CN111849790B - 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用，所述重组顶头孢霉工程菌是通过敲除顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因所得。本发明通过构建Acaxl2基因缺陷的重组顶头孢霉工程菌，来促进节孢子的形成，从而达到提高头孢菌素产量的目的。

Description

重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程菌及其应用，具体涉及一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)是工业生产头孢菌素的原料，头孢菌素是一类具有重要应用价值的广谱抗生素。头孢菌素C是顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)产生的一类次级代谢产物，顶头孢霉培养过程中的主要形态是分生孢子与节孢子，两者在无性周期中有规律地发生。其中，分生孢子由盘状的分生孢子梗簇中的小梗形成，常在固态培养时出现，而节孢子则是液体培养过程中，养分供应的限制后，溶胀的基质菌丝分裂产生。有文献表明，在顶头孢霉菌生产培养过程中发现，节孢子的分化与头孢菌素C生物合成的最大速率相吻合。节孢子的形成似乎与头孢菌素C的高产有关(请参见文献Nash C H,Huber FM.Antibiotic Synthesis and Morphological Differentiation of Cephalosporiumacremonium[J].Applied microbiology,1971,22(1):6-10.和Bartoshevich Y E,Zaslavskaya P L,Novak M J,et al.Acremoniumchrysogenum differentiation andbiosynthesis of cephalosporin[J].Journal of Basic Microbiology[J].Journal ofBasic Microbiology,1990,30(5):313-320.)。在许多工业生产中，也往往将菌丝形态与CPC产量高低进行关联(请参见文献万平,冀志霞,储炬等.菌丝形态分化与头孢菌素C合成的关系[J].微生物学通报,2005,032(001):15-21.)。但对于节孢子产生与CPC产量之间关联机制的研究，相关文献报道较少。
近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的普及，极大地提高了人类对于不同物种中遗传物质改造的可操作性。这为利用基因工程手段定向改造顶头孢霉菌提供了良好的技术基础。
发明内容
本发明提供一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用，旨在得到一种生产头孢菌素能力较高的顶头孢霉菌。
为解决上述问题，第一方面，本申请提供一种重组顶头孢霉工程菌，其特征在于，所述重组顶头孢霉工程菌是通过敲除顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因所得，所述Acaxl2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施例中，所述顶头孢霉菌为顶头孢霉1-D1工业菌株。
在一些实施例中，所述敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因为将所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的egfp基因。
在一些实施例中，所述重组顶头孢霉工程菌在发酵中后期至发酵结束，直径为2-8μm的节孢子的含量为70％至95％。
第二方面，本申请提供一种重组顶头孢霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1)构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体；
2)构建同源修复片段；
3)将步骤1)所述pAN7-Acaxl2基因敲除载体和步骤2)所述同源修复片段共转化至顶头孢霉菌中，获得产头孢菌素C的重组顶头孢霉工程菌。
在一些实施例中，所述步骤1)中的构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体包括步骤：
1.1)、提供如SEQ ID NO.3所示的sgRNA靶序列，将所述sgRNA靶序列引入到序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.7所示的引物中；
1.2)、以pUC57为模板，进行PCR扩增，回收片段后进行融合PCR后获得可识别Acaxl2基因的特异性sgRNA片段Acaxl2-sgRNA；
1.3)、通过克隆连接的方法，将Acaxl2-sgRNA引入到CRISPR/cas9操作载体上，得到pAN7-Acaxl2质粒。
在一些实施例中，所述步骤1.3)包括：
将pAN7-sorA质粒利用HindIII和SpeI进行双酶切，胶回收含cas9蛋白表达盒的大片段质粒骨架，与1.2中的Acaxl2-sgRNA片段一步克隆连接，构建pAN7-Acaxl2质粒。
在一些实施例中，所述步骤2)中的构建同源修复片段包括：
2.1)、设计序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11所示的引物，通过真菌基因组DNA提取试剂盒提取工业顶头孢霉1-D1的基因组，以所述基因组为模板，进行上下游同源臂的扩增；
2.2)、以pAN7-1-eGFP为模板，用序列如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13引物进行PCR扩增，得到egpf表达盒；
2.3)、将胶回收后的步骤2.1中的上下游同源臂与步骤2.2中的egpf表达盒进行三片段融合，获得同源修复片段B1-eGFP-B2。
第三方面，本申请提供一种以上的重组顶头孢霉工程菌在生产头孢菌素C中的应用。
在一些实施例中，在10％的接种量，28℃，220rpm摇瓶振荡培养72h后，调温至25℃，培养至168h发酵的发酵条件下，所述重组顶头孢霉工程菌的产量为2000-6000μg/ml。
有益效果：本发明提供一种重组顶头孢霉工程菌，头孢菌素是由重组顶头孢霉工程菌产生，而头孢菌素的产量受节孢子的生成的影响，本发明通过构建Acaxl2基因缺陷的重组顶头孢霉工程菌，来促进节孢子的形成，从而达到提高头孢菌素产量的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中pAN7-Acaxl2构建电泳图；
图2是本发明实施例中pAN7-Acaxl2构建流程示意图；
图3是本发明实施例中同源修复片段B1-eGFP-B2的构建示意图；
图4是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP验证原理示意图；
