラスミドDNAを制限消化し、そして生成物を確かめる
ために上記方法に従ってDNAを配列決定することによっ
てスクリーンした。
アスペルギラス・オリザエHow B430を、pBANe8と称す
るNA2−tpiプロモーター/LipolaseTM遺伝子/AMGターミ
ネーターを含む線状フラグメントによりアスペルギラス
・オリザエHow B425を形質転換することにより生成し
た。pBANe8をPme Iにより消化し、そして線状発現カセ
ットを、40mMのトリス−酢酸塩−1mMのジナトリウムEDT
A（TAE）緩衝液を用いて分離用アガロース電気泳動によ
り単離した。
るNA2−tpiプロモーター/LipolaseTM遺伝子/AMGターミ
ネーターを含む線状フラグメントによりアスペルギラス
・オリザエHow B425を形質転換することにより生成し
た。pBANe8をPme Iにより消化し、そして線状発現カセ
ットを、40mMのトリス−酢酸塩−1mMのジナトリウムEDT
A（TAE）緩衝液を用いて分離用アガロース電気泳動によ
り単離した。
amdSのためのアスペルギラス・オリザエHow B425の形
質転換を、1ml当たり２×107個のプロトプラストの濃度
で、プロトプラストにより実施した。10μｇのDNAを100
μｌのプロトプラストに添加した。次に、250μｌの体
積のPEG（60％のPEG4000−10mMのCaCl2−10mMのトリス
−HCl,pH8.0）を添加し、そしてその混合物を37℃で30
分間、放置した。3mlのSTC培地を添加し、そしてその混
合物を、10mMのウリジンにより補充されたCOVEプレート
上にプレートし、amdSを選択する。プレートを、34℃で
７〜10日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地
のプレートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベ
ートした。形質転換体を、同じ条件下で、スクロースを
有さない同じ培地の同じプレートを用いて、胞子を画線
培養し、そして単離されたコロニーを採取することによ
って精製した。
質転換を、1ml当たり２×107個のプロトプラストの濃度
で、プロトプラストにより実施した。10μｇのDNAを100
μｌのプロトプラストに添加した。次に、250μｌの体
積のPEG（60％のPEG4000−10mMのCaCl2−10mMのトリス
−HCl,pH8.0）を添加し、そしてその混合物を37℃で30
分間、放置した。3mlのSTC培地を添加し、そしてその混
合物を、10mMのウリジンにより補充されたCOVEプレート
上にプレートし、amdSを選択する。プレートを、34℃で
７〜10日間インキュベートした。形質転換体を同じ培地
のプレートに移し、そして37℃で３〜５日間インキュベ
ートした。形質転換体を、同じ条件下で、スクロースを
有さない同じ培地の同じプレートを用いて、胞子を画線
培養し、そして単離されたコロニーを採取することによ
って精製した。
例20:ヘムタンパク質生成に対するhemA/hemB同時過剰発
現の特異性 ヘムは細胞増殖及び代謝のためのエネルギーの供給に
関与されるので、高められたヘムタンパク質生成がアポ
ー酵素との会合のためへのヘムの高められた利用性によ
るものであって、高められた細胞代謝及び増殖による単
純な高められたアパータンパク質生成によるものではな
いことを示すことが重要である。この仮説を試験するた
めの間接的な方法は、ヘムタンパク質ではない異種酵
素、すなわちリパーゼを生成する株においてhemA及びhe
mBを同時発現することであった。増強されたエネルギー
利用性が高められたヘムタンパク質生成の原因であるな
ら、類似する結果がリパーゼ発現に基づいて観察される
べきである。逆に言えば、高められたヘムタンパク質生
成が特に、成熟酵素アセンブリーのためのヘムの高めら
れた利用性によるものであるなら、リパーゼ発現に対す
る効果はほとんど観察されるべきでない。
現の特異性 ヘムは細胞増殖及び代謝のためのエネルギーの供給に
関与されるので、高められたヘムタンパク質生成がアポ
ー酵素との会合のためへのヘムの高められた利用性によ
るものであって、高められた細胞代謝及び増殖による単
純な高められたアパータンパク質生成によるものではな
いことを示すことが重要である。この仮説を試験するた
めの間接的な方法は、ヘムタンパク質ではない異種酵
素、すなわちリパーゼを生成する株においてhemA及びhe
mBを同時発現することであった。増強されたエネルギー
利用性が高められたヘムタンパク質生成の原因であるな
ら、類似する結果がリパーゼ発現に基づいて観察される
べきである。逆に言えば、高められたヘムタンパク質生
成が特に、成熟酵素アセンブリーのためのヘムの高めら
れた利用性によるものであるなら、リパーゼ発現に対す
る効果はほとんど観察されるべきでない。
例19に記載されるアスペルギラス・オリザエ株How B4
30を、例18に記載されるようにしてpSE37及びpSE38によ
り同時形質分解し、非−ヘムタンパク質hemA/hemB同時
過剰発現株アスペルギラスオリザエ株SE33を生成した。
再び、SE34と称する対照形質転換体を、pSE39による同
じ株の形質転換により生成した。
30を、例18に記載されるようにしてpSE37及びpSE38によ
り同時形質分解し、非−ヘムタンパク質hemA/hemB同時
過剰発現株アスペルギラスオリザエ株SE33を生成した。
再び、SE34と称する対照形質転換体を、pSE39による同
じ株の形質転換により生成した。
形質転換体を、1/4の強度のMY25培地1mlを含む24−ウ
ェルマイクロタイタープレートの個々のウェル中に約１
×105個の胞子／ウェルで接種した。マイクロタイター
プレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び100rpmで
４日間インキュベートした。LipolaseTM標準（Novo Nor
disk A/S,Bagsvaerd,Denmark）に対するリパーゼ生成レ
ベルを、次の方法に従って決定した。アッセイ基質を、
使用の直前、原液基質（21μｌのｐ−ニトロフェニル酪
酸/ml DMSO）を、MC緩衝液（4mMのCaCl2−100mMのMOPS,
pH7.5）中に1:50で希釈することによって調製した。Lip
olaseTM標準を、MC緩衝液及び0.02％ α−オレフィン
スルホネート（AOS）界面活性剤において40LU/mlを含む
ように調製し、４℃で貯蔵し、そして次に、使用の直
前、MC緩衝液に1/20で希釈した。両サンプルを、0.02％
