JPH09107977A - 新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 - Google Patents
新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法Info
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- JPH09107977A JPH09107977A JP8188203A JP18820396A JPH09107977A JP H09107977 A JPH09107977 A JP H09107977A JP 8188203 A JP8188203 A JP 8188203A JP 18820396 A JP18820396 A JP 18820396A JP H09107977 A JPH09107977 A JP H09107977A
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】配列表の配列番号：１、配列番号：２、配
列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択さ
れるＤＮＡ又はその一部であって、かつ、動物細胞にお
いてプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡと有用
遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする
組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含有するベクター、該
組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞、該ベクターで形
質転換されてなる動物細胞、該動物細胞を有する動物、
該ＤＮＡを用いた動物細胞によるタンパク質の製造方
法、有用遺伝子の発現方法。 【効果】本発明のＤＮＡ断片をプロモーターとして用い
ることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞において大
量に発現させることができる。
列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択さ
れるＤＮＡ又はその一部であって、かつ、動物細胞にお
いてプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡと有用
遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする
組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含有するベクター、該
組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞、該ベクターで形
質転換されてなる動物細胞、該動物細胞を有する動物、
該ＤＮＡを用いた動物細胞によるタンパク質の製造方
法、有用遺伝子の発現方法。 【効果】本発明のＤＮＡ断片をプロモーターとして用い
ることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞において大
量に発現させることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なプロモーター
および該プロモーターを用いた遺伝子発現方法に関す
る。更に詳しくは、動物細胞中で働き得る新規なプロモ
ーターを含むＤＮＡに関するものであり、また、該プロ
モーターの下流にタンパク質をコードする核酸を連結し
て得られるＤＮＡを含有するベクターを用いるタンパク
質の製造方法。更に、該プロモーターの下流に有用遺伝
子を連結し、得られたＤＮＡあるいは該ＤＮＡを含有す
るベクターを動物細胞に導入することによる有用遺伝子
の発現方法に関するものである。
および該プロモーターを用いた遺伝子発現方法に関す
る。更に詳しくは、動物細胞中で働き得る新規なプロモ
ーターを含むＤＮＡに関するものであり、また、該プロ
モーターの下流にタンパク質をコードする核酸を連結し
て得られるＤＮＡを含有するベクターを用いるタンパク
質の製造方法。更に、該プロモーターの下流に有用遺伝
子を連結し、得られたＤＮＡあるいは該ＤＮＡを含有す
るベクターを動物細胞に導入することによる有用遺伝子
の発現方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】動物由来の有用遺伝子産物を遺伝子工学
的に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物宿
主を用いると遺伝子が発現しなかったり、遺伝子産物で
ある蛋白が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正
しくなされない等の理由で活性を持たなかったりするこ
とがしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞
が宿主として用いられることが多く、この場合プロモー
ターの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻
繁に用いられてきた動物細胞用プロモーターとしては、
ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモー
ター、アクチンプロモーター等がある。
的に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物宿
主を用いると遺伝子が発現しなかったり、遺伝子産物で
ある蛋白が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正
しくなされない等の理由で活性を持たなかったりするこ
とがしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞
が宿主として用いられることが多く、この場合プロモー
ターの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻
繁に用いられてきた動物細胞用プロモーターとしては、
ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモー
ター、アクチンプロモーター等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】動物細胞を宿主として
有用遺伝子産物を大量に生産する場合、従来用いられて
きた動物細胞用プロモーターは転写活性の点で必ずしも
満足のいくものではなく、更に強力なプロモーターの開
発が待ち望まれている。従って、本発明の第１の目的
は、動物細胞用のプロモーターとして強力なプロモータ
ー活性を有するＤＮＡを提供することにある。本発明の
第２の目的は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮ
Ａと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結した組換えＤ
ＮＡを提供することにある。本発明の第３の目的は、本
発明の組換えＤＮＡを含有するベクターを提供すること
にある。本発明の第４の目的は、本発明の組換えＤＮＡ
を有する動物細胞および該動物細胞を有する動物を提供
することにある。本発明の第５の目的は、該プロモータ
ーを用いるタンパク質の製造方法を提供することにあ
る。本発明の第６の目的は、該プロモーターを用いる有
用遺伝子の発現方法を提供することにある。
有用遺伝子産物を大量に生産する場合、従来用いられて
きた動物細胞用プロモーターは転写活性の点で必ずしも
満足のいくものではなく、更に強力なプロモーターの開
発が待ち望まれている。従って、本発明の第１の目的
は、動物細胞用のプロモーターとして強力なプロモータ
ー活性を有するＤＮＡを提供することにある。本発明の
第２の目的は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮ
Ａと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結した組換えＤ
ＮＡを提供することにある。本発明の第３の目的は、本
発明の組換えＤＮＡを含有するベクターを提供すること
にある。本発明の第４の目的は、本発明の組換えＤＮＡ
を有する動物細胞および該動物細胞を有する動物を提供
することにある。本発明の第５の目的は、該プロモータ
ーを用いるタンパク質の製造方法を提供することにあ
る。本発明の第６の目的は、該プロモーターを用いる有
用遺伝子の発現方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、動物細胞
で高い転写効率を持つプロモーターを得る目的で鋭意研
究を続けたところ、ヒトのＮ−アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼＩＩＩ（ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝
子の上流に強力なプロモーターが存在することを見出し
た。このプロモーターを含むＤＮＡの塩基配列を決定
し、該ＤＮＡを西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流
に連結してルシフェラーゼ遺伝子の発現を行わしめたと
ころ、該プロモーターが従来知られている動物細胞用プ
ロモーターよりも遥かに強力なプロモーターであること
を確認した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を
進めて完成するに至ったものである。
で高い転写効率を持つプロモーターを得る目的で鋭意研
究を続けたところ、ヒトのＮ−アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼＩＩＩ（ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝
子の上流に強力なプロモーターが存在することを見出し
た。このプロモーターを含むＤＮＡの塩基配列を決定
し、該ＤＮＡを西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流
に連結してルシフェラーゼ遺伝子の発現を行わしめたと
ころ、該プロモーターが従来知られている動物細胞用プ
ロモーターよりも遥かに強力なプロモーターであること
を確認した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を
進めて完成するに至ったものである。
【０００５】即ち、本発明の要旨は、（１） 配列表の
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配
列番号：４からなる群より選択されるＤＮＡ又はその一
部であって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性
を有するＤＮＡ、（２） 前記（１）に記載のＤＮＡと
ハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、か
つ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮ
Ａ、（３） 前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡと有
用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とす
る組換えＤＮＡ、（４） 有用遺伝子がタンパク質をコ
ードする核酸、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮ
Ａ、デコイをコードする核酸、およびリボザイムからな
る群より選択される核酸であることを特徴とする前記
（３）記載の組換えＤＮＡ、（５） 前記（３）又は
（４）に記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
（６） ベクターがプラスミドベクター又はウイルスベ
クターであることを特徴とする前記（５）記載のベクタ
ー、（７） 前記（３）又は（４）に記載の組換えＤＮ
Ａを導入してなる動物細胞、（８） 前記（５）又は
（６）に記載のベクターで形質転換されてなる動物細
胞、（９） 前記（７）又は（８）に記載の動物細胞を
有する動物、（１０） 前記（１）又は（２）に記載の
ＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された動物細胞を培養し、次いで培養物から該
タンパク質を採取することを特徴とする動物細胞による
タンパク質の製造方法、（１１） 前記（１）又は
（２）に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に
連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、次
いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞
による有用遺伝子の発現方法、（１２） 前記（１）又
は（２）に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
動物細胞を形質転換し、次いでその動物細胞を培養する
ことを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方
法、に関する。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、および配
列番号：４からなる群より選択されるＤＮＡ又はその一
部であって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性
を有するＤＮＡ、（２） 前記（１）に記載のＤＮＡと
ハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、か
つ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮ
Ａ、（３） 前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡと有
用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とす
る組換えＤＮＡ、（４） 有用遺伝子がタンパク質をコ
ードする核酸、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮ
Ａ、デコイをコードする核酸、およびリボザイムからな
る群より選択される核酸であることを特徴とする前記
（３）記載の組換えＤＮＡ、（５） 前記（３）又は
（４）に記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
（６） ベクターがプラスミドベクター又はウイルスベ
クターであることを特徴とする前記（５）記載のベクタ
ー、（７） 前記（３）又は（４）に記載の組換えＤＮ
Ａを導入してなる動物細胞、（８） 前記（５）又は
（６）に記載のベクターで形質転換されてなる動物細
胞、（９） 前記（７）又は（８）に記載の動物細胞を
有する動物、（１０） 前記（１）又は（２）に記載の
ＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された動物細胞を培養し、次いで培養物から該
タンパク質を採取することを特徴とする動物細胞による
タンパク質の製造方法、（１１） 前記（１）又は
（２）に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に
連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、次
いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞
による有用遺伝子の発現方法、（１２） 前記（１）又
は（２）に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
動物細胞を形質転換し、次いでその動物細胞を培養する
ことを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方
法、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本明細書で言う「プロモーター」とは、転写開始
点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な
位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を
担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類
似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に
限定されるものではなく、この領域以外に、発現調整の
ためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合する
ために必要な領域を含んでいてもよい。また本明細書中
で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、これ
は本明細書で言うプロモーターを含む領域のことを示
す。
する。本明細書で言う「プロモーター」とは、転写開始
点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な
位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を
担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類
似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に
限定されるものではなく、この領域以外に、発現調整の
ためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合する
ために必要な領域を含んでいてもよい。また本明細書中
で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、これ
は本明細書で言うプロモーターを含む領域のことを示
す。
【０００７】本明細書で言う「プロモーター活性」と
は、プロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子
を連結し、宿主（動物細胞）に導入した際、宿主内また
は宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物を生産する能
力および機能を有することを示す。一般的に、プロモー
ターの下流に、定量が容易に行えるタンパク質をコード
する遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連
結させ、宿主に導入し、これらタンパク質の発現量を測
定することでプロモーターの有無や強弱をプロモーター
の活性として表す。このようにプロモーターの下流に発
現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主に導入した
際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産
物の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入し
た宿主においてプロモーター活性を有することになる。
は、プロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子
を連結し、宿主（動物細胞）に導入した際、宿主内また
は宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物を生産する能
力および機能を有することを示す。一般的に、プロモー
ターの下流に、定量が容易に行えるタンパク質をコード
する遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連
結させ、宿主に導入し、これらタンパク質の発現量を測
定することでプロモーターの有無や強弱をプロモーター
の活性として表す。このようにプロモーターの下流に発
現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主に導入した
際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産
物の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入し
た宿主においてプロモーター活性を有することになる。
【０００８】本明細書で言う「動物細胞」としてはヒト
由来の細胞が挙げられるが、本発明のプロモーターがそ
の動物細胞内においてプロモーター活性を有するもので
あれば特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外
の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブ
タ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類
（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ
等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類
（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類
（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マ
グロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サ
メ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。
由来の細胞が挙げられるが、本発明のプロモーターがそ
の動物細胞内においてプロモーター活性を有するもので
あれば特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外
の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブ
タ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類
（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ
等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類
（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類
（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マ
グロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サ
メ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。
【０００９】本明細書で言う「有用遺伝子」には、動物
細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、
動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又はアンチ
センスＲＮＡ、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク
質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配
列または類似の配列を持つデコイをコードする核酸、動
物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムが挙げられ
る。
細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、
動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又はアンチ
センスＲＮＡ、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク
質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配
列または類似の配列を持つデコイをコードする核酸、動
物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムが挙げられ
る。
【００１０】動物細胞において発現可能なタンパク質を
コードする核酸としては動物由来のものが挙げられる