图5是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP PCR验证图示意图；
图6和图7是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1发酵参数比较示意图；
图8是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1头孢菌素C产量比较示意图；
图9是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1菌丝形态示意图；
图10是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1菌丝生长单位比较示意图；
图11是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1菌丝长度分布示意图；
图12是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1菌丝直径分布示意图；
图13是本发明实施例中Ac-ΔAcaxl2::eGFP与1-D1节孢子数量与CPC产量分布示意图；
图14是本发明实施例中与BSSS及CPC产量相关的基因表达量变化示意图；
图15是本发明实施例中Acaxl2缺失菌株相关基因调控网络示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
一、本申请实施例中涉及培养基的配方与配制如下所述：
麦芽汁培养基、种子培养基、摇瓶发酵培养基配方参见文献(李英英,杭海峰,庄英萍等.常压常温等离子体(ARTP)诱变选育顶头孢霉高产菌[J].中国抗生素杂志,2017,42(11):945-950.)，与上述文献不同的地方是，在本实施例中：种子培养基pH消前7.2。
二、本申请实施例中涉及菌株和质粒的说明详如下:
顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)1-D1工业菌株、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、真菌表达质粒pAN7-1、含CRISPR-Cas9基因编辑系统质粒pAN7-sorA均由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保藏，含RGR结构质粒pUC57由华大基因合成。
三、本申请实施例中涉及的仪器、试剂、以及引物说明
本发明实施例中涉及的仪器，包括：岛津LC-20T(日本岛津有限公司)、Nanodrop2000型核酸定量仪(美国Thermo公司)。
本发明实施例中涉及的试剂，包括：真菌基因组抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于Axygen公司；限制性内切酶购于NEB公司；KOD酶购于东洋坊公司；RT-qPCR相关试剂盒购于艾科瑞生物工程有限公司。
本发明所涉及的测序、引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1、引物列表(大写字母为模板质粒pUC57中RGR特异性结构的骨架)
Primer name Sequence(5’-3’) 序列号
sgaxl2-1 aactcaccgcgacgtAAGCTTtcggagCTGATGAGTCCGTGAGGAC SEQID NO.4.
sgaxl2-2 gcgaatacgagatgtcggagGACGAGCTTACTCGTTTC SEQID NO.5.
sgaxl2-3 ctccgacatctcgtattcgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC SEQID NO.6.
sgaxl2-4 cagtaacgttaagtgACTAGTTCGAGATGACCCAATGTCC SEQID NO.7.
Acaxl2-B1-F1 ggtgatgtccgtgttgcccttggtcttgag SEQID NO.8.
Acaxl2-B1-R1 gatacaagggaattcaggagccagcagggcgcagttcattgcgat SEQID NO.9.
Acaxl2-B2-F1 acatctccactcgaagcaccttccagcataagccgggcatgatc SEQID NO.10.
Acaxl2-B2-R1 tcgcctgaggaagcagaccaggagcatgat SEQID NO.11.
Acaxl2-PET-F1 actgcgccctgctggctcctgaattcccttgtatctctacacacagg SEQID NO.12.
Acaxl2-PET-R1 ggcttatgctggaaggtgcttcgagtggagatgtggagtg SEQID NO.13.
A1-1 ctcagttgagctctaccttctcttc SEQID NO.14.
A1-2 actgcttgatctgatcggagat SEQID NO.15.
A2-1 agcgataagagtccatccatatcag SEQID NO.16.
A2-2 agtcgaagaatatcctcttgacac SEQID NO.17.
A3-1 gagtacaactacaacagccacaac SEQID NO.18.
A3-2 tctcgagattgtcgagtctcagccattgct SEQID NO.19.
表2 RT-qPCR反应引物
Primer name Sequence(5’-3’) 序列号
actin-F1 gcagtgatctccttctgcatac SEQID NO.20.
actin-R1 caccaccttcaactccatcat SEQID NO.21.
AcBud3-F1 ggaaggttccgaagggttt SEQID NO.22.
AcBud3-R1 gacttcctgccgacattatca SEQID NO.23.
AcBud4-F1 gggagacgactggaatgg SEQID NO.24.
AcBud4-R1 ctatggagaggaggcgaaat SEQID NO.25.
AcCPCR1-F2 gcaccaacttcccgaaacta SEQID NO.26.
AcCPCR1-R2 gaaagcaagaactcgatccca SEQID NO.27.
AcFKH-F2 ggctcctttctggagattcat SEQID NO.28.
AcFKH-R2 gcaagggactactgctctg SEQID NO.29.
cefEF-F cctcgcttccgttcttgaaa SEQID NO.30.
cefEF-R caccaagggtatcttctacttgac SEQID NO.31.
cefG-F1 cacgacgattcgagatgatgtt SEQID NO.32.
cefG-R1 ccgactacggcagcaattt SEQID NO.33.
pcbAB-F1 gtcagcaattgcgatgcg SEQID NO.34.
pcbAB-R1 gctagcacaagcctctcg SEQID NO.35.
