RU2788528C1 - Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков - Google Patents
Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788528C1 RU2788528C1 RU2022127025A RU2022127025A RU2788528C1 RU 2788528 C1 RU2788528 C1 RU 2788528C1 RU 2022127025 A RU2022127025 A RU 2022127025A RU 2022127025 A RU2022127025 A RU 2022127025A RU 2788528 C1 RU2788528 C1 RU 2788528C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phaffii
- strain
- recipient
- vkpm
- heterologous proteins
- Prior art date
Links
- 241001099156 Komagataella phaffii Species 0.000 title claims abstract description 48
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 13
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 10
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 10
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 10
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 10
- 241000949040 Citrobacter gillenii Species 0.000 description 10
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 10
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 7
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 108060000428 AOX Proteins 0.000 description 6
- 102100010989 AOX1 Human genes 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 6
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 5
- 101710004801 aml Proteins 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 5
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-Aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N Boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039636 EC 1.1.1.85 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 235000014966 Eragrostis abyssinica Nutrition 0.000 description 2
- 229960000304 Folic Acid Drugs 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 229940053207 Niacin Drugs 0.000 description 2
- 229960004172 Pyridoxine Hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229960002477 Riboflavin Drugs 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-OUCADQQQSA-N Riboflavin Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-OUCADQQQSA-N 0.000 description 2
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N Sodium molybdate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229960000344 Thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 2
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L Copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229920000900 Hepatitis delta virus ribozyme Polymers 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- 101700021119 LEUC Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 101700056051 cas9 Proteins 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010358 genetic engineering technique Methods 0.000 description 1
- 101710008935 hisHF Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101710017890 large T Proteins 0.000 description 1
- 101710026279 leuB2 Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229920002033 ribozyme Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Komagataella phaffii YLM9 с инактивированным геном LEU2, являющийся реципиентом для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков. Указанный штамм депонирован под номером ВКПМ Y-5014. Изобретение обеспечивает получение штамма-реципиента, который позволяет получать высокопродуктивные безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков. 4 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения ауксотрофного штамма-реципиента метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii, пригодного для конструирования на его основе безмаркерных штаммов-продуцентов, способных синтезировать гетерологичные белки.
Уровень техники
В настоящее время метилотрофные дрожжи Komagataella phaffii (Pichia pastoris) широко используются в качестве экспрессионной системы для получения гетерологичных белков. Активное использование дрожжей K. phaffii в современных биотехнологических производствах связано с их преимуществами по сравнению с другими прокариотическими и эукариотическими системами экспрессии, к которым относятся: высокая скорость роста при ферментации с высокой плотностью клеток (что позволяет получить более высокий уровень продукции целевого белка), эффективная секреция белка, простота питательных сред и условий культивирования, возможность применения различных генетических манипуляций, способность осуществлять посттрансляционные модификации гетерологичных белков [Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98, 5301-5317].
Конструирование дрожжевых безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков является необходимым условием их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве. Для получения штаммов-продуцентов гетерологичных белков в настоящее время применяется стратегия мультикопийной интеграции экспрессионных кассет в геном K. phaffii. Для интеграции нескольких копий целевого гена применяют отбор трансформантов на средах, содержащих высокие концентрации антибиотиков.
Необходимость создания безмаркерных штаммов-продуцентов обусловлена определенными запретами на использование маркеров антибиотикорезистентности в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, обычно, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение многократных интеграций генетического материала в хромосому, что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным ограничением на их применение. Поэтому конструирование штаммов-реципиентов, на основе которых возможно создавать безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков, является актуальным и практически значимым.
Активно используемыми в биотехнологии, а также применяющимися в качестве моделей для изучения метилотрофных дрожжей рода Komagataella, являются штаммы K. phaffii GS115 (his4) (Invitrogen, США), K. phaffii Х-33 (Invitrogen, США), K. phaffii KM71 (Invitrogen, США) и др.
В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения рассмотрим штамм метилотрофных дрожжей K. phaffii M12. Данный штамм обладает фенотипом Leu", что позволяет отбирать трансформанты на минимальной среде без добавления лейцина [Microb Cell Fact, 2017, 16:99].
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является получение высокопродуктивных безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков, таких как белки, обладающие ферментативной активностью, флуоресцентные белки, белки-гормоны и др.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма-реципиента, который даст возможность получать высокопродуктивные безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков.