が、本発明においてこれは限定されるものではなく、動
物細胞において発現可能であれば、細菌類、酵母類、放
線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来
のもの、あるいは植物、昆虫等の生物由来のものも本明
細書で言う有用遺伝子に含まれる。
コードする核酸としては動物由来のものが挙げられる
が、本発明においてこれは限定されるものではなく、動
物細胞において発現可能であれば、細菌類、酵母類、放
線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来
のもの、あるいは植物、昆虫等の生物由来のものも本明
細書で言う有用遺伝子に含まれる。
【００１１】本明細書で言う「デコイをコードする核
酸」とは、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質を
コードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列ま
たは類似の配列を持つＤＮＡを示し、これらを「おと
り」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑
制するものを言う。本明細書で言う「リボザイム」と
は、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをい
い、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものを言
う。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子
配列より設計可能であり、例えば、ハンマ−ヘッド型リ
ボザイムとしては、フェブス レター(FEBS Letter）、
第２２８巻、第２２８−２３０頁（１９８８）に記載の
方法が用いることができる。また、ハンマ−ヘッド型リ
ボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型
リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定の
タンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これら特定の
タンパク質の翻訳を阻害するものであれば本明細書で言
うリボザイムに含まれる。
酸」とは、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質を
コードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列ま
たは類似の配列を持つＤＮＡを示し、これらを「おと
り」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑
制するものを言う。本明細書で言う「リボザイム」と
は、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをい
い、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものを言
う。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子
配列より設計可能であり、例えば、ハンマ−ヘッド型リ
ボザイムとしては、フェブス レター(FEBS Letter）、
第２２８巻、第２２８−２３０頁（１９８８）に記載の
方法が用いることができる。また、ハンマ−ヘッド型リ
ボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型
リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定の
タンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、これら特定の
タンパク質の翻訳を阻害するものであれば本明細書で言
うリボザイムに含まれる。
【００１２】本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片の下流に有用遺伝子を有用遺伝子を発現可能な状態
で連結することにより、有用遺伝子の発現を増強するこ
とができる。即ち、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結してなる
組換えＤＮＡがベクターを介してまたはベクターを用い
ずに導入された動物細胞において、有用遺伝子が発現す
る。ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイ
ルスベクターが好ましく使用される。ベクターを使用し
ない場合には、ＤＮＡ断片を文献記載の方法で導入でき
る〔Virology,52, 456(1973), Molecular and Cellular
Biology, 7, 2745(1987), Journal ofthe National Ca
ncer Institute, 41, 351(1968), EMBO Journal, 1, 84
1(1982) 〕。
断片の下流に有用遺伝子を有用遺伝子を発現可能な状態
で連結することにより、有用遺伝子の発現を増強するこ
とができる。即ち、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結してなる
組換えＤＮＡがベクターを介してまたはベクターを用い
ずに導入された動物細胞において、有用遺伝子が発現す
る。ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイ
ルスベクターが好ましく使用される。ベクターを使用し
ない場合には、ＤＮＡ断片を文献記載の方法で導入でき
る〔Virology,52, 456(1973), Molecular and Cellular
Biology, 7, 2745(1987), Journal ofthe National Ca
ncer Institute, 41, 351(1968), EMBO Journal, 1, 84
1(1982) 〕。
【００１３】本発明のこのような組換えＤＮＡ断片を持
つ動物細胞およびこのような動物細胞を持つ動物も本発
明の範囲に含まれる。本発明により発現を増強すること
ができる有用遺伝子としては、前記のように例えばタン
パク質をコードするＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アン
チセンスＲＮＡ、デコイをコードするポリヌクレオチ
ド、デコイとして機能するヌクレオチド配列、リボザイ
ムなどが挙げられる。また、本発明は目的のタンパク質
を生産する方法、本発明のプロモーター活性を有するＤ
ＮＡ断片を使用する有用遺伝子の発現方法を開示してい
る。
つ動物細胞およびこのような動物細胞を持つ動物も本発
明の範囲に含まれる。本発明により発現を増強すること
ができる有用遺伝子としては、前記のように例えばタン
パク質をコードするＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アン
チセンスＲＮＡ、デコイをコードするポリヌクレオチ
ド、デコイとして機能するヌクレオチド配列、リボザイ
ムなどが挙げられる。また、本発明は目的のタンパク質
を生産する方法、本発明のプロモーター活性を有するＤ
ＮＡ断片を使用する有用遺伝子の発現方法を開示してい
る。
【００１４】即ち、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された動物細胞を培養し、培養物から該タンパ
ク質を採取するタンパク質の製造方法も本発明の範囲に
含まれる。同様に、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られ
る組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、培養することによ
る有用遺伝子の発現方法、あるいは該組換えＤＮＡを含
有するベクターで動物細胞を形質転換し、その動物細胞
を培養することによる動物細胞による有用遺伝子の発現
方法も本発明の範囲に含まれる。
ＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された動物細胞を培養し、培養物から該タンパ
ク質を採取するタンパク質の製造方法も本発明の範囲に
含まれる。同様に、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られ
る組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、培養することによ
る有用遺伝子の発現方法、あるいは該組換えＤＮＡを含
有するベクターで動物細胞を形質転換し、その動物細胞
を培養することによる動物細胞による有用遺伝子の発現
方法も本発明の範囲に含まれる。
【００１５】本発明のＤＮＡは、動物細胞用のプロモー
ター活性を有するものであり、配列表の配列番号：１で
示されるＤＮＡ配列の全部又はその一部を含むものであ
る。即ち、本発明のＤＮＡ断片は、新規なプロモーター
を含むＤＮＡ断片であり、該プロモーターを含む限り、
配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の中のいかなるＤＮ
Ａ断片であってもよく、あるいは、配列番号：１で示さ
れるＤＮＡ配列の一部を含むいかなるＤＮＡ断片であっ
てもよい。例えば、特に限定されるものではないが、配
列番号：２で示されるＤＮＡ断片、配列番号：３で示さ
れるＤＮＡ断片、および配列番号：４で示されるＤＮＡ
断片の全部又は一部、もしくはそれらを含有するＤＮＡ
断片等が挙げられる。また、これらのＤＮＡ断片とハイ
ブリダイズすることができるＤＮＡ断片であって、動物
細胞においてプロモーター活性を有するものも、本発明
のＤＮＡ断片に含まれる。
ター活性を有するものであり、配列表の配列番号：１で
示されるＤＮＡ配列の全部又はその一部を含むものであ
る。即ち、本発明のＤＮＡ断片は、新規なプロモーター
を含むＤＮＡ断片であり、該プロモーターを含む限り、
配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の中のいかなるＤＮ
Ａ断片であってもよく、あるいは、配列番号：１で示さ
れるＤＮＡ配列の一部を含むいかなるＤＮＡ断片であっ
てもよい。例えば、特に限定されるものではないが、配
列番号：２で示されるＤＮＡ断片、配列番号：３で示さ
れるＤＮＡ断片、および配列番号：４で示されるＤＮＡ
断片の全部又は一部、もしくはそれらを含有するＤＮＡ
断片等が挙げられる。また、これらのＤＮＡ断片とハイ
ブリダイズすることができるＤＮＡ断片であって、動物
細胞においてプロモーター活性を有するものも、本発明
のＤＮＡ断片に含まれる。
【００１６】本発明の動物細胞用のプロモーターは次の
ようにして発見されたものである。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ
遺伝子は、井原ら［ジャーナル オブ バイオケミスト
リー(Journal of Biochemistry）、第１１３巻、第６９
２〜６９８頁（１９９３年）］によって、胎児肝臓ｃＤ
ＮＡライブラリー及びゲノムコスミドライブラリーから
単離されているのでこれらを使用した。ヒトＧｎＴ−Ｉ
ＩＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンのうちＨ１５
とＨ２０（特開平６−６２８６５号公報）は５’非翻訳
領域を含んでおり、この領域のＤＮＡ配列は予想される
開始コドンの上流８塩基対を除いて異なっている。ゲノ
ムクローンとしてはコスミドＨｕｇ３とＨｕｇ５が得ら
れており、そのうちＨｕｇ３はＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の
コード領域とその上流約３５ｋｂを含んでいる。
ようにして発見されたものである。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ
遺伝子は、井原ら［ジャーナル オブ バイオケミスト
リー(Journal of Biochemistry）、第１１３巻、第６９
２〜６９８頁（１９９３年）］によって、胎児肝臓ｃＤ
ＮＡライブラリー及びゲノムコスミドライブラリーから
単離されているのでこれらを使用した。ヒトＧｎＴ−Ｉ
ＩＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンのうちＨ１５
とＨ２０（特開平６−６２８６５号公報）は５’非翻訳
領域を含んでおり、この領域のＤＮＡ配列は予想される