三、下面对本发明的实施例进行详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
实施例1、基因敲除载体的获得
1、sgRNA的设计
通过UniProt蛋白质序列数据库查询得到Acaxl2蛋白质序列，经tblastn比对得到核酸序列，将野生型顶头孢霉ATCC11550 Acaxl2基因序列(GenBank:KFH43876.1)与顶头孢霉1-D1测序结果进行比对，确定了Acaxl2基因序列(如SEQ ID NO.1所示)并未产生突变。通过sgRNA设计网站(https://gt-scan.csiro.au/submit/)进行靶目标序列设计：5’-ctccgacatctcgtattcgcTGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)，设计引物(sgaxl2-1，sgaxl2-2)、(sgaxl2-3，sgaxl2-4)，以pUC57为模板，进行PCR扩增，回收片段后进行融合PCR后获得可识别Acaxl2基因的特异性sgRNA片段Acaxl2-sgRNA(288bp)，经电泳验证，如图1所示，为pAN7-Acaxl2构建电泳图，其中A：Acaxl2-sgRNA构建片段(泳道1：sgRNA片段1，204bp；泳道2：sgRNA片段2，84bp)；B：Acaxl2-sgRNA片段(完整sgRNA片段，288bp)。结果显示：条带大小均符合预期。
2、构建pAN7-Acaxl2基因敲除质粒
将pAN7-sorA质粒利用HindIII、SpeI进行双酶切，酶切结果如图1所示，其中C：pAN7-sorA质粒HindIII、SpeI双酶切(泳道1：pAN7-sorA质粒；泳道2：双酶切质粒)胶回收含cas9蛋白表达盒的大片段质粒骨架(15604bp)，然后与Acaxl2-sgRNA片段一步克隆连接，构建pAN7-Acaxl2质粒。将该质粒进行宿主菌感受态的转化，优选的，所述宿主菌为大肠杆菌DH5α。挑取单菌落进行菌落PCR验证，对于初步验证成功的质粒进行测序验证，载体构建流程图见图2。
实施例2、构建同源修复片段
设计引物(Acaxl2-B1-F1，Acaxl2-B1-R1)、(Acaxl2-B2-F1，Acaxl2-B2-R1)，通过真菌基因组DNA提取试剂盒提取工业顶头孢霉1-D1的基因组，以其为模板，进行同源臂B1、B2的扩增，如图3所示，长度分别为997bp、993bp。以pAN7-1-eGFP为模板，用(Acaxl2-PET-F1，Acaxl2-PET-R1)进行PCR扩增，得到长度为3848bp的egpf表达盒(egpf基因如SEQ IDNO.2所示)。将胶回收后的上述片段进行三片段融合，获得长度为5798bp的同源修复片段B1-eGFP-B2。
实施例3、构建重组顶头孢霉工程菌(Ac-ΔAcaxl2::eGFP)
1、原生质体转化
将构建的敲除质粒pAN7-Acaxl2与同源修复片段B1-eGFP-B2，以2:1的质量比进行原生质体共转，外源DNA总体积为18μl，与原生质体轻柔混匀，将该体系与上层培养基混合后倒至含下层培养基的平板中，28℃培养10-12天，待转化板长出半透明的白色菌落，使用已灭菌牙签转移至麦芽汁平板(潮霉素抗性：150μg/ml)，28℃培养7天。
2、原生质体转化筛选验证
请参阅图4，为重组顶头孢霉工程菌Ac-ΔAcaxl2::eGFP验证原理示意图，将转化子菌体通过4对引物进行菌落PCR验证，本发明实施例中以(A1-1，A1-2)为引物扩增靶基因序列，对照组1-D1有扩增片段(458bp)，实验组应无扩增片段，见图5A；以(A2-1，A2-2)、(A3-1，A3-2)为引物分别扩增上游同源臂B1与表达盒启动子部分(1152bp)、表达盒eGFP部分与下游同源臂B2(1754bp)，对照组1-D1应无扩增片段，实验组应有扩增片段，见图5B与图5C。以(A2-1，A3-2)为引物扩增时，如图5D所示，对照组1-D1(2021bp)与实验组(5062bp)条带长度有明显差异。
实施例4、重组顶头孢霉工程菌的发酵与产物测定
摇瓶发酵与产物CPC检测参见文献(李英英,杭海峰,庄英萍等.常压常温等离子体(ARTP)诱变选育顶头孢霉高产菌[J].中国抗生素杂志,2017,42(11):945-950.)，与上述文献不同的是，在本实施例中：
1)种子液：将成熟斜面挖块接种至装液量为25ml的250ml摇瓶中，28℃，220rpm振荡培养72h后，用50％甘油以1:1对种子液进行保种，于-80℃进行保存。
2)种子摇瓶：保种液以2％接种量接至装液量为50ml的500ml种子摇瓶，28℃，220rpm振荡培养72h即为种子液。
3)发酵摇瓶：以10％的接种量，将种子转接至装液量为30ml的500ml摇瓶28℃，220rpm振荡培养72h后，调温至25℃，培养至168h发酵结束。
实验结果请参阅图6和图7，为突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP与对照菌株1-D1的pH与PMV参数的比较。在两株菌株发酵过程中，pH的变化趋势一致。在0-24h时，pH呈上升态势，分析是由于培养基中尿素被分解生成NH3，其在液体中以NH4+存在。随着菌体生长，NH4+被利用生成H+，同时有机酸含量的增加，pH开始下降。但是由于发酵培养基中含有碳酸钙等调节物质，可适当稳定发酵液中整体环境。此外，在种子接入后，菌体量开始缓慢增长，但是突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP的涨幅稳定，对照菌株1-D1在24h-48h阶段菌体量有小幅下降，随后逐渐开始缓慢生长，重复实验仍有该表现，使菌株在后续生产过程不占优势。
本发明实施例中，CPC最终产量可以为2000-6000μg/ml，例如，可以达到4000-5700μg/ml。请参阅图8，突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP与对照菌株1-D1头孢菌素C产量比较示意图。本发明实施例对两菌株分别进行了三批次的发酵试验，在图8中可以看到，CPC含量的总体态势基本与PMV值趋势相一致，随着菌量的增加，发酵液中营养被逐渐消耗，菌体生长由初级代谢转入次级代谢，CPC的分泌逐渐增加。在发酵24-72h期间，PMV增幅大于最初的24h，与此同时，CPC产量快速增长。截止至发酵终点，突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP产量为5573μg/ml。而对照菌株的产量仅为1754μg/ml。
实施例5、重组顶头孢霉工程菌的菌丝形态分析
1)菌体前处理：取1ml发酵液去上清，1×PBS多次洗涤后，在避光条件下，加入等量2.5％戊二醛固定液，吹吸混匀，室温避光静置2h后，于4℃避光保存。
2)荧光染色：将菌体离心去固定液，PBS洗涤后至洁净载玻片上，滴加CFW溶液，再滴加10％KOH溶液，染色1min。在100倍油镜，405nm波长下进行显微观察。
3)形态分析：使用image J软件对离散菌丝的菌丝长度(length)、菌丝直径(widths)以及菌丝生长单位(G＝菌丝总长/顶端数)进行统计，以百分比形式对取样点菌丝形态进行描述。统计时，将三个平行样本的显微图像进行综合分析，每个时间点菌丝计数不少于150，每个样本不少于40，分类统计，计算出不同类别菌丝长度与直径在每个取样时间点的不同占比。
实验结果请参阅图9，首先，将细长菌丝定义为直径小于2μm(图9，0h)，中度膨大片段为直径2-5μm的菌丝片段与椭圆、球形细胞(图9，ΔAcaxl2::eGFP 72h)以及高度膨大片段为直径大于5μm的圆球形细胞(图9，1-D1 72h)。从图中可以看出，随着发酵的进行，两者形态间的差异逐渐增大。