のAOS界面活性剤を含むMC緩衝液に希釈し、そして20μ
ｌのアリコートを、96−ウェルプレートのウェルに、次
に200mlの希釈基質を分散した。プレートリーダーを用
いて、405nmでの吸光度を、約１分間隔で取られる２回
の読取りの差異として記録した。リパーゼ単位/ml（LU/
ml）を、LipolaseTM標準に対して計算した。
ェルマイクロタイタープレートの個々のウェル中に約１
×105個の胞子／ウェルで接種した。マイクロタイター
プレートを、保湿チャンバーにおいて34℃及び100rpmで
４日間インキュベートした。LipolaseTM標準（Novo Nor
disk A/S,Bagsvaerd,Denmark）に対するリパーゼ生成レ
ベルを、次の方法に従って決定した。アッセイ基質を、
使用の直前、原液基質（21μｌのｐ−ニトロフェニル酪
酸/ml DMSO）を、MC緩衝液（4mMのCaCl2−100mMのMOPS,
pH7.5）中に1:50で希釈することによって調製した。Lip
olaseTM標準を、MC緩衝液及び0.02％ α−オレフィン
スルホネート（AOS）界面活性剤において40LU/mlを含む
ように調製し、４℃で貯蔵し、そして次に、使用の直
前、MC緩衝液に1/20で希釈した。両サンプルを、0.02％
のAOS界面活性剤を含むMC緩衝液に希釈し、そして20μ
ｌのアリコートを、96−ウェルプレートのウェルに、次
に200mlの希釈基質を分散した。プレートリーダーを用
いて、405nmでの吸光度を、約１分間隔で取られる２回
の読取りの差異として記録した。リパーゼ単位/ml（LU/
ml）を、LipolaseTM標準に対して計算した。
リパーゼアッセイの結果は、集団としてのhemA/himB
同時形質転換体が対照形質転換と比べて、1.25倍のリポ
ラーゼを生成したことを示している。対照集団に対する
リパーゼhemA/hemB同時過剰発現のわずかだが、有意義
な相違は、細胞増殖や代謝作用への増大したヘムの利用
率のわずかな効果によるものでありうる。
同時形質転換体が対照形質転換と比べて、1.25倍のリポ
ラーゼを生成したことを示している。対照集団に対する
リパーゼhemA/hemB同時過剰発現のわずかだが、有意義
な相違は、細胞増殖や代謝作用への増大したヘムの利用
率のわずかな効果によるものでありうる。
例21:ヘム経路中間体の蓄積に対するhemA/himB同時過剰
形質転換の効果 例17に記載される24−ウェルプレートにおいて増殖さ
れたアスペルギラスオリザエSE27株の大部分の菌子体及
び培養ブイヨンの両者は、ピンク又は赤色に出現した。
Centricon 10カラム（Amicon,Beverly,MA）を用いての
アスペルギラスオリザエSE27株の濾過は、赤色が濾液に
存在することを示し、これはその色彩が小さな分子によ
るものであったことを示唆する。濾液は、ポルフィリン
と適合する405nmの波長で光を吸収することが観察され
た。
形質転換の効果 例17に記載される24−ウェルプレートにおいて増殖さ
れたアスペルギラスオリザエSE27株の大部分の菌子体及
び培養ブイヨンの両者は、ピンク又は赤色に出現した。
Centricon 10カラム（Amicon,Beverly,MA）を用いての
アスペルギラスオリザエSE27株の濾過は、赤色が濾液に
存在することを示し、これはその色彩が小さな分子によ
るものであったことを示唆する。濾液は、ポルフィリン
と適合する405nmの波長で光を吸収することが観察され
た。
アスペルギラスオリザエSE27培養物ブイヨンにおける
赤色がヘミ生合成に関与される１又は複数のポルフィリ
ンの存在によるものであったことを確かめるために、培
養物ブイヨンを、C.A.Burtis and E.R.Ashwood（editor
s）In the Tietz Textbook of Clinical Chemistry,199
4,Chapter 38により記載される方法に従ってHPLCにより
分析した。HPLC分析は、培養物ブイヨンがウロポルフィ
リン（ウロ）、七−、六−及び五−カルボキシル化され
たポルフィリン及びコプロポルフィリン（コプロ）と同
じ保持時間を有する高レベルの化合物を含むことを示し
た。対照株アスペルギラスオリザエSE36（pSE39により
形質転換されたアスペルギラスオリザエ）からのブイヨ
ンは、それらの中間体の少々の蓄積を示した。ウロポル
フィリン化合物：コプロポルフィリンの比は、すべての
hemA/hemB同時過剰発現株において少なくとも3:1であっ
た。
赤色がヘミ生合成に関与される１又は複数のポルフィリ
ンの存在によるものであったことを確かめるために、培
養物ブイヨンを、C.A.Burtis and E.R.Ashwood（editor
s）In the Tietz Textbook of Clinical Chemistry,199
4,Chapter 38により記載される方法に従ってHPLCにより
分析した。HPLC分析は、培養物ブイヨンがウロポルフィ
リン（ウロ）、七−、六−及び五−カルボキシル化され
たポルフィリン及びコプロポルフィリン（コプロ）と同
じ保持時間を有する高レベルの化合物を含むことを示し
た。対照株アスペルギラスオリザエSE36（pSE39により
形質転換されたアスペルギラスオリザエ）からのブイヨ
ンは、それらの中間体の少々の蓄積を示した。ウロポル
フィリン化合物：コプロポルフィリンの比は、すべての
hemA/hemB同時過剰発現株において少なくとも3:1であっ
た。
hemA/hemB同時過剰発現株の個々はまた、ポリフィリ
ン化合物の高レベルの螢光特徴を示すが、ところが対照
株は螢光を示さなかった。SE27−３株からの菌糸体（42
0−450で励起、520でバリアーフィルター）の螢光顕微
鏡は、対照株SE28−１又は22−１に存在しなかった、螢
光の明白なパッチ及び顆粒を示した。それらの結果は、
hemA/hemB同時過剰発現株が多量のウロポルフィリンを
生成したことを示唆した。
ン化合物の高レベルの螢光特徴を示すが、ところが対照
株は螢光を示さなかった。SE27−３株からの菌糸体（42
0−450で励起、520でバリアーフィルター）の螢光顕微
鏡は、対照株SE28−１又は22−１に存在しなかった、螢
光の明白なパッチ及び顆粒を示した。それらの結果は、
hemA/hemB同時過剰発現株が多量のウロポルフィリンを
生成したことを示唆した。
それらの中間体の蓄積は、ヘムの生合成において速度
−制限段階になるウロポルフィリノーゲンIIIデカルボ
キシラーゼ（Uro D）に起因する。
−制限段階になるウロポルフィリノーゲンIIIデカルボ