開始コドンの上流８塩基対を除いて異なっている。ゲノ
ムクローンとしてはコスミドＨｕｇ３とＨｕｇ５が得ら
れており、そのうちＨｕｇ３はＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の
コード領域とその上流約３５ｋｂを含んでいる。
【００１７】そこでＨ１５、Ｈ２０の各々の５’非翻訳
領域をプローブとしたＨｕｇ３コスミドクローンのサザ
ンハイブリダイゼーション、ＤＮＡ塩基配列の解析等を
行うことによって、Ｈ１５は開始コドンの上流約２９ｋ
ｂ（Ｈ１５エキソン−２）と１ｋｂ（Ｈ１５エキソン−
１）、またＨ２０は開始コドンの上流約２６ｋｂ（Ｈ２
０エキソン−１）にエキソンを持つことが明らかとなっ
た。また、ヒト脳由来ｍＲＮＡを鋳型としてＧｎＴ−Ｉ
ＩＩ遺伝子特異的なプライマーを用いて５’−ラピッド
アンプリフィケーション オブ ｃＤＮＡ エンド
（ＲＡＣＥ）を行ったところ、Ｈ１５とＨ２０ではスプ
ライシングが行われている開始コドンの上流７塩基対の
部位でスプライシングが行われていないｍＲＮＡが存在
することが判明した。このｍＲＮＡから得られたｃＤＮ
ＡをＨ２０４と呼ぶ。
領域をプローブとしたＨｕｇ３コスミドクローンのサザ
ンハイブリダイゼーション、ＤＮＡ塩基配列の解析等を
行うことによって、Ｈ１５は開始コドンの上流約２９ｋ
ｂ（Ｈ１５エキソン−２）と１ｋｂ（Ｈ１５エキソン−
１）、またＨ２０は開始コドンの上流約２６ｋｂ（Ｈ２
０エキソン−１）にエキソンを持つことが明らかとなっ
た。また、ヒト脳由来ｍＲＮＡを鋳型としてＧｎＴ−Ｉ
ＩＩ遺伝子特異的なプライマーを用いて５’−ラピッド
アンプリフィケーション オブ ｃＤＮＡ エンド
（ＲＡＣＥ）を行ったところ、Ｈ１５とＨ２０ではスプ
ライシングが行われている開始コドンの上流７塩基対の
部位でスプライシングが行われていないｍＲＮＡが存在
することが判明した。このｍＲＮＡから得られたｃＤＮ
ＡをＨ２０４と呼ぶ。
【００１８】これらの結果から、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺
伝子転写産物は少なくとも３種類からなることが明らか
にされた。Ｈ１５、Ｈ２０、Ｈ２０４の転写に関わるプ
ロモーターは各々Ｈ１５エキソン−２の上流域、Ｈ２０
エキソン−１の上流域、および予想される翻訳開始点の
ゲノム上での上流域に存在すると考えられるので、西洋
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として
これらの領域を含むＤＮＡ断片のＣＯＳ１細胞における
プロモーター活性を測定したところ、図１（図中、ボッ
クス表示がエキソン部分で、破線がイントロン部分を示
す）に示すようにＨ１５エキソン−２内部のHind III部
位からＨ２０エキソン−１内部のSac II部位までを含む
Ｈ２０上流域約３ｋｂ断片（これを含むプラスミドをｐ
ＰＧ２０Ｂと呼ぶ）にはプロモーター活性は検出できな
かった。しかし、Ｈ１５上流域のEcoR I部位からＨ１５
エキソン−２内部のHind III部位の一部を含む約３ｋｂ
断片（これを含むプラスミドをｐＰＧ１５と呼ぶ）およ
びコード域上流のSph I 部位からコード域内部のNae I
部位までを含む約１．１ｋｂ断片（これを含むプラスミ
ドをｐＰＧ２０４−１．１と呼ぶ）、即ちＨ２０４を含
む断片にはプロモーター活性があり、後者は前者よりも
約１０倍、またＳＶ４０プロモーターよりも約１．５倍
強い活性を有することが分かった。
伝子転写産物は少なくとも３種類からなることが明らか
にされた。Ｈ１５、Ｈ２０、Ｈ２０４の転写に関わるプ
ロモーターは各々Ｈ１５エキソン−２の上流域、Ｈ２０
エキソン−１の上流域、および予想される翻訳開始点の
ゲノム上での上流域に存在すると考えられるので、西洋
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として
これらの領域を含むＤＮＡ断片のＣＯＳ１細胞における
プロモーター活性を測定したところ、図１（図中、ボッ
クス表示がエキソン部分で、破線がイントロン部分を示
す）に示すようにＨ１５エキソン−２内部のHind III部
位からＨ２０エキソン−１内部のSac II部位までを含む
Ｈ２０上流域約３ｋｂ断片（これを含むプラスミドをｐ
ＰＧ２０Ｂと呼ぶ）にはプロモーター活性は検出できな
かった。しかし、Ｈ１５上流域のEcoR I部位からＨ１５
エキソン−２内部のHind III部位の一部を含む約３ｋｂ
断片（これを含むプラスミドをｐＰＧ１５と呼ぶ）およ
びコード域上流のSph I 部位からコード域内部のNae I
部位までを含む約１．１ｋｂ断片（これを含むプラスミ
ドをｐＰＧ２０４−１．１と呼ぶ）、即ちＨ２０４を含
む断片にはプロモーター活性があり、後者は前者よりも
約１０倍、またＳＶ４０プロモーターよりも約１．５倍
強い活性を有することが分かった。
【００１９】さらに、この１．１ｋｂ断片内にはNae I
部位から約０．８ｋｂの位置にXhoI 部位、約０．５ｋ
ｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHinc II 部
位があり、ｐＰＧ２０４−１．１をこれらの制限酵素の
いずれか一つと、ベクターのマルチプルクローニングサ
イトに切断部位を持つBam HIで消化するとＧｎＴ−ＩＩ
Ｉ開始コドンを含む、０．８ｋｂ断片（断片Ａと呼
ぶ）、０．５ｋｂ断片（断片Ｂと呼ぶ）、及び０．２ｋ
ｂ断片（断片Ｃと呼ぶ）を切り出すことができる。これ
らの断片は上記の１．１ｋｂ断片よりもプロモーター活
性が２〜３倍も強く、ＳＶ４０プロモーターよりも３〜
５倍も強いプロモーター活性を有することが分かった。
このようにして、本発明者らは、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺
伝子のコード域上流約０．２〜約１ｋｂを含むＤＮＡ断
片が強いプロモーター活性を持つことを明らかにし、本
発明に到達するに至った。以下に本発明のＤＮＡ断片の
取得方法について詳細に説明する。
部位から約０．８ｋｂの位置にXhoI 部位、約０．５ｋ
ｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHinc II 部
位があり、ｐＰＧ２０４−１．１をこれらの制限酵素の
いずれか一つと、ベクターのマルチプルクローニングサ
イトに切断部位を持つBam HIで消化するとＧｎＴ−ＩＩ
Ｉ開始コドンを含む、０．８ｋｂ断片（断片Ａと呼
ぶ）、０．５ｋｂ断片（断片Ｂと呼ぶ）、及び０．２ｋ
ｂ断片（断片Ｃと呼ぶ）を切り出すことができる。これ
らの断片は上記の１．１ｋｂ断片よりもプロモーター活
性が２〜３倍も強く、ＳＶ４０プロモーターよりも３〜
５倍も強いプロモーター活性を有することが分かった。
このようにして、本発明者らは、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺
伝子のコード域上流約０．２〜約１ｋｂを含むＤＮＡ断
片が強いプロモーター活性を持つことを明らかにし、本
発明に到達するに至った。以下に本発明のＤＮＡ断片の
取得方法について詳細に説明する。
【００２０】（１）動物細胞においてプロモーター活性
を有するＤＮＡ断片の塩基配列 ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の上流部を含むゲノムコスミ
ドクローン、例えば井原らのコスミドクローンＨｕｇ３
を制限酵素Sph I とNae I （ともに宝酒造社製）で切断
し、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする領域のすぐ上流を含む
１．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離する。このＤＮＡ断片は
配列番号：１に示す塩基配列を有する。この断片を有用
遺伝子との連結等の目的に使用しやすいようにプラスミ
ドベクター、たとえば、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサ
ブクローニングする。
を有するＤＮＡ断片の塩基配列 ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の上流部を含むゲノムコスミ
ドクローン、例えば井原らのコスミドクローンＨｕｇ３
を制限酵素Sph I とNae I （ともに宝酒造社製）で切断
し、ＧｎＴ−ＩＩＩをコードする領域のすぐ上流を含む
１．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離する。このＤＮＡ断片は
配列番号：１に示す塩基配列を有する。この断片を有用
遺伝子との連結等の目的に使用しやすいようにプラスミ
ドベクター、たとえば、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）にサ
ブクローニングする。
【００２１】サブクローニングされた１．１ｋｂSph I
−Nae I 断片（ｐＨｕｇ５’−２０４）の塩基配列は、
例えばジデオキシ法［プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ
ＵＳＡ(Proceeding of theNational Academy of Scie
nces of the USA）、第７４巻、第５４６３頁（１９７
７）］によって決定可能である。一般に１．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列を１回の反応で決定することは困難
なので、適当な制限酵素でさらに細分化し、サブクロー
ニングしてジデオキシ反応を行う方法、エクソヌクレア
ーゼＩＩＩで一連の欠失プラスミドを作製してからジデ
オキシ反応を行う方法、決定された配列をもとに順にプ
ライマーを合成してジデオキシ反応を行う方法等を用い
ることができる。本発明では、制限酵素としてBst XI、
Xho I 、Ssp I 、Kpn I 、Hinc II を用いて細分化し
（ｐＨｕｇ５’−２０４の挿入断片の制限酵素地図を図
２に示す）、サブクローニングしてジデオキシ反応を行
うことによってｐＨｕｇ５’−２０４の塩基配列を配列
表の配列番号：１に示すように決定した。
−Nae I 断片（ｐＨｕｇ５’−２０４）の塩基配列は、
例えばジデオキシ法［プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ
ＵＳＡ(Proceeding of theNational Academy of Scie
nces of the USA）、第７４巻、第５４６３頁（１９７
７）］によって決定可能である。一般に１．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列を１回の反応で決定することは困難
なので、適当な制限酵素でさらに細分化し、サブクロー
ニングしてジデオキシ反応を行う方法、エクソヌクレア
ーゼＩＩＩで一連の欠失プラスミドを作製してからジデ
オキシ反応を行う方法、決定された配列をもとに順にプ
ライマーを合成してジデオキシ反応を行う方法等を用い
ることができる。本発明では、制限酵素としてBst XI、
Xho I 、Ssp I 、Kpn I 、Hinc II を用いて細分化し
（ｐＨｕｇ５’−２０４の挿入断片の制限酵素地図を図
２に示す）、サブクローニングしてジデオキシ反応を行
うことによってｐＨｕｇ５’−２０４の塩基配列を配列
表の配列番号：１に示すように決定した。
【００２２】この１．１ｋｂ断片内には図２に示すよう
にNae I 部位から約０．８ｋｂの位置にXho I 部位、約
０．５ｋｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHi
nc II 部位があり、ｐＨｕｇ５’−２０４をこれらの制
限酵素のいずれか一つと、ベクターのマルチプルクロー
ニングサイトに切断部位を持つBam HIで消化することに
より、いずれもＧｎＴ−ＩＩＩ開始コドンを含む、配列
表の配列番号：２に示す０．８ｋｂ断片（断片Ａ）、配
列番号：３に示す０．５ｋｂ断片（断片Ｂ）、及び配列
番号：４に示す０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を切り出すこ
とができる。
にNae I 部位から約０．８ｋｂの位置にXho I 部位、約
０．５ｋｂの位置にSsp I 部位、０．２ｋｂの位置にHi
nc II 部位があり、ｐＨｕｇ５’−２０４をこれらの制
限酵素のいずれか一つと、ベクターのマルチプルクロー
ニングサイトに切断部位を持つBam HIで消化することに
より、いずれもＧｎＴ−ＩＩＩ開始コドンを含む、配列
表の配列番号：２に示す０．８ｋｂ断片（断片Ａ）、配
列番号：３に示す０．５ｋｂ断片（断片Ｂ）、及び配列
番号：４に示す０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を切り出すこ
とができる。
【００２３】（２）本発明のプロモーターを含むＤＮＡ
断片の調製 上記のコスミドまたはプラスミドから制限酵素Sph I と
Nae I （ともに宝酒造社製）で消化して切り出し、ある
いはさらにXho I 、Ssp I 、Hinc II 等の制限酵素で消
化して切り出すのが最も容易な調製法である。その他、
他の制限酵素で消化する方法、超音波処理による方法、
ホスホルアミダイト法で化学合成する方法、ポリメラー
ゼ連鎖反応法等を利用して調製する方法等も利用でき
る。例えば、配列番号：１等のＤＮＡ配列から適宜プラ
イマーを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応法により所望の
ＤＮＡ断片を容易に調製することができる。
断片の調製 上記のコスミドまたはプラスミドから制限酵素Sph I と
Nae I （ともに宝酒造社製）で消化して切り出し、ある
いはさらにXho I 、Ssp I 、Hinc II 等の制限酵素で消
化して切り出すのが最も容易な調製法である。その他、
他の制限酵素で消化する方法、超音波処理による方法、
ホスホルアミダイト法で化学合成する方法、ポリメラー
ゼ連鎖反応法等を利用して調製する方法等も利用でき
る。例えば、配列番号：１等のＤＮＡ配列から適宜プラ
イマーを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応法により所望の
ＤＮＡ断片を容易に調製することができる。
【００２４】本発明のプロモーターの塩基配列を利用す
るハイブリダイゼーション法により、他の細胞由来の遺
伝子から本発明のプロモーターを得ることもできる。こ
の場合は、例えば以下の方法が適用できる。まず他の細
胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従いプラス
ミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライ
ブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で
培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロ
ースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡ
を膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識した
プローブ（プローブとしては、配列表の配列番号：１に
記載したＤＮＡ断片、またはその一部、例えば断片Ａ
（配列番号：２）、断片Ｂ（配列番号：３）、または断
片Ｃ（配列番号：４）等が使用できる）を含む溶液中で
保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッド
を形成させる。
るハイブリダイゼーション法により、他の細胞由来の遺
伝子から本発明のプロモーターを得ることもできる。こ
の場合は、例えば以下の方法が適用できる。まず他の細
胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従いプラス
ミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライ
ブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で
培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロ
ースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡ
を膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識した
プローブ（プローブとしては、配列表の配列番号：１に
記載したＤＮＡ断片、またはその一部、例えば断片Ａ
（配列番号：２）、断片Ｂ（配列番号：３）、または断
片Ｃ（配列番号：４）等が使用できる）を含む溶液中で
保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッド
を形成させる。
【００２５】例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳ
Ｃ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μ
ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液
中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着
を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブ
とハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作
をハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り
返す。こうして得られたクローンの中には、目的のプロ
モーターをコードするＤＮＡが挿入されている。
Ｃ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μ
ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液
中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着
を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブ
とハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作
をハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り
返す。こうして得られたクローンの中には、目的のプロ
モーターをコードするＤＮＡが挿入されている。
【００２６】得られた遺伝子は、例えば次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のプロモーターで
あるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダイゼ
ーションにより得られたクローンの場合、組換体が大腸
菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に
従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を
取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニン
グし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体
がファージの場合も基本的に同様のステップにより塩基
配列を決定することが出来る。これら培養から塩基配列
決定までの基本的な操作法については、例えば、モレキ
ュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル
(Molecular Cloning A Laboratory Manual）、第２版、
Ｔ．マニアティス(T. Maniatis）、第１章、第９０〜１
０４頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー
社、１９８９年発行に記載されているとおりに行うこと
ができる。
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のプロモーターで
あるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダイゼ
ーションにより得られたクローンの場合、組換体が大腸
菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に
従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を
取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニン
グし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体
がファージの場合も基本的に同様のステップにより塩基
配列を決定することが出来る。これら培養から塩基配列
決定までの基本的な操作法については、例えば、モレキ
ュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル
(Molecular Cloning A Laboratory Manual）、第２版、
Ｔ．マニアティス(T. Maniatis）、第１章、第９０〜１
０４頁、コールド スプリングハーバー ラボラトリー
社、１９８９年発行に記載されているとおりに行うこと
ができる。
【００２７】得られた遺伝子が目的のプロモーターであ
るかどうかは、決定された塩基配列を本発明のプロモー
ターと比較してその相同性から推定することができる。
得られた遺伝子がプロモーターの全てを含まないと考え
られる場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡ
プライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅
したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更に
ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、本発明のプロモーターにハ
イブリダイズするプロモーターの全コード領域の塩基配
列を決定することができる。
るかどうかは、決定された塩基配列を本発明のプロモー
ターと比較してその相同性から推定することができる。
得られた遺伝子がプロモーターの全てを含まないと考え
られる場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡ
プライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅
したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更に
ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、本発明のプロモーターにハ
イブリダイズするプロモーターの全コード領域の塩基配
列を決定することができる。
【００２８】本発明の有用遺伝子の発現方法は、このよ
うにして得られる本発明のプロモーターの下流に有用遺
伝子を発現可能に連結して得られるＤＮＡ断片を動物細
胞に導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする
ものである。上記のようにして調製された本発明のプロ
モーターを含むＤＮＡ断片の下流に目的の有用遺伝子を
発現可能に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマ
ー法を利用することができる。ＤＮＡリガーゼにより連
結する場合は、例えば両者が同一の制限酵素部位を有す
るときはこの制限酵素で消化した後、例えばモレキュラ
ー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第
２版、Ｔ．マニアティス他著、第１章、第６２頁、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー社、１９８
９年発行に記載された反応緩衝液中で両方のＤＮＡ断片
を混合し、ＤＮＡリガーゼを加えることにより、また両
者が同一の制限酵素部位を有しないときは末端をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平滑末端化した後上
記のようにＤＮＡリガーゼで処理することにより連結す
る。一方、ホモポリマー法を用いる場合は、制限酵素で
直鎖状にしたベクターの３’末端にターミナルデオキシ
リボヌクレオチジルトランスフェラーゼとｄＧＴＰによ
ってポリＧ鎖を付加し、また、インサートＤＮＡの３’
末端には同様にポリＣ鎖を付加し、これらのポリＧ鎖と
ポリＣ鎖をアニールさせ、例えば塩化カルシウム法によ
り大腸菌に導入する［プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ
ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７頁（１９７８）］こと
により連結する。
うにして得られる本発明のプロモーターの下流に有用遺
伝子を発現可能に連結して得られるＤＮＡ断片を動物細
胞に導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする
ものである。上記のようにして調製された本発明のプロ
モーターを含むＤＮＡ断片の下流に目的の有用遺伝子を
発現可能に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマ
ー法を利用することができる。ＤＮＡリガーゼにより連
結する場合は、例えば両者が同一の制限酵素部位を有す
るときはこの制限酵素で消化した後、例えばモレキュラ
ー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第
２版、Ｔ．マニアティス他著、第１章、第６２頁、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー社、１９８
９年発行に記載された反応緩衝液中で両方のＤＮＡ断片
を混合し、ＤＮＡリガーゼを加えることにより、また両
者が同一の制限酵素部位を有しないときは末端をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）で平滑末端化した後上
記のようにＤＮＡリガーゼで処理することにより連結す
る。一方、ホモポリマー法を用いる場合は、制限酵素で
直鎖状にしたベクターの３’末端にターミナルデオキシ
リボヌクレオチジルトランスフェラーゼとｄＧＴＰによ
ってポリＧ鎖を付加し、また、インサートＤＮＡの３’
末端には同様にポリＣ鎖を付加し、これらのポリＧ鎖と
ポリＣ鎖をアニールさせ、例えば塩化カルシウム法によ
り大腸菌に導入する［プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ
ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７頁（１９７８）］こと
により連結する。
【００２９】本発明に使用できる目的の有用遺伝子とし
ては、例えばインターロイキン１〜１２遺伝子、インタ
ーフェロンα、β、γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コ
ロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質
転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織
プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝
子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。
ては、例えばインターロイキン１〜１２遺伝子、インタ
ーフェロンα、β、γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コ
ロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質
転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織
プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝
子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。
【００３０】上記のようにして得られる本発明のＤＮＡ
断片と有用遺伝子が連結したＤＮＡ断片は動物細胞用の
適当なベクターに組み込んで遺伝子発現用のプラスミド
を得ることができる。かかるベクターとしては、ｐＴＭ
［ヌクレイック アシッズリサーチ（Nucleic Acids Re
search）、１０巻、６７１５頁（１９８２）］、ｃｏｓ
２０２［ジ エンボ ジャーナル（The EMBO Journa
l）、第６巻、第３５５頁（１９８７）］、ｐ９１２０
３（Ｂ）［サイエンス(Science）、第２２８巻、第８１
０頁（１９８５）］、ＢＣＭＧＳＮｅｏ［ジャーナル
オブ エクスペリメンタル メディシン（Journal of E
xperimental Medicine）、第１７２巻、第９６９頁（１
９９０）］等が挙げられる。
断片と有用遺伝子が連結したＤＮＡ断片は動物細胞用の
適当なベクターに組み込んで遺伝子発現用のプラスミド
を得ることができる。かかるベクターとしては、ｐＴＭ
［ヌクレイック アシッズリサーチ（Nucleic Acids Re
search）、１０巻、６７１５頁（１９８２）］、ｃｏｓ
２０２［ジ エンボ ジャーナル（The EMBO Journa
l）、第６巻、第３５５頁（１９８７）］、ｐ９１２０
３（Ｂ）［サイエンス(Science）、第２２８巻、第８１
０頁（１９８５）］、ＢＣＭＧＳＮｅｏ［ジャーナル
オブ エクスペリメンタル メディシン（Journal of E
xperimental Medicine）、第１７２巻、第９６９頁（１
９９０）］等が挙げられる。
【００３１】得られた遺伝子発現用のプラスミドは、リ
ン酸カルシウム法［モレキュラーアンド セルラー バ
イオロジー（Molecular and Cellular Biology）、第７
巻、第２７４５頁（１９８７）］、電気穿孔法［プロシ
ーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８１巻、第７１
６１頁（１９８４）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［メ
ソッズ イン ヌクレイック アシッズ リサーチ（Me
thods in Nucleic Acids Research)、第２８３頁、カラ
ムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行］、リポソーム
法［バイオテクニークス（BioTechniques)、第６巻、第
６８２頁（１９８９）］等によって適当な宿主細胞に導
入することができる。かかる宿主細胞としては、ＣＯＳ
１細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ−２１細胞、ＢＨＫ−２
１細胞等が挙げられる。得られた形質転換細胞を適当な
培地で培養することにより、目的の有用遺伝子産物を効
率よく製造することができる。
ン酸カルシウム法［モレキュラーアンド セルラー バ
イオロジー（Molecular and Cellular Biology）、第７
巻、第２７４５頁（１９８７）］、電気穿孔法［プロシ
ーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８１巻、第７１
６１頁（１９８４）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［メ
ソッズ イン ヌクレイック アシッズ リサーチ（Me
thods in Nucleic Acids Research)、第２８３頁、カラ
ムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行］、リポソーム
法［バイオテクニークス（BioTechniques)、第６巻、第
６８２頁（１９８９）］等によって適当な宿主細胞に導
入することができる。かかる宿主細胞としては、ＣＯＳ
１細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ−２１細胞、ＢＨＫ−２
１細胞等が挙げられる。得られた形質転換細胞を適当な
培地で培養することにより、目的の有用遺伝子産物を効
率よく製造することができる。
【００３２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
【００３３】実施例１ 井原らによって報告されているＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子
［ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１３
巻、第６９２頁（１９９３）］を含むゲノム領域が挿入
されたコスミドクローンＨｕｇ３を制限酵素Sph I とNa
e I （ともに宝酒造社製）で消化し、アガロースゲル電
気泳動を行った。ゲルから１．１ｋｂの断片を切り出
し、イージートラップ（EASYTRAPTM、宝酒造社製）を用
いてＤＮＡを回収し、この断片をSph I とHinc II で消
化したｐＵＣ１９とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、
塩化カルシウム法によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導
入した。得られたアンピシリン耐性菌のコロニーを拾い
あげて培養し、その菌体からアルカリ法によってプラス
ミドを調製した。ｐＵＣ１９のマルチプルクローニング
サイトにはHind III部位、Sph I 部位、Hinc II 部位、
Bam HI部位がこの順に互いに近接して並んでいた。プラ
スミドをBam HIとHind IIIで二重消化した後、アガロー
スゲル電気泳動において、１．１ｋｂのHind III−Bam
HI断片を持つことを確認（この断片の塩基配列は配列番
号：１に示される配列であった）した後、該プラスミド
をプラスミドｐＨｕｇ５’−２０４とした。該プラスミ
ドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した後、Escher
ichia coli XL1-Blue/pHug5'-204（工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５３２として寄託
されている）を得た。
［ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１３
巻、第６９２頁（１９９３）］を含むゲノム領域が挿入
されたコスミドクローンＨｕｇ３を制限酵素Sph I とNa
e I （ともに宝酒造社製）で消化し、アガロースゲル電
気泳動を行った。ゲルから１．１ｋｂの断片を切り出
し、イージートラップ（EASYTRAPTM、宝酒造社製）を用
いてＤＮＡを回収し、この断片をSph I とHinc II で消
化したｐＵＣ１９とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、
塩化カルシウム法によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導
入した。得られたアンピシリン耐性菌のコロニーを拾い
あげて培養し、その菌体からアルカリ法によってプラス
ミドを調製した。ｐＵＣ１９のマルチプルクローニング
サイトにはHind III部位、Sph I 部位、Hinc II 部位、
Bam HI部位がこの順に互いに近接して並んでいた。プラ
スミドをBam HIとHind IIIで二重消化した後、アガロー
スゲル電気泳動において、１．１ｋｂのHind III−Bam
HI断片を持つことを確認（この断片の塩基配列は配列番
号：１に示される配列であった）した後、該プラスミド
をプラスミドｐＨｕｇ５’−２０４とした。該プラスミ
ドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した後、Escher
ichia coli XL1-Blue/pHug5'-204（工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５３２として寄託
されている）を得た。
【００３４】次いで、ｐＨｕｇ５’−２０４をBam HIと
Hind IIIで消化し、１．１ｋｂ断片をアガロースゲルか
らイージートラップを用いて回収し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）によって末端を平滑化した。一
方、プロモーターを欠いた西洋ホタルルシフェラーゼ遺
伝子、ＳＶ４０エンハンサー、大腸菌の複製開始点及び
アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドであるエンハ
ンサーベクター（東洋インキ社製）を西洋ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子のすぐ上流に位置するSma I 部位で消化
し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによって先に回収した１．１
ｋｂ断片と連結した後塩化カルシウム法によって大腸菌
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。
Hind IIIで消化し、１．１ｋｂ断片をアガロースゲルか
らイージートラップを用いて回収し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）によって末端を平滑化した。一
方、プロモーターを欠いた西洋ホタルルシフェラーゼ遺
伝子、ＳＶ４０エンハンサー、大腸菌の複製開始点及び
アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドであるエンハ
ンサーベクター（東洋インキ社製）を西洋ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子のすぐ上流に位置するSma I 部位で消化
し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによって先に回収した１．１
ｋｂ断片と連結した後塩化カルシウム法によって大腸菌
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。
【００３５】１．１ｋｂ断片の挿入の向きを調べる目的
でアンピシリン耐性菌からアルカリ法でプラスミドを調
製し、Xho I で消化してアガロースゲル電気泳動を行っ
た。制限酵素地図から１．１ｋｂ断片が西洋ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子と同じ向きに挿入されていれば０．８
ｋｂ断片が、逆向きに挿入されていれば０．３ｋｂ断片
が観察されると予想されるので、０．８ｋｂXho I 断片
を持つプラスミドを選び出すことによってｐＰＧ２０４
−１．１を得た。
でアンピシリン耐性菌からアルカリ法でプラスミドを調
製し、Xho I で消化してアガロースゲル電気泳動を行っ
た。制限酵素地図から１．１ｋｂ断片が西洋ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子と同じ向きに挿入されていれば０．８
ｋｂ断片が、逆向きに挿入されていれば０．３ｋｂ断片
が観察されると予想されるので、０．８ｋｂXho I 断片
を持つプラスミドを選び出すことによってｐＰＧ２０４
−１．１を得た。
【００３６】１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地［１％バクトトリプトン、０．５％バクトイース
トエキストラクト（共にディフコ社製）、０．５％Ｎａ
Ｃｌ］が２００ｍｌ入った２リットル容三角フラスコに
ｐＰＧ２０４−１．１を保持する大腸菌を接種し、３７
℃で１晩振盪培養し、モレキュラー アンド セルラー
バイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１９８７）に
記載の塩化セシウム平衡密度勾配遠心法によってプラス
ミドを調製した。１０ｃｍペトリディッシュ１枚当たり
２０μｇのｐＰＧ２０４−１．１をモレキュラー アン
ド セルラーバイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１
９８７）に記載のリン酸カルシウム法でＣＯＳ１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）にトランスフェクトし
た。
Ｂ培地［１％バクトトリプトン、０．５％バクトイース
トエキストラクト（共にディフコ社製）、０．５％Ｎａ
Ｃｌ］が２００ｍｌ入った２リットル容三角フラスコに
ｐＰＧ２０４−１．１を保持する大腸菌を接種し、３７
℃で１晩振盪培養し、モレキュラー アンド セルラー
バイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１９８７）に
記載の塩化セシウム平衡密度勾配遠心法によってプラス
ミドを調製した。１０ｃｍペトリディッシュ１枚当たり
２０μｇのｐＰＧ２０４−１．１をモレキュラー アン
ド セルラーバイオロジー、第７巻、第２７４５頁（１
９８７）に記載のリン酸カルシウム法でＣＯＳ１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）にトランスフェクトし
た。
【００３７】トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞のル
シフェラーゼ活性は、ピッカジーンキット（東洋インキ
社製）を用い、キットの説明書の指示に従って測定し
た。トランスフェクションの４８時間後にキットの細胞
溶解液０．７ｍｌに細胞を懸濁し、その上清２０μｌと
発光基質１００μｌを混合してただちに液体シンチレー
ションカウンターで発光強度を測定した。ポジティブコ
ントロールとしてキットに含まれるコントロールベクタ
ー（ＳＶ４０プロモーター）、ネガティブコントロール
としてエンハンサーベクターでトランスフェクトした細
胞を用いた。
シフェラーゼ活性は、ピッカジーンキット（東洋インキ
社製）を用い、キットの説明書の指示に従って測定し
た。トランスフェクションの４８時間後にキットの細胞
溶解液０．７ｍｌに細胞を懸濁し、その上清２０μｌと
発光基質１００μｌを混合してただちに液体シンチレー
ションカウンターで発光強度を測定した。ポジティブコ
ントロールとしてキットに含まれるコントロールベクタ
ー（ＳＶ４０プロモーター）、ネガティブコントロール
としてエンハンサーベクターでトランスフェクトした細
胞を用いた。
【００３８】その結果、本発明のＤＮＡ断片を用いたも
の（ｐＰＧ２０４−１．１）は、ＳＶ４０プロモーター
よりも遙かに強いプロモーター活性をもっていた。
の（ｐＰＧ２０４−１．１）は、ＳＶ４０プロモーター
よりも遙かに強いプロモーター活性をもっていた。
【００３９】 相対発光強度（％） エンハンサーベクター ０．４ ＳＶ４０プロモーター １００ ｐＰＧ２０４−１．１ １５６
【００４０】実施例２ ｐＨｕｇ５’−２０４をXho I で消化し、ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポ
リメラーゼによって末端を平滑化し、更にBamHIで消化
してアガロースゲル電気泳動の後、０．８ｋｂ断片（断
片Ａ）をイージートラップを用いて回収した。また、ｐ
Ｈｕｇ５’−２０４をSsp I とBam HIで消化して０．５
ｋｂ断片（断片Ｂ）、及びHinc II とBam HIで消化して
０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を断片Ａと同様に回収した。
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ存在下、Ｔ４−ＤＮＡポ
リメラーゼによって末端を平滑化し、更にBamHIで消化
してアガロースゲル電気泳動の後、０．８ｋｂ断片（断
片Ａ）をイージートラップを用いて回収した。また、ｐ
Ｈｕｇ５’−２０４をSsp I とBam HIで消化して０．５
ｋｂ断片（断片Ｂ）、及びHinc II とBam HIで消化して
０．２ｋｂ断片（断片Ｃ）を断片Ａと同様に回収した。
【００４１】断片Ａは配列番号：１のＤＮＡ断片の第３
００番目のＣから第１１１６番目のＣまでの８１７ｂｐ
のＤＮＡ断片であり、断片Ｂは配列番号：１のＤＮＡ断
片の第５９５番目のＡから第１１１６番目のＣまでの５
２２ｂｐのＤＮＡ断片であり、断片Ｃは配列番号：１の
ＤＮＡ断片の第９１７番目のＧから第１１１６番目のＣ
までの２００ｂｐのＤＮＡ断片である。断片Ａ、断片
Ｂ、または断片ＣをSmaI とBam HIで消化したエンハン
サーベクターと連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入
した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、ScaI とHind IIIで切断して目的の断片が
挿入されていることを確認した。即ち、断片Ａが挿入さ
れていると２．０ｋｂ、断片Ｂが挿入されていると１．
７ｋｂ、断片Ｃが挿入されていると１．４ｋｂの断片が
見られる。このようにして断片Ａを持つｐＰＧ２０４−
０．８、断片Ｂを持つｐＰＧ２０４−０．５、及び断片
Ｃを持つｐＰＧ２０４−０．２を得た。
００番目のＣから第１１１６番目のＣまでの８１７ｂｐ
のＤＮＡ断片であり、断片Ｂは配列番号：１のＤＮＡ断
片の第５９５番目のＡから第１１１６番目のＣまでの５
２２ｂｐのＤＮＡ断片であり、断片Ｃは配列番号：１の
ＤＮＡ断片の第９１７番目のＧから第１１１６番目のＣ
までの２００ｂｐのＤＮＡ断片である。断片Ａ、断片
Ｂ、または断片ＣをSmaI とBam HIで消化したエンハン
サーベクターと連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入
した。得られたアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、ScaI とHind IIIで切断して目的の断片が
挿入されていることを確認した。即ち、断片Ａが挿入さ
れていると２．０ｋｂ、断片Ｂが挿入されていると１．
７ｋｂ、断片Ｃが挿入されていると１．４ｋｂの断片が
見られる。このようにして断片Ａを持つｐＰＧ２０４−
０．８、断片Ｂを持つｐＰＧ２０４−０．５、及び断片
Ｃを持つｐＰＧ２０４−０．２を得た。
【００４２】ｐＰＧ２０４−０．８、ｐＰＧ２０４−
０．５、及びｐＰＧ２０４−０．２を保持する大腸菌か
ら実施例１と同様に塩化セシウム平衡密度勾配遠心法で
プラスミドを調製し、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェク
トした。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞抽出物
のルシフェラーゼ活性を実施例１と同様の方法で測定し
た。但し、発光強度はルミノメーター（ＬＢ ９５０
１、ベルトールド社製）で測定した。その結果、縮小化
した断片は１．１ｋｂのSph I −Nae I 断片に比べて２
倍〜３倍のプロモーター活性を有していた。
０．５、及びｐＰＧ２０４−０．２を保持する大腸菌か
ら実施例１と同様に塩化セシウム平衡密度勾配遠心法で
プラスミドを調製し、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェク
トした。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞抽出物
のルシフェラーゼ活性を実施例１と同様の方法で測定し
た。但し、発光強度はルミノメーター（ＬＢ ９５０
１、ベルトールド社製）で測定した。その結果、縮小化
した断片は１．１ｋｂのSph I −Nae I 断片に比べて２
倍〜３倍のプロモーター活性を有していた。
【００４３】 相対発光強度（％） ｐＰＧ２０４−１．１ １００ ｐＰＧ２０４−０．８ ３１６ ｐＰＧ２０４−０．５ ３３３ ｐＰＧ２０４−０．２ ２１９
【００４４】
【発明の効果】本発明のＤＮＡ断片をプロモーターとし
て用いることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞にお
いて大量に発現させることができる。
て用いることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞にお
いて大量に発現させることができる。
【００４５】
配列番号：１ 配列の長さ：1116 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列： GCATGCGCCA CTACACTCAG CTACTTTGTA TTTTTAGTAG AGACAGGGTT TCACCATGTT 60 GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CCTGACCTTG TGATCTGCCC ACCTCGGCCT CCCAAAGTGC 120 TGGGATTATA GGCGTGAGCC ACTGCACTGG CCGACCTCAA ATTTTTATGC CTGGAGATTA 180 GTAAAGGGCA TGGAATAATG AAGGGGAACT TTTATTTTAT TTTGTTTTTG AGATAGGGTC 240 TCAGTCTGTT GTCCAGGCTG GGGCGCAGTG GTGCAATCAT GGCTCACTGC AGCCTCAACC 300 TCGAGGTCTC AAGTGATCCT CCCACCTCAC CTCAGCCTCC TAAGTAGCTG GGACCACAAG 360 CACATGGCAC CACACCTGGC ACCACACCTG GCTAATTTTT AAATTTTCTG TAGAGATGGG 420 GTCTCACTAT GTTGTCCAGC TGGTCTCAAA CTCCTGGGCT CAAGTGATCC TCCTGCCTCA 480 GCCTCTGAAG GTGTTGGGAT TACAGGCGTG AGCACCACGC CTGGCCTAAT TTTATTCATT 540 AAATATGTTA GAATTAAGTG TTTTCCCTTG AGACCTGTGA GTTTTTCAGT GAAAAATATT 600 CAAAAGGTTT GTCAGTATGT CCATAAAAAA GAAGATAGGA GGGGAGGGAC AGGACCCAGG 660 AGGGCAGCCT ACAGCCTGCT CTCCCCGTTC TGTCCTGGGG CGGAGTCTGT ACTGCGAGTT 720 GAGCTTTTCC CAAGTCGTCA TGTTACTCCT GGAGCCAAGC CTAGCAGTGC AGCCTCACAG 780 TCAGGTTGGG GTGGTCCAGC GGAGAAGCAG GCTGCAGAGG GGGCAGGGTG GTGGCCTGGG 840 GATCTCAGGG AAGGGCTATG GGAGCACGGC GGTGTCCTCA GTGCTGGGGC TTTCAGGGGC 900 CTTGGTACCG CGAGTTGACT CTTGGGGGCA GGAGGTCACT CCATGCAGGG GCAGCAGGTG 960 CTGGCCACCA CATTGTCCAG CAAGGTGGCA GCAGAGGCCT CCTAGGTCCC CTTCCTAGGA 1020 AAGGAGCCTG GGCTGCCCTG ATGAGTCTCC TGTCTCTCTC TCTCCCGCAG GATGAAGATG 1080 AGACGCTACA AGCTCTTTCT CATGTTCTGT ATGGCC 1116
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：817 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列： CTCGAGGTCT CAAGTGATCC TCCCACCTCA CCTCAGCCTC CTAAGTAGCT GGGACCACAA 60 GCACATGGCA CCACACCTGG CACCACACCT GGCTAATTTT TAAATTTTCT GTAGAGATGG 120 GGTCTCACTA TGTTGTCCAG CTGGTCTCAA ACTCCTGGGC TCAAGTGATC CTCCTGCCTC 180 AGCCTCTGAA GGTGTTGGGA TTACAGGCGT GAGCACCACG CCTGGCCTAA TTTTATTCAT 240 TAAATATGTT AGAATTAAGT GTTTTCCCTT GAGACCTGTG AGTTTTTCAG TGAAAAATAT 300 TCAAAAGGTT TGTCAGTATG TCCATAAAAA AGAAGATAGG AGGGGAGGGA CAGGACCCAG 360 GAGGGCAGCC TACAGCCTGC TCTCCCCGTT CTGTCCTGGG GCGGAGTCTG TACTGCGAGT 420 TGAGCTTTTC CCAAGTCGTC ATGTTACTCC TGGAGCCAAG CCTAGCAGTG CAGCCTCACA 480 GTCAGGTTGG GGTGGTCCAG CGGAGAAGCA GGCTGCAGAG GGGGCAGGGT GGTGGCCTGG 540 GGATCTCAGG GAAGGGCTAT GGGAGCACGG CGGTGTCCTC AGTGCTGGGG CTTTCAGGGG 600 CCTTGGTACC GCGAGTTGAC TCTTGGGGGC AGGAGGTCAC TCCATGCAGG GGCAGCAGGT 660 GCTGGCCACC ACATTGTCCA GCAAGGTGGC AGCAGAGGCC TCCTAGGTCC CCTTCCTAGG 720 AAAGGAGCCT GGGCTGCCCT GATGAGTCTC CTGTCTCTCT CTCTCCCGCA GGATGAAGAT 780 GAGACGCTAC AAGCTCTTTC TCATGTTCTG TATGGCC 817
【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：522 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列： AATATTCAAA AGGTTTGTCA GTATGTCCAT AAAAAAGAAG ATAGGAGGGG AGGGACAGGA 60 CCCAGGAGGG CAGCCTACAG CCTGCTCTCC CCGTTCTGTC CTGGGGCGGA GTCTGTACTG 120 CGAGTTGAGC TTTTCCCAAG TCGTCATGTT ACTCCTGGAG CCAAGCCTAG CAGTGCAGCC 180 TCACAGTCAG GTTGGGGTGG TCCAGCGGAG AAGCAGGCTG CAGAGGGGGC AGGGTGGTGG 240 CCTGGGGATC TCAGGGAAGG GCTATGGGAG CACGGCGGTG TCCTCAGTGC TGGGGCTTTC 300 AGGGGCCTTG GTACCGCGAG TTGACTCTTG GGGGCAGGAG GTCACTCCAT GCAGGGGCAG 360 CAGGTGCTGG CCACCACATT GTCCAGCAAG GTGGCAGCAG AGGCCTCCTA GGTCCCCTTC 420 CTAGGAAAGG AGCCTGGGCT GCCCTGATGA GTCTCCTGTC TCTCTCTCTC CCGCAGGATG 480 AAGATGAGAC GCTACAAGCT CTTTCTCATG TTCTGTATGG CC 522
【００４８】配列番号：４ 配列の長さ：200 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列： GACTCTTGGG GGCAGGAGGT CACTCCATGC AGGGGCAGCA GGTGCTGGCC ACCACATTGT 60 CCAGCAAGGT GGCAGCAGAG GCCTCCTAGG TCCCCTTCCT AGGAAAGGAG CCTGGGCTGC 120 CCTGATGAGT CTCCTGTCTC TCTCTCTCCC GCAGGATGAA GATGAGACGC TACAAGCTCT 180 TTCTCATGTT CTGTATGGCC 200
【図１】図１は、本発明のプロモーターを含むＤＮＡ
（ｐＰＧ２０４−１．１）とヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子
ｃＤＮＡ（Ｈ１５、Ｈ２０等）との関係を示した概略図
である。
（ｐＰＧ２０４−１．１）とヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子
ｃＤＮＡ（Ｈ１５、Ｈ２０等）との関係を示した概略図
である。
【図２】図２は、ｐＨｕｇ５’−２０４の挿入断片の制
限酵素地図を示す図である。
限酵素地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西河 淳 大阪府豊中市新千里南町３丁目８番 Ａ５ −401号 (72)発明者 谷口 直之 大阪府豊中市上野東２丁目19番32−201号
Claims (12)
- 【請求項１】 配列表の配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３、および配列番号：４からなる群より選択
されるＤＮＡ又はその一部であって、かつ、動物細胞に
おいてプロモーター活性を有するＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡとハイブリダイ
ズすることができるＤＮＡであって、かつ、動物細胞に
おいてプロモーター活性を有するＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡと有用遺
伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする組
換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 有用遺伝子がタンパク質をコードする核
酸、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デコイ
をコードする核酸、およびリボザイムからなる群より選
択される核酸であることを特徴とする請求項３記載の組
換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項３又は４に記載の組換えＤＮＡを
含有するベクター。 - 【請求項６】 ベクターがプラスミドベクター又はウイ
ルスベクターであることを特徴とする請求項５記載のベ
クター。 - 【請求項７】 請求項３又は４に記載の組換えＤＮＡを
導入してなる動物細胞。 - 【請求項８】 請求項５又は６に記載のベクターで形質
転換されてなる動物細胞。 - 【請求項９】 請求項７又は８に記載の動物細胞を有す
る動物。 - 【請求項１０】 請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流
にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得
られる組換えＤＮＡを含有するベクターで形質転換され
た動物細胞を培養し、次いで培養物から該タンパク質を
採取することを特徴とする動物細胞によるタンパク質の
製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流
に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮ
Ａを動物細胞に導入し、次いでその動物細胞を培養する
ことを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方
法。 - 【請求項１２】 請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流
に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮ
Ａを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、次いで
その動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞によ
る有用遺伝子の発現方法。
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| JP18820396A JP4177904B2 (ja) | 1995-06-30 | 1996-06-28 | 新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18775395 | 1995-06-30 | ||
| JP7-187753 | 1995-06-30 | ||
| JP7-233364 | 1995-08-17 | ||
| JP23336495 | 1995-08-17 | ||
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH09107977A true JPH09107977A (ja) | 1997-04-28 |
| JP4177904B2 JP4177904B2 (ja) | 2008-11-05 |
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| JP (1) | JP4177904B2 (ja) |
-
1996
- 1996-06-28 JP JP18820396A patent/JP4177904B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4177904B2 (ja) | 2008-11-05 |
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