从发酵起点0h种子菌形图来看，两株菌均以细长、带有隔膜的菌丝为主要形态，直径小于2μm。在突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP隔膜附近中，部分菌丝有膨大现象，甚至已形成小球状的凸起(星号标出)，可能是新分支的形成相关。同时，在对照菌株1-D1中也有相关现象存在，可能与其工业背景有一定关系。24h时，突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP菌丝膨大，形成节孢子串现象开始出现，即在同一隔膜段内，菌丝呈现出波浪形膨大，而非整个隔膜段膨大。相较之下，对照菌株1-D1主要为顶端膨大，且有高度膨大趋势。随着发酵进行，突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP在48h时，出现了膨大菌丝向内凹陷逐渐形成隔膜的趋势，与酵母出芽生殖较为相似。此外，在96h、120h的菌形图(星号位置)中，发现了另一种隔膜形成现象——通过细胞壁形成物质的堆积逐渐形成隔膜，类似构巢曲霉的隔膜形成模型。
菌丝的膨大与隔膜形成使细长菌丝逐渐变为节孢子串(未分离的节孢子)，然后分离形成节孢子。部分节孢子局部膨大再次分裂，产生新的分支或者新的节孢子，而部分节孢子继续膨大，且不再分裂出新的菌体。这些巨型节孢子直径可达8μm以上，膨大至一定程度时，菌体开始破碎，胞内内含物外泄，导致菌体死亡，如图9中箭头所示。在突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP发酵结束时，菌体仍以较为活跃的节孢子为主，衰亡现象不明显。而在对照菌株1-D1中，节孢子串的形成较慢，发酵液中菌丝体积膨大的情况较突变株更为明显。在发酵进行至144h时，对照菌株1-D1中已观察到菌体的破碎，至发酵结束(168h)菌体破碎情况更为严重。结合PMV与CPC产量数据，菌丝形态不一样，可能造成堆积度不一样从而造成表观离心体积不一样。发现对照株在48h-120h内菌体生物量虽有增加，但总体菌丝形态与菌体活力与突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP有较大差异，这可能是两者在生物量与产量有巨大差异表现的主要原因。
菌丝生长单位(G)是菌丝总长度与菌丝顶端数之商，一般用于对菌体分枝与生长的描述。通过image J软件，在本实施例对取样中的菌丝总长以及顶端数进行了统计与计算，实验结果如图10所示，从图中可以看到，无论对照菌株1-D1还是突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP的种子，其菌丝生长单位均处于较高水平，分别为41.14μm与45.25μm。转入发酵摇瓶后，两种菌体都得到了充分的生长，菌体分枝数的增加，使菌丝生长单位迅速下降，突变株在24h时，G为25.39μm，对照菌株经48h降至25.72μm。由于菌丝膨大与断裂，菌丝生长单位在一定程度上有所波动，但两者波动趋势较为一致。此外，在本实施例中发现突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP的生长单位在72h后一直低于对照菌株1-D1。这种现象可能与突变株Ac-ΔAcaxl2::eGFP菌丝长度类型相关，在72h后，突变菌株长度在20μm以下的菌丝比值皆高于对照(除120h外)。
根据菌丝形态图像特点，将菌丝长度与菌丝直径进行了分类，类别如图11与图12所示，菌丝长度分为小于20μm、20-50μm与大于50μm三类，而菌丝直径则分为小于2μm、2-5μm与大于5μm。
从图11与图12可以看出，种子形态主要以细长菌丝为主体，发酵初期至中期，较短菌丝(＜20μm)与中长型菌丝(20-50μm)占比逐渐增加，且菌丝直径逐渐膨大，形成局部膨大并且串联的菌丝片段(节孢子串)。在发酵中期至后期的转变过程中，中度膨大(2-5μm)对照株菌丝不断向高度膨大转化，发酵时间为72h时，直径大于5μm的菌丝占比约为70％，随后在60-80％间浮动。而突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP则相反，菌丝直径总体保持在2-5μm，且在60-75％范围内波动。数据显示，72h后突变株Ac-ΔAcaxl2::eGFP中2-5μm直径的菌丝与大于5μm的菌丝比例约为7:3，总体活力较好。中度膨大菌丝的稳定比例以及中等菌丝长度(20-50μm)，这显示出在突变株Ac-ΔAcaxl2::eGFP整体在发酵中后期以节孢子串形态为主，Acaxl2基因的敲除可以促进菌丝中度膨大，形成节孢子，但对于其分离没有明显促进作用。
本发明实施例将直径为2-8μm的膨大菌丝定义为节孢子，其中包括较小的椭圆形节孢子(2-5μm)与巨型节孢子(5-8μm)。在本发明的一个实施例中，所述重组顶头孢霉工程菌在发酵中后期至发酵结束，直径为2-8μm的节孢子的含量为70％至95％。例如：在一个具体的实施例中，在发酵48h至72h的时间范围内，直径为2-8μm的节孢子的含量为75％至90％。
请参阅图13，随着发酵的进行，突变株Ac-ΔAcaxl2::eGFP菌株中节孢子占比逐渐增加，并在72h左右逐渐稳定，且含量占总体菌丝的90％。与此同时，CPC的含量也在逐渐增加。而对照菌株1-D1则表现出相反态势，节孢子的比例逐步减少，由48h的95％下降至168h的54％，CPC的合成也较为缓慢。结合图9与图13来看，在对照菌株1-D1的发酵过程中，发酵主体多为直径大于8μm的菌体细胞，而该类过度膨大的菌体状态并非处于代谢活跃期，反而更倾向于细胞逐渐衰亡而导致的体积增大，其总体活力较低，故导致整体发酵水平低下。这表明Acaxl2的缺失可以促进菌丝的膨大，且膨大菌丝主要形成直径为2-8μm的节孢子或节孢子串。在突变株Ac-ΔAcaxl2::eGFP发酵后期，发酵液中仍主要以该类型细胞存在，过度膨胀的菌体较少，总体活力较好，这可能是突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP的CPC高产的主要原因。
实施例6、重组顶头孢霉工程菌的氧化应激压力培养实验
压力测定参见文献(Bloemendal S,
Figure BDA0002617393860000131
D,Terfehr D,et al.Tools foradvanced and targeted genetic manipulation of theβ-lactam antibiotic producerAcremonium chrysogenum[J].Journal of Biotechnology,2014,169:51-62.)。与上述文献不同的地方是，在本实施例中：制备顶头孢霉节孢子悬浮液，以2μl接种于固体基本培养基(MM)参见文献(Gsaller F,Blatzer M,Abt B,et al.The first promoter forconditional gene expression in Acremonium chrysogenum:Iron starvation-inducible mir1P[J].Journal of Biotechnology,2013,163(1):77-80.)，在28℃条件下培养12-14天。对于细胞壁压力测定，向MM添加25-250mg/l CFW和0.005-0.03％刚果红。分别通过添加0.6、0.8、1.0和1.2M的氯化钠、氯化钾、葡萄糖和山梨糖醇来启动渗透压。使用0.01-0.2％DTT测试了对ER应激的影响，并使用0.003-0.0075％H2O2作为氧化应激源。所有实验均设置三个平行。
