JP2001516584A

JP2001516584A - 乳酸生産のための酵母菌株

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Publication number: JP2001516584A
Application number: JP2000511873A
Authority: JP
Inventors: ポーロ，ダニロ; ビアンキ，ミケーレ; ランツイ，ビアンカ・マリア; フロンタリ，ラウラ; バイ，マリナ; ウインクラー，アーロン・アドリアン; アルベルジーナ，リリア
Original assignee: エイ・イー・スタリー・マニユフアクチヤリング・カンパニー
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2001-10-02
Also published as: US6429006B1; CA2302434A1; US7049108B2; DE69832624T2; US7326550B2; BR9812434A; EP1012298A1; DK1012298T3; ATE311460T1; AU748462B2; DE69832624D1; IT1294728B1; US20030032152A1; ITMI972080A1; SI1012298T1; WO1999014335A1; ES2252863T3; AU9539298A; US20060148050A1; EP1012298B1

Abstract

(57)【要約】乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換され、そしてさらに、高い収率と生産性をもつ乳酸生産のために改変された酵母菌株が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の少なく
とも１個のコピーにより形質転換され、そして高い収率と生産性をもつ乳酸生産
のためにさらに改変された酵母菌株に関する。

【０００２】発明の背景乳酸およびその誘導体の応用は、多くの工業活動分野（すなわち、化学、化粧
品および薬学）、ならびに食品製造と使用の重要な範囲を包含する。さらにまた
、今日では、生分解性ポリマー材の合成のために直接使用されるそのような有機
酸の製造における関心が高まりつつある。

【０００３】乳酸は、化学合成によるか、または微生物を使用する炭水化物の発酵によって
製造することができる。後者の方法は、化学合成によって生成されるラセミ混合
物に対して、１種の異性体を独占的に生産する微生物が開発されたので、今や商
業的に好適である。もっとも重要な工業用微生物。例えば属ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびリゾープス
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）は、Ｌ（＋）−乳酸を生産する。また、Ｄ（−）−乳酸も
しくはＬ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の混合物の発酵による生産も知られてい
る。

【０００４】典型的な乳酸発酵においては、生産微生物の代謝活性に対する生産された乳酸
によって惹起される阻害効果が存在する。乳酸の存在に加えて、ｐＨ値を低下す
ることも、また細胞増殖と代謝活性を阻害する。結果として、一般に、乳酸生産
の程度が低下される。

【０００５】それ故、乳酸を中和し、そしてｐＨ低下を防ぐためのＣａ（ＯＨ）₂、ＣａＣＯ₃、ＮａＯＨもしくはＮＨ₄ＯＨの添加は、遊離の乳酸蓄積のネガティブ効果に
対抗するための工業的工程における慣用の操作である。

【０００６】これらの工程は、ｐＨを範囲約５〜７の一定値に維持することによって、乳酸
塩の生産を可能にする；これは、十分に乳酸のｐＫ_a、３．８６以上である。

【０００７】主要な欠点は、発酵中の乳酸の中和に関係している。主として、遊離の乳酸を
その塩から再生し、そして中和する陽イオンの処理もしくは再利用するために、
付加的操作が必要になる；これは、費用のかかる工程である。もし、遊離の乳酸
が、低いｐＨ値において増殖する微生物によって蓄積でき、それによって、乳酸
塩の生産を最小化することができれば、余分な操作と費用のすべてが排除できる
であろう。

【０００８】乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する組み換え酵母の使用によって、解糖の
流れを乳酸生産の方向へシフトさせることが提案された。

【０００９】フランス特許出願公開第６９２５９１号（ＩｎｓｔｉｔｕｔＮａｔｉｏｎ
ａｌｅｌａＲｅｃｈｅｒｃｈｅＡｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）は、乳酸菌由来
の乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子であって、酵母においてその発
現を調節している配列の制御下にある該遺伝子の少なくとも１個のコピーを含有
する酵母菌株、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株を開示
している。

【００１０】該菌株は、アルコールおよび乳酸発酵の両方を行うことができ、そしてこのい
わゆる「中間的（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」もしくは「均衡（ｂａｌａｎｃ
ｅｄ）」発酵は、ビール醸造、ワイン醸造およびパン焼きのような領域において
利用することができるであろう。

【００１１】また、Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている
遺伝子を用いるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換を報告
した。

【００１２】しかしながら、エタノールの高い生産のために、前記両方法の乳酸生産におけ
る収率は、乳酸菌の使用によって得られる収率に匹敵するとは見なされなかった
。過去の１０年間において、Ｓ．セレビシエ以外の「非慣用酵母」が、異種タ
ンパク質の発現のための宿主としてかなり高い工業的関心を得た。例は、メタノ
ール資化性酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ラクトース資化性酵母、例えばクルイベロミセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）である。炭素およびエネルギー源として広範
囲な基質の使用を可能にすることに加えて、他の議論は、「非慣用酵母」の工業
的使用のために提案された。一般的に言えば、バイオマスおよび生産物収量は、
これらの酵母のある種では、細胞環境の苛酷な条件によってもほとんど影響を受
けない。高濃度の糖耐性（すなわち、５０〜８０％ｗ／ｖグルコース培地；トル
ラスポラ−異名チゴサッカロミセス−・デルブルッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ −ｓｙｎ．Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ− ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）
、チゴサッカロミセス・ルキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）およびチゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂａｉｌｉｉ）；ＯｋＴａｎｄＨａｓｈｉｎａｇａＦ．，Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌ＆ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ４３（１）：３９−４７，１９９７）、ならびに酸および乳酸耐性（
チゴサッカロミセス・ルキシイおよびチゴサッカロミセス・バイリイ；Ｈｏｕｔ
ｓｍａＰＣ，ｅｔａｌ．，ＪｏｆＦｏｏｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ５９
（１２），１３００−１３０４，１９９６）の「非慣用酵母」が利用しうる。既
に強調されたように、もし発酵法が、前記の１つ以上の「苛酷な条件」下で実施
されれば、下流処理の費用は、著しく削減することができるであろう。

【００１３】発明の概要第１の実施態様によれば、本発明は、エタノール生産能を欠いているか、また
は低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ
ＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的
に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株
を提供する。

【００１４】より具体的には、本発明は、低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピル
ビン酸デカルボキシラーゼ活性をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）をコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、
機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵
母菌株を提供する。

【００１５】その他の実施態様によれば、本発明は、クルイベロミセス、トルラスポラおよ
びチゴサッカロミセスの種の酵母菌株であって、該酵母において遺伝子の発現を
可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ
ＤＨ）をコードしている遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された
酵母菌株を提供する。

【００１６】さらなる実施態様によれば、本発明は、また、異種ＬＤＨ遺伝子により形質転
換され、そして乳酸輸送体を過剰発現する酵母細胞を提供する。

【００１７】他の実施態様は、酵母プロモーター配列に機能的に結合された乳酸デヒドロゲ
ナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および炭素源を含
有する発酵培地において前記の代謝的に工作された酵母菌株を培養し、そして発
酵培地から乳酸を回収することによるＤＬ−、Ｄ−もしくはＬ−乳酸の製造方法
である。

【００１８】さらにまた、本発明は、操作された発酵培地において該酵母菌株を培養し、そ
して発酵培地から乳酸を回収することによって、乳酸の炭素源における生産性（
ｇ／ｌ／ｈｒ）、生産量（ｇ／ｌ）および収率（ｇ／ｇ）を改良する方法を提供
する。

【００１９】発明の記述乳酸が、属クルイベロミセス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッ
カロミセスに属する代謝的に改変された酵母によって生産し得ることが見い出さ
れた。

【００２０】より具体的には、乳酸生産における非常に高い収率が、少なくともエタノール
発酵を乳酸発酵によって置換するように工作された酵母菌株によって得られるこ
とが見い出された。

【００２１】乳酸生産において、なおより高い収率（＞８０％ｇ／ｇ）は、エタノール発酵
とミトコンドリアによるピルビン酸の使用の両方を、乳酸発酵によって置換する
ように工作された酵母菌株によって得られるかも知れない。

【００２２】この目的のために、また、本発明は、例えば、１細胞当たりの増加されたＬＤ
Ｈコピー数、またはＬＤＨ発現を制御するより強力なプロモーターの使用の結果
として、増強されたＬＤＨ活性をもつ形質転換酵母細胞を提供する。

【００２３】１細胞当たりの増加されたＬＤＨコピー数は、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク
質をコードしている核酸配列の少なくとも１個のコピー、好ましくは少なくとも
２個のコピー、より好ましくは４個のコピー、なおより好ましくは、該核酸配列
の１０〜５０個のコピーを意味する。

【００２４】乳酸のもっとも高い生産のためには、本発明により形質転換された酵母細胞は
、好ましくは、乳酸輸送体を過剰発現する。これは、乳酸輸送体のために必要な
遺伝子の１個以上のコピーにより酵母細胞を形質転換することによって得ること
ができる。

【００２５】本発明による菌株は、いくつかの方法によって、例えば、乳酸デヒドロゲナー
ゼ活性の発現を標的とする遺伝子工学技術、およびエタノールの生産に関与する
酵素活性、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ
活性の不活性化もしくは抑制、およびミトコンドリアによるピルビン酸の利用に
関与する酵素活性の不活性化もしくは抑制によって得ることができる。

【００２６】ピルビン酸デカルボキシラーゼは、アルコール経路における最初の段階を触媒
するので、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性をもたないか実質的に
低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する酵母菌株
が好適である。

【００２７】さらに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ミトコンドリアによるピルビン酸の
利用における最初の段階を触媒するので、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ
）活性をもたないか実質的に低い活性をもち、そして異種の乳酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を発現する酵母菌株が、また好適である。

【００２８】乳酸は、乳酸輸送体を介して培地中に分泌されるので、乳酸を生産し、そして
乳酸輸送体を過剰発現する細胞が、また好適である。

【００２９】酵母菌株におけるＬＤＨ遺伝子の発現は、遊離の酸が直接得られ、そして乳酸
塩の面倒な転化と回収が最小化されるような酸性ｐＨ値における乳酸の生産を可
能にする。本発明において、発酵培地のｐＨは、最初は４．５を超えていてもよ
いが、発酵の終了時には、ｐＨ４．５以下、好ましくは３以下まで低下するであ
ろう。

【００３０】いかなる種類の酵母菌株も、本発明により使用されてもよいが、クルイベロミ
セス、サッカロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種が好適であ
る。何故なら、これらの菌株は、非常に低いｐＨにおいて、特にｐＨ４．５以下
の範囲において増殖し、そして／または代謝できるからである；これらの菌株の
ための遺伝子工学法は、よく開発されている；そしてこれらの菌株は、食品関連
の応用における使用のために広く受け入れられている。

【００３１】乳酸の良好な収率は、さらに、「野生型」ピルビン酸デカルボキシラーゼおよ
び／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ乳酸デヒドロゲナーゼをコー
ドしている遺伝子により形質転換されたクルイベロミセス、トルラスポラおよび
チゴサッカロミセス菌株によって得ることができる。

【００３２】用語「低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性」は、細胞における減少された
酵素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。

【００３３】用語「低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」は、細胞における減少された酵
素濃度、または酵素の低いか全くない比触媒活性、のいずれかを意味する。

【００３４】本発明によれば、エタノール生産がゼロであるかそれに近いが、例えば、野生
型菌株の正常値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く
、そしてなおより好ましくは少なくとも９０％低く、低い生産が受け入れられる
菌株の使用が好適である。

【００３５】本発明によれば、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性が、ゼロであるかそれに近いが、例えば、野生型菌株の正常
値よりも少なくとも６０％低く、好ましくは少なくとも８０％低く、そしてさら
により好ましくは少なくとも９０％低く、低い活性が認められる菌株の使用が好
適である。

【００３６】ＰＤＣ活性をもたないＫ．ラクチスの例は、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９６において開示された。

【００３７】低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株の例は、Ａｃｃ．Ｎｏ．２０００２
７および２０００２８を付してＡＴＣＣから入手できる。調節ＰＤＣ２遺伝子の
欠失の結果として低いＰＤＣ活性をもつサッカロミセス菌株のさらなる例が、Ｈ
ｏｈｍａｎｎＳ（１９９３）（ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２４１：６５
７−６６６）において記述された。

【００３８】ＰＤＣ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、ＦｌｉｋｗｅｅｒｔＭ．
Ｔ．らにより記述された（Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６）。Ｓ
．セレビシエにおける、ＰＤＣ活性の低下は、構造遺伝子（ＰＤＣ１，ＰＤＣ５
，ＰＤＣ６）の欠失もしくは調節遺伝子（ＰＤＣ２）の欠失のいずれかによって
得ることができる。

