NO313840B1 - Phaffia-celle, Phaffia rhodozyma, E. coli, fremgangsmÕte for transformering og fremstilling av Phaffia celler samtfremgangsmÕte for fremstilling av et önsket produkt - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører Phaffia-celle, Phaffia rhodozyma,

E. coli, fremgangsmåte for transformering og fremstilling av Phaffia celler samt fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket produkt. Mer spesifikt beskriver den foreliggende oppfinnelse hjelpemidler og fremgangsmåter for å transformere visse gjærarter og for å oppnå overekspresjon av ønskede gener i disse artene. Den foreliggende oppfinnelse beskriver transformerte Phaffia rhoHr>7:yma-arte,r. Oppfinnelsen beskriver også en fremgangsmåte for å transformere Phaffia rhoHn7yma-fitammftr

11972 beskrev først Phaff et al. (Proe. IVIFS: Ferment. Technol. Today 759-774) en ny gjærart som hadde blitt isolert fra bred-bladede trær i Japan. Denne gjær varkarakterisertav et høyt karotenoidinnhold, og det faktum at det var den første karotenoidinneholdende gjær som ble funnet å fermentere flere sukkerarter. Siden alle artene ble funnet i fjellområder i Japan og Alaska, foreslo Phaff et al. navnet Bhr>Ho7yma mrmtanae

11976 forsøkte Miller et al. (int. J. Syst. Bacteriol. 26:286-291) å gi en mer systematisk beskrivelse av disse artene, og foreslo navnet Phaffia rh orlo7yma.

Phaffia rhodr>?yma er den eneste arten som i dag er kjent i genus Phaffia

Omhyggelig analyse av karotenoidinnholdet i denne gjærstammen er blitt omtalt av Andrewes et al., 1976, (Phytochemistry 15:1003-1007) og Andrewes og Starr, 1976, (Phytochemistry 15:1009-1011). Det ble funnet at én av de viktigste karotenoidene i denne art er astaxanthin. Astaxantin var tidligere kjent å være ansvarlig for fargedannelse i f.eks. krill og derfor for fargen i fisk slik som ørret, laks og flekkpagell som beiter naturlig på krill.

Johnson et al. (1977) (J. Fish. Res. Board Can. 34:2417-2421) omtalte anvendelsen av Phaffia som en diettpigmentkilde. De konkluderte at både salmonider og skalldyr kan farges av Phaffia.

Én av de begrensende faktorene for omfattende anvendelse av Phaffia som fiskeforbestanddel, viste seg å være det lave astaxanthin-innholdet i denne gjær.

Danisco (internasjonal patentsøknad WO 88/08025, i mellomtiden innvilget som europeisk patent EP 367 765B) omtalte for første gang det økede astaxanthin-innholdet i Ehaffia-celler etter dyrkning av celler som hadde blitt mutagenisert.

Imidlertid synes den maksimale astaxanthin-produktivitet å være begrenset, fordi etter flere mutageneserunder kan ikke lenger noen økning i astaxanthin-innholdet påvises (som omtalt i europeisk patentsøknad EP 482544). Dette kan delvis skyldes utilsiktede mutasjoner som opptrer under vilkårlig mutagenese.

Rekombinant DNA-teknologi kunne sannsynligvis overkomme denne flaske-halsen i artsutvikling. For å kunne oppnå rekombinante arter, er det imidlertid behov for en effektiv transformasjonsprosess og adekvat ekspresjomregulerende sekvenser

Transformasjon av Phaffia hindres av den rigide celleveggen som også

påvirker muligheten til å oppnå Ehaffk-protoplaster. Videre er geneteisk verktøy slik som plasmier, promotorer og markørgener, ikke tilgjengelige for Phaffia i dag. Nylig har protoplastutvikling i Phaffia blitt omtalt (EP 482544). Disse protoplastene kunne med fordel bli benyttet i protoplastfusjons-eksperimenter og gi opphav til arter med øket astaxanthin-prodoktivitet.

I dag er transformasjon av Phaffia-arter ikke beskrevet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører Phaffia celle, kjennetegnet ved at den er transformert med DNA, idet DNA omfatter:

a) et ønsket gen som skal bli uttrykt i nevnte Phaffia celle,

b) en Phaffia promoter heterolog med nevnte ønskede gen som skal bli uttrykt og som er i operabel kobling dermed.

Det er videre beskrevet Phaffia, kjennetegnet ved at Phaffia promoteren er aktinpromoteren.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre E. coli, kjennetegnet ved at den er CBS 359.93 og CBS 442.92.