Он достигается путем получения ауксотрофного по лейцину штамма дрожжей Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 - реципиента для конструирования безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 Экспрессионная плазмида pGAP-sgRNA2_leu2-pPFK300-Cas9-Km
Фиг. 2 Экспрессионная кассета 1
Фиг. 3 Экспрессионная кассета 2
Фиг. 4 Экспрессионная кассета 3
Осуществление изобретения
Получение заявляемого штамма осуществляется путем инактивации в штамме дикого типа Komagataella phaffii ВКПМ Y-4287 нативного гена LEU2, кодирующего фермент (3-изопропилмалатдегидрогеназу (IMDH), который участвует в биосинтезе лейцина. Инактивация может быть осуществлена с использованием любой из известных генно-инженерных методик.
Штамм-реципиент депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) как Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014.
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP следующего состава (мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют. Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией. При росте в жидкой среде YP следующего состава (мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, вода -остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм-реципиент способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.
Пример 1. Получение штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 с инактивированным геном LEU2
Заявленный штамм получают на основе штамма дикого типа K. phaffii ВКПМ Y-4287 путем инактивации гена LEU2, кодирующего β-изопропилмалатдегидрогеназу.
Инактивацию проводят с использованием системы геномного редактирования CRISPR-Cas9 [FEMS Yeast Research, 2017, 17(5)].
Методом Гиббсона [Nat Methods. 2009, 6(5), 343-345] конструируют плазмиду pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km (фиг. 1), содержащую следующие генетические элементы:
1. Последовательность НН - sgRNA2_leu2 - HDV, содержащая рибозим типа Hammerhead (НН) [Nature, 1994, 372(6501), 68-74] на 5'- конце, sgRNA2_leu2, которая нацелена на ген LEU2, и рибозим вируса гепатита дельта (HDV) [Nature, 1998, 395(6702), 567-574] на 3'- конце, под контролем дрожжевого GAP промотора.
2. Оптимизированную последовательность гена cas9, встроенную в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнала ядерной локализации большого Т-антигена SV40 [Cell Commun Signal, 2021, 19(60), 1-10], под контролем дрожжевого PFK300 промотора и CYC1 терминатора;
3. Дрожжевой селективный маркер kanR под контролем дрожжевого TEF промотора, обуславливающий у дрожжей K. phaffii устойчивость к антибиотику генетицину (G418);
4. Последовательность CEN/ARS, обеспечивающая сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма.
Полученную автономно реплицируемую плазмиду трансформируют в штамм K. phaffii ВКПМ Y-4287 методом электропорации.
Штамм K. phaffii ВКПМ Y-4287 предварительно выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотреитола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут.Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После электропорации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 600 мкг/мл.
Для инактивации гена LEU2 отобранные трансформанты пересевают 2 раза на среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) и антибиотика G418 в количестве 600 мкг/мл.
Селекцию трансформантов с инактивированным геном LEU2 проводят по способности к росту на минимальной среде М9 с добавлением и без добавления в среду лейцина в количестве 50 мкг/мл. Состав среды М9 (мас. %): Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4Cl - 0,1; MgSO4 7H2O -0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl2 - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р- аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO4 0,004; KJ -0,01; FeCl3 - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO4 - 0,04, вода - остальное. Отбирают трансформант, обладающий фенотипом His-, не способный расти на среде М9 без содержания лейцина.
Выщепление репликативной плазмиды pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km из клеток трансформанта проводят путем его ферментации в течение 48 ч в жидкой питательной среде YP с добавлением 2% глюкозы. Далее клетки высевают на агаризованную питательную среду YP с добавлением глюкозы (2 мас. %). Инкубируют в течение 48 ч при 30°С. Полученные колонии реплицируют на чашку с агаризованной средой YP и 2% глюкозой без антибиотика G418 и аналогичную чашку с антибиотиком G418. Клон, потерявший плазмиду pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km, отбирают по неспособности к росту на среде, содержащей антибиотик G418. Получают штамм с инактивированным геном LEU2.
Полученный штамм депонирован Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) как Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014.
В приведенных примерах получения трансформантов на основе штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, в качестве репортерных гетерологичных белков были использованы ферменты, легко детектируемые в культуральной жидкости путем измерения их активности.
Пример 2. Получение трансформантов штамма дрожжей K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующих фитазу Citrobacter gillenii
Трансформанты штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующие фитазу С.gillenii, получают трансформацией клеток этого штамма интегративной экспрессионной кассетой 1.