【００３９】ＰＤＨ活性をもたないクルイベロミセス菌株の例は、Ｚｅｅｍａｎらにより記
述された（Ｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｙｒｕｖａｔｅｍｅｔａ
ｂｏｌｉｓｍｉｎＫ．ｌａｃｔｉｓ；Ｙｅａｓｔ，ｖｏｌ１３Ｓｐｅｃ
ｉａｌＩｓｓｕｅＡｐｒｉｌ１９９７，ＥｉｇｈｔｅｅｎｔｈＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉ
ｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐ１４３）。

【００４０】ＰＤＨ活性をもたないサッカロミセス菌株の例は、ＰｒｏｎｋＪＴ．らによ
り記述された（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４０（Ｐｔ３）：６０１−１０
，１９９４）。

【００４１】ＰＤＣ遺伝子は、種々の酵母の属中で高度に保存されている（Ｂｉａｎｃｈｉｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９（１
）：２７−３６，１９９６；ＬｕＰ．ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ＆Ｅ
ｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６４（１）：９４−７，
１９９８）。それ故、ＬｕＰら（前出）によって報告されたように、古典的分
子アプローチにしたがって、両トルラスポラおよびチゴサッカロミセス酵母種か
らピルビン酸デカルボキシラーゼ活性に必要な遺伝子を、同定し、クローン化し
、そして破壊することが可能であることは、容易に期待できる。さらに、Ｎｅｖ
ｅｌｉｎｇＵら（１９９８，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，１８０（６）：１５４０−８，１９９８）によって報告されたように、同じ
古典的アプローチにしたがって、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの両酵
母種においてＰＤＨ活性に必要な遺伝子を、単離し、クローン化し、そして破壊
することが可能であることは、また容易に期待できる。

【００４２】ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、既知の方法、例えばＵｌｂｒｉｃｈ
Ｊ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，ｐ．１０
９−１１９，１９７０，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに
よって測定できる。

【００４３】ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばＮｅｖｅｌｉｎｇＵ．ら（前出
）による既知の方法によって測定できる。

【００４４】適当な菌株は、野生型もしくは保存菌株の選択的突然変異および／または遺伝
子操作によって得ることができる。数百の変異株が、「高生産性スクリーン」ア
プローチによって選択できる。種々の解糖系流速を支持する栄養物質を使用する
ことによるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の調節（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
Ｐｒｏｇ．１１，２９４−２９８，１９９５）は、満足されないことが証明され
た。

【００４５】本発明により酵母菌株におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性および／ま
たはピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下もしくは消滅する好適な方法は、対
応する遺伝子もしくは遺伝子群の欠失にある。

【００４６】これらの欠失は、Ｂｉａｎｃｈｉら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１９（１），２７−３６，１９９６；ＦｌｉｋｗｅｅｒｔＭ．Ｔ．ｅｔ
ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１２：２４７−２５７，１９９６およびＰｒｏｎｋＪＴ
．ｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０（Ｐｔ３）：６０１−１
０，１９９４）によって開示されたような既知の方法によって、選択マーカー、
例えばＵＲＡ３マーカー、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ
３マーカーの手段による欠失もしくは挿入によって実施される。あるいはまた、
欠失、点変異および／またはフレーム・シフト変異が、機能性プロモーターおよ
びＰＤＣおよび／またはＰＤＨ活性に必要な遺伝子中に導入できる。これらの技
術は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３０５，３９１−３９７，１９８３において開示
されている。これらの活性を低下する付加法は、ＰＤＣおよびＰＤＨｍＲＮＡの
翻訳を阻害するための、遺伝子配列中の終止コドンの導入もしくはアンチセンス
ｍＲＮＡの発現であってもよい。

【００４７】ＰＤＣ遺伝子が、Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３遺伝子によって置換されたクルイ
ベロミセス・ラクチス菌株は、既に、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ１９（１），２７−３６，１９９６において記述された。

【００４８】乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子は、いかなる種（例えば、ウシ
のような哺乳類もしくは細菌類）のものであってもよく、そしてそれは、Ｌ（＋
）−ＬＤＨもしくはＤ（−）−ＬＤＨをコードしていてもよい。あるいはまた、
両タイプのＬＤＨ遺伝子が、同時に発現されてもよい。さらに、ＬＤＨＤＮＡ
配列をもついかなる天然もしくは合成変異体、野生型ＬＤＨ遺伝子と高い同一性
をもついかなるＤＮＡ配列、正常なＬＤＨ活性を補足するいかなるＤＮＡ配列が
、使用されてもよい。

【００４９】輸送体遺伝子として、例えば、Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしている
ＪＥＮ１遺伝子が使用できる。

【００５０】酵母菌株の形質転換は、組み込みもしくは複製ベクター、直鎖状もしくはプラ
スミド状のいずれを用いても実施することができる。

【００５１】本発明の組み換え細胞は、外来ＤＮＡを細胞中に導入させるすべての方法（Ｓ
ｐｅｎｃｅｒＪｆ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｓｉｃＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２８（５）：３２１−３３３，１９８８）、例えば、形
質転換、エレクトロポレーション、接合、プロトプラスト融合もしくはすべての
他の既知技術によって得ることができる。形質転換に関して、種々の方法が記述
された：特に、それは、ＩｔｏＨ．ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：
１６３，１９８３）による酢酸リチウムおよびポリエチレングリコールの存在下
、またはＤｕｒｒｅｎｓＰ．ら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：７，１９９
０）によるエチレングリコールおよびジメチルスルホキシドの存在下で、全細胞
を処理することによって実施することができる。また別の方法は、欧州特許第３
６１９９１号において記述されている。エレクトロポレーションは、Ｂｅｃｋｅ
ｒＤ．Ｍ．およびＧｕａｒｅｎｔｅＬ．（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８，１９９１）により実施することができる。

【００５２】非細菌性組み込みベクターの使用は、酵母菌体が、発酵法の終了時点で、保存
飼料として、または他の繁殖用、農業用もしくは食用目的に使用される場合には
好適であろう。

【００５３】本発明の特定の実施態様では、組み換えＤＮＡは、自律もしくは組み込み複製
できる発現プラスミドの一部分である。

【００５４】特に、両Ｓ．セレビシエおよびＫ．ラクチスでは、自律複製ベクターは、選ば
れた宿主における自律複製配列を使用することによって得ることができる。特に
、酵母においては、それらは、プラスミド（２μ，ｐＫＤ１など）もしくは染色
体配列（ＡＲＳ）さえから得られる複製開始点であってもよい。

【００５５】組み込みベクターは、相同組み換えによりベクターの組み込みを可能にする、
宿主ゲノムのある領域における相同ＤＮＡ配列を使用することによって得ること
ができる。

【００５６】遺伝子発現のための遺伝道具は、Ｓ．セレビシエに関して非常に良く開発され
ており、そしてＲｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ，８：４２
３，１９９２に記述されている。遺伝道具は、また、組み換えタンパク質生産の
ための宿主細胞として酵母クルイベロミセスおよびトルラスポラ種の使用を可能
にするためにも開発されてきた（ＳｐｅｎｃｅｒＪｆ，ｅｔａｌ．，前出；
ＲｅｉｓｅｒＪ．ｅｔａｌ．，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４３，７５−
１０２，１９９０）。Ｋ．ラクチスにおいて自律的に複製するベクターの若干の
例は、Ｋ．ラクチスの直鎖状プラスミドｐＫＧ１（ｄｅＬｏｖｅｎｃｏｕｒｔ
Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４：７３７，１９８２
）に基づくか、または自己複製と正しい分離能をベクターに付与するＫ．ラクチ
スそれ自体の染色体配列（ＫＡＲＳ）（ＤａｓＳ．，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ
Ｃ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，６：１２３，１９８２）を含有しているか
いずれかであると報告されている。さらにまた、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）に固有の２μ−様プラスミド（プラスミドｐＫＤ１
−米国特許第５１６６０７０号）の認識が、組み換えタンパク質の生産のた
めの非常に有効な宿主／ベクター系を確立させた（欧州特許出願公開第３６１
９９１号）。組み換え体ｐＫＤ１に基づくベクターは、適当な酵母および細菌マ
ーカーに融合された完全な元の配列を含有する。あるいはまた、ｐＫＤ１の一部
を、共通のＳ．セレビシエ発現ベクターと組み合わせることができる（Ｒｏｍａ
ｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｙｅａｓｔ，８：４２３，１９９２）（Ｃｈｅｎ
ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：９５，１９８９）。

【００５７】Ｓ．セレビシエ由来の２μプラスミドが、トルラスポラにおいて複製し、そし
て安定に維持されることが知られている。この酵母において、異種タンパク質の
発現は、同時形質転換操作、すなわち、Ｓ．セレビシエのための発現ベクターと
全２μプラスミドの同時存在によって得られた（ＣｏｍｐａｇｎｏＣ．ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）。分子
間および分子内組み換えの結果として、完全な２μ配列と異種遺伝子を担持して
いるハイブリッドプラスミドを単離することができる；そのようなプラスミドは
、原則的には、トルラスポラを直接形質転換することができる。

【００５８】さらに、Ｓ．セレビシエＡＲＳ１配列に基づくエピソームプラスミドも記述さ
れているが、このプラスミドの安定性は非常に低い、Ｃｏｍｐａｇｎｏら（前出
）。

【００５９】近年、ｐＴＤ１と名付けられた内因性の２μ−様プラスミドが、トルラスポラ
において単離された（ＢｌａｉｓｏｎｎｅａｕＪ．ｅｔａｌ．，Ｐｌａｓｍ
ｉｄ，３８：２０２−２０９，１９９７）；現在Ｓ．セレビシエのために利用で
きる遺伝道具は、新規プラスミドに転移することができ、かくしてトルラスポラ
酵母種に与えられる発現ベクターを得る。

【００６０】トルラスポラ酵母のための遺伝マーカーは、例えば、ＵＲＡ３（Ｗａｔａｎａ
ｂｅＹ．ｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４５：
４１５−４２０，１９９６），Ｇ４１８耐性（ＣｏｍｐａｇｎｏＣ．ｅｔａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．，３：１００３−１０１０，１９８９）およびシ
クロヘキシミド耐性（ＮａｋａｔａＫ．ｅｔＯｋａｍｕｒａｋ．，Ｂｉｏ
ｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０：１６８６−１６８９，
１９９６）を含む。

【００６１】チゴサッカロミセス種からの２μ−様プラスミドが知られており、そしてＺ．
ルキシイ（ｐＳＲ１）、Ｚ．ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）（ｐＳＢ３）
、Ｚ．フェルメンタチ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）（ｐＳＭ１）およびＺ．バ
イリイ（ｐＳＢ２）において単離された（ＳｐｅｎｃｅｒＪｆ．ｅｔａｌ．
，前出）。

【００６２】プラスミドｐＳＲ１は、もっともよく知られている：それはＳ．セレビシエに
おいて複製されるが、２μＡＲＳは、Ｚ．ルキシイにおいて認識されない（Ａｒ
ａｋｉＨ．ａｎｄＨｏｓｈｉｍａＹ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７
：７５７−７６９，１９８９）。

【００６３】Ｓ．セレビシエＡＲＳ１に基づくエピソームベクターは、Ｚ．ルキシイのため
に記述されている（Ａｒａｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
，２３８：１２０−１２８，１９９３）。

【００６４】チゴサッカロミセスのための選択マーカーは、Ｇ４１８を含有する培地におい
て増殖を可能にする遺伝子ＡＰＴ１である（Ｏｇａｗａｅｔａｌ．，Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４：２５２１−２５２９，１９９０）。

【００６５】誘導的であれ構成的であれ、いかなる酵母プロモーターが、本発明により使用
されてもよい。今日まで、Ｓ．セレビシエにおけるタンパク質の発現に使用され
たプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら（前出）によってよく記述されている。Ｋ
．ラクチスにおいて外来タンパク質発現に普通に使用されるプロモーターは、Ｓ
．セレビシエＰＧＫおよびＰＨＯ５であるか（Ｒｏｍａｎｏｓら、前出）、また
は相同プロモーター、例えばＬＡＣ４（ｖａｎｄｅｎＢｅｒｇＪ．Ａ．ｅ
ｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５，１９９０）およびＫｌ
ＰＤＣ（米国特許第５６３１１４３号）である。Ｋ．ラクチスのピルビン酸
デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（ＫｌＰＤＣ）が特に好適である。

【００６６】クルイベロミセス・ラクチス株の形質転換に特に有効である異種遺伝子発現の
ためのベクターは、米国特許第５１６６０７０号に記述されており、引用に
よって本明細書に組み入れられる。