キシラーゼ（Uro D）に起因する。
例22:アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザ
ン分析 アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザン分
析を実施し、ヘムタンパク質生成株による赤色の生成が
hemA及びhemBの両発現カセットの複数のコピーを必要と
するかどうかを決定した。
ン分析 アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザン分
析を実施し、ヘムタンパク質生成株による赤色の生成が
hemA及びhemBの両発現カセットの複数のコピーを必要と
するかどうかを決定した。
例１に記載のように調製された個々の株についての全
細胞DNAを、サザンハイブリダイゼーションにより分析
した（Maniatisなど.,1982,Molecular Cloning,A Labor
atory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,New York）。約10μｇの個々のDNAサンプルをPs
t I又はPvu Iにより消化し、そして１％アガロースゲル
上でサイズにより分別した。ゲルを短い波長のUV光下で
写真を取り、そして0.25NのHClにおいて30分間、続いて
0.4NのNaOHにおいて30分間ソークした。ゲルにおけるDN
Aを、Turboブロット装置（Schleicher ＆ Schleicher,K
eene,NH）を用いて、製造業者の説明書に従って、0.4N
のNaOHにおける細管ブロットによりHybond Nハイブリダ
イゼーション膜（Amersham,Arlington Heights,IL）上
に移した。膜をUV架橋し、そして例４に記載のようにし
てプレハイブリダイズしたが、但し、５％のVistra Liq
nidブロッキング剤（Amersham,Arlington Heights,IL）
を、Geniusブロッキング剤の代わりに使用した。螢光ラ
ベルされたプローブを、Vistra Kit（Amersham,Arlingt
on Heights,IL）を用いて、例３に記載されるDNAフラグ
メントをランダム−プライミングすることによって調製
した。ハイブリダイゼーション及び洗浄段階を例４に記
載のようにして実施した。螢光プローブのシグナルを、
Vistra Kitを用いて、製造業者の説明書に従って増幅し
た。螢光は、Storm Imaging System（Molecular Dynami
cs,Sunnyrale,CA）上での走査により検出した。
細胞DNAを、サザンハイブリダイゼーションにより分析
した（Maniatisなど.,1982,Molecular Cloning,A Labor
atory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,New York）。約10μｇの個々のDNAサンプルをPs
t I又はPvu Iにより消化し、そして１％アガロースゲル
上でサイズにより分別した。ゲルを短い波長のUV光下で
写真を取り、そして0.25NのHClにおいて30分間、続いて
0.4NのNaOHにおいて30分間ソークした。ゲルにおけるDN
Aを、Turboブロット装置（Schleicher ＆ Schleicher,K
eene,NH）を用いて、製造業者の説明書に従って、0.4N
のNaOHにおける細管ブロットによりHybond Nハイブリダ
イゼーション膜（Amersham,Arlington Heights,IL）上
に移した。膜をUV架橋し、そして例４に記載のようにし
てプレハイブリダイズしたが、但し、５％のVistra Liq
nidブロッキング剤（Amersham,Arlington Heights,IL）
を、Geniusブロッキング剤の代わりに使用した。螢光ラ
ベルされたプローブを、Vistra Kit（Amersham,Arlingt
on Heights,IL）を用いて、例３に記載されるDNAフラグ
メントをランダム−プライミングすることによって調製
した。ハイブリダイゼーション及び洗浄段階を例４に記
載のようにして実施した。螢光プローブのシグナルを、
Vistra Kitを用いて、製造業者の説明書に従って増幅し
た。螢光は、Storm Imaging System（Molecular Dynami
cs,Sunnyrale,CA）上での走査により検出した。
アスペルギラス・オリザエ株SE27及びSE32のサザンブ
ロット分析は、両発現プラスミドpSE37及びpSE38の複数
のコピーが存在し、そして赤色の生成が両発現カセット
の存在を必要としたことを示した。
ロット分析は、両発現プラスミドpSE37及びpSE38の複数
のコピーが存在し、そして赤色の生成が両発現カセット
の存在を必要としたことを示した。
微生物の寄託
次の株は、Agricultural Research Service Patent C
ulture Collection（NRRL）,Northern Regional Resear
ch Laboratory,1815 University Street,Peoria,Illino
ls 61604,USAに、ブダペスト条約に従って寄託されてい
る。
ulture Collection（NRRL）,Northern Regional Resear
ch Laboratory,1815 University Street,Peoria,Illino
ls 61604,USAに、ブダペスト条約に従って寄託されてい
る。
菌株は、培養物へのアクセスが、37C.F.R.§1.14及び
35U.S.C.§122下で、Commissioner of Patent and Trad
emarksにより決定される条件に従って、この特許出願の
係属の間、利用できるであろうことを保証する条件下で
寄託されている。寄託物は個々の寄託された菌株の実質
的に純粋な培養物を表わす。寄託物は、対象の出願の相
対物又はその結果物が出願される国々における外国特許
法により必要とされる場合、利用できる。しかしなが
ら、寄託物の利用性は、政府の決定により許可される特
許権利の逸脱においては、対象発明を実施する許可を構
成しないことが理解されるべきである。
35U.S.C.§122下で、Commissioner of Patent and Trad
emarksにより決定される条件に従って、この特許出願の
係属の間、利用できるであろうことを保証する条件下で
寄託されている。寄託物は個々の寄託された菌株の実質