本发明实施例将对照菌株1-D1与突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP分别接种于含不同浓度的Calcofluor White(CFW)、刚果红、DTT、KCl、NaCl、山梨醇、葡萄糖、过氧化氢的MM培养基中，从细胞壁、内质网、渗透压与氧化应激四个方面进行实验研究。结果显示，ΔAcaxl2敲除菌株在含不同生长压力的MM培养基中生长受到抑制，并且菌形发生改变。突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP生长能力的降低显示出Acaxl2可能参与了氧化应激、渗透压调节等过程，对细胞壁的完整性与菌体应激能力起着重要作用。
实施例7、Axl2蛋白保守性研究
本发明实施例通过以顶头孢霉的基因组注释为基础，通过BLASTP分析，鉴定发现构巢曲霉(A.nidulans)中的AnAxl2与AcAxl2为潜在同源物。通过对产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、构巢曲霉(A.nidulans)、棉孢曲霉(A.gossypii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和顶头孢霉完整Axl2蛋白序列进行多蛋白序列比对(ClustalX与DNAMAN)，发现AcAxl2与上述菌株享有19％至31％相似水平的序列同一性(附录1)。从野生型顶头孢霉ATCC11550中测序结果中得到的AcAxl2是880个氨基酸(aa)的蛋白质，并由ACRE_053550开放阅读框(ORF)编码，包含2644bp，与1-D1测序结果中AcAxl2蛋白质所含信息相一致。注释信息显示，AcAxl2包含一个N端钙粘蛋白样基序(CADG)与一个早期设定结构域(E-set)，其位于N或C末端，糖类利用酶催化的一类结构域以及其他未知功能蛋白结构。蛋白质序列比对中，同源性主要来源于CADG与E-set，分别高达53.18％与49.59％。CADG的范围为从151到235位氨基酸，该结构域将AcAxl2表征为I型整合血浆糖蛋白(Type I integral plasmaglycoprotein)。在ScAxl2(S.cerevisiae)中，所推定的Dystroglycan repeat结构区域(28-115aa)，与AcAxl2、AgAxl2(A.gossypii)推定的E-set有较高的同源性，范围分别为27到114位氨基酸与343到419位氨基酸。同时AcAxl2与PcAxl2(P.chrysogenum)有36.56％的同源性，其范围为从25到112位氨基酸，以及与AnAxl2(A.nidulans)有42.86％的同源性，其范围为25到110位氨基酸。因此，可以看出，从酵母到丝状真菌，Axl2蛋白的某些结构域具有一定的保守性。
实施例8、Ac-ΔAcaxl2::eGFP相关基因表达量测定
在本发明另一实施例中，对突变菌株ΔAcaxl2::eGFP中部分全局调控因子(CPCR1、Acfkh1)、BSSS途径(AcBud3、AcBud4)以及CPC关键合成基因(pcbAB、cefEF、cefG)的表达量进行了测定。各时间点的突变菌株Ac-ΔAcaxl2::eGFP与对照菌株1-D1分别以自身γ-actin基因(GenBank：AF056976)作为内参进行表达量矫正，采用2-ΔΔCt方法进行数据处理，作为对照的工业菌株1-D1表达水平设定为1，其中，测定所需的引物参阅表2，实验结果参阅图14所示。
从图14中可以看到，CPC合成途径关键基因以及BSSS途径中在两个发酵时间点的基因表达量均有不同程度的上调。其中，CPC合成基因pcbAB、cefEF、cefG在发酵72h时，分别上调1.89、18.55与2.49倍，96h时分别上调3.19、8.19与1.79倍。而AcBud3、AcBud4则在72h与96h分别上调1.21、1.07倍与1.59、1.21倍。相反，两个全局调控因子有轻微下调现象。在顶头孢霉A3/2菌株的研究中发现，叉头状蛋白Acfkh1可能参与了菌体分离，当对其进行敲除时，菌体生长时会出现菌丝膨大，且多具隔膜，培养至144h时，膨大的节孢子仍未完全分离相连现象明显(请参阅文献：Hoff B,Schmitt E K,Kück U.CPCR1,but not itsinteracting transcription factor AcFKH1,controls fungal arthrospore formationin Acremonium chrysogenum[J].Molecular Microbiology,2005,56(5):1220-1233.)。该现象在本实验敲除菌的发酵中也有观察到(图9 144h)，并且Acfkh1表达量有所下调。当cpcr1在ΔAcfkh1菌株中进行过表达时，菌体并没有观察到节孢子的增加，相反，Acfkh1在Δcpcr1的过表达也没有明显促进作用，但当在A3/2中进行过表达时，菌体的加速分裂被所观察到，Acfkh1与cpcr1的相互作用，对菌体中形态功能的行使是非常有必要的。同时全局调控因子还会对产物合成基因进行调控。
在本发明实施例中，突变菌株ΔAcaxl2::eGFP三个限制性步骤的关键酶基因转录量远远高于对照菌株1-D1，其中将青霉素N转化为脱乙酰头孢菌素C的双功能酶编码基因cefEF的上调作用最为明显，这为双方产量的差异做出了较好的解释。此外，对于BSSS途径中，地标蛋白基因Acbud3、Acbud4的表达量也有略微上调。在酵母出芽生殖中，这两种蛋白主要通过被ScAxl2所募集，定位至出芽位点，参与隔膜形成。但是在Acaxl2缺陷菌株中，蛋白无法通过AcAxl2进行定位，从而导致出芽的无序性。此外，全局调控因子AcFKH1的下调可能会促进菌体的膨大与隔膜的形成，这种现象可能正是通过对AcBud3、AcBud4基因的上调作用而实现。隔膜的形成是菌丝局部膨大转换为节孢子的重要过程，本实施例观察到大多菌丝形态停留在节孢子串的状态，即节孢子未完全分离。与此同时，CPC产量在相应增加，这种节孢子串的转化过程与CPC产量可能有密切关系。本实施例推测了Acaxl2缺失后对基因组层面的影响，请参阅图15，为Acaxl2缺失菌株相关基因调控网络图。如图15中显示，其中，箭头：基因表达量下调/上调；虚尾箭头：推测为负调节/正调节；问号：未知调节。这种影响主要集中在芽位点选择系统(BSSS)、分隔起始网络(SIN)、全局调控因子与CPC合成途径。
本发明实施例提供了一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用。头孢菌素是由重组顶头孢霉工程菌产生，而头孢菌素的产量受节孢子的生成的影响，本发明从菌丝的隔膜入手来促进节孢子的生成。而隔膜的形成主要由分隔起始网络(Septationinitiation network，SIN)、芽位点选择系统(Bud site selection system，BSSS)、隔膜蛋白与形成素所控制。其中，分隔起始网络(SIN)和芽位点选择系统(BSSS)起了重要作用。BSSS由Axl1、Axl2、Bud3与Bud4四种蛋白组成且相互作用，其中，Ⅰ型整合质膜蛋白轴向出芽模式蛋白2(Alx2)是BSSS轴向出芽系统的核心组成部分(参见文献Kluge J,Kück U.AcAxl2and AcMst1 regulate arthrospore development and stress resistance in thecephalosporin C producer Acremonium chrysogenum[J].Current Genetics 2018,64(3):713-727.)。本发明通过构建Acaxl2基因缺陷的重组顶头孢霉工程菌，来促进节孢子的形成，从而达到提高头孢菌素产量的目的。
以上对本申请实施例所提供的一种重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<120> 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用
<141> 2020-08-04
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2643
<212> DNA
<213> Acremonium chrysogenum
<400> 1
atgacttcta ttctaagaac gattctccta ctgccgctat acgttcaagc cgccgcaggt 60
cagccgacta tcgcgttccc ctttaacgcg cagctcccgc cagtcgccag gataggaagc 120
ctgttcacgt actccttcgc gactcacacc ttccaatccg actccgacat ctcgtattcg 180
ctgggtgaac accccagctg gctatctctc gagggcgagg agcgccgcct gtacggtatc 240
ccagaagatg aaactgttcc cccaggagaa gtggtcggac agactgtcca gatcatcgcc 300
accgacgaca cgggctccac tacgatggac tctaccgtcg tcgtgtcccg cggttcaggg 360
ccaacggtcg agatccccat ctccgatcag atcaagcagt ttggcgacta ctcggcgccc 420
tcttccatcc tctcctaccc ggcgaccgag ttcaaataca ccttcgacca aagcaccttc 480
cagcataagc cgggcatgat caactactat gccgtgtcgg gcgacagcag cccgttgccc 540
gcgtggatca gcttcgacgg gccatctttg acgttttccg gcaggactcc agccgctgat 600
gccctcaccc agccgccgca gcagtttgat atccgtctgg tggcgtcgga tatcgaggga 660
ttctcctcta ttgccgtcga cttttccatt gtcgtgggaa ggcacaagct caccgcggat 720
gaccccgtcg tagagctgaa cgccagccgc gggtcctctg tcagttacaa agggttgacg 780
gacgggatca agctcgacga cgaaccaatg ggccccggcg acctcaatgt gacgacaact 840
gacatccccg actggctatc acttgatcct aatacatggg ttatcgaggg aagacccggc 900
gaaggcgacc actcgacgaa tttcactatc cgctttaccg accccttttc ggacacactc 960
gatgtgtggg tcatggctca tgtcgccacg gggttattcg agagcacgtt ccgagatgtc 1020
gaggccacgc cgggcgaaga cttcacgctg gacctcgctt cacacttcag ggacccttcc 1080
gacattgaag tgaacctcga gactgagccc gagcagcaat ggctgagact cgacaatctc 1140
gagatcaaag gcaaggtccc caaatccgcc tcgggcgagc taaagatttc catcgaggca 1200
cggtctcgga gcactggccg catggagacg gagaccctgg gcatgacctt tctggccgca 1260
gatgggagca gcacaaccac acgcacgacc acgacctcgg ccccgtccga aacggccagc 1320
gatagcgacg acgctgatgg gaccaaggag gaaaacgaag aggatggcgg cggcatcggc 1380
accagtgcta ttcttctggc gacaatcatc ccgattcttg tcattgctct acttatcatg 1440
ctcctggtct gcttcctcag gcgacgccgc aatcgccgca cctacctgtc gcagaagaag 1500
ctccgcacaa agatctccca tccggttcta ggcagcctca aagtcaacgg gtcgacgcaa 1560
cacgcgctga gaaacgaaaa gggcgggcac gttcaagtca catcccacca ttcatcggag 1620
tcttcggata cgctgggcag cttcccgtcc cacgacatga gccaggtgta catgcagaac 1680
gcgggaccgt cgacgagcag gacattcggc agttccggga ccgaggaagg gagagaatcg 1740
tggttcacgg tggatagaac gggtaccggc gagaggtcct cgcatagtcg ggggtcagat 1800
gccacggcac ctcgctcgac tcatcaactc ctgcccacgc cgccttttct tgctcaatcg 1860
ggagacgacg gctttaggag ctgcctcgac cttacgatat catccttaga tgagctgcca 1920
agcttgcagc cgctaccaga tccgtaccag cgacccggtc gttcgccggc catgtactcg 1980
tctatcacca cgagctccgc agcccttcca ctatctcggc ccggtagtcc cccatcccac 2040
cccatgccca ttgccacagc cgcaagcata gcagcattct ccaaaaaatc gggcaaggcc 2100
agctcggaca aggactggag caccatccac gacgtcgaat cggatgaaac ggttccggag 2160
ctaccaccgc ccatcccagc gcgcttatcg ggccagcagt ggctcagccg gcgtacgggg 2220
agcggctccc aggcggggcg ggagtctttc atatcggaag cgtcgtttgg ctcggcggag 2280
aactggcggg tgattggaaa ccaccggcga agcgcgccca acctctcatc atacaacgag 2340
attgtcgagc aagccccttt ccacccctcg aggccgggca caccgccgac ggccagtgaa 2400
gggggttcgg taccaagtgt gaggggctat agtctcccgg caccttcctc gcctcctccc 2460
tccgccccca tccccgcggc tgctgctccc ggcggagcat cgagcaagtg ggtgcgtccc 2520
aaggcatcgt ggagtcgatt ctcgaagcta aacgaggacg acaagcccgg cgctgatgca 2580
acgaactgga agagggagaa ttccggcaag tcgtccgagg ggagtgtgaa ggcgtttatc 2640
taa 2643
<210> 2
<211> 3808
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaattccctt gtatctctac acacaggctc aaatcaataa gaagaacggt tcgtcttttt 60