【００６７】ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９（１），２７−３６，１９９
６に開示されている、好ましくはクルイベロミセス種からの、なおより好ましく
はクルイベロミセス・ラクチスからのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロ
モーターが、特に好適である。また、好ましくはサッカロミセス種、なおより好
ましくはサッカロミセス・セレビシエからのトリオースリン酸イソメラーゼおよ
びアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが好適である（Ｒｏｍａｎｏｓら、
前出）。

【００６８】乳酸の生産のために、本発明の酵母菌株は、炭素源および他の必須栄養素を含
有する培地において培養され、そして乳酸が、ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ４．
５以下、なおより好ましくはｐＨ３以下において回収される。培地のｐＨが低下
されるので、比較的少量の中和剤が必要である。乳酸塩の形成は、対応して減じ
られ、そして乳酸を回収するためには遊離酸の比例的に少ない再生が必要になる
。回収工程は、既知の方法のいずれを用いてもよい（Ｔ．Ｂ．Ｖｉｃｋｒｏｙ，
Ｖｏｌｕｍｅ３，Ｃｈａｐｅｒ３８ｏｆ ”ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”（ｅｄｉｔｏｒ：Ｍ．ＭｏｏＹｏｕｎｇ），Ｐｅ
ｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）（Ｒ．Ｄａｔｔａｅｔａｌ．，Ｆ
ＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ１６，２２１−２３１，
１９９５）。典型的には、乳酸を回収する前に、微生物が濾過もしくは遠心によ
って除去される。乳酸回収の既知の方法は、例えば、非混和性溶媒相への乳酸の
抽出、または乳酸もしくはそのエステルの蒸留を含む。炭素源に対するより高い
収率（乳酸ｇ／消費グルコースｇ）およびより高い生産性（乳酸ｇ／ｌ／ｈ）が
、Ｍｇ⁺⁺およびＺｎ⁺⁺を欠くか、または該イオンの低い利用能をもつ培地におい
て増殖する酵母菌株、特にサッカロミセス菌株によって得られる。好ましくは、
培地は、Ｍｇ⁺⁺５ｍＭ未満および／またはＺｎ⁺⁺０．０２ｍＭ未満を含有するで
あろう。

【００６９】本発明は、乳酸の生産において次の利点を提供する：１．発酵が、ｐＨ４．５以下で実施される場合、慣用の方法と比較して、外来
の微生物による汚染の危険性が低い。さらに、発酵設備は単純化でき、そして発
酵制御が容易に行うことができる。２．より少ない中和剤が、中和のために培地中に添加されるので、対応して、
乳酸塩を遊離乳酸へ転化するための鉱酸もしくは他の再生薬剤を使用する必要性
が低い。したがって、生産コストが低減できる。３．より少ない中和剤が培地に添加されるので、培養液の粘度が低下される。
その結果、培養液は処理が容易である。４．本発明により分離された細胞は、新鮮な乳酸発酵のための種菌微生物とし
て再び利用できる。５．細胞は、本発明にしたがって、乳酸発酵中に連続的に分離され、そして回
収することができ、それ故、発酵が連続的に実施できる。６．組み換え酵母菌株は、エタノール生産能とピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
性を欠くか、または両低いエタノール生産と低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活
性をもつので、乳酸の生産は、野生型のエタノール生産能と野生型のミトコンド
リアによるピルビン酸利用能の両方をもつ酵母菌株に比較して、より高い収率で
実施することができる。７．クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセスの種に属する
代謝的に工作された非慣用酵母による乳酸の生産は、非慣用炭素源（すなわち、
若干の例を示せば、ガラクトース−ラクトース−スクロース−ラフィノース−マ
ルトース−セロビオース−アラビノース−キシロース）から、高糖濃度培地中で
細胞を増殖させ、そして高濃度の乳酸の存在下で細胞を増殖させて得ることがで
きる。

【００７０】

【発明の詳細な記述】

定義次の定義は、本発明の詳細な記述を理解する際、当業者を助けるために提供さ
れる。

【００７１】「増幅」は、所望の核酸分子のコピー数を増加することを指す。

【００７２】「コドン」は、特定のアミノ酸配列を指定する３個のヌクレオチド配列を指す
。

【００７３】「欠失」は、核酸配列から１個以上のヌクレオチドを除去する変異を指す。

【００７４】「ＤＮＡリガーゼ」は、２つの二本鎖ＤＮＡ片を共有結合する酵素を指す。

【００７５】「エレクトロポレーション」は、宿主細胞を透過性にするよう短時間高電圧の
ｄｃ電荷を使用して、そこに染色体外ＤＮＡを取り込ませる、細胞中に外来ＤＮ
Ａを導入する方法を指す。

【００７６】用語「内因性」は、生物体もしくは細胞内から生じる物質を指す。

【００７７】用語「エンドヌクレアーゼ」は、内部の位置において二本鎖ＤＮＡを加水分解
する酵素を指す。

【００７８】用語「発現」は、対応するｍＲＮＡを生産するための遺伝子の転写、および対
応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を生産
するためのこのｍＲＮＡの翻訳を指す。

【００７９】用語「アンチセンスＲＮＡの発現」は、遺伝子産物、例えばタンパク質をコー
ドしている第２のＲＮＡ分子にハイブリダイズできる第１のＲＮＡ分子を生産す
るためのＤＮＡの転写を指す。ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成は、遺伝子産
物を生産する第２のＲＮＡ分子の翻訳を阻害する。

【００８０】句「機能的に結合された」は、コーディングもしくは構造配列の転写が、プロ
モーターもしくはプロモーター領域によって命令できるような方向および距離に
おける、プロモーターもしくはプロモーター領域およびコーディングもしくは構
造配列を指す。

【００８１】用語「遺伝子」は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ
、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはＲＮＡ分子をコードして
いる他のＤＮＡ、ならびに発現の制御に関与するコーディング配列に隣接してい
る領域を指す。

【００８２】用語「ゲノム」は、宿主細胞内の染色体およびプラスミドの両方を包含する。
したがって、宿主細胞中に導入された本発明のコーディングＤＮＡは、染色体に
組み込まれていても、またプラスミドに局在されていてもよい。

【００８３】「異種ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡとは異なる起源からのＤＮＡを指す。

【００８４】「相同ＤＮＡ」は、受容細胞のＤＮＡと同じ起源からのＤＮＡを指す。

【００８５】「ハイブリダイゼーション」は、塩基対を介して相補的な鎖と結合する核酸鎖
の機能を指す。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖における相補的配列が
互いに結合する場合に起きる。

【００８６】「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ＬＤＨ）は、ピルビン酸およびＮＡＤＨの、乳酸
およびＮＡＤ⁺への転化を触媒するタンパク質を指す。Ｌ（＋）−ＬＤＨは、Ｌ（＋）−乳酸を生成し；Ｄ（−）−ＬＤＨは、Ｄ（−）−乳酸を生成する。

【００８７】用語「乳酸輸送体」は、細胞の内側から外側への乳酸の輸送を可能にするタン
パク質を指す。

【００８８】「変異」は、核酸配列におけるすべての変化もしくは変更を指す。ある種のタ
イプは、ポイント、フレームシフトおよびスプライシングを含んで存在する。変
更は、特異的に（例えば部位特異的変異誘発）もしくはランダムに（例えば化学
薬剤により、修復マイナス細菌株を通過して）遂行されてもよい。

【００８９】核酸コード：Ａ＝アデノシン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアノシン；Ｔ＝チミジン
；Ｎ＝等モルのＡ，Ｃ，ＧおよびＴ；Ｉ＝デオキシイノシン；Ｋ＝等モルのＧお
よびＴ；Ｒ＝等モルのＡおよびＧ；Ｓ＝等モルのＣおよびＧ；Ｗ＝等モルのＡお
よびＴ；Ｙ＝等モルのＣおよびＴ．「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ペプチド、ポリペプチドも
しくはタンパク質をコードしているＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。

【００９０】「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（ＰＤＣ）は、ピルビン酸のアセトアルデ
ヒドへの転化を触媒するタンパク質を指す。

【００９１】「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ」（ＰＤＨ）は、ピルビン酸のアセチル−Ｃｏ
Ａへの転化を触媒するタンパク質複合体を指す。

【００９２】「プラスミド」は、環状の、染色体外の、自己複製するＤＮＡ片を指す。

【００９３】「点変異」は、核酸配列において単一ヌクレオチドの変更を指す。

【００９４】「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、１つの核酸配列の多数のコピーを作
成するための酵素的技術を指す。ＤＮＡ配列のコピーは、２つのアンプリマー（
ａｍｐｌｉｍｅｒ）間でＤＮＡポリメラーゼを往復させることによって製造され
る。この増幅法の基礎は、変性し、次にアンプリマーを再アニールし、続いて伸
長して、側面を接するアンプリマー間に位置する領域に新しいＤＮＡ鎖を合成す
るための多周期の温度変化である。

【００９５】用語「プロモーター」もしくは「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼ
に対する認識部位を提供することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の
生産を調節する要素および／または正しい部位における転写の開始に必須な他の
因子を指す。

【００９６】「組み換え細胞」もしくは「形質転換細胞」は、そのＤＮＡが、外因性核酸分
子のその細胞への導入によって変えられた細胞を指す。

【００９７】用語「組み換えＤＮＡ構築物」は、１種以上のＤＮＡ配列が機能的作動方式に
おいて結合されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みもしくは自律複製できる、
プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製する配列、ファージ、または直
鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列
を指す。そのような組み換えＤＮＡ構築物もしくはベクターは、ＤＮＡ配列が、
翻訳され、したがって発現される機能的ｍＲＮＡに転写されるような様式で、細
胞中に、５’調節配列もしくはプロモーター領域および選択される遺伝子産物の
ためのＤＮＡ配列を導入できる。組み換えＤＮＡ構築物もしくは組み換えベクタ
ーは、あるいはまた、興味ある特定のＲＮＡの翻訳を阻害するために、アンチセ
ンスＲＮＡを発現できるように構築されてもよい。

【００９８】「低い（酵素）活性」は、同種の野生型菌株から単離される測定酵素活性に較
べて、形質転換もしくは変異菌株から単離されるより低い測定酵素活性を指す。
低い酵素活性は、低い酵素濃度、酵素の低い比活性もしくはそれらの組み合わせ
の結果であろう。

【００９９】「修復マイナス」もしくは「修復欠失」菌株は、低いか、または除去されたＤ
ＮＡ修復経路をもつ生物体を指す。そのような菌株は、同種の野生型菌株の率に
較べて、増大される変異率を現す。修復マイナス菌株を通しての核酸配列の伝播
は、核酸配列を通したランダム変異の導入をもたらす。

【０１００】「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチドの特定のパリンドローム配列
を認識し、そして両鎖を切断する酵素を指す；また、制限エンドヌクレアーゼと
呼ばれる。切断は、典型的には、制限部位内で起きる。

【０１０１】「選択性マーカー」は、その発現が、核酸配列を含有する細胞の同定を容易に
する表現型を与える核酸配列を指す。選択性マーカーは、毒性化学物質に対する
耐性（例えばアンピシリン耐性、カナマイシン耐性）を示すか、栄養欠乏（例え
ばウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を補足するか、または肉眼的に区別しうる
特徴（例えば色彩変化、蛍光）を与えるものを含む。

【０１０２】「転写」は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡコピー生産する方法を指す。

【０１０３】「形質転換」は、外因性核酸配列（例えばベクター、プラスミド、組み換え核
酸分子）を、外因性核酸配列が染色体に組み込まれるか、または自律複製できる
細胞中に導入する方法を指す。

【０１０４】「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質生産を指す。

【０１０５】用語「収率」は、消費されたグルコース量（ｇｒ／ｌ）で除した生産された乳
酸量（ｇｒ／ｌ）を指す。

【０１０６】酵素の「単位」は、酵素活性を指し、そして１分間当たりの総細胞タンパク質
１ｍｇ当たり変換された基質ミクロモル量を示す。

【０１０７】「ベクター」は、核酸配列を宿主生物中に運搬するプラスミド、コスミド、バ
クテリオファージもしくはウイルスを指す。

【０１０８】ウシ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ−Ａ）の部位特異的変異誘発ウシ酵素ＬＤＨ−Ａ（ＥＣ１．１．１．２７）のコーディング配列を完全な長
さのｃＤＮＡから単離するために、古典的な部位特異的変異誘発（Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１，１９７８，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４
：３２９，１９８７）が遂行された。オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異
誘発は、合成オリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡ断片とのイン・ビトロのハイブ
リダイゼーションに基づき、このオリゴヌクレオチドは、変異誘発されるべきＤ
ＮＡ配列と一致する、中心のミスマッチ領域を除くＤＮＡ断片と相補的である。