的に純粋な培養物を表わす。寄託物は、対象の出願の相
対物又はその結果物が出願される国々における外国特許
法により必要とされる場合、利用できる。しかしなが
ら、寄託物の利用性は、政府の決定により許可される特
許権利の逸脱においては、対象発明を実施する許可を構
成しないことが理解されるべきである。
本明細書に記載され、そして請求される発明は、本明
細書に開示される特定の態様が本発明のいくつかの観点
の例示として意図されるので、それらの態様により限定
されるものではない。いづれかの同等の態様は本発明の
範囲内に存在することが意図される。実際、本明細書に
示され、そして記載される態様の他に、本発明の種々の
修飾が前述の記載から当業者に明らかになるであろう。
そのような修飾はまた、本発明の範囲内である。
細書に開示される特定の態様が本発明のいくつかの観点
の例示として意図されるので、それらの態様により限定
されるものではない。いづれかの同等の態様は本発明の
範囲内に存在することが意図される。実際、本明細書に
示され、そして記載される態様の他に、本発明の種々の
修飾が前述の記載から当業者に明らかになるであろう。
そのような修飾はまた、本発明の範囲内である。
種々の文献が本明細書に引用され、それらの開示は、
引用により本明細書に組込まれる。
引用により本明細書に組込まれる。
配 列 表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）Novo Nordisk Biotech,Inc.
（Ｂ）通り:1445 Drew Avenue
（Ｃ）市:Davis
（Ｄ）州:California
（Ｅ）国:US
（Ｆ）郵便番号:95616−4880
（Ｇ）電話：（916）757−8100
（Ｈ）テレファックス：（916）758−0317
（ii）発明の名称：糸状菌におけるヘムタンパク質生
産を増加せしめるための方法 （iii）配列の数:39 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:4157個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:636個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1807個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:375個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号18: （２）配列番号19についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号19: （２）配列番号20についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号20: （２）配列番号21についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号21: （２）配列番号22についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:649個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号22: （２）配列番号23についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:548個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号23: （２）配列番号24についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:587個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号24: （２）配列番号25についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:342個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号25: （２）配列番号26についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:330個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号26: （２）配列番号27についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:330個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号27: （２）配列番号28についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:323個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号28: （２）配列番号29についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:398個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号29: （２）配列番号30についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:323個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号30: （２）配列番号31についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:424個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号31: （２）配列番号32についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号32: （２）配列番号33についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号33: （２）配列番号34についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号34: （２）配列番号35についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:34個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号35: （２）配列番号36についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号36: （２）配列番号37についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号37: （２）配列番号38についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号38: （２）配列番号39についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （xi）配列：配列番号39:
産を増加せしめるための方法 （iii）配列の数:39 （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:4157個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:636個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1807個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:375個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:23個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号18: （２）配列番号19についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号19: （２）配列番号20についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号20: （２）配列番号21についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号21: （２）配列番号22についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:649個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号22: （２）配列番号23についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:548個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号23: （２）配列番号24についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:587個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号24: （２）配列番号25についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:342個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号25: （２）配列番号26についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:330個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号26: （２）配列番号27についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:330個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号27: （２）配列番号28についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:323個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号28: （２）配列番号29についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:398個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号29: （２）配列番号30についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:323個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号30: （２）配列番号31についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:424個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ナシ （xi）配列：配列番号31: （２）配列番号32についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号32: （２）配列番号33についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号33: （２）配列番号34についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号34: （２）配列番号35についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:34個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号35: （２）配列番号36についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号36: （２）配列番号37についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号37: （２）配列番号38についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号38: （２）配列番号39についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （xi）配列：配列番号39:
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:69）
(72)発明者 チェリー，ジョエル アール.