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 1 используют синтезированный ранее ген phyCg-op [FEMS Microbiology letters, 2021, 368, fnaa217], кодирующий фитазу С.gillenii [Genbank, №МТ157261].
Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют кассету 1 (фиг. 2), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген phyCg-op, кодирующий фитазу С.gillenii, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер PpLEU2, комплементирующий у дрожжей K. phaffii мутацию в гене LEU2;
4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1.
Указанную интегративную экспрессионную кассету 1 трансформируют в штамм K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт -1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После электропорации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.
Селекцию трансформантов ведут в течение 5 суток при температуре 30°С на минимальной агаризованной среде без содержания лейцина следующего состава (мас. %): Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,3; NaCl - 0,05; NH4Cl - 0,1; MgSO4 7H2O - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl2 - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин -0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO4 - 0,004; KJ - 0,01; FeCl3 - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO4 - 0,04, вода -остальное. Отбирают произвольно по 10 трансформантов.
Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров
PhyCg-op-F и PhyCg-op-R
PhyCg-op-F 5'- gacgaacaatctggtatgcaatt -3',
PhyCg-op-R 5'- ttacttttcagcacattcgct -3'.
Режим реакции ПЦР: 95°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 95°С - 30 с, 56°С - 30 с, 72°С - 80 с; 72°С - 5 мин. - 1 цикл.
Наличие ПЦР-фрагмента размером 1233 п. н. подтверждает присутствие целевого гена в составе хромосомы полученных трансформантов.
Для сравнения продуктивности получают трансформанты штамма K. phaffii Y-4287, продуцирующие фитазу С.gillenii.
Трансформанты штамма K. phaffii Y-4287, продуцирующие фитазу С.gillenii, получают трансформацией клеток штамма K. phaffii Y-4287 интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген phyCg-op, кодирующий фитазу С.gillenii, полученной аналогично и трансформированной как описано ранее [Биотехнология, 2021, 37(4), 5-13].
Для сравнения уровней продукции фитазы в штаммах K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 проводят ферментацию десяти отобранных трансформантов каждого штамма, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii. Ферментацию проводят при следующих условиях:
- Посевную культуру каждого трансформанта выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
- Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением 2% метанола в течение 2 суток.
Продуктивность трансформантов, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii, оценивают по уровню активности фитазы в культуральной жидкости. Для этого по окончании ферментации клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а в отделенном супернатанте определяют фитазную активность модифицированным методом Фиске-Субарроу [JMicrobiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.].
В табл. 1 представлены продуктивности трансформантов штаммов K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii, среднее значение продуктивности, рассчитанное для 10 трансформантов каждого штамма, и относительная продуктивность трансформантов.
Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что среднее значение продуктивности трансформантов K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 превышает таковое для трансформантов K. phaffii ВКПМ Y-4287 более чем на 13%.
Пример 3. Получение трансформантов штамма дрожжей K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующих амилазу Bacillus licheniformis
Трансформанты штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующие амилазу В. licheniformis, получают трансформацией клеток этого штамма интегративной экспрессионной кассетой 2.
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 2 в качестве источника гена amyS [Genbank, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/CP093290.1 ?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=2&RID=B3RY153T013], кодирующего амилазу В. licheniformis, используют тотальную геномную ДНК В. licheniformis ВКПМ В-10958.
Синтезируют ДНК гена amyS методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R
AmyS-F 5'- gcaaatcttaatgggacgct -3',
AmyS-R 5'- tctttgaacataaattgaaa -3'.
Режим реакции ПЦР: 95°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 95°С - 30 с, 57°С - 30 с, 72°С - 90 с; 72°С - 5 мин. - 1 цикл.
Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют экспрессионную кассету 2 (фиг. 3), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген amyS, кодирующий амилазу В. licheniformis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер PpLEU2, комплементирующий у дрожжей K. phaffii мутацию в гене LEU2;
4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1
Интегративную экспрессионную кассету 2 трансформируют в штамм K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014. Трансформацию экспрессионной кассеты 2 и селекцию трансформантов осуществляют, как описано в примере 1.
Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R, описанных выше.
Для получения трансформантов контрольного штамма K. phaffii ВКПМ Y-4287, продуцирующих амилазу В. licheniformis, конструируют экспрессионную кассету 3.
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 3 используют последовательность гена amyS.
Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют экспрессионную кассету 3 (фиг. 4), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген amyS, кодирующий амилазу В. licheniformis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;
3. Дрожжевой селективный маркер kanR, под контролем дрожжевого TEF промотора, обуславливающий у дрожжей K. phaffii устойчивость к антибиотику генетицину (G418);
4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1
Интегративную экспрессионную кассету 3 трансформируют в штамм K. phaffii Y-4287. Трансформацию экспрессионной кассеты 3 и селекцию трансформантов осуществляют, как описано ранее [Биотехнология, 2021, 37(4), 5-13].
Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R, описанных выше.
Для сравнения уровней продукции амилазы В. licheniformis в штаммах K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 проводят ферментацию десяти отобранных трансформантов каждого штамма с генами, кодирующими амилазу В. licheniformis. Ферментацию проводят, как описано в примере 1.
Определение активности амилазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом: в каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата крахмала в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.
В табл. 2 представлены продуктивности трансформантов штаммов K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий амилазу В. licheniformis, среднее значение продуктивности, рассчитанное для 10 трансформантов каждого штамма, и относительная продуктивность трансформантов.
Из данных, приведенных в таблице 2, следует, что среднее значение продуктивности трансформантов K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 превышает таковое для трансформантов K. phaffii ВКПМ Y-4287 более чем на 17%.
Таким образом, полученные результаты показывают, что использование заявляемого штамма-реципиента приводит к получению безмаркерных штаммов с продуктивностью гетерологичных белков, значительно повышенной относительно родительского штамма K. phaffii ВКПМ Y-4287.
Отсутствие генов антибиотикорезистентности и повышенная продуктивность штаммов, получаемых на основе заявленного штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, расширяют возможность их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве.
Claims (1)
- Штамм дрожжей Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2788528C1 true RU2788528C1 (ru) | 2023-01-23 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2746817C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-04-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр "Бирюч-новые технологии" | Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) YIB Δleu2_PLA2S |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2746817C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-04-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр "Бирюч-новые технологии" | Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) YIB Δleu2_PLA2S |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BETANCUR M.O. et al. Multicopy plasmid integration in Komagataella phaffii mediated by a defective auxotrophic marker. Microb Cell Fact. 2017 Jun 8; 16(1):99. doi: 10.1186/s12934-017-0715-8. * |
ГОРДЕЕВА Т.Л. и др. Изучение экспрессионного потенциала новых штаммов дрожжей рода Komagataella. БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2021, Т.37, N4, с. 5-13, реферат. ТЮРИН О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2014, с. 1-24. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105229154A (zh) | 组成型启动子 | |
JP2001516584A (ja) | 乳酸生産のための酵母菌株 | |
US4816405A (en) | Vectors for transformation by ascomycetes | |
US20160289690A1 (en) | Mortierella alpina recombinant gene expression system and construction method and use thereof | |
CN112592881B (zh) | 用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌 | |
JP7473137B2 (ja) | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 | |
Wang et al. | Improved protein synthesis and secretion through medium enrichment in a stable recombinant yeast strain | |
RU2652877C9 (ru) | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом | |
RU2788528C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков | |
RU2787584C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном HIS4 - реципиент для конструирования безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков | |
JP6206408B2 (ja) | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター | |
RU2737623C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris с увеличенной продукцией фитазы Escherichia coli | |
WO2003016525A9 (fr) | Procede de production d'alcool a partir d'amidon | |
CN111849790B (zh) | 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用 | |
JP3443605B2 (ja) | 間性ヘテロ接合フィコマイセス | |
RU2751595C2 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент фитазы Escherichia coli | |
KR100545563B1 (ko) | 재조합 단백질 생산 능력이 향상된 사카로마이세스세레비지애 변이주 | |
RU2728243C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris, продуцирующий ксиланазу из Paenibacillus brasilensis | |
CN113122461A (zh) | 单细胞蛋白生产菌及其应用 | |
Hsieh et al. | An autoselection system in recombinant Kluyveromyces lactis enhances cloned gene stability and provides freedom in medium selection | |
RU2771079C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
KR102613937B1 (ko) | 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법 | |
RU2795707C1 (ru) | Трансформант Ogataea haglerorum - продуцент термостабильной α-амилазы | |
RU2771582C1 (ru) | Трансформант дрожжей Komagataella phaffi - продуцент фитазы Citrobacter gillenii | |
RU2752896C1 (ru) | Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ |