JPH04330288A

JPH04330288A - 微生物の育種方法

Info

Publication number: JPH04330288A
Application number: JP7914891A
Authority: JP
Inventors: Yoko Ishino; 石野　洋子; Toshio Yajima; 敏夫矢島; Jiyungo Okada; 淳吾岡田
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1991-04-11
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1992-11-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、宿主微生物に外来ＤＮ
Ａを導入する微生物の育種方法に関し、より具体的には
宿主微生物に一定の大きさのＤＮＡ断片をベクターを用
いることなく直接導入する微生物の育種方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】産業上有用な物質を生産する微生物の育
種方法としては、従来以下のようなものがあった。１）変異原物質処理およびＵＶ照射による突然変異誘発
法。この方法は変異がアトランダムに導入される為に、
目的のものが複数の制御を受けている場合には有用菌を
得る確率が非常に小さくなる。また、目的としている箇
所以外に二次的な変異を起こし、ダメージを与えること
も往々にしてある。

【０００３】２）接合のような自然に起こる組み換え法
。これは接合が起こる微生物にその適用限られ、接合時
の組み換えなので、導入される情報に限度があり、確率
が低い。３）宿主−ベクター系を用いた形質転換法。この方法は
、目的とする遺伝子をプラスミドあるいはウィルスのよ
うなベクターに繋いでからプロトプラスト法または酢酸
リチウム法を用いて形質転換を行うというものである。この方法は適当なベクターが知られている菌体にその適
用が限られ、また、形質転換の確率はそのベクターの取
り込まれやすさに依存する。また、取り込まれてもその
ベクターが脱落してしまうことも多く安定性に問題があ
る場合がある。

【０００４】しかしながら、宿主−ベクター系を利用す
る育種方法は、クローン化遺伝子を用いてはじめて可能
となる遺伝子の操作方法を提供するものであり、有用物
質を生産する微生物作出の目的や遺伝子機能の解析研究
などに広く用いられている。真核細胞の一種として興味
を集める酵母を宿主とする場合の研究について概観する
と、通常のプラスミドによる形質転換を行う方法を初め
とし、線状プラスミドの利用を主目的に線状プラスミド
とミトコンドリアＤＮＡの宿主細胞への導入が比較検討
（Ｋ．　ＥｓｓｅｒおよびＦ．　Ｋｅｍｐｋｅｎ，　Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９８６
，　６９〜７６ページ）され、そして酵母の染色体ＤＮ
Ａそのものを宿主酵母に直接導入する方法（Ｋ．　Ｇｏ
ｔｏ　ら、Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　
５４，　１４９９〜１５０４，　１９９０）も公表され
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、外来Ｄ
ＮＡをベクターを用いて宿主細胞に導入して形質転換ま
たは形質導入を行う方法は、多様性のある微生物の有力
な育種手段であるが、適当な宿主−ベクター系が確立し
ていない系では適用ができない。そこで、本発明の目的
はベクターを使用することなく外来ＤＮＡ断片を宿主微
生物に導入し、染色体に組み込む方法の提供にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ベクター
を用いることなく宿主微生物の形質転換を行うべく、鋭
意検討を重ねたところ、酵母の染色体ＤＮＡ供与菌から
調製したＤＮＡを物理的剪断あるいは酵素処理して得た
一定の大きさのＤＮＡ断片がそのまま直接宿主に導入で
き、かつ安定な形質転換体を高頻度で得ることができる
ことを見い出した。さらに、かかる方法は酵母以外の微
生物へも適用可能であることを確認して本発明を完成し
た。

【０００７】従って、上記課題は、本発明の宿主微生物
に外来ＤＮＡを導入する微生物の育種方法であって、（
ａ）外来ＤＮＡが染色体に由来し、かつその大きさが　
１００ｋｂ以下であるＤＮＡ断片またはその等価なＤＮ
Ａ断片であり、そして（ｂ）前記ＤＮＡ断片を宿主微生
物に直接導入してその微生物の染色体に組み込む、こと
を特徴とする方法によって解決される。