アメリカ合衆国，カリフォルニア
95616，デイビス，アンダーソン ロー
ド 916
(72)発明者 ジョーンズ，オウブレイ
アメリカ合衆国，カリフォルニア
95695，ウッドランド，マッキンレイ
アベニュ 547
(56)参考文献 特表 平６−506108（ＪＰ，Ａ)
米国特許4902620（ＵＳ，Ａ)
Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（1993）23,
ｐ．501−507
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1987）,
262（35），ｐ．16822−16829
Ｙｅａｓｔ（1995），11（５），ｐ.
419−424
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ.
（1991），228（１−２），ｐ．300−
306
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1994）,
269（２），ｐ．813−815
Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1990）,
265（13），ｐ．7278−7283
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（1986），240,
ｐ．673−677
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（1991）,
173（１），ｐ．325−333
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (36)
- 【請求項１】ヘムタンパク質の製造方法であって、 （ａ）糸状菌細胞中に、 （ｉ）前記糸状菌細胞に対して内因性の第１核酸配列に
よりコードされているヘム生合成酵素の発現を指令する
ことができる１又は複数の第１制御配列、ここで前記１
又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作用可能
に連結されている、及び／又は （ii）５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする核
酸配列もしくはポルホビリノーゲンシンターゼをコード
する核酸配列又はそれらの組み合わせであるヘム生合成
酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複
数のコピー、 を導入し、 ここで、前記１もしくは複数の第１制御配列及び／又は
前記１もしくは複数の第２核酸配列の導入が前記糸状菌
細胞により生産されるヘムの量を増加させ、その結果ヘ
ムタンパク質の生産を増強させる； （ｂ）ヘムタンパク質及びヘム生合成酵素の生成のため
に適切な栄養培地において前記糸状菌細胞を培養し；そ
して （ｃ）前記糸状菌細胞の栄養培地から前記ヘムタンパク
質を回収する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】１又は複数の第１制御配列が前記糸状菌中
に導入される請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記第１制御配列が、リーダー、ポリアデ
ニル化配列、プロモーター、プロペプチドコード領域、
シグナルペプチドコード領域、及び転写ターミネーター
から成る群から選択される請求の範囲第２項記載の方
法。 - 【請求項４】前記１又は複数の第１制御配列が糸状菌株
から得られるものである請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】１又は複数の第２核酸配列の１又は複数の
コピーが糸状菌細胞中に導入される請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項６】前記１又は複数の第２核酸配列が、該第２
核酸配列の発現を指令することができる１又は複数の第
２制御配列に作用可能に連結される請求の範囲第５項記
載の方法。 - 【請求項７】前記１又は複数の第２核酸配列が糸状菌株
から得られるものである請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】前記１又は複数の第２核酸配列が５−アミ
ノレブリン酸シンターゼをコードする請求の範囲第５項
記載の方法。 - 【請求項９】前記１又は複数の第２核酸配列が、配列番
号２に示されるアミノ酸配列を有する５−アミノレブリ
ン酸シンターゼをコードする請求の範囲第８項記載の方
法。 - 【請求項１０】前記１又は複数の第２核酸配列が、配列
番号１に示される核酸配列を有する請求の範囲第９項記
載の方法。 - 【請求項１１】前記１又は複数の第２核酸配列が、ポル
ホビリノーゲンシンターゼをコードする請求の範囲第５
項記載の方法。 - 【請求項１２】前記１又は複数の第２核酸配列が、配列
番号４に示されるアミノ酸配列を有するポルホビリノー
ゲンシンターゼをコードする請求の範囲第11項記載の方
法。 - 【請求項１３】前記ポルホビリノーゲンシンターゼをコ
ードする第２核酸配列が、配列番号３に示される核酸配
列を有する請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１４】前記制御配列の１又は複数のコピー及び
前記第２核酸配列の１又は複数のコピーが前記糸状菌細
胞中に導入される請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１５】前記ヘムタンパク質をコードする第３核
酸配列の１又は複数のコピーを、段階ａ又は段階ｂの前
に、前記糸状菌細胞中に導入することをさらに含んで成
る請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１６】ヘム又はヘム類似体源を、栄養培地中に
導入することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載