cgtttatatc ttgcatcgtc ccaaagctat tggcgggata ttctgtttgc agttggctga 120
cttgaagtaa tctctgcaga tctttcgaca ctgaaatacg tcgagcctgc tccgcttgga 180
agcggcgagg agcctcgtcc tgtcacaact accaacatgg agtacgataa gggccagttc 240
cgccagctca ttaagagcca gttcatgggc gttggcatga tggccgtcat gcatctgtac 300
ttcaagtaca ccaacgctct tctgatccag tcgatcatcc gctgaaggcg ctttcgaatc 360
tggttaagat ccacgtcttc gggaagccag cgactggtga cctccagcgt ccctttaagg 420
ctgccaacag ctttctcagc cagggccagc ccaagaccga caaggcctcc ctccagaacg 480
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aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 2700
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gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 2940
gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 3000
atggacgagc tgtacaagta aagtagatgc cgaccgcggg atccacttaa cgttactgaa 3060
atcatcaaac agcttgacga atctggatat aagatcgttg gtgtcgatgt cagctccgga 3120
gttgagacaa atggtgttca ggatctcgat aagatacgtt catttgtcca agcagcaaag 3180
agtgccttct agtgatttaa tagctccatg tcaacaagaa taaaacgcgt tttcgggttt 3240
acctcttcca gatacagctc atctgcaatg cattaatgca ttgactgcaa cctagtaacg 3300
ccttncaggc tccggcgaag agaagaatag cttagcagag ctattttcat tttcgggaga 3360
cgagatcaag cagatcaacg gtcgtcaaga gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg 3420
ctccacgcga ctatatattt gtctctaatt gtactttgac atgctcctct tctttactct 3480
gatagcttga ctatgaaaat tccgtcacca gcncctgggt tcgcaaagat aattgcatgt 3540
ttcttccttg aactctcaag cctacaggac acacattcat cgtaggtata aacctcgaaa 3600
tcanttccta ctaagatggt atacaatagt aaccatgcat ggttgcctag tgaatgctcc 3660
gtaacaccca atacgccggc cgaaactttt ttacaactct cctatgagtc gtttacccag 3720
aatgcacagg tacacttgtt tagaggtaat ccttctttct agaagtcctc gtgtactgtg 3780
taagcgccca ctccacatct ccactcga 3808
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctccgacatc tcgtattcgc tgg 23
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aactcaccgc gacgtaagct ttcggagctg atgagtccgt gaggac 46
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgaatacga gatgtcggag gacgagctta ctcgtttc 38
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctccgacatc tcgtattcgc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagtaacgtt aagtgactag ttcgagatga cccaatgtcc 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtgatgtcc gtgttgccct tggtcttgag 30
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatacaaggg aattcaggag ccagcagggc gcagttcatt gcgat 45
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acatctccac tcgaagcacc ttccagcata agccgggcat gatc 44
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcgcctgagg aagcagacca ggagcatgat 30
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actgcgccct gctggctcct gaattccctt gtatctctac acacagg 47
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggcttatgct ggaaggtgct tcgagtggag atgtggagtg 40
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctcagttgag ctctaccttc tcttc 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
actgcttgat ctgatcggag at 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agcgataaga gtccatccat atcag 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agtcgaagaa tatcctcttg acac 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gagtacaact acaacagcca caac 24
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tctcgagatt gtcgagtctc agccattgct 30