【０１０９】ＡＴＧコドン１１ｂｐ前にＸｂａＩ制限酵素部位を導入するために、１７４３
ｂｐウシＬＤＨｃＤＮＡが、プラスミドｐＬＤＨ１２（Ｉｓｈｉｇｕｒｏｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１２８１−２８５，１９９１）から、ＥｃｏＲＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）による消化によってクローン化された。単離されたＤＮＡ断片
は、次いで、ｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃９６２１０；ｌｏｔ
＃４８６４５，１９９６）発現ベクターに挿入された。

【０１１０】そのようなベクターは、Ｍ１３およびＲ４０８バクテリオファージ複製開始点
および抗生物質耐性の２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の１つ、テトラ
サイクリン耐性は機能性である。他（すなわちアンピシリン耐性）は、不活性化
されていた。変異誘発反応の間に、変異鎖に対してアンピシリン耐性を回復する
オリゴヌクレオチドが提供される（ｏｌｉｇｏＡＭＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩＴａｂ．１）。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓ
ｓＤＮＡ）鋳型にアニーリングされる。同時に、変異原性オリゴヌクレオチド（
ｏｌｉｇｏＬＤＨ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）は、同様にアニーリングされた。Ｄ
ＮＡ合成および連結反応に続いて、ＤＮＡが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の修復
マイナス菌株（ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ；ｋｉｔＰｒｏｍｅｇａ）中に形質
転換される。選択は、ＬＢ＋アンピシリンにおいて行われた（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）。ＪＭ１０９（ｋｉｔＰｒｏｍｅ
ｇａ）Ｅ．コリ菌株における形質転換の第２ラウンドが、変異および野生型プラ
スミドの適当な分離を確実にした。

【０１１１】

【表１】

【０１１２】表１：部位特異的変異誘発のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌ
クレオチド配列。ｏｌｉｇｏＬＤＨにおける下線の配列は、変異誘発によって導
入されたＸｂａＩ制限部位を示す。

【０１１３】使用された技術および材料（ｏｌｉｇｏＬＤＨ以外の）のさらなる詳細は、キ
ットのデータシートにおいて見い出すことができる。

【０１１４】ウシＬＤＨについて変異されたｃＤＮＡを含有する、得られたプラスミドは、
ｐＶＣ１と命名された（図２）。

【０１１５】ラクトバチルス・カゼイ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌｕｓ）からの細菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ）のＰＣＲ変異誘発ラクトバチルス・カゼイＬＤＨ遺伝子（ＧＴＧ）の元の開始（ｓｔａｒｔｉｎ
ｇ）コドン（ＧＴＧ）（ＬＤＨ配列は，ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅ
ｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋＳ
ｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ７６７０８において利
用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｓ．セレビシエによって正しく認識されない。
本発明者らは、プラスミドｐＳＴ２およびＬＤＨ配列を、ＨｕｔｋｉｎｓＲｏ
ｂｅｒｔ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡ）から得た
。ｐＳＴ２は、ｐＵＣ１９ベクター（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．８８５８２７）に基
づいており、そしてＬ．カゼイ６８６（Ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａ）から増幅さ
れたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩＬＤＨ−ｃＤＮＡ断片を含有する。

【０１１６】普通の真核生物の最初のコドン（すなわち、ＡＴＧ）により開始するコーディ
ング配列を得るために、ＬＤＨ配列が、ＰＣＲを介して変異誘発された。

【０１１７】ＬＤＨ配列（ＧｅｎＢＡｎｋＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅのアクセ
スナンバーＭ７６７０８、前出）の位置１６３におけるＮｃｏＩ制限酵素部位の
導入は、元のＧＴＧコドンのＡＴＧへの付随変化を与える。ＰＣＲ反応（Ｍａｓ
ｔｅｒｃｙｃｌｅｒ５３３０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）は、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｐ２２５１）ベクターに基づく
プラスミドｐＬＣ１から出発して遂行し、そしてＬ．カゼイの遺伝子（ｐＳＴ２
から切り取られた断片ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ）を含有する。反応のプライマーと
して使用されたオリゴヌクレオチドの配列は表２に報告される。増幅サイクル：９４°；１’ （変性段階）９４°３０” （変性段階）５６°３０” ４回（プライマーアニーリング段階）６８°３’ （伸長段階）９４°３０” （変性段階）６０°３０” ２３回（プライマーアニーリング段階）６８°３’ （伸長段階）６８°３’ （最終伸長段階）反応の最後に、増幅され、そして変異された遺伝子に対応する単一バンドが単
離された。次いで、ＤＮＡ断片は、平滑末端連結によりｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇａｍｓｈｉｒｅ，Ｅ
ｎｇｌａｎｄ；ｃｏｄ．ＲＰＮ５１１０）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部
位において挿入され、ｐＬＣ３プラスミドが生じた。

【０１１８】すべての他の変異誘発法が、同様に使用できる。

【０１１９】

【表２】

【０１２０】表２：ＰＣＲ増幅のために使用された合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列。ｏｌｉｇｏＡＴＧにおける下線の配列は、変異誘発によって導入された
ＮｃｏＩ制限部位、および結果として得られたＡＴＧ開始コドンを示す。

【０１２１】また、本発明者らは、古典的なＰＣＲアプローチにしたがって、細菌バチルス
・メガテリウムおよびバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１１６７）からのＬ（＋
）ＬＤＨ遺伝子（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅ
ｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋＳ
ｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＭ２２３０５およびＭ１
９３９６において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を、酵母Ｓ．セレビシエのため
の発現ベクター（すなわち、それぞれｐＢＭＥ２およびｐＢＳＴ２、下記参照）
中にクローン化した。

【０１２２】ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＥＰＬ２複製ベクターの構築ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびコーディング配列は、Ｋ．ラクチスのｒａｇ
６変異を相補するＫ．ラクチス・ゲノムライブラリークローン（Ｂｉａｎｃｈｉ
ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１９９６
）から４ＫｂｐＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローン化された。プロモーター
領域が、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ＃２１２２０５）のＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位中に、
分子クローニング標準操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，前出）を用いるＴ４ＤＮＡリガーゼによりサブクロー
ン化された。ｐＶＣ１ベクターから１６７５ｂｐをもつＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片として単離されたウシＬＤＨ配列は、ベクターｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＫＳの対応するクローニング部位においてクローン化された。ＧＭ８２
Ｅ．コリ菌株（ｄａｍ^- ｄｃｍ^-）（ＡＴＣＣもしくはＣＧＳＣコレクションか
ら得られる）は、それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６（図３Ａ
および３Ｂ）と呼ばれる２種の新ベクターにより形質転換された。

【０１２３】それぞれｐＫＳＭＤ８／７およびｐＫＳＥＸＨ／１６からＳａｌＩ−ＸｂａＩ
断片として単離された、ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨ配列は、Ｓ
ａｌＩエンドヌクレアーゼの存在下、室温で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりイン
・ビトロで連結されて、ＸｂａＩ末端において連結された。連結反応産物は、ｐ
Ｅ１ベクター（ＢｉａｎｃｈｉＭ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１
２：１８５−１９２，１９８７；ＣｈｅｎＸ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ
．Ｇｅｎｅｔ．１６：９５−９８，１９８９およびＵＳ＃５１６６０７０）のＳ
ａｌＩクローニング部位においてクローン化された。このプラスミドは、サッカ
ロミセス・セレビシエ遺伝マーカーＵＲＡ３を含有するＹＩｐ５組み込みプラス
ミド、およびクルイベロミセス・ドロソフィラルムから単離されたｐＫＤ１プラ
スミド（ＵＳ＃５１６６０７０）に基づいている。プラスミドｐＥ１は、Ｓ．セ
レビシエ２μ ＤＮＡに類似する機能的構成をもち、そしてクルイベロミセス・
ラクチス細胞（ＣｈｅｎＸ．Ｊ．ｅｔａｌ．，前出）において安定な進行
で複製することができる。プラスミド上のＵＲＡ３マーカーは、Ｋ．ラクチスｕ
ｒａＡ１−１変異を相補（ｄｅＬｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔｅｔａｌ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７−７４２（１９８２））させ、したがって
、ウラシルを含まない選択培地における形質転換細胞の増殖を可能にする。

【０１２４】得られたベクターは、ｐＥＰＬ２（図４）と呼ばれ、そしてＥ．コリＤＨ５−
ａｌｆａ菌株（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｂｕｒｇ，ＭＡ）を形質転換するために使用された。

【０１２５】ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよび細菌ＬＤＨ遺伝子を含有するｐＥＰＬ４複製ベクターの構築ｐＥＰＬ２プラスミドに関して記述されたウシＬＤＨ遺伝子が、本文を通して
記述された古典的分子アプローチにしたがって、細菌ラクトバチルス・カゼイ遺
伝子（前記参照）からのＬＤＨＤＮＡ配列と置き換えられて、プラスミドｐＥ
ＰＬ４を得た。ウシもしくは細菌ＬＤＨを担持する形質転換Ｋ．ラクチス酵母細
胞は、類似の結果を与えた。

【０１２６】ＫｌＰＤＣＡプロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＺ１０複製ベクターの構築ベクターｐＬＡＺ１０は、ＫｌＰＤＣ１プロモーターとウシＬＤＨコーディン
グ配列を担持するｐＥＰＬ２のＳａｌＩ断片を、ベクターｐ３Ｋ３１のユニーク
ＳａｌＩ部位中にクローニングすることによって得られた。ベクターｐ３Ｋ３１
は、市販ベクターｐＵＣ１９およびプラスミドｐＫＤ１のユニークＳｐｈＩ部位
に挿入されたベクターｐＫａｎ７０７（Ｆｌｅｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／ｔ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９６８−９７４，１９９１）のＧ４１８耐性カセットか
らなる。

【０１２７】ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＭ２，ｐＢＳＴ２，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１組み込みベクターの構築Ｌ．カゼイＬＤＨ遺伝子は、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ消化によってｐＬＣ３（前記
）から切り取られ、そしてｐＹＸ０１２もしくはｐＹＸ０２２組み込みベクター
（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍＥｕｒｏｐｅＬｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｅｎｇｌ
ａｎｄ）中に連結された。

【０１２８】ＴＰＩプロモーターの制御下の細菌ＬＤＨ遺伝子について変異されたＤＮＡを
含有し、そして栄養素要求性マーカーＵＲＡ３もしくはＨＩＳ３を担持する、得
られた２種のプラスミドは、ｐＬＣ５（図５）およびｐＬＣ７とそれぞれ命名さ
れた。ｐＢ１、ｐＢＭ２およびｐＢＳＴ２の構築では、本発明者らは、ｐＬＣ５
の構築について記述されたものと類似のアプローチを使用した；しかしながら、
ウシＬＤＨ、Ｂ．メガテリウムＬＤＨおよびＢ．ステアロサーモフィルスＬＤＨ
（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１３９
１）（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，１９８７，３６８：１
１６７）をそれぞれ使用した。最後に、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗ
ａｃｈｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：１７９３−１８０８）が
、ＳａｃＩとＳｍａＩにより消化され、そして生じる断片が、同じ酵素で切断さ
れたｐＬＣ５中に連結されて、プラスミドｐＬＣ５−ＫａｎＭＸを生成した。こ
のプラスミドでは、ＬＤＨ遺伝子は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。

【０１２９】Ｓ．セレビシエの乳酸輸送体をコードしているＪＥＮ１（ＤａｖｉｓＥ．Ｓ
．，Ｔｈｅｓｉｓ，１９９４−ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｕｋａｒｙｏｔ
ｉｃＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（２３），１１１６９，
１９９２）（Ａｎｄｒｅ，Ｂ．Ｙｅａｓｔ（１１），１５７５，１９９５）のＤ
ＮＡ配列（ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏ
ｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅｎｂａｎｋＳｅｑｕ
ｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＵ２４１５５において利用でき
る −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）は、Ｅ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
Ｍａｒｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）から得られた。ＪＥＮ１コーディング配列は、本
文を通して記述された古典的ＰＣＲアプローチによって増幅され、そしてプラス
ミドｐＹＸ０２２（前記）中にクローン化された。組み込みプラスミドでは、Ｊ
ＥＮ１過剰発現は、ＴＰＩプロモーターの制御下にある。

【０１３０】ＡＤＨ１プロモーターおよびウシＬＤＨｃＤＮＡを含有するｐＬＡＴ−ＡＤＨ複製ベクターの構築第１に、ｐＬＤＨ−Ｋａｎプラスミドが、ｐＦＡ６−ＫａｎＭＸ４ベクター（
Ｗａｃｈｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ１０：１７９３−１８０８（１９９４）
）のＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ消化から誘導されたゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付
与するＡＰＴ１遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ，ＵＳＡ，ｃａｔ．２１２
２０８）クローニングベクターのＥｃｏＲＶ部位にクローニングして構築された
。