の方法。 - 【請求項１７】鉄源を、栄養培地中に導入することをさ
らに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１８】前記ヘムタンパク質がオキシドレダクタ
ーゼである請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１９】前記オキシドレダクターゼが、カタラー
ゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダ
ーゼ又はペルオキシダーゼである請求の範囲第18項記載
の方法。 - 【請求項２０】前記オキシドレダクターゼがカタラーゼ
である請求の範囲第19項記載の方法。 - 【請求項２１】前記オキシドレダクターゼがオキシダー
ゼである請求の範囲第19項記載の方法。 - 【請求項２２】前記オキシドレダクターゼがオキシゲナ
ーゼである請求の範囲第19項記載の方法。 - 【請求項２３】前記オキシドレダクターゼがハロペルオ
キシダーゼである請求の範囲第19項記載の方法。 - 【請求項２４】前記オキシドレダクターゼがペルオキシ
ダーゼである請求の範囲第19項記載の方法。 - 【請求項２５】前記ペルオキシダーゼが、コプリナス
（Coprinus）、アルトロミセス（Arthromyces）又はフ
ァネロカエト（Phanerochaete）の種から得られる請求
の範囲第24項記載の方法。 - 【請求項２６】前記ペルオキシダーゼがコプリナス（Co
prinus）の株から得られる請求の範囲第25項記載の方
法。 - 【請求項２７】前記ペルオキシダーゼがコプリナス・シ
ネレウス（Coprinus cinereus）の株から得られる請求
の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項２８】前記ペルオキシダーゼがコプリナス・マ
クロリゾス（Coprinus macrorhizus）の株から得られる
請求の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項２９】前記ヘムタンパク質が前記糸状菌細胞に
とって生来的である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３０】前記ヘムタンパク質が前記糸状菌細胞に
対して外来性である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３１】前記糸状菌細胞が、アクレモニウム（Ac
remonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリ
ウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マイセ
リオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Mucor）、ニ
ューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicill
ium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム
（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Torichoderma）
の種の細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３２】前記糸状菌細胞がアスペルギラス（Aspe
rgillus）の細胞である請求の範囲第31項記載の方法。 - 【請求項３３】前記アスペルギラス（Aspergillus）の
細胞が、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryz
ae）の細胞である請求の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３４】前記アスペルギラス（Aspergillus）の
細胞が、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus nige
r）の細胞である請求の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３５】（ｉ）糸状菌細胞に対して内因性の第１
核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指
令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで
前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作
用可能に連結されている；及び／又は （ii）５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする核
酸配列もしくはポルホビリノーゲンシンターゼをコード
する核酸配列又はそれらの組み合わせであるヘム生合成
酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複
数のコピー； を含んで成る、ヘムタンパク質を生成することができる
組換え糸状菌細胞。 - 【請求項３６】（ｉ）糸状菌細胞に対して内因性の第１
核酸配列によりコードされるヘム生合成酵素の発現を指
令することができる１又は複数の第１制御配列、ここで
前記１又は複数の第１制御配列は前記第１核酸配列に作
用可能に連結されている；及び／又は （ii）５−アミノレブリン酸シンターゼをコードする核
酸配列もしくはポルホビリノーゲンシンターゼをコード
する核酸配列又はそれらの組み合わせであるヘム生合成
酵素をコードする１又は複数の第２核酸配列の１又は複
数のコピーを、組換え糸状菌細胞中に導入することを含
んで成る、組換え糸状菌細胞の生成方法。
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