【０００８】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
で宿主微生物に導入できる外来ＤＮＡ断片は、本発明の
目的に沿うＤＮＡ断片を供給できる微生物であればいず
れの微生物の染色体に由来するものであってもよく、起
源となりうる微生物としては、例えば、酵母、糸状菌お
よび枯草菌が挙げられる。これらのうち、好ましいＤＮ
Ａ断片は酵母染色体に由来するものである。また、本発
明では、それ自体既知のＤＮＡ合成法などにより調製し
た上記ＤＮＡ断片と等価なものもその範囲内に包含され
る。等価とは、ＤＮＡ断片が宿主染色体に組み込まれた
とき、染色体由来の対応するＤＮＡ断片と同等の機能を
発揮できる特性をいう。かかるＤＮＡ断片の大きさは、
特定遺伝子の発現を可能にする大きさであれば特に限定
されるものでないが、　１００ｋｂ以下、具体的には５
０ｋｂ以下、好ましくは３〜２０ｋｂの範囲内にある。

【０００９】上記ＤＮＡ断片は、微生物細胞からのそれ
自体公知のＤＮＡ抽出方法に準じて採取したＤＮＡを物
理的剪断力あるいは制限酵素処理によって切断すること
によって調製することができる。こうして調製したＤＮ
Ａ断片は、特定の断片を単離したものとして、または単
離することなく処理混合物の状態で宿主への導入工程に
供することができる。例えば、適当な細胞壁溶解酵素を
用いてＤＮＡ供与菌をプロトプラスト（またはスフェロ
プラスト）化した後、常法によりそれらを破壊し、次い
でタンパク質変性、フェノール・クロロホルム抽出、イ
ソアミルアルコール・クロロホルム洗浄、エタノール沈
殿、ＲＮａｓｅ　処理、エタノール沈殿という一連の操
作を行ってＤＮＡを得る。

【００１０】本発明で用いるＤＮＡの切断方法の具体例
のうち、物理的剪断としては、ＤＮＡ溶液をパスツール
ピペットに数回（３〜５回程度）通すか、注射針（１６
Ｇ〜２６Ｇ程度だが通常のものならどれでも可）に１〜
２回通して切断するなどの方法を挙げることができ、そ
して制限酵素による方法としては、クラスＩ、クラスＩ
Ｉに属するいずれの酵素も用いることができるが、クラ
スＩＩが好ましく、より具体的には、ＥＣｏＲＩ，Ｂａ
ｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ　，　ＰｓｔＩ，　ＸｂａＩ，
　ＳａｃＩなど６塩基認識の制限酵素による切断あるい
は　Ｓａｕ３ＡＩ，　ＴａｑＩ，　ＡｌｕＩなど４塩基
認識の制限酵素による部分切断などの方法が挙げられる
。切断されたＤＮＡ断片は、例えばＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ
バッファー中にて４℃で保存する。

【００１１】本発明に用いる宿主微生物は、上記ＤＮＡ
断片の起源となりうる微生物のいずれでもよいが、酵母
、糸状菌および枯草菌が好ましく、特にファフィア（Ｐ
ｈａｆｆｉａ　）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　）属に属するものが好ましい。より
具体的には色素アスタキサンチン産生菌であるファフィ
ア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　　　ｒｈｏｄｏｚｙ
ｍａ　）および酵母の宿主として広く使用されているサ
ッカロミセス・セルビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。

【００１２】これらの宿主に上記ＤＮＡ断片を導入する
方法としては、宿主細胞をプロトプラスト化することな
く、酢酸リチウム溶液を用いてＤＮＡ断片を挿入するか
、エレクトロポレーションもしくはエレクトロインジェ
クション法によりＤＮＡ断片を挿入するか、あるいは宿
主細胞を予めプロトプラスト化して、通常のプラスミド
の導入に用いられるＰＥＧ（ポリエチレングリコール）
法によるか、またはさらにエレクトロポレーション法を
用いてもよい。