En av fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelse for å transformere Phaffia omfatter:

dyrking av Phaffia celler til eksponensialfasen,

fremstilling av protoplaster fra disse cellene,

tilsetting av en vektor inneholdende et ønsket gen klonet nedstrøms fra en

Phaffia promotor heterolog for nevnte ønskede gen,

utsåing av protoplaster på et selektivt regenereringsmedium,

selektering av transformerte Phaffia cellen

En annen fremgangsmåte for å transformere Phaffia ifølge oppfinnelsen omfatter:

dyrking av Phaffia celler til ønsket tetthet,

høsting av cellene,

inkubering av cellene med transformerende DNA omfattende et ønsket gen

klonet nedstrøms fra en Phaffia-promoter i nærvær av litiumacetat,

utsåing av blandingen på selektive skåler,

selektering av transformerte Phaffia celler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling a Phaffia celler inneholdende en mengde av et ønsket protein eller karotenoid, kjennetegnet ved at omfatter: transformering av Phaffia celler med en vektor som inneholdende et ønsket gen klonet nedstrøms fra en Phaffia-promoter som kan være et

proteinkodende gen eller et regulatorisk gen,

selektering av transformerte celler,

dyrkning av transformerte celler under egnede betingelser for å fremstille et ønsket protein eller karotenoid.

Det er videre beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket produkt, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av transformerte Phaffia celler ifølge krav 1 til 3 under ønskede betingelser for å fremstille ønskede produkt.

Ekspresjonsregulerende sekvenser kan klones oppstrøms for både homologe og heterologe gener.

Den foreliggende oppfinnelse omtaler således hjelpemidler og fremgangsmåter for å oppnå ekspresjon av ønskede gener i Phaffia. Phaffia kan således benyttes for å fremstille heterologe proteiner. Ved hjelp av kloning og ekspresjon av gener innenfor den biosyntetiske karotenoid-reaksjonsvei, er det også mulig å benytte Phaffia rhoHfvzyma for å fremstille ønskede karotenoider. Ønsket karotenoidfremstilling omfatter øket produksjon av astaxanthin, og også inkludert er fremstilling av andre karotenoider slik som zeaxanthin, cantaxanthin og 6-karoten. Fig. 1: Kartlegging av restriksjonssetene rundt PJiaffta-aktingenet. Sothern blot av kromosomalt DNA spaltet med flere restriksjonsenzymer og hybridisert med 500 bp Sall-BamHI Ehaffia-aktin-genfragment. Felt 1, kromosomalt DNAx Hpal; 2,x Kpnl; 3,x Xhol; 4,x Xbal; 5,x EcoRV; 6,x BamHI; 7,x EcoRI/BamHI; 8,x Hindlll/BamHI; 9,x Hindlll/EgUI. Blottet ble hybridisert i 6 x SSC, 5 x Denhardts, 0,1% SDS, 100 ng/ml sildemelke-DNA ved 65°C og vasket med 1 x SSC/0,1% SDS ved 65°C. Fig. 2:Restriksjonskart over 5'-setet til Ehaffia-aktm-genet. Oligonukleotidene som er laget for invers PCR, er vist.

mmmmmm strukturelt aktin-gen (eksoner

5'-oppstrøms- og promotorsekvens til aktin aktinintron — — > <s ——

oligonukleotider benyttet i invers PCR

Fig. 3: Organiseringen av Phaffia rhndozyrna-aktin-geriet. Restriksjonsseter benyttet for kloning er vist.

strukturelt aktin-gen (eksoner)

5' oppstrøms- og promotorsekvens til aktin

aktinintron

3' ikke-kodende aktinsekvens

^ transkripsjonsstartsted

Fig. 4::BCloningsdiagram over aktin-fleomycinfusjonskontruksjoner.

oppstrøms- og promotorsekvenser til Phaffia rhodozyma-aktin ribosomalt DNA fra Phaffia rhodozyrna-aktin strukturelt aktin-gen fra Phaffia rhoHozyma-aktin fleomycin- (S.h) gen + cycl(gjær) terminator , mmmmmmmmmm y ikke-kodende Phaffia rhodozyma-aktin-sekvenser pTZ18R

Fig. 5:Kloningsdiagram av aktin-G418-fusjonskonstruksjonene.

oppstrøms- og promotorsekvens til Phaffia rhodoTyma-aktin ribosomalt DNA fra Phaffia rhodozyma-akrin

strukturelt aktin-gen fra Phaffia rhodo7yma-aktin

G41<g>

3' ikke-kodende Phaffia rhodo7yTTia-aktin-s<p>.kvfinser pTZ18R

Fig. 6: Sothern blot av kromosomalt DNA spaltet med både BamHI og EcoRI og isolert fra transformerte Phaffia-stammer (eksempel 11) med tre ulike prober, dvs. A) 430 bp BamHI-StuI-fleo-fragment utviklet i 72 timer,

B) 1,8 kb BamHI-Sall-aktinpromtorfragment utviklet i 3 timer,

C) pTZ18R utviklet over natt.

Fig. 7A: Sothern blot av BamHI-spaltet kromosomalt DNA fra (felt 1 til 20); pGB-Ph9, CBS6938, lb, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2h, 2i, 2j, 3b, 4a, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i. CBS6938, lb og 3b er negative kontroller; pGB-Ph9 er en positiv kontroll. De andre tallene er mulige transformanter. Hybridisering med PTZ-probe.

Fig. 7B: Se figurtekst fig. 7A, hybridisering med G418-probe.