【０１３１】第２に、ウシＬＤＨ遺伝子のコーディング領域が、前述のｐＶＣ１プラスミド
からのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＶＴ１０２−Ｕベクター（Ｖｅｒｎｅ
ｔｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ５２：２２５−２３３（１９８７））中にサブクロ
ーニングすることによって、Ｓ．セレビシエのＡＤＨ１プロモーターとターミネ
ーター配列の制御下でクローン化された。

【０１３２】最後に、全発現カセット（ＡＤＨ１プロモーター−ＬＤＨ遺伝子−ＡＤＨ１タ
ーミネーター）が、ＳｐｈＩ消化によって切り取られ、ｐＬＤＨ−Ｋａｎと連結
され、ＳｐｈＩで直鎖状にされて、ｐＬＡＴ−ＡＤＨベクター（図６）を得た。

【０１３３】Ｋ．ラクチスＰＭＩ／Ｃ１菌株の単離ＰＭ６−７Ａ酵母菌株（ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１）（
Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ１９９２，８：７１１）に
おけるＫｌＰＤＣＡ遺伝子の欠失が、菌株ＰＭＩを生じた。欠失は、Ｓ．セレビ
シエのＵＲＡ３マーカーの挿入によって実施された。菌株ＰＭＩは、グルコース
含有培地で増殖する；ＰＤＣ活性は検出されず、そして菌株はエタノールを生産
しない（ＢｉａｎｃｈｉＭ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，（１９９６）、前出）。い
かなる検出しうるＰＤＣ活性ももたないＳ．セレビシエ細胞は、グルコース無機
質培地では増殖しない（ＦｌｉｋｗｅｅｒｔＭ．Ｔ．ｅｔａｌ．Ｙｅａｓｔ
，１２：２４７−２５７，１９９６）ということを強調することが重要である。

【０１３４】ＰＭＩ酵母細胞の定常期の培養からの１ｘ１０⁷〜３ｘ１０⁷細胞が、５−フル
オロオロチン酸を含有する合成培地上に平板塗布された。５−フルオロオロチン
酸含有培地における酵母細胞の増殖は、ウラシル合成において損傷された細胞の
選択を可能にする（ＭｃＣｕｓｋｅｒａｎｄＤａｖｉｓ，Ｙｅａｓｔ７：
６０７−６０８（１９９１））。２８℃で５日培養後、数株のｕｒａ−変異株が
単離された。得られたこれらの変異株の１株は、ＰＭＩ／Ｃ１と呼ばれ、組み込
み形質転換によって予め導入されたＵＲＡ３遺伝子における変異を生じたが、そ
れは、ＵＲＡ３遺伝子を含有するプラスミド（Ｋｅｐ６ベクター；Ｃｈｅｎｅ
ｔａｌ．，Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２１１−２２０（１
９８８））を用いる形質転換による相補試験から証明された。ＰＭＩ／Ｃ１の遺
伝子型は、次のとおりである：ＭＡＴａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，
ｐｄｃＡ：：ｕｒａ３。

【０１３５】ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２菌株の単離一般的戦略は、最初に、各ＰＤＣ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５およ
びＰＤＣ６）の単一欠失変異株を作成することであった。遺伝子欠失は、Ｗａｃ
ｈら（１９９４；Ｙｅａｓｔ１０、１７９３−１８０８）およびＧｕｅｌｄｅ
ｎｅｒら（１９９６；ＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓＲｅｓ．２４，２５１９−
２５２４）によって記述されたショートフランキングホモロジー（ＳＦＨ）ＰＣ
Ｒ法を用いて、対応するＰＤＣ遺伝子の座における相同性組み換えによりｌｏｘ
Ｐ−Ｋａｎ^SRD−ｌｏｘＰカセットの組み込みによって行われた。続いて、欠失カセットは、欠失座におけるｌｏｘＰ部位の単一コピーをリーディングビハイ
ンド（ｌｅａｄｉｎｇｂｅｈｉｎｄ）するｃｒｅ−リコンビナーゼを発現する
ことによって除かれた。ｐｄｃ１ｐｄｃ５ｐｄｃ６三重欠失変異株は、続い
て、単一の一倍体欠失株を交雑することによって作成された。

【０１３６】ＰＣＲ反応は、ある種のシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子（機密）の調節配列（プ
ロモーター／ターミネーター）に融合されたカナマイシン耐性（Ｅ．コリトラ
ンスポゾンＴｎ９０３のオープンリーディングフレーム）の遺伝子を含有するＤ
ＮＡ鋳型において実施された。この選択カセットは、ｌｏｘＰ配列（ｌｏｘＰ−
Ｋａｎ^SRD−ｌｏｘＰ）によって両端において隣接されており、ＳＲＤ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）によって
開発された。ｌｏｘＰ−Ｋａｎ^SRD−ｌｏｘＰカセットを増幅するために使用されるプライマーは、センスプライマーのＤＮＡ配列が、選択カセット配列の５’
末端と相同であるように、そしてプライマーが、ある種のサッカロミセス・セレ
ビシエＰＤＣ遺伝子の５’末端配列に対応する、その５’末端領域４０ヌクレオ
チドにおける付加において存在するように、設計される。アンチセンスプライマ
ーは、類似の方法で構築され、それは、選択カセットの３’末端と相補的であり
、この場合、このプライマーは、ある種のサッカロミセス・セレビシエＰＤＣ遺
伝子の３’末端配列に対応する、また好ましくは４０ヌクレオチドをその５’末
端領域において含有する。

【０１３７】次の表は、ＳＦＨＰＣＲ法による対応するＰＤＣ遺伝子の遺伝子欠失のため
に使用されるプライマーを示す。下線の配列は、対応するＰＤＣ遺伝子と相同性
であり、そしてｌｏｘＰ−Ｋａｎ^SRD−ｌｏｘＰカセットに相補的な配列は、太字で存在する。

【０１３８】

【表３】

【０１３９】ＰＣＲ増幅された欠失カセットは、ＳＲＤによって開発された原栄養性二倍体
サッカロミセス・セレビシエ菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２の形質転換のために使用さ
れた。

【０１４０】ＣＥＮ．ＰＫ１１２（Ｍａｔａ，ａｌｐｈａ，ＵＲＡ３，ＵＲＡ３，ＨＩＳ３
，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＥＵ２，ＴＲＰ１，ＴＲＰ１，ＭＡＬ２−８^C，ＭＡＬ２−８^C，ＳＵＣ２，ＳＵＣ２）形質転換株の選択のために、ゲネチシン（硫酸Ｇ−４１８，ＬｉｆｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、最終濃度２００ｍｇ／ｌにおいて添加された。四分子
分析後、続いて、Ｇ４１８耐性胞子が、診断的ＰＣＲによって解析されて、対応
するＰＤＣ遺伝子の正しい欠失を確認し、そして一倍体菌株の交配型を決定した
。

【０１４１】３個のＰＤＣ遺伝子、ＰＤＣ１，ＰＤＣ５おいてＰＤＣ６について欠失された
菌株を得るために、一倍体欠失株が、続いて交雑された。２個の二重欠失株、ｐ
ｄｃ１：：Ｋａｎ^SRD ｐｄｃ６：：Ｋａｎ^SRDおよびｐｄｃ５：：Ｋａｎ^SRD ｐｄｃ６：：Ｋａｎ^SRDを得るために、対応する一倍体株が交雑された。四分子分析後、Ｋａｎ^SRDマーカーに関して非親系二型（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔａｌｄｉｔｙｐｅ）を示す胞子が、続いて、診断的ＰＣＲによって解析されて、両遺
伝子の正しい欠失を確認し、そして交配型を決定した。得られる二重欠失株が交
雑されて、三重欠失株を得た。四分子分析後、診断的ＰＣＲによって、３個のＰ
ＤＣ遺伝子について欠失された胞子が探された。

【０１４２】破壊に成功した遺伝子からＫａｎ^SRDマーカーを除去するために、一倍体欠失株（単一、二重および三重変異株）が、ｃｒｅ−リコンビナーゼ・プラスミド、
ｐＰＫ−ＩＬＶ２^SMR（ＳＲＤによって開発された）により形質転換された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２^SMRは、ＧＡＬ１プロモーター制御下のｃｒｅ−リコンビナーゼ、および優性選択マーカーとして、プラスミドプラスミドｐＰＫ−Ｉ
ＬＶ２^SMRにより形質転換された酵母細胞をスルホメツロンメチル（３０ｍｇ／ｌ）の存在下で増殖可能にさせるＩＬＶ２耐性遺伝子を含有する。続いて、Ｋａ
ｎ^SRDマーカーの正確な切除が、全酵母細胞に関して診断的ＰＣＲによって解析された。プラスミドｐＰＫ−ＩＬＶ２^SMRを除去するために、酵母細胞は、培地中スルホメツロンメチルなしで適当な時間培養され、続いて、スルホメツロンメ
チル感受性細胞が探索された。

【０１４３】次の表は、得られた酵母菌株を示す。括弧内の数字は、対応する遺伝子の欠失
ヌクレオチド（ＡＴＧ＝１）を指す。ネガティブ数字の場合は、最初の数字は、
ＡＴＧの上流の欠失ヌクレオチドを意味し、そして第２の数字は、終始コドンの
下流の欠失ヌクレオチドを意味する。

【０１４４】

【表４】

【０１４５】主として、本発明者らは、得られたデータを総括している表において、またＣ
ＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤ
Ｃ６と名付けられる菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１２およびＣＥＮ．ＰＫ１８２を使用し
た。

【０１４６】同様のアプローチを使用して、ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持しているＳ．セレ
ビシエＧＲＦ１８Ｕ株（Ｍａｔａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３）
が構築された（ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２；Ｍａｔａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅ
ｕ２，ｕｒａ３，ｐｄｃ２：：ＡＰＴ１）。本発明者らは、プラスミドｐＦＡ６
ａ−ＫａｎＭＸ（Ｗａｃｈｅｔａｌ．前出）から単離された、組み込みのマ
ーカーとしてのＧ４１８耐性を付与するＡＰＴ１遺伝子を使用した；ＰＤＣ１，
ＰＤＣ５およびＰＤＣ６遺伝子において欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活
性はゼロである。ＰＤＣ２遺伝子に欠失を担持している菌株では、ＰＤＣ活性は
野生型菌株で測定されるレベルの約２０〜４０％である。

【０１４７】Ｋ．ラクチスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］の単離二重欠失菌株Ｋｌｐｄｃ１△／Ｋｌｐｄａ１△は、菌株ＭＷ３４１−５／Ｋｌ
ｐｄｃ１△（ＭＡＴα，ｌａｃ４−８，ｌｅｕ２，ｌｙｓＡ１−１，ｕｒａＡ１
−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎｃｈｉｅｔａｌ．，１９９６，
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９（１）、２７−３６において既述のように
得られた；Ｄｅｓｔｒｕｅｌｌｅｅｔａｌ．，提供）を、菌株ＣＢＳ２３５
９／Ｋｌｐｄａ１△（ＭＡＴａ，ＵＲＡ３−４８，Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬ
Ｅ）と交雑することによって得られた二倍体菌株の一倍体分離集団から選択され
た。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１−ａｌｐｈａサブユニット（ＥＣ．
１．２．４．１）（ＤＮＡ配列は、ＳｔｅｅｎｓｍａＨ．Ｙ．；Ｆａｃｕｌｔ
ｙｏｆＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓａｎｄＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ
ｓ，ＣｌｕｓｉｕｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｅｉｄｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈ
ｅｒｌａｎｄによって得られた−ＤＮＡ配列は，また、ｔｈｅＮａｔｉｏｎａ
ｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって提供されるＧｅ
ｎｂａｎｋＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅのアクセスナンバーＡＦ０２
３９２０において利用できる −ＮＣＢＩ− ウェブ・サイト：ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）をコードしているＰＤＡ１遺伝
子の欠失は、酵母菌株ＣＢＳ２３５９において、古典的ＰＣＲアプローチおよび
本文を通じて記された酵母形質転換にしたがって得られた。本発明者らは、組み
込みのマーカーとしてフレオマイシン耐性を付与するマーカーＴｎ５Ｂｌｅ（Ｇ
ａｔｉｎｇｎｏｌｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，９１：３５，１９９０）を使用し
た。

【０１４８】ＢＭ１−３Ｃ（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ
１：：Ｔｎ５ＢＬＥ）と呼ばれる二重欠失菌株は、フレオマイシン耐性／アンチ
マイシン感受性分離菌株として選択された。次いで、ベクターｐＬＡＺ１０が、
遺伝的に、次のように二重欠失菌株に転移された。

【０１４９】Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３菌株のｐＬＡＺ１０形質転換株ＰＭＩ／８（ＭＡＴ
ａ，ａｄｅＴ−６００，ｕｒａＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｂｉａｎ
ｃｈｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９：２７−３６，１
９９６）が、菌株ＭＷ１０９−８Ｃ（ＭＡＴα，ｌｙｓＡ１−１，ｔｒｐＡ１−
１）と交雑された。得られる二倍体菌株の胞子形成後、菌株７Ｃ（ＭＡＴα，ａ
ｄｅＴ−６００，ｌｙｓＡ１−１，Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３，ｐＬＡＺ１０⁺ ）と呼ばれるゲネチシン耐性／アンチマイシン感受性菌株が選択された。

【０１５０】菌株ＢＭ１−３Ｃおよび菌株７Ｃが交雑され、そして得られた二倍体菌株の胞
子形成後、フレオマイシン耐性／ゲネチシン耐性の一倍体分離菌株が選択された
。すべての一倍体分離株はアンチマイシン感受性であった。原栄養株ＢＭ３−１
２Ｄ（Ｋｌｐｄｃ１：：ＵＲＡ３；Ｋｌｐｄａ１：：Ｔｎ５ＢＬＥ、ｐＬＡＺ１
０⁺）が、さらなる実験のために選ばれた。

【０１５１】ベクターｐＥＰＬ２およびｐＥＰＬ４を用いるクルイベロミセス酵母ＰＭ６− ７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１の形質転換ＰＭ６−７ＡおよびＰＭＩ／Ｃ１細胞が、ＹＰＤ培地において濃度０．５ｘ１
０⁸細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度２ｘ１０⁹細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＥＰＬ２もしくはｐＥＰＬ４５〜１０μｇの存在下でエレ
クトロポレーション（７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌ
ｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。ＵＲＡ⁺形質転換株の選択は、ウラシルを含まない合成固形培地（０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ
／ｖ％グルコース、２００ｍｇ／ｌアデニン、２ｗ／ｖ％寒天）において実施さ
れた。

【０１５２】ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるトルラスポラ酵母の形質転換ＣＢＳ８１７細胞が、ＹＰＤ培地において濃度６ｘ１０⁷細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍ
ソルビトール中濃度２ｘ１０⁹細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ１μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５
ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅ
ｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）された。

【０１５３】細胞は、ＹＥＰＤ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チュー
ブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８^r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天
，２００μｇ／ｍｌＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０
３１））において実施された。

【０１５４】ベクターｐＬＡＴ−ＡＤＨを用いるチゴサッカロミセス酵母の形質転換ＡＴＴＣ３６９４７およびＡＴＴＣ６０４８３細胞が、ＹＰＤ培地において濃
度２ｘ１０⁸細胞／ｍｌまで増殖され、収穫され、そして０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７，５中濃度
４ｘ１０⁸細胞／ｍｌにおいて、室温で１時間再懸濁された。細胞は、水中で１回、１Ｍソルビトール中で２回洗浄され、そして１Ｍソルビトール中濃度５ｘ１
０⁹細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞は、ｐＬＡＴ−ＡＤＨ３μｇの存在下でエレクトロポレーション（１．５ｋＶ，７．５ＫＶ／ｃｍ，２５μＦ，２
００Ω：ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）され
た。

【０１５５】細胞は、ＹＥＰＤ５ｍｌ、ソルビトール１Ｍを含有する滅菌微生物用チュー
ブにおいて一夜増殖された。Ｇ４１８^r形質転換株の選択は、固形培地（２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天
，２００μｇ／ｍｌＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０
３１））において実施された。

【０１５６】ベクターｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，ｐＬＡＴ− ＡＤＨ，ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸおよびｐＪＥＮ１を用いるサッカロミセス酵母細胞の形質転換ＧＲＦ１８Ｕ（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２（前記）、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐ
ＬＣ５］（Ｍａｔａｌｐｈａ，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｕｒａ３：：ＴＰＩ−Ｌ
ＤＨ）、ＣＥＮＰＫ１１３（Ｍａｔａ；ＣＢＳ８３４０）、ＣＥＮＰＫ−１（
Ｍａｔａ，ｕｒａ３）、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６（
前記）およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２（前記）酵母細胞が、富栄養ＹＰＤ完
全培地（２ｗ／ｖ％酵母エキス、１ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）
において濃度２ｘ１０⁷細胞／ｍｌまで増殖され、０．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中で１回洗浄され、そして０
．１Ｍ酢酸リチウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中
に濃度２ｘ１０⁹細胞／ｍｌにおいて再懸濁された。細胞懸濁液１００μｌは、ベクター（すなわち、ｐＬＣ５，ｐＬＣ７，ｐＢ１，ｐＢＳＴ２，ｐＢＭＥ２，
ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ，ｐＪＥＮ１の場合には、栄養要求マーカーにおいて予め
直鎖化された）５〜１０μｇと５分インキュベートされた。ＰＥＧ４０００２
８０μｌの添加後、細胞は、３０℃で少なくとも４５分間インキュベートされた
。ＤＭＳＯ４３μｌを添加し、そして懸濁液が４２℃で５分間インキュベートさ
れた。細胞は、水で２回洗浄され、選択培地上に平板塗布された。ＣＥＮＰＫ−
１菌株（ｕｒａ３）の単離のために、ＣＥＮＰＫ１１３細胞が、５−フルオロオ
ロチン酸を含有する培地（上記参照）で増殖された。

【０１５７】単一形質転換細胞は、０．７％ｗ／ｖ酵母窒素源、２ｗ／ｖ％グルコース、２
ｗ／ｖ％寒天，プラス指標として適当な補充物質もしくはＧ４１８においてスコ
アーされた。Ｇ４１８^R形質転換株の選択では、また細胞は、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％ペプトン、１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％寒天，２００μ
ｇ／ｍｌＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ｃａｔ．１１８１１−０３１）にお
いてスコアーされた。

【０１５８】形質転換株：補充物質ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］：ウラシル２００ｍｇ／ｌ、ロイシン２００
ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ／ｌ
。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ
／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭＥ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ
／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２００ｍｇ
／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ。ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］：ロイシン２００ｍｇ／ｌ、ヒスチジン２
００ｍｇ／ｌ。ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］：補充物質なしＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ。ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：
Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ。ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］：Ｇ４１８２００ｍｇ
／ｌ。

【０１５９】

【表５】

【０１６０】ＫＬ＝Ｋ．ラクチスのプロモーターＳＣ＝Ｓ．セレビシエのプロモーターＢ．Ｓｔｅ．＝バチルス・ステアロサーモフィルスｐＪＥＮ１は、ＪＥＮ１遺伝子の発現のために使用された。

【０１６１】バッチ試験クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］、ＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ４］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ４］形質転換細胞のバッチ解析上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／
ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍ
ｇ／ｌ、グルコース５０ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された
。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐＨ５．６に緩衝化さ
れるか、されないか両方であった。

【０１６２】細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、
新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。
フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発
酵が規則的な時点でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるために
サンプルの音波処理（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出
力３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎ
ｔｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅ
ｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９
１）１４２，５３５−５３９）により測定された（図７および８、および表３）
。

【０１６３】クルイベロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］形質転換細胞のバッチ解析上記操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒
素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ／ｌ、エ
タノール２０ｇｒ／ｌ、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養
において試験された。使用された培地は、２００ｍＭリン酸バッファーによりｐ
Ｈ５．６に緩衝化された。

【０１６４】細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、
新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。
フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発
酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサ
ンプルの音波処理（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出力
３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔ
ｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅｎ
，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１
）１４２，５３５−５３９）により測定された。最初、細胞はエタノールを使用
し、次いで、非常に高い収率でグルコースを乳酸に変換した（＞０．７５；乳酸
ｇ／消費グルコースｇ）（表３）。

【０１６５】トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ
酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース２０ｇ／
ｌ、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験された
。使用された培地は、緩衝化されなかった。

【０１６６】細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、
新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。
フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発
酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサ
ンプルの音波処理（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出力
３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔ
ｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅｎ
，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１
）１４２，５３５−５３９）により測定された。（図１０および表３）。

【０１６７】チゴサッカロミセスＡＴＣＣ３６９４７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］およびＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換細胞のバッチ解析上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／
ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ
／ｌ、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養において試験され
た。使用された培地は、緩衝化されなかった。

【０１６８】細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、
新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。
フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発
酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサ
ンプルの音波処理（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出力
３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔ
ｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅｎ
，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１
）１４２，５３５−５３９）により測定された（図１１および表３）。

【０１６９】サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢ１］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＭ２］、ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＢＳＴ２］、ＣＥＮＰＫ−１［ｐＬＣ５］形質転換細胞のバッチ解析上記形質転換操作によって得られたクローンが、最小合成培地（１．３％ｗ／
ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、グルコース５０ｇ
／ｌおよび適当な補充物質（上記参照））における増殖のバッチ培養において試
験された。使用された培地は、緩衝化されなかった。細胞は、同じ試験培地にお
いて前培養された。対数的に増殖している細胞が、新鮮な培地１００ｍｌを含有
するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂ
ｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発酵が規則的間隔でモニターさ
れた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサンプルの音波処理（Ｓｏｎｉ
ｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出力３５％、１０秒）後、電気コ
ールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅ
ｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅｎ，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔ
ａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１４２，５３５−５３９）
により測定された（表３）。

【０１７０】サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５］、ＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換細胞のバッチ解析−回転フラスコ− 上記操作によって得られたクローンが、富栄養培地（１．０％ｗ／ｖ酵母エキ
ス、２％ｗ／ｖペプトン、グルコース１００ｇ／ｌ）における増殖のバッチ培養
において試験された。培地は、緩衝化されなかった。

【０１７１】細胞は、酵母エキス−ペプトン＋エタノール（５ｇ／ｌ）培地において前培養
された。１００ｍｌが、回転フラスコ中に接種された（１．５ｌ作業容量；始
発ｐＨ＝５．７）。回転フラスコは３０℃で培養された、撹拌：５５ｒｐｍ。発
酵が規則的間隔でモニターされた（表Ａ，Ｂ，Ｃおよび表３）。

【０１７２】種々の形質転換株由来のＬＤＨ比活性は、５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高
かった。

【０１７３】ＬＤＨ活性用量（ｄｏｓａｇｅ）ウシＬＤＨ約１０⁸細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビ
ーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイ
クルによって４℃において溶解された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ５４１５Ｃ，１３６００ＲＣＦ，１０分）によって
除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、ＭｙｃｒｏＡｓｓａｙ，Ｂｉｏ
ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定さ
れた。

【０１７４】抽出液約０．２ｍｇが、ＳＩＧＭＡ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）キットＤＧ１
３４０−ＵＶを使用して、製造者の指示にしたがってＬＤＨ活性を試験された。

【０１７５】細菌ＬＤＨ約１０⁸細胞が回収され、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中で洗浄され、そして同じバッファーに懸濁された。細胞は、ガラスの微小ビ
ーズ（直径４００μｍ、ＳＩＧＭＡ，Ｇ−８７７２）の存在下の強い渦の５サイ
クルによって４℃において溶菌された。細胞破片は、遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ５４１５Ｃ，１３６００ＲＣＦ，１０分）によって
除去され、そしてタンパク質抽出液の濃度が、ＭｙｃｒｏＡｓｓａｙ，Ｂｉｏ
ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ（ｃａｔ．５００−０００６）によって測定さ
れた。

【０１７６】細胞抽出液は、１２．８ｍＭＮＡＤＨ０．０１ｍｌ、２ｍＭフルクトース１，６−二リン酸０．１ｍｌ、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ＝５．６）０．７４ｍｌ、適当に希釈された細胞抽出液０．０５ｍｌおよび１００ｍＭピルビン酸０．１ｍｌ：を用いて、ＬＤＨ活性を試験された。

【０１７７】ＬＤＨ活性は、３４０ｎｍ、２５℃において、総細胞抽出液１ｍｇ当たりの、
１分間に酸化されるＮＡＤＨミクロモル数としてアッセイされた。

【０１７８】増殖培地における代謝物用量遠心によって細胞を除去した後得られた、増殖培地からのサンプルが、グルコ
ース、エタノール、Ｌ（＋）−およびＤ（−）−乳酸の存在に関して、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ＭａｎｎｈｅｉｍＤＥからのキット（それ
ぞれ＃．７１６２５１，１７６２９０および１１１２８２１）を用い、製造者の
指示にしたがって分析された。

【０１７９】クルイベロミセスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ２］およびＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ
２］形質転換酵母に関する実験バッチ試験は、図７Ａ，７Ｂおよび図８Ａ，８Ｂ
において示される。

【０１８０】トルラスポラＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に関する実験デ
ータは、図１０に示される。

【０１８１】チゴサッカロミセスＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］形質転換酵母に
関する実験データは、図１１に示される。

【０１８２】回転フラスコ中で増殖するサッカロミセスＣＥＮＰＫ１１３［ｐＬＣ５−Ｋａ
ｎＭＸ］、ＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ２［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］およびＣＥＮ
ＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６［ｐＬＣ５−ＫａｎＭＸ］形質転換
酵母に関する実験データは、表Ａ，Ｂ，Ｃにおいて示される。

【０１８３】

【表６】

【０１８４】

【表７】

【０１８５】

【表８】

【０１８６】形質転換クルイベロミセス、トルラスポラ、チゴサッカロミセスおよびサッカ
ロミセス酵母から得られたすべての結果は、表３において総括され、そして比較
される。収率は、消費グルコース量（ｇｒ／ｌ）によって除された生産乳酸量（
ｇｒ／ｌ）である。遊離乳酸パーセントは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌ
ｂａｌｃｈの式：ｐＨ＝ｐＫ_a＋ｌｏｇ［（乳酸％）／（遊離乳酸％）］から得られ、この場合、乳酸のｐＫ_aは３．８６である。

【０１８７】表３Ａと表３Ｂにおいて報告されたデータの比較により、異なる酵母の属にお
いて、グルコースにおいて、より高い収率をもつ乳酸生産は、ＬＤＨとＰＤＣ活
性の相対比率−細胞レベルにおいて−を変化することによって得ることができる
ことが、明らかに分かる。そのような結論は、次のような少なくとも２種の異な
るアプローチ：（１）ＰＤＣ活性を低下させること（形質転換Ｋ．ラクチス宿主：ＰＭ６−７Ａ
対ＰＭＩ／Ｃ１からのデータを比較する；形質転換Ｓ．セレビシエ宿主：ＧＲＦ
１８Ｕ対ＧＲＦ１８Ｕ△ＰＤＣ２、そしてＣＥＮＰＫ１１３対ＣＥＮＰＫ１１３
△ＰＤＣ２およびＣＥＮＰＫ１１３△ＰＤＣ１△ＰＤＣ５△ＰＤＣ６からのデー
タを比較する）、（２）ＬＤＨ遺伝子コピー数と、したがってＬＤＨ活性を増加すること（Ｓ．セ
レビシエ宿主：ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］対ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ
７］からのデータを比較する；２つの菌株におけるＬＤＨ非相同の活性は、それ
ぞれ５〜６および７〜８Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇ）、によって得ることができる。

【０１８８】さらに、より高い収率は、増殖培地の組成を操作することによって得ることが
できる。また、この場合には、低いエタノール生産が観察された（また表４参照
）。

【０１８９】

【表９】

【０１９０】

【表１０】

【０１９１】

【表１１】

【０１９２】操作された無機質培地において増殖するサッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］に関する実験データ（表４）サッカロミセスＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］形質転換細胞による乳
酸生産が、また、合成培地において細胞を増殖して実施された（Ｄ．Ｐｏｒｒｏ
ｅｔａｌ．，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐＨｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄｆｅｄ−ｂａｔｃｈｓｙｓｔｅｍｆｏｒｂｕｄｄｉｎｇｙｅａｓ
ｔ．Ｒｅｓ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５−５３９，１９９１
）。使用された合成培地において、ＭｇおよびＺｎ塩源は、それぞれＭｇＳＯ₄ （５ｍＭ）およびＺｎＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ（０．０２ｍＭ）である。生産は、他の形
質転換サッカロミセス細胞のために前述されたような好気的バッチ培養（グルコ
ース濃度５０ｇｒ／ｌ）において試験された。両ＭｇＳＯ₄およびＺｎＳＯ₄ｘ７
Ｈ₂Ｏの欠落は、より高い収率とより高い乳酸生産性を生じた。事実、これらの無機質は、エタノール生産に導く酵素活性のためのコファクターとして要求され
るであろう。データは表４に示される。

【０１９３】

【表１２】

【０１９４】注釈：対照：完全合成培地（Ｒｅｓ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４２，５３５
−５３９，１９９１；別記） −Ｍｇ：ＭｇＳＯ₄無添加以外は対照と同じ −Ｚｎ：ＺｎＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ無添加以外は対照と同じ全試験では、最終ｐＨ値は、３．０以下であり、したがって遊離乳酸％は、８
８％以上であった。

【０１９５】ＪＥＮ１遺伝子を過剰発現する酵母細胞による乳酸生産より良好な乳酸生産とより低いエタノール生産は、乳酸輸送体をコードしてい
るＪＥＮ１遺伝子の過剰発現によって得られた。

【０１９６】ＧＲＦ１８Ｕ［ｐＬＣ５］（すなわち、ネガティブコントロール）およびＧＲ
Ｆ１８Ｕ［ｐＬＣ５］［ｐＪＥＮ１］が、２％グルコース、０．６７％ＹＮＢｗ
／ｖおよび補充物質（すなわち、それぞれ、ロイシン−ヒスチジン１００ｍｇ／
ｌおよびロイシン１００ｍｇ／ｌ）を含有する培地において増殖された。

【０１９７】細胞は、同じ試験培地において前培養された。対数的に増殖している細胞が、
新鮮な培地１００ｍｌを含有するフラスコ（容量３００ｍｌ）中に接種された。
フラスコは、振盪浴（Ｄｕｂｎｏｆｆ，１５０ｒｐｍ）中３０℃で培養され、発
酵が規則的間隔でモニターされた。細胞数濃度は、細胞凝集物を避けるためにサ
ンプルの音波処理（ＳｏｎｉｃａｔｏｒＦｉｓｈｅｒ３００，中間点、出力
３５％、１０秒）後、電気コールターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔ
ｅｒＺＢＩＣｏｕｎｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＨａｒｐｅｎｄｅｎ
，ＧＢ，Ｐｏｒｒｏｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１
）１４２，５３５−５３９）により測定された。

【０１９８】

【表１３】

【０１９９】連続乳酸生産乳酸の連続的で安定な生産が、形質転換Ｋ．ラクチスＰＭ６−７Ａ［ｐＥＰＬ
２］、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］および形質転換Ｓ．セレビシエＧＲＦ１８Ｕ
［ｐＬＣ５］［ｐＬＣ７］両菌株を用いる、古典的なケモスタット培養（新鮮培
地のバイオリアクターへの連続流入が、範囲０．０１〜０．３ｈｒ^-1の比増殖速
度を支持した）の手段によって２週以上にわたって得られた。

【０２００】フィード・バッチ試験撹拌タンク発酵槽におけるＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産さらに、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］による乳酸生産が、栄養培地（３０ｇ乾
物／Ｌライトコーンスチープウォーター、Ａ．Ｅ．ＳｔａｌｅｙＭａｎｕｆ
ａｃｔｕｒｉｎｇＣｏ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ；１０ｇ／ＬＤｉｆｃｏ酵
母エキス、Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ；２００ｍｇ／Ｌアデニン、５
０ｇ／Ｌグルコース）８リッターを含有する１４リッター撹拌タンク発酵槽に
おける培養によって試験された。発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐ
ｍで撹拌され、そして２リッター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏ
ｒｍ１５２０，ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇＣｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）
が、発泡を制御するために必要に応じて添加された。グルコースは、発酵培地に
おける残濃度約２５〜５０ｇ／Ｌを維持するために必要に応じてフィードされた
。制御される場合、ｐＨは、１４．８Ｍ水酸化アンモニウム水溶液の自動添加に
よって維持された。酸性ｐＨにおける乳酸生産は、次のように試験された：（１
）発酵ｐＨが発酵を通じて４．５に制御された。（２）初期発酵ｐＨが、１４．
８Ｍ水酸化アンモニウム８０ｍＬが添加されるまで、４．０に制御された。次い
で、ｐＨ制御は中止された。（３）初期発酵ｐＨが５．０であり、そして発酵中
、中和剤が添加されなかった。結果は表６に示される。経過時間は接種時間以降
測定された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、ＹＳ
ＩＭｏｄｅｌ２７００ＳｅｌｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎａｌ
ｙｚｅｒ（ＹｅｌｌｏｗＳｐｒｉｎｇｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．，Ｉ
ｎｃ．，ＹｅｌｌｏｗＳｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いて、グルコースおよびＬ
（＋）−乳酸について分析された。ガスクロマトグラフィーによって測定された
エタノールは、いずれの発酵においても検出されなかった。収率および遊離乳酸
は、前記のように計算された。発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付き
エルレンマイヤーフラスコ中、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ
（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、アデニン２００ｍｇ／Ｌ，硫酸アンモ
ニウム５ｇ／Ｌ、グルコース５０ｇ／Ｌ）５０ｍＬにおいて、ＰＭＩ／Ｃ１［ｐ
ＥＰＬ２］を、培養振盪機（ＭｏｄｅｌＧ−２４，ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃ
ｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において
３０℃、３００ｒｐｍで３０時間前培養することによって調製された。

【０２０１】同様な結果が、細菌ＬＤＨ遺伝子を用いて得られた（プラスミドｐＥＰＬ４；
データ未掲載）。

【０２０２】

【表１４】

【０２０３】撹拌タンク発酵槽におけるＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産さらに、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］による乳酸生産が、栄養培地（６．
７ｇｒ／ＹＮＢ／酵母窒素源−Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ、グルコー
ス４５ｇ／Ｌ，２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ）０．８リッ
ターを含有する１リッター撹拌タンク発酵槽における培養によって試験された。
発酵槽は、終始３０℃に維持され、４００ｒｐｍで撹拌され、そして０．８リッ
ター／ｍｉｎで通気された。消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ１５２０，ＤｏｗＣｏ
ｒｎｉｎｇＣｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）が、発泡を制御するために必
要に応じて添加された。形質転換細胞は、最初は、菌体生産のためにエタノール
を使用（増殖の最初の５０時間）し、次いで、グルコースをＬ（＋）−乳酸に変
換した。ｐＨは、２ＭＫＯＨの自動添加によって４．５に維持された。グルコー
スは、発酵培地における残濃度約３５〜４５ｇ／Ｌを維持するために必要に応じ
てフィードされた。

【０２０４】結果は図９および表７に示される（ケース１）。経過時間は接種時間以降測定
された。濾過により細胞を除去した後得られた発酵からのサンプルは、Ｐｏｒｒ
ｏｅｔａｌ．１９９５（前出）に記載のように標準酵素分析を用いて、グル
コース、エタノールおよびＬ（＋）−乳酸について分析された。Ｔ＝５０ｈｒ後
、エタノールは、サンプル試験のいずれにおいても検出されなかった。収率およ
び遊離乳酸は、前記のように計算された。

【０２０５】発酵のための種菌は、２５０ｍＬ容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中
、最小合成培地（１．３％ｗ／ｖ酵母窒素源−ａａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ，ＭＩ）、２％ｗ／ｖエタノール、Ｇ４１８２００ｍｇ／ｌ）５０ｍＬにお
いて、ＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］を、培養振盪機（ＭｏｄｅｌＧ−２４
，ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．，Ｉｎｃ．，Ｅ
ｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において３０℃、３００ｒｐｍで４０時間前培養することに
よって調製された。

【０２０６】異なる実験（表７、ケース２）では、始発発酵ｐＨは５．４であり、そして中
和剤は、発酵を通じて添加されなかった。

【０２０７】

【表１５】

【０２０８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングが、解糖の流れを乳酸生産の方向
へシフトする。ピルビン酸分岐点における鍵の酵素反応は、次の酵素：（１）：ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ；（２）：アルコールデヒドロゲナーゼ；（３）：アセトアル
デヒドデヒドロゲナーゼ；（４）：アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；（５）；サ
イトゾルからミトコンドリアへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（６）：ミトコン
ドリアからサイトゾルへのアセチル−ＣｏＡシャトル；（７）：異種の乳酸デヒ
ドロゲナーゼ；（８）：ピルビン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。補充
合成に関与する酵素反応は省略された。

【図２】プラスミドｐＶＣ１の図。

【図３Ａ】プラスミドｐＫＳＭＤ８／７の図。

【図３Ｂ】ｐＫＳＥＸＨ／１６の図。

【図４】プラスミドｐＥＰＬ２の図。

【図５】プラスミドｐＬＣ５の図。

【図６】プラスミドｐＬＡＴ−ＡＤＨの図。

【図７Ａ】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラ
クチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝４９におけ
る残グルコース濃度は検出されなかった。Ｄ（−）−乳酸の生産も、また検出さ
れなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより
高かった。同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（
データ未掲載）。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。

【図７Ｂ】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラ
クチスＰＭ６−７ａ［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００
ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．
６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図７Ａに示したテキストバッチにお
けるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝４９における残グルコース濃度は検出さ
れなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより
高かった。同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。

【図８Ａ】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラ
クチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝６０におけ
る残グルコース濃度は、１２，０１ｇ／ｌであった。より長い培養時間は、菌体
およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比活性は
、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＬＤＨを用いて得られた（
データ未掲載）。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。

【図８Ｂ】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換クルイベロミセス・ラ
クチスＰＭ１／Ｃ１［ｐＥＰＬ２］からのＬ（＋）−乳酸生産。培地は、２００
ｍＭリン酸バッファーを用いて、時間Ｔ＝０において緩衝化された（ｐＨ＝５．
６）。このテキストバッチでは、ｐＨ値は、図８Ａに示したテキストバッチにお
けるよりも、ずっと遅く低下する。Ｔ＝８７における残グルコース濃度はゼロで
あった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って３Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高か
った。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ同様な結果が、細菌Ｌ．カゼイＬＤＨを用いて得られた（データ未掲載）。

【図９Ａ】撹拌タンクバイオリアクター（またテキスト参照）における形質転換クルイベ
ロミセスＢＭ３−１２Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸生産。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）グルコース濃度、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。

【図９Ｂ】撹拌タンクバイオリアクターにおける形質転換クルイベロミセスＢＭ３−１２
Ｄ［ｐＬＡＺ１０］細胞からのＬ（＋）−乳酸収率。グルコース対乳酸生産。収率（ｇ／ｇ）は８５．４６％であった。

【図１０】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換トルラスポラ（異名チ
ゴサッカロミセス）・デルブルッキイＣＢＳ８１７［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からの
Ｌ（＋）−乳酸生産。Ｔ＝１３０における残グルコース濃度は、３ｇ／ｌであっ
た。より長い培養時間は、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもた
らさなかった。ＬＤＨ比活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍ
ｇより高かった。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ

【図１１】Ｇｌｕ−ＹＮＢに基づく培地での増殖における形質転換チゴサッカロミセス・
バイリイＡＴＣＣ６０４８３［ｐＬＡＴ−ＡＤＨ］からのＬ（＋）−乳酸生産。
Ｔ＝６０における残グルコース濃度は、８ｇ／ｌであった。より長い培養時間は
、菌体およびＬ（＋）−乳酸両方のより高い生産をもたらさなかった。ＬＤＨ比
活性は、全実験に沿って０．５Ｕ／総細胞タンパク質ｍｇより高かった。同様な
結果が、異なる菌株を用いて得られた（ＡＴＣＣ３６９４７，データ未掲載）。（△）細胞／ｍｌ；（−）ｐＨ値；（○）エタノール生産、ｇ／ｌ；（■）Ｌ（
＋）−乳酸生産、ｇ／ｌ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月１０日（２０００．３．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１】エタノール生産能を欠いているか、または同じ菌株の野生型酵母に較べて低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換されているが、乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている該遺伝子が、ＵＡＳｇａｌ／ＴＡＴＡｃｙｃｌ−およびウシ遺伝子のｃＤＮＡ（ＬＤＨ−Ａ）の最初のＡＴＧコドン上流の長い配列（０．１５Ｋｂｐ）からなるプロモーター配列には、機能的に結合されていない、酵母菌株。

【請求項２】酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換されたサッカロミセス・セレビシエであって、該酵母菌株が、乳酸デヒドロゲナーゼにより同様に形質転換された同じ菌株の野生型酵母に較べてエタノール生産能を欠いているか、または低いエタノール生産能をもち、そして該酵母菌株が、グルコース１ｇ当たり乳酸０．３４７ｇに等しいか、またはそれを超える収量における乳酸生産能をもつサッカロミセス・セレビシエ。

【請求項３】酵母において乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合された該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された非慣用酵母菌株であって、該酵母菌株が、乳酸デヒドロゲナーゼにより同様に形質転換された同じ菌株の野生型酵母に較べてエタノール生産能を欠いているか、または低いエタノール生産能をもつ非慣用酵母菌株。

【請求項４】同じ菌株の野生型酵母に較べて約６０％未満であるエタノー
ル生産能をもつ、請求項１〜３記載の酵母菌株。

【請求項５】低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／または低いピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコー
ドしている核酸配列の少なくとも１個のコピーをもつ、請求項１〜４記載の酵母
菌株。

【請求項６】低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ、請求項５記載
の酵母菌株。

【請求項７】低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもつ、請求項５記
載の酵母菌株。

【請求項８】両低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デ
カルボキシラーゼ活性をもつ、請求項５記載の酵母菌株。

【請求項９】ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼ、または両方をコードしている遺伝子もしくは遺伝子群が、選択マーカーによ
る欠失もしくは挿入によって破壊されている、請求項１〜８のいずれか１つに記
載の酵母菌株。

【請求項１０】選択マーカーがＵＲＡ３マーカーである、請求項９記載の
酵母菌株。

【請求項１１】選択マーカーが、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲ
Ａ３マーカーである、請求項１０記載の酵母菌株。

【請求項１２】選択マーカーが、毒性化合物に対する耐性をコードしてい
る優性マーカーである、請求項９記載の酵母菌株。

【請求項１３】サッカロミセス、クルイベロミセス、トルラスポラおよび
チゴサッカロミセスの種から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の
酵母菌株。

【請求項１４】サッカロミセス・セレビシエの菌株である、請求項１３記
載の酵母菌株。

【請求項１５】クルイベロミセス・ラクチスの菌株である、請求項１３記
載の酵母菌株。

【請求項１６】トルラスポラ・デルブルッキイの菌株である、請求項１３記載の酵母菌株。

【請求項１７】チゴサッカロミセス・バイリイの菌株である、請求項１３記載の酵母菌株。

【請求項１８】クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセ
スの種から選ばれる酵母菌株であって、該酵母において乳酸デヒドロゲナーゼを
コードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合さ
れた該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。

【請求項１９】ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により
形質転換された、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の酵母菌株。

【請求項２０】細菌乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により
形質転換された、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の酵母菌株。

【請求項２１】乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子が酵母ゲノ
ムに組み込まれる、請求項１〜２０のいずれか１つに記載の酵母菌株。

【請求項２２】プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下の乳
酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによっ
て形質転換された、請求項１〜２１のいずれか１つに記載の酵母菌株。

【請求項２３】プロモーター配列がピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
プロモーターである、請求項２２記載の酵母菌株。

【請求項２４】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２３記載の酵母菌株。

【請求項２５】乳酸輸送体を過剰発現する、上記請求項のいずれか１つに
記載の酵母菌株。

【請求項２６】乳酸輸送体がＪＥＮ１である、請求項２５記載の酵母菌株
。

【請求項２７】ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターに機能
的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有するベ
クター。

【請求項２８】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２７記載のベクター。

【請求項２９】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ラクチス・ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２８記載のベクタ
ー。

【請求項３０】炭素源を含有する発酵培地における請求項１〜２６の組み
換え酵母菌株の増殖、および発酵培地からの乳酸の回収を含む、乳酸の製造方法
。

【請求項３１】炭素源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラ
クトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、セロビオース、アラビノー
ス、キシロースの１種以上から選ばれる、請求項３０記載の方法。

【請求項３２】発酵培地が、Ｍｇ⁺⁺５ｍＭ未満および／またはＺｎ⁺⁺０．
０２ｍＭ未満を含有する、請求項３０もしくは３１記載の乳酸の製造方法。

【請求項３３】発酵培地がｐＨ７以下をもつ、請求項３０〜３２記載の方
法。

【請求項３４】ｐＨが４．５以下である、請求項３３記載の方法。

【請求項３５】ｐＨが３以下である、請求項３４記載の方法。

【請求項３６】Ｄ−もしくはＬ−乳酸または２種の混合物の製造のための
請求項３０記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/56 (Ｃ１２Ｐ 7/56 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ランツイ，ビアンカ・マリアイタリア・アイ−20129ミラノ・ビアガスパレゴツツイ８ (72)発明者フロンタリ，ラウライタリア・アイ−20129ミラノ・ビアガスパレゴツツイ８ (72)発明者バイ，マリナイタリア・アイ−20129ミラノ・ビアガスパレゴツツイ８ (72)発明者ウインクラー，アーロン・アドリアンイタリア・アイ−20129ミラノ・ビアガスパレゴツツイ８ (72)発明者アルベルジーナ，リリアイタリア・アイ−20129ミラノ・ビアガスパレゴツツイ８Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA80 CA04 DA12 EA04 FA02 GA11 4B050 CC03 DD02 DD11 LL05 4B064 AD02 CA06 CA19 CC24 DA10 DA16 4B065 AA80X AB01 BA02 BB02 BB03 BB15 BB16 CA10 CA41 CA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エタノール生産能を欠いているか、または同じ菌株の野生型
酵母に較べて低いエタノール生産能をもち、そして酵母において乳酸デヒドロゲ
ナーゼをコードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列が機能的に
結合した該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項２】同じ菌株の野生型酵母に較べて約６０％未満であるエタノー
ル生産能をもつ、請求項１記載の酵母菌株。
【請求項３】低いピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／または低いピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ活性、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコー
ドしている核酸配列の少なくとも１個のコピーをもつ、請求項１もしくは２記載
の酵母菌株。
【請求項４】低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性をもつ、請求項３記載
の酵母菌株。
【請求項５】低いピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもつ、請求項３記
載の酵母菌株。
【請求項６】低いピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性と低いピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ活性とももつ、請求項３記載の酵母菌株。
【請求項７】ピルビン酸デカルボキシラーゼもしくはピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ、または両方をコードしている遺伝子もしくは遺伝子群が、選択マーカ
ーによる欠失もしくは挿入によって破壊されている、請求項１〜６のいずれか１
つに記載の酵母菌株。
【請求項８】選択マーカーがＵＲＡ３マーカーである、請求項７記載の酵
母菌株。
【請求項９】選択マーカーが、サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ
３マーカーである、請求項８記載の酵母菌株。
【請求項１０】選択マーカーが、毒性化合物に対する耐性をコードしてい
る優性マーカーである、請求項７記載の酵母菌株。
【請求項１１】サッカロミセス、クルイベロミセス、トルラスポラおよび
チゴサッカロミセスの種から選ばれる、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の
酵母菌株。
【請求項１２】サッカロミセス・セレビシエの菌株である、請求項１１記
載の酵母菌株。
【請求項１３】クルイベロミセス・ラクチスの菌株である、請求項１１記
載の酵母菌株。
【請求項１４】トルラスポラ・デルブルッキイの菌株である、請求項１１
記載の酵母菌株。
【請求項１５】チゴサッカロミセス・バイリイの菌株である、請求項１１
記載の酵母菌株。
【請求項１６】クルイベロミセス、トルラスポラおよびチゴサッカロミセ
スの種から選ばれる酵母菌株であって、該酵母において乳酸デヒドロゲナーゼを
コードしている遺伝子の発現を可能にするプロモーター配列に、機能的に結合さ
れた該遺伝子の少なくとも１個のコピーにより形質転換された酵母菌株。
【請求項１７】ウシ乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により
形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１８】細菌乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子により
形質転換された、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項１９】乳酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子が酵母ゲノ
ムに組み込まれる、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２０】プロモーター配列および該プロモーター配列の制御下の乳
酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクターによっ
て形質転換された、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の酵母菌株。
【請求項２１】プロモーター配列がピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
プロモーターである、請求項２０記載の酵母菌株。
【請求項２２】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２１記載の酵母菌株。
【請求項２３】乳酸輸送体を過剰発現する、上記請求項のいずれか１つに
記載の酵母菌株。
【請求項２４】乳酸輸送体がＪＥＮ１である、請求項２３記載の酵母菌株
。
【請求項２５】ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターに機能
的に結合された乳酸デヒドロゲナーゼをコードしているＤＮＡ配列を含有するベ
クター。
【請求項２６】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】プロモーター配列が、クルイベロミセス・ラクチス・ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子プロモーターである、請求項２６記載のベクタ
ー。
【請求項２８】炭素源を含有する発酵培地における請求項１〜２４の組み
換え酵母菌株の増殖、および発酵培地からの乳酸の回収を含む、乳酸の製造方法
。
【請求項２９】炭素源が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラ
クトース、スクロース、ラフィノース、マルトース、セロビオース、アラビノー
ス、キシロースの１種以上から選ばれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】発酵培地が、Ｍｇ⁺⁺５ｍＭ未満および／またはＺｎ⁺⁺０．
０２ｍＭ未満を含有する、請求項２８もしくは２９記載の乳酸の製造方法。
【請求項３１】発酵培地がｐＨ７以下をもつ、請求項２８〜３０記載の方
法。
【請求項３２】ｐＨが４．５以下である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】ｐＨが３以下である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】Ｄ−もしくはＬ−乳酸または２種の混合物の製造のための
請求項２８記載の方法。