【００１３】例えば、プロトプラスト化のための細胞壁
の除去には、各種生物の生産する任意の細胞壁溶解酵素
、例えば、ザイモリアーゼ、ノボザイム、リゾチーム、
マセロザイム、ドリセラーゼ、キチナーゼ、キトサナー
ゼ、ヘリカーゼ、キタラーゼ、セルラーゼもしくはかた
つむりの消化液を単独または組み合わせて使用すること
ができる。上述のように、プロトプラスト化した宿主に
エレクトロポレーションによりＤＮＡ断片を導入するこ
とが好ましいが、例えばその方法は以下のように行うこ
とができる。すなわち、プロトプラスト化（またはスフ
ェロプラスト化）した宿主を、等張液（０．６Ｍ〜１．
２Ｍソルビトール、好ましくは、１．０〜１．２Ｍソル
ビトールを緩衝液に含む）に、１０３　〜１０９　個／
ｍＬ好ましくは１０５　〜１０８　個／ｍＬ懸濁し、そ
こに上記の方法で準備したＤＮＡ断片を、０．０１μｇ
／ｍＬ〜　１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１μｇ／
ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ入れて４℃でしばらく静置した後
、エレクトロポレーションを行う。パルスの波形として
は、指数減衰波、方形波のいずれも用いることができる
が、望ましくは方形波がよい。電極間隔、パルス幅、パ
ルス強度、パルス回数については、宿主微生物の種類に
よって適宜異なるが、通常、電極間隔０．１〜３ｍｍ、
好ましくは０．５〜２ｍｍ、パルス幅３０〜　５００μ
ｓ、好ましくは５０〜　２００μｓ、パルス強度１〜３
０ｋＶ／ｃｍ、好ましくは３〜７ｋＶ／ｃｍ、パルス回
数１〜１５回、好ましくは１〜１０回の範囲で選ぶこと
ができる。

【００１４】こうしてＤＮＡ断片を導入した宿主微生物
のプロトプラスト再生は、各種のプロトプラスト再生培
地を用いて行う。培地を工夫することにより、各種の特
性を持つ優良菌株の獲得が可能になる。ＤＮＡ断片が取
り込まれ、形質転換した株の選択は、アミノ酸要求性等
のマーカーや表現型を利用するか、またはサザン法によ
るＤＮＡ解析により行うことができる。選択された株に
ついて、アミノ酸要求性の回復、ウラシルなど他の栄養
要求性の回復、薬剤や金属耐性の獲得およびアスタキサ
ンチン生産能向上による表現型、すなわち赤色コロニー
の獲得により確認したところによれば、高い確度でＤＮ
Ａ断片が宿主菌の染色体に取り込まれたものと確認でき
た。

【００１５】

【実施例】以下の例により本発明をより具体的に説明す
るが、これらの例示は本発明の範囲の限定を意図するも
のでない。例１：ファフィア酵母同士の形質転換（１）ＤＮＡの調製酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、バクトペプ
トン０．５％およびグルコース０．５％からなる液体合
成培地を坂口フラスコに５０ｍＬずつ分注し、　１２０
℃、２０分間オートクレーブで加熱滅菌した。ファフィ
ア・ロドチーマ（ＡＴＣＣ　２４２０３株）を保存スラ
ントから一白金耳とり、上記培地１本に接種し、２０℃
、３日間振盪培養した。

【００１６】培養液を遠心分離して得た菌体を５０ｍＭ
　　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）溶液で１回洗浄した後、バ
ッファー（０．０２Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ２−メル
カプトエタノール、１．２Ｍソルビトールを含む０．０
２Ｍのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．８）５ｍＬに懸濁
し、次いで２０℃で１時間プレインキュベーションを行
った。この後、５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１．２Ｍソルビ
トール溶液で１度洗浄後、次にプロトプラスト化溶液（
０．０１６Ｍクエン酸ソーダと０．０８Ｍリン酸１カリ
ウムからなるｐＨ５．８のクエン酸緩衝液、１．２Ｍソ
ルビトールと１．６ｍｇ／ｍＬのノボザイム２３４　を
含む）５ｍＬに菌体を懸濁して、２０℃で２時間インキ
ュベーションを行った。

【００１７】この状態で菌体が球状のプロトプラストに
なっていることを検鏡して確認した。０．１Ｍ　　ＥＤ
ＴＡ、１．２Ｍソルビトール溶液で１回洗浄し、５ｍＬ
の０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．０）に均一に懸濁し、プロナーゼＰを最終濃度　
５００μｇ／ｍＬになるように加えた。これに、さらに
２５％ＳＤＳ溶液を徐々に加え最終濃度１％にし、よく
混合させて、スフェロプラストを破裂させた後、３７℃
で４時間放置した。その後、６０〜６５℃で３０分間加
熱し、氷で冷した後、５ｍＬのフェノール−クロロホル
ム（１：１）溶液に加え、よく混合し、次いで遠心（１
０，０００ｒｐｍ　、１０分間）した。上層をとり、イ
ソアミルアルコール−クロロホルム（１：２４）で２回
洗い、得られた上層に２倍量の冷エタノールを加え、Ｄ
ＮＡを巻きつけて得た。ＲＮａｓｅ　５０μｇ／ｍＬで
３７℃、１．５時間処理した後、再びタンパク質除去、
エタノール沈殿を行ってＤＮＡ分画を得た。ＤＮＡは、
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶
液に溶かし、４℃で保存した。

【００１８】（２）栄養要求性変異株の調製ファフィア
・ロドチーマ（ＡＴＣＣ　２４２０１）株をＹＭ培地　
（Ｄｉｆｃｏ　社製）　を用い２０℃で４５時間培養し
、集菌後、蒸留水で２回洗浄したのちリン酸緩衝液（０
．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５　）５ｍＬに懸濁さ
せた。この懸濁液に変異誘発剤として、Ｎ−メチル−Ｎ
´−ニトロ−ニトロソゲアニジンを５μｇ／ｍＬとなる
ように添加し、懸濁液を２０℃で１時間振盪した。つい
で、集菌後、蒸留水で２回菌体を洗浄した。

【００１９】変異処理後、懸濁液を蒸留水で１０００倍
程度希釈し、希釈懸濁液０．１ｍＬ　をＹＭ寒天培地　
（Ｄｉｆｃｏ　社製）　に塗株して２０℃で７２時間培
養し、コロニーを得た。このコロニーのプレートをマスタープレートとしてレプ
リカ法により変異株の検出を行なった。すなわち、滅菌
したベルベット生地を用いて、前記マスタープレートの
コロニーを最少培地〔Ｄｉｆｃｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔ
ｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ
ｓ　　（Ｄｉｆｃｏ　社製）　６．７ｇ／Ｌ、グルコー
ス２０ｇ／Ｌおよび寒天２０ｇ／Ｌ〕にレプリカし、２
０℃で７２時間培養した。最少培地で増殖できない菌株
を栄養要求性変異株としてマスタープレートから釣菌し
た。

【００２０】その結果、マスタープレートからリジン要
求性変異株２４２０１−Ｌｙｓ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２
１２０）を得た。なお、ＦＥＲＭ　Ｐ番号は、工業技術
院微生物工業技術研究所への寄託番号であり、本菌株は
平成３年３月２２日付で寄託された（以下、同様の意味
を有する）。この２４２０１−Ｌｙｓ　を宿主に用いる
ために、坂口フラスコで２０℃、３日間振盪培養した後
、集菌して上述と同様な方法で、プロトプラスト化を行
った。

【００２１】こうして得た２４２０１−Ｌｙｓ　のプロ
トプラストを１０７　個／ｍＬになるようにし、そこへ
ＡＴＣＣ　２４２０３由来のＤＮＡを５０μｇ加えた。加えたＤＮＡはあらかじめ注射針に３回通すことにより
、約１０ｋｂの長さに切断した。４℃で１０分間静置し
た後、島津製作所社製細胞融合・遺伝子導入装置ＳＳＨ
−２　を用いてエレクトロポレーションを行った。電極
間隔１ｍｍ、パルス幅６０μｓ、パルス強度７ｋＶ／ｃ
ｍ、パルス回数３回で行った。

【００２２】電気パルスを印加し、次いで２０〜３０分
間静置した後、ソルビトール１．２Ｍを含むＹＰＤＡ培
地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２
％、アデニン０．０４％、寒天２％）と、同様にソルビ
トール１．２Ｍを含むＭＭ培地（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒ
ｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ
　０．６７％、グルコース２％、寒天２％）のプレート
上に希釈して　１００μＬずつ撒いた。ひき続き、ＭＭ
培地溶液（寒天を除いたもの）に１％低融点アガーを加
えて作った培地を重層してプロトプラストを埋設した。このようにして調製したプレートを２０℃で７日間培養
して再生した形質転換株を得ることができた。