Fig. 7C: Se figurtekst fig. 7A, hybridisering med rDNA-probe.

I sin mest generelle form beskriver den foreliggende oppfinnelse transformerte Ehaffia-celler. Det foretrekkes at Phaffia-cellene er Phaffia rhodo7yma-celler. Den foreliggende oppfinnelse beskriver også fremgangsmåter for å transformere Ehaffia-celler.

Skjønt uten at det er begrensende, beskrives en vellykket transformasjon ved bruk av EhafQa-promotor klonet oppstrøms fra et gen som skal uttrykkes.

Den foreliggende oppfinnelse viser videre at Ehaffia-celler, liksom andre gjærceller, er følsomme for seleksjonsforbindelser slik som G418, hygromycin og fleomycin over et passende konsentrasjonsområde. Transformasjon av EhafQa-cellene med genene som koder for proteinene som overfører motstand mot disse forbindelsene til cellene, gir et passende seleksjonssystem for transformasjon.

Den foreliggende beskrivelse inneholder holdepunkter som viser at anvendelsen av sterke gjærpromotorer, fortrinnsvis promotorer fra Sar, r, haromyr, es cp. revisiap, og Kliiyveromyr-ps lar.tis, mer spesifikt ADH1-, GAPDH-, Og TEF-la-promotorene fra Saccharomyces cerevisiaR3ikke gir ekspresjon av markørgenet i transformerte PJbafQa-celler. Det ble faktisk således umulig å bevise hvorvidt transformasjon skjedde i det hele tatt.

Andre sterke promotorer er blitt benyttet liksom SV 40-promotoren, kanamycinpromotoren fra Tn903, PGK-promotoren fra P. chrysogermm og GAPDH-promotoren fra A. nidulans, og alle viste det samme (negative) resultatet.

Dette startet en søk for promotorer fra Phaffia. Som en generell fremgangsmåte, ble gener valgt som forventes å være konserverte i gjærarter. Prober ble isolert som representerte spesielle konserverte regioner i disse gener, og disse prober ble benyttet til hybridisering mot Phaffia-genomisk DNA. Hybridiserende fragmenter som svarte til spesifikke gener, ble benyttet for å isolere de fullstendige genene eller minst promotorregionene til genene. Promotoren som således ble isolert, ble så klonet i en passende transformasjon/ekspresjonsvektor oppstrøms fra et rapportgen.

Ph a ffi a -protopl åster ble laget ved å bruke standard fremgangsmåter, og de ble deretter transformert med transformasjons/ekspresjonsvektoren. Til slutt ble de transformerte EhafQa-protoplastene regenerert og utvalgt på et passende selektivt medium.

Andre fremgangsmåter kan også benyttes for å isolere Phaffi a-promotorer. Slike fremgangsmåter omfatter isolering av et uttrykt Phaffia-protein, delvis sekvensering av dette protein og utvikling av en oligonukleotidprobe basert på denne sekvens. Etter hybridisering av spaltet og elektroforesert DNA eller undersøkelse av et genomisk- eller cDNA-Ehaffra-bibliotek, kan et gen utvelges. Deretter kan promotoren til dette genet lokaliseres og klones på en passende måte.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelsen av de følgende probene for å hybridisere med genomisk Phaffia-DNA;

et 1,7 kb ribosomalt DNA-fragment fra K. lactis,

et 800 bp PCR-fragment fra TPI-genet til K. lactis,

et 250 bp PCR-fragment fra K-JacJds-elongeringsfaktoren,

et 3 kb fragment fra PGK-genet i pTZ18R til cerevisia<p>,, og et 200 bp PCR-fragment fra 5<*>kodende området til aktingenet i K. lactis.

Det viste seg at kun rDNA og aktinfragmentet hybridiserte med genomisk Pbaffia-DNA; TPI, PGK og elongeringsfaktorprobene, skjønt de ble oppnådd fra sterkt konserverte gener, hybridiserte ikke ved lav stringens. Det genomiske DNA som inneholdt aktin-genet, ble deretter klonet, og hybridiserende kloner sekvensert. Sekvensen ble funnet å tilsvare den kjente aktinsekvensen fra andre gjærarter. Sekvensen ble deretter benyttet som en spesifikk probe for å påvise en klon som inneholdt aktinpromotoren til Phaffia rhodo7yma. Den foreliggende oppfinnelse beskriver således et isolert og renset DNA-fragment som koder for en Phaffia-promotor, fortrinnsvis Phaffia-akrinpromotoren.

Etter at promotoren var isolert, ble den klonet inn oppstrøms for et ønsket gen som skulle uttrykkes på en funksjonell måte. Et slikt ønsket gen kan være et hvert gen. Både homologe og heterologe gener kan benyttes. Homologe gener omfatter gener som er aktive i den biosyntetiske reaksjonsvei for karotenoid, disse genene omfatter strukturelle gener så vel som regulatoriske gener. Heterologe gener omfatter alle genene som er av interesse, hvis ekspresjonsprodukt ikke er dødelig for Phaffia, slike gener omfatter gener som koder for farmasøytiske proteiner, detergens-enzymer, mat og fødeenzymer og proteiner av betydning i karotenoid-syntesen. For å underlette påvisning, har heterologer G418 og fleomycinresistenskodende gener blitt benyttet i den foreliggende søknaden. Disse genene kan kobles på en perfekt måte med den ønskede promotoren. Det er imidlertid også mulig å gjøre en fusjon med en del av genet som normalt følger promotoren, hvilket resulterer i et fusjonsprotein.

Transformasjon av Phaffia rhodozyma ble utført på følgende måte. Phaffia-protoplaster ble fremstilt ved bruk av standard fremgangsmåter, og de ble deretter transformert med transformasjonsvektoren. Til slutt ble de transformerte Phaffia-protoplastene regenerert og utvlagt ved hjelp av et passende selektivt medium.

Transformanter ble også utviklet ved bruk av den såkalte litiumacetat-fremgangsmåten. I denne fremgangsmåte blir cellene inkubert over natt i nærvær av PEG, litiumacetat og transformerende DNA. Etter inkubasjon blir cellene sådd ut på selektive skåler. Skjønt søkerne er de første som beskriver transformerte Phaffia-celler, antas det at andre fremgansmåter kan være anvendbare for å oppnå transformanter, og disse fremgangsmåter omfatter elektronbombardering.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver for første gang en vektor som kan transformere en Phaffia med samtidig ekspresjon av det klonede genet. Den beskrevne vektor inneholder aktin-promotoren og et markørgen. Ved bruk av seleksjonsmedium ble transformasjon av Phaffia bevist. Aktinpromotoren ble benyttet og klonet oppstrøms for de G418 og fleomycinresistenskodende genene. EhafQa-promotoren kan også benyttes for å uttrykke andre klonede gener. Vektoren inneholder således et ønsket gen og et seleksjonsmarkørgen.

Ved at en promotor og et seleksjonssystem er utviklet for Phaffia, er det mulig å klone ønskede gener i Phaffia Slike gener omfatter alle heterologe gener som gir anvendbare produkter ved ekspresjon. Imidlertid gir Phaffia rhndozyma andre interessante muligheter.

I videste forstand gjør fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelse det mulig å klone og uttrykke klonede heterologe eller homologe gener i Phaffia. Nevnte gener kan klones på en episomal vektor, eller de kan integreres i genomet. Ved siden av å benytte Phaffia som en produksjons vert for de ønskede proteinene, er det også mulig å klone og uttrykke genene i den biosyntetiske reaksjonsvei til karotenoider for å endre reaksjonsveiene som er funnet i Phaffia eller for å utvikle nye reaksjonsveier for karotenoider som ikke normalt finnes i Phaffia De resulterende transformerte celler kan fremstille et karotenoid som ikke forekommer naturlig i Phaffia. Den kan fremstille en øket mengde av et karotenoid som forekommer naturlig i vertscellen.

Et eksempel på dette er det følgende. Klassisk mutagenese blir benyttet for å oppnå mutanter som fremstiller spesifikke forstadier for astaxanthin, et foretrukket eksempel på et slik forstadium er 6-karotein. En art som fremstiller et annet karotenoidforstadium, kan oppnås på samme måte. Deretter blir et gen innført i Enaffia-arten, der ekspresjonsproduktet benytter forstadiet som er laget i stammen som substrat etter klassisk mutagenese. I tilfelle med 6-karoten som et substrat, blir et passende gen, f.eks. genet hvor proteinproduktet syntetiserer zeaxanthin (crtZ-gen), oppnådd fra F. rwinia iireHovora (Misawa et al., 1990, J. Bacteriol., 122:6704-6712). Andre slike gener kan oppnås f.eks. fra Flavohacteriiim (en grampositiv bakterie), Syne. chococms (en cyanobakterie) eller Chlamydomonas eller Punaliella (alge).

Det er også mulig å benytte villtypearter, uten mutagenese. Ved å over-uttrykke et enzym som benytter et forstadium i en biosyntetisk reaksjonsvei, kan denne reaksjonsvei avvike fra sitt naturlige forløp og gi et annet karotenoidprodukt som ikke naturlig forekommer i den benyttede arten.

Kloning og overekspresjon av gener som direkte er innblandet i frem-stillingen av astaxanthin eller av gener eller sekvenser som har en regulerende funksjon i astaxanthin-produksjon, kan føre til øket astaxanthinproduksjon.

Det ønskede genet kan uttrykkes episomalt eller det kan integreres i genomet i vertscellen. Det kan være nyttig å benytte genforøkning for å fremstille flere kopier av genet i vertscellen. De foreliggende eksemplene gir holdepunkter for tilstedeværelsen av en ARS i rDNA fra Phaffia rhodozyma.

Det er mulig å fremstille andre karotenoidforstadier på samme måte, generelt kan alle karotenoidene som enzymatisk kan avledes fra forstadier av astaxanthin i Phaffia, fremstilles, spesifikke karoteoider omfatter kantaxanthin og lykopen. Videre, B-karoten kan overføres til retinol på en lignende måte.

De transformerte EhafQa-cellene dyrkes under betingelser hvor alkohol ikke fremstilles. Temperaturen er i området på 15-26°C. Det foretrukne område er 20-22°C. Fermenteringen utføres i et medium som omfatter passende næringsemner. Disse omfatter molasse eller sakkarose som karbonkilde og nitrogenkilder såsom urea, ammoniakksalter eller maisavledet væske. Mikronæringsemner blir også tilsatt mediet.

Videre utføres dyrkning under aerobe betingelser. Vekstbetingelsene, valget av spesifikke næringsemner og substratbegrensning har blitt omtalt å influere på veksten av Ehaffia-celler. Tilpasning skjer i tråd med det ønskede produktproteinet eller karotenoidvekstbetingelser og forstadietilsetning.

Etter dyrking i transformerte Ehaffia-celler, blir cellene høstet, og cellene kan herunder behandles på forskjellig måte, avhengig av den ønskede bruk av produktet eller med tanke på formuleringen. Behandlingene omfater;

åpning av cellene,

tørking av cellene,

ekstraksjon av produktet, protein eller karotenoid fra cellene.

Gjærcellene som inneholder karotenoidene, benyttes som de er eller i tørket form som tilsetning til dyrefor eller mat.

Videre blir gjæren blandet med andre forbindelser slik som proteiner, karbo-hydrater eller oljer. Generelt kan alle fremgangsmåter benyttes for å gjøre Phaffia passende for tilsetning til for eller mat.

Karotenoidene kan isoleres for eksempel som beskrevet av Johnson et al., (Appl. Environm. Microbiol., 35:1155-1159 (1978)).

Rensede karotenoider benyttes som fargeforbindelser i mat og/eller for. Det er også mulig å benytte karotenoidene i kosmetikk eller i farmasøytiske sammen-setninger.

Det er klart fra beskrivelsen ovenfor at eksemplene er en illustrasjon av et generelt prinsipp.

F. sperimentfilt

Detaljene vedrørende molekylære kloningsteknikker er beskrevet av Sambrook et al. i Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. utgave (1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press). Disse teknikkene omfatter DNA-gelelektroforese, Southern blotting, DNA-sekvensering, fosforylering av 5-endene med T4-polynukleotidkinase og syntese av jevnt merkede DNA-prober ved hjelp av vilkårlige "primere".

Enzyminkubasjoner utføres etter instruksjoner beskrevet av produsenten. Disse inkubasjonene omfatter restriksjons-enzymspalting og sammenkobling.

Stammer

Fsr. heriehia eoli TM10Q

recAl, endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, -,

(lacproAB), [F', traD36, proAB, ladqZ M15]

Phaffia rhodoyyma CBS6938

Phaffia rhndn7yma PF 11-12 ble deponert i Centraal Bureau voor de Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands under nr. CBS 797.91 den 16. desember 1991.

Plasmider benyttet for kloning

pTZ18R amp R (Pharmacia/LKB)

pUCG418 amp R, geneticin R (EP301670)

pUT701 amp R, fleo R (Cayla)

Medium

LB: 10 g/l bacto trypton, 5 g/l gjærekstrakt,

lOg/lNaCl.

LC<+>skåler: 5 g/l gjærekstrakt, 10 g/l bacto trypton,

8 g/l NaCl, 0,025 g/l tymin, 1 g/l MgS04.7H20,

4 g/l stivelse, 20 g/l bacto agar.

YEPD: 10 g/l gjærekstrakt, 20 g/l bacto pepton, 2%

glukose, etter ønske tilsettes geneticin (G418)

eller fleomycin (skåler: + 20 g/l bacto agar).

YEPDS: YEPD + 1M sorbitol (skåler: + 20 g/l bacto agar).

Andre fremgangsmåter

Transformasjon av F. ml i ble utført ved bruk av DSMO-fremgangsmåten,

Chung et al. 1989, (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 56:2172-2175).

Isolering av plasmid-DNA fra F. roi i ble utført ved bruk av Qiagen^-kittet. Isolering av kromosomalt DNA fra Phaffia er beskrevet i eksempel 3.

Isolering av total RNA fra Phaffia ble utført ifølge Lacy, R.L. og R.C.

Dickson, 1981, Mol. Cell. Biol., 2:629.

Koloniavtrykk og hybridisring ble utført ifølge Colony/Plaque Screen1™

manual (NEF-978 Du Pont).

DNA-fragmenter ble isolert fra agarose ved bruk av Geneclean<tm>. Polymerasekjedereaksjon (PCR).

PCR-reaksjoner ble utført rutinemessig i blandinger som har den følgende sammensetning:

1 fig kromosomalt DNA eller 5 [ ig total RNA,

1 piM av hver oligonukleotid-"probe",

200fiM av hvert dNTP,

11 mM Tris-HCl, pH 8,3,

50 mM KCL,

2 mM MgCl2,

0,01% w/v gelatin,

1 mM NaCl,

0,1 mM EDTA,

5 U ampli Taq-polymerase (Perkin-Eimer).

Totalvolumet var 50 på.

Før tilsetting av Taq-polymerasen denatureres DNA i 8 min. ved 94°C. Så tilsettes Taq-polymerase, og en dråpe mineralolje tilsettes mot fordampning. Deretter startes reaksjonen.

Ulike variasjoner av PCR-fremgangsmåten benyttes. Med kromosomalt DNA som et templat, gjøres følgende kjøring; 25 cykluser: 2* 94°C, 2' 45°C, i 5' til 72°C, 3* 72°C.

Den omvendte PCR er en annen PCR-fremgangsmåte benyttet i denne teknikken der DNA-templatet først blir spaltet og koblet sammen før anvendelse i PCR. PCR selv utføres som følger; 25 cykluser: 2' 94°C, 2' 55°C, 3' 72°C.

Den tredje PCR-fremgangsmåte er reverstranskirptase-PCR- (RT-PCR) teknikken. Total RNA benyttes som templat, og før PCR starter, må en revers-transkriptasereaksjon finne sted. RNasin (20 U) og M.MLV-reverstranskriptase

(50 U) tilsettes til den normale reaksjonsbufferen. Først inkuberes blandingen ved 50°C i 8 min., så finner reverstranskripsjon sted. Denatureringstrinnet utføres som vanlig og etter tilsetting av Taq-polymerasen, kan den normale PCR-kjøring finne sted i 25 cykluser: V 94°C, 1' 55°C, 1' 30" 72°C.

Transformasjon av PJiaffia-gjær med litiumklorid ble utført ifølge Ito, H. og

Y. Fukuda, J. Bacteriol., 152:163-168.

Transformasjon av Ehaffk-gjær med litiumacetat (PLATE-teknikk) ble utført ifølge Elble R. 1992, Biofeedback 12 nr. 1 (kan fremskaffes gjenom Reader Service under nr. 118), som beskrevet nedenfor.

Lesninger:

1M LiAc.2H20 (Sigma), 13,8 g/100 ml, 15<*>U0°C

45% PEG 4000 (Brocacef), 90 g/200 ml, 15' U0°C

PLATE - 90 ml 45% PEG 4000

10 ml 1M LiAc

1 ml 1M Tris-HCL pH 7,5

0,2 ml 0,5 M EDTA

Fremgangsmåte:

1. Ta 0,5 ml kultur (se bakgrunn) og sentrifuger 10" i en mikrosentrifuge.

Dekanter supernatant ved å snu om røret og riste det en gang.

2. Tilsett 10 pl bærer-DNA (100/ig filtrert sildemelke-DNA) og 1 til 10 fig transformerende DNA. Utfør blanding på vortex.

3. Tilsett 0,5 ml PLATE. Bland på vortex.

4. Inkuber over natt ved romtemperatur på benken (se bakgrunn).

5. Tilsett blandingen direkte på selektive skåler (se bakgrunn).

Bakgrunn-

1. Volumet som skal sentrifugeres avhenger av den optiske tetthet til kulturen. Best resultater oppnås hvis 10

celler benyttes.

4. Minst over natt. Ta kontroller for undersøkelse av celleoverlevelse (overlevelseskurve). 5. Utsåing av mer enn 0,2 ml transformasjonsblanding pr. selektiv skål, reduserer veksten av koloniene på grunn av PEG-løsningen.

RNA-analyser ved hjelp av 5' "primer"-forlengelse ble utført ifølge Mertins, P. og D. Gallwitz, 1987, (EMBO J., 6:1757-1763).

I korthet ble en mengde på 5 fig totalt cellulært RNA bunnfelt sammen med IO6 c.p.m. av den passende<32>P-ende-merkede "primeren", vasket med 70% EtOH, tørket og løst opp i 15 fi\ 50 mM Tris-HCl, pH 8,3,150 mM KC1, 7 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA. Etter oppvarming i 2 min. til 65°C, ble nukleinsyrene holt på is i 2 min., og etter tilsetting av 15 U RNasin, 5fi\ dNTP'er og DTT (0,5 mM hver av dATP, DCTP, dTTP og dGTP; 1 mM DTT, endelig konsentrasjon) og 200 U M.MLV-reverstranskriptase, ble reaksjonen kjørt videre i 2 timer ved 42°C. Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen lagret ved -20°C. 5'-"primer"-forlengelses-reaksjonsproduktene ble analysert på en denaturerende polyakrylamidgel. DNA-isolering fra gel ved hjelp av agarosebehandling ble utført som følger: DNA-båndet av interesse kuttes ut fra 1% LGT-agarosegel og vekten bestemmes. Gelbiten inkuberes i 10 volumer med TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5,1 mM EDTA) i minst 1 time og deretter ekvilibreres mot TNE (100 mM Tris-HCl pH 7,5,100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Gelbiten smeltes ved 65°C i løpet av 10 min. og plasseres i et 37°C vannbad. Etter avkjøling til 37°C, tilsettes agarose (Sigma) til en konsentrasjon på 1 enhet pr. 100 mg agarose.

Røret inkuberes minst i 2 timer ved 37°C, helst over natt, etterfulgt av 4 x fortynning for å redusere saltkonsentrasjonen og ekstrahert med et likt volum av fenolkloroform (tilsette først 1/2 volum fenol, blanding og så tilsette 1/2 volum kloroform). Ekstraksjonen gjentas til interfasen har forsvunnet.

Tilslutt utføres den siste ekstraksjon ved 1/2 volum kloroform og super-natanten bunnfelles ved å tilsette 1/10 volum av 3 M natriumacetat og to volum - 20°C etanol. Etter inkubering ved -20°C i 2 timer, blir DNA bunnfelt ved hjelp av sentrifugering, tørket og løst opp i et passende volum TE.

Eksempler

Fksempel 1

Antimntikafalsnmhet til Phaffia rhorinzyma

Et derivat av Phaffia rhodo7yma-stamme CBS 6938, PF 11-12, ble undersøkt med hensyn på følsomhet overfor flere anti-biotika. G418, hygromycin og fleomycin ble benyttet. Eksperimentene ble utført med friske over natt YePD- (1% gjær-ekstrakt, 2% pepton, 2% dekstrose) kulturer. Cellene ble sådd ut i forskjellige mengder på YePD-agarskåler som inneholdt de ovenfor nevnte antibiotika. G418 var selektiv i et område på 5 til 20 /ig/ml. Hygromycin i et område på 2,5 til 10 pig/ ml og fleomycin i et området på 0,1 til 0,4/ig/ml.

Phaffia rhodozyma-stamme CBS 6938 ble også undersøkt med hensyn på følsomhet overfor G418 og fleomycin. G418 var selektiv i et område på 5 til 100 fig/ ml og fleomycin i et område på 0,1 til 2,5 jug/ml.

Fksempel 2

Protoplast- transformasjon av Phaffia rhndnzyma ved hnik av heterologe promotorer

Et derivat av Phaffia rhndnzyma-stamme CBS 6938, PF 11-12, fremstilt ved hjelp av klassisk mutagenese, ble inokulert i 100 ml flytende medium som inneholdt 2% dektrose, 1% gjærekstrakt og 2% pepton (YePD) og dyrket ved 21°C til en optisk tetthet på 0,3-0,8 ved 600 nm (dvs. omtrent 5 x IO6 celler/ml). Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 5000 rpm (Hettich Rotana) i løpet av 5 min. ved romtemperatur og vasket to ganger med 0,7 M KCl-10 mM sitronsyre pH 6,2. Celle-bunnfallet ble resuspendert i 5 ml av vaskeblandingen, og Novozym<1>"<1>234 ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mg/ml. Cellene ble inkubert ved 25°C i løpet av 20-40 min. (stamme uavhengig). Protoplastdannelse ble bekreftet ved mikroskopisk analyse. Protoplastene ble vasket grundig i 1 M sorbitol og resuspendert i 2 ml 1M sorbitol som inneholdt 50 mM kalsiumklorid. 10-25 fig ufordøyet plasmid-DNA, som beskrevet i tabell 1, ble tilsatt 200 pil protoplaster og inkubert i 10 min. ved romtemperatur. Eksperimentene ble utført både i nærvær og fravær av bærer-DNA. Deretter ble 2 ml av en løsning som inneholdt 20% til 40% PEG 4000 og 50 mM kalsium-klorid tilsatt, blandet grundig, og inkubert for ytterligere 10 til 20 minutter i romtemperatur. Protoplastene ble sentrifugert ved 300 rpm (Heraeus Biofuge) i 3 min. ved romtemperatur, og bunnfallet ble resuspendert i 0,2 ml 1 M sorbitol.

Forskjellige mengder ble sådd ut på filtere plassert på topppen av osmotisk (1 M sorbitol) stabilisert YePD-agar-skåler for å oppnå regenerasjon. Ulik regenera-sjonstid ble benyttet, f.eks. 4 og 24 timer, før overføring av filterne til stabilisert (1 M sorbitol) selektivt YePD-agarmedium.

Plasmider basert på PTZ 18/19 skjelettet, ble benyttet for å transformere et derivat av Phaffia rhodozyma-starnme CBS 6938 (PF 11-12 fremstilt ved hjelp av klassisk mutagenese). Rapport-genene som var tilstede i plasmidene, har blitt benyttet på en vellykket måte i transformering og seleksjonsstudier i mange ulike organismer. Vi benyttet kanamycin- (G418) gener fra transposonene Tn 5 og Tn 903, hygromycingenet fra F- coli og fleomycingenet fra S hindustanns

Rapportgenene ble klonet nedstrøms for promotorsekvensene heterologt med Phaffia, f.eks. S. cerevkiae ADH 1, GPDH og TEF la-promotorene, SV 40-promotoren, F, coli kanamycinpromotoren fra Tn 903, P r-hrysogermm PGK-promotoren og A. nidnlans GAPDH-promotoren. Plasmidene ble isolert og renset ifølge Oiagen<*111->rfemgangsmåten fra Stratagene™<1.>

Transformasjonseksperimenter med Phaffia ble utført med ulike DNA-prøver, dvs. CCC fra CsCl-renset DNA, SacJ-liniarisert DNA og en blanding av eksisterende CCC fra plasmidene renset ved Qiagen-søyler. De eksisterende plasmidene inneholdt ulike kombinasjoner av heterologe promotorsekvenser med fleomycingenet (tabell 1).

Tabell 1. Oppsummering av eksisterende plasmider benyttet i protoplast-transformasj onseksperimenter.

De første eksperimentene med disse plasmidene, hvor vi benyttet dobbeltlagskåler for seleksjon, protoplastperioder på 30 min. og den antydede stammen, avslørte ikke en klar forskjell i kolonitall mellom kontrollskåler og transforma-sjonsskåler (resultatene er ikke vist) og etter analyse av en rekke potensielle transformanter, var vi ikke i stand til å påvise transformasjon.

Ingen av de ovennevnte transformasjons-eksperimentene resulterte i kolonier som var motstandsdyktige overfor G418, hygromycin eller fleomycin. Det kunne konkluderes at ingen (påvisbare) transformanter var oppnådd.

Dette satte i gang et nytt forsøk basert på anvendelsen av en promotor (og andre ekspresjonsregulerende sekvenser) homologe til Phaffia.

F.ksP!TTipP.1

Hybridisering frir å påvise gener fra Phaffia rhodn7yma

Phaffia rhodr>7yma-celler (stamme CBS 6938) ble dyrket i 100 ml medium som inneholdt 2% (w/v) glukose, 1% (w/v) gjær-ekstrakt og 2% (w/v) baktopepton (YePD) ved 20°C. Cellene ble høstet etter 3 dager (OD6oo= ± 5), ved hjelp av sentrifugering. Bunnfallet ble resuspendert i 20 ml lysisbuffer (60 mM EDTA, 1,2 M sorbitol, 100 mM Na-citrat pH 7,0), og Novozyme<to>234 ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mg/ml. Blandingen ble inkubert ved 30°C i omtrent 3 timer, under hvilken protoplastdannelse ble bekreftet ved hjelp av mikroskopisk analyse. Protoplastene ble høstet ved sentrifugering i 5 min. ved 4000 rpm (Heraeus, Minifuge RF), og bunnfallet ble resuspendert i 10 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,0; 20 mM EDTA. Deretter ble SDS tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1%. Etter cellelysis og etterfølgende fire ganger fortynning i TE, ble flere fenol/kloroform-ekstraksjoner utført. DNA ble bunnfalt med 0,1 volum 3 M NaAc og 2 volum kald etanol. DNA ble samlet opp ved sentrifugering i en inokuleringsnål og løst opp i 4 ml H2O. Etter RNase-behandling, ble løsningen ekstrahert flere ganger med fenol/ kloroform. DNA ble igjen bunnfelt med 3 M NaAc og etanol og løst opp i 3 ml H20.

Kromosomalt DNA ble isolert fra ulike arter; K lactis og S cerevisiae (Cryer et al. (1975) Methods in Cell Biology 12:39, Prescott D.M. (Ed.) Academic Press, New York), Penicillin™ (Bainbridge et al. (1990) FEMS Microbiol. 66:113-118) og fra Phaffia rhodozyma CBS 6398 som beksrevet ovenfor. Det isolerte DNA ble spaltet med HindlTT. DNA-fragmentene ble skilt på en 0,7% agarosegel og blottet på nitrocellulosefilter. Blottene ble hybridisert i 6 x SSC, 0,1% SDS, 5 x Denhardts, 100/ig/ml sildemelke-DNA ved 50°C.

De følgende probene ble benyttet på adskilte blottinger;

ribosomalt DNA

K lactis 1,7 kb CM-DNA-fragment fra (18S) pG7-rDNA#4

(Maleszka og Clark-Walker. 1990. Nucl. Acids REs. 1&:-1889).

TPI-gen (Triose Phosphate Isomerase) K lactis 800 bp PCR-fragment

(oligo'er: 2192-2193, SEQ ID NO: log 2)

KLef-gen ( K lactis elongeringsfaktor) K. lac tis 250 bp EcaRJ-E<y>iill-DNA-'

fragment fra pTZ18Rklef (se under)

PGK-gen (fosfoglycerat-kinase) S cerevisiae 3 kb HindIII-DNA-fragment

fra PGK-2 (se Hitzeman et al. 1992. Nucl. Acids Res. 10:7791-7808) Actin-gen K lactis 200 bp aktin-PCR-fragment (oligo'er 2557-2558),

SEQ ID NO: 3 og 4.

KJaclis-elongeringsfaktor ble klonet som følger. Kromosomalt DNA ble isolert fra K lactis og spaltet med Hindlll. Det spaltetde DNA ble klonet i pUC13 x Hindlll og koblingsblandingen ble transformert til E. coli. R. coli-koloniene ble undersøkt ved hjelp av kolonihybridisering, med bruk av EF-