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcagtgatct ccttctgcat ac 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
caccaccttc aactccatca t 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggaaggttcc gaagggttt 19
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gacttcctgc cgacattatc a 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gggagacgac tggaatgg 18
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctatggagag gaggcgaaat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gcaccaactt cccgaaacta 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaaagcaaga actcgatccc a 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
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<400> 28
ggctcctttc tggagattca t 21
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcaagggact actgctctg 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cctcgcttcc gttcttgaaa 20
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<211> 24
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<213> 人工序列
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caccaagggt atcttctact tgac 24
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<211> 22
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<400> 32
cacgacgatt cgagatgatg tt 22
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccgactacgg cagcaattt 19
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<213> 人工序列
<400> 34
gtcagcaatt gcgatgcg 18
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gctagcacaa gcctctcg 18

Claims (9)

1.一种提高顶头孢霉生产头孢菌素C产量的方法，其特征在于，利用重组顶头孢霉工程菌提高头孢菌素C的产量，所述重组顶头孢霉工程菌是通过敲除顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因所得，所述Acaxl2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述顶头孢霉菌为顶头孢霉1-D1工业菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因为将所述顶头孢霉菌基因组上的Acaxl2基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的egfp基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组顶头孢霉工程菌在发酵中后期至发酵结束，直径为2-8 μm的节孢子的含量为70%至95%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组顶头孢霉工程菌的构建方法，包括步骤：
1）构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体；
2）构建同源修复片段；
3）将步骤1)所述基因敲除载体和步骤2)所述同源修复片段共转化至顶头孢霉1-D1工业菌株中，获得产头孢菌素C的重组顶头孢霉工程菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中的构建pAN7-Acaxl2基因敲除载体包括步骤：
1.1）、提供如SEQ ID NO.3所示的sgRNA靶序列，将所述sgRNA靶序列引入到序列如SEQID NO.4-SEQ ID NO.7所示的引物中；
1.2）、以pUC57为模板，进行PCR扩增，回收片段后进行融合PCR后获得可识别Acaxl2基因的特异性sgRNA片段Acaxl2-sgRNA；
1.3）、通过克隆连接的方法，将Acaxl2-sgRNA引入到CRISPR/cas9操作载体上，得到pAN7-Acaxl2质粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1.3）包括：
将pAN7-sorA质粒利用HindIII和SpeI进行双酶切，胶回收含cas9蛋白表达盒的大片段质粒骨架，与1.2中的Acaxl2-sgRNA片段一步克隆连接，构建pAN7-Acaxl2质粒。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的构建同源修复片段包括步骤：
2.1）、设计序列如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.11所示的引物，通过真菌基因组DNA提取试剂盒提取工业顶头孢霉1-D1的基因组，以所述基因组为模板，进行上下游同源臂的扩增；
2.2）、以pAN7-1-eGFP为模板，用序列如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13引物进行PCR扩增，得到egpf表达盒；
2.3）、将胶回收后的步骤2.1中的上下游同源臂与步骤2.2中的egpf表达盒进行三片段融合，获得同源修复片段B1-eGFP-B2。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法在生产头孢菌素C中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在10%的接种量，28℃，220 rpm摇瓶振荡培养72 h后，调温至25℃，培养至168 h发酵的发酵条件下，所述重组顶头孢霉工程菌的产量为2000-6000μg/ml。
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农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量;陈国枝等;《中国抗生素杂志》;20190731;第44卷(第7期);第805-810页 *

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