【００２３】宿主のプロトプラスト化率は９９％以上、
再生率は３．２％であり、リジン要求性を相補して最少
培地上に生育するコロニーは、２．５×１０２　個／ｐ
ｌａｔｅ　の割合で得ることができた。なお、リジン要
求性を失う復帰突然変異株は得られなかった。すなわち
、１．０×１０３　個／μｇＤＮＡの頻度で形質転換体
が得られることを示す。得られた形質転換株は３カ月間４℃で保存した後も最少
培地上で生育することができることを確認した。すなわ
ち導入された遺伝子は染色体ＤＮＡに組み込まれて安定
に保持されていると考えられる。

【００２４】例２：サッカロミセス・セルビシェのファ
フィア酵母ＤＮＡによる形質転換酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、バクトペプ
トン０．５％およびグルコース１．０％からなる液体合
成培地を坂口フラスコに５０ｍＬ分注し、　１２０℃、
２０分間オートクレーブで加熱滅菌した。

【００２５】サッカロミセス・セルビシェＬ−３Ｃ（Ｌ
ｅｕ−　，Ｕｒａ−　）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２１１６）
　を宿主とするため、保存スラントから一白金耳とり、
上記培地に接種し、３０℃、２４時間振盪培養した。遠
沈して菌体を集め、溶液Ａ（１．２Ｍソルビトール、０
．０１Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶
液（ｐＨ５．８））で洗浄し、５ｍｌの溶液Ａに懸濁す
る。これに、０．１Ｍ２−メルカプトエタノールと、ザ
イモリアーゼ１ｍｇ／ｍＬを加え、３０℃、１時間イン
キュベートした。検鏡してプロトプラストになっている
ことを確認した後、洗浄し、実施例１と同様にして、フ
ァフィアＡＴＣＣ　２４２０３の約１０ｋｂに断片化さ
れたＤＮＡを用いてベクターに連結することなく直接形
質転換を行った。

【００２６】その結果、宿主のプロトプラスト化率は、
９９％以上、再生率は８．２％、形質転換株は５．８×
１０１　個／μｇＤＮＡの割合で得ることができた。得
られた形質転換株のうち５株を任意に選択し、次いでこ
れらの株をウラシルを添加した最少培地中（液体）で１
０世代継続培養した後も良好な生育を示し、これらの形
質転換株が安定であることが確認された。

【００２７】例３：ファフィア酵母の形質転換（１）１
３−Ｌｅｕ株、６−１０−Ａｒｇ株の調製ファフィア・
ロドチーマ（ＡＴＣＣ　２４２０１）株について例１と
同様に変異処理を行った。

【００２８】変異処理後、得られたコロニーの中から肉
眼で色調の濃くなったものを選択した。さらに、前述の
変異処理を施して得られたＹＭ寒天培地上のコロニーを
最少培地上にレプリカしてアミノ酸要求性の変異株の検
出を行なった。選択したコロニーの中から、乾燥菌体重
量当りのアスタキサンチン量が親株の４倍程度に増加し
た変異株１３−Ｌｅｕ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２１１８）
　と２０倍程度に増加した変異株６−１０−Ａｒｇ　（
ＦＥＲＭ　Ｐ−１２１１７）　を得た。

【００２９】（２）ＤＮＡの調製（１）で得られた６−１０−Ａｒｇ株から例１の（１）
と同様にして染色体ＤＮＡを調製した。ＤＮＡは、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ溶液に溶かし、４℃で保存した。

【００３０】（３）６−１０株のＤＮＡによる１３−Ｌ
ｅｕの形質転換宿主にする６−１０−Ａｒｇ株を坂口フラスコで２０℃
、３日間振盪培養し、上述と同様な方法でプロトプラス
ト化を行った。１３−Ｌｅｕ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２１
１８）　のプロトプラストを１０７　個／ｍＬになるよ
うにし、そこへ６−１０−Ａｒｇ由来のＤＮＡ断片を５
０μｇ加えた。加えたＤＮＡはあらかじめ注射針に３回
通すことにより、１０ｋｂの長さに切断したものである
。４℃で１０分間静置した後、島津製作所社製細胞融合・
遺伝子導入装置ＳＳＨ−２　を用いてエレクトロポレー
ションを行った。電極間隔１ｍｍ、パルス幅６０μｓ、
パルス強度７ｋＶ／ｃｍ、パルス回数３回で行った。電
気パルスを印加後２０〜３０分間静置した後ソルビトー
ル１．２Ｍを含むＹＰＤＡ培地（酵母エキス１％、ポリ
ペプトン２％、グルコース２％、アデニン０．０４％、
寒天２％）と、同様にソルビトール１．２Ｍ−ＭＭ培地
（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　
Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　０．６７％、グルコース２％
、寒天２％）のプレート上に希釈して　１００μＬずつ
撒いた。ひき続き、ＭＭ培地溶液（寒天を除いたもの）
に１％低融点アガーを加えて作った培地を重層してプロ
トプラストを埋設した。このようにして調製したプレー
トを２０℃で７日間培養して再生した形質転換株を得る
ことができた。宿主のプロトプラスト化率は９９％以上
、再生率は３．５％であった。アミノ酸要求性の相補で
求めた形質転換株は、１．８×１０３　個／μｇＤＮＡ
の頻度であった。そして、この操作で得られた形質転換
株の１つは、次のような高いアスタキサンチン生産性を
示したうえに、菌体の増殖速度も宿主と同等であった。 ―────────────────────────
──────―　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　比増殖速度　　　　アスタキサン
チン含量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　μｍａｘ（ＹＲ）　（ｍｇ／乾
燥菌体ｇ）―───────────────────
───────────―　　宿主　　　　　　　　　
　　　１３−Ｌｅｕ株　　　　　　０．０８　　　　　
　　　　　　　０．６０　　形質転換株　　　　　　　
　Ｔ−１　株　　　　　　０．０８　　　　　　　　　
　　　３．１７―─────────────────
─────────────―この形質転換株Ｔ−１　
株を１０回植えついだ後、アスタキサンチンの含量を測
定したがアスタキサンチン含量に有意の変化は認められ
なかった。

【００３１】

【発明の効果】本発明の方法に従うと、適当なベクター
が知られていない宿主菌体についても、形質転換を行う
ことができるうえに、ベクターに導入すべきＤＮＡを繋
ぐ等の操作が不要なので、形質転換効率が上がり、また
、外来ＤＮＡが直接宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれ、
脱落の心配もなく安定に保持されるため、産業上有用な
優良株の育種方法として好適である。

【００３２】本発明の方法をＵＶ照射、あるいは　ＮＴ
Ｇ，ＥＭＳ　などの薬剤による処理によって変異が誘発
された菌株や、異属に属する菌株等の種々の組み合わせ
に応用することにより、よりバラエティーに富んだ産業
上有用な物質を高生産する菌株を育種することが可能に
なり、生産された物質を、医薬、化粧品、食品、飼料分
野等へ応用することが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　宿主微生物に外来ＤＮＡを導入する微
生物の育種方法であって、（ａ）外来ＤＮＡが染色体に
由来し、かつその大きさが　１００ｋｂ以下であるＤＮ
Ａ断片またはその等価なＤＮＡ断片であり、そして（ｂ
）前記ＤＮＡ断片を宿主微生物に直接導入してその微生
物の染色体に組み込む、ことを特徴とする方法。
【請求項２】　　前記ＤＮＡ断片がファフィア（Ｐｈａ
ｆｆｉａ　）属およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　）属に属する微生物からなる群より選ば
れる微生物の染色体に由来するものであり、そして宿主
微生物が前記微生物のいずれかより選ばれる請求項１記
載の方法。
【請求項３】　　ＤＮＡ断片を宿主微生物に直接導入す
る工程を、宿主微生物のプロトプラストを用い、かつエ
レクトロポレーション法によって行う請求項２記載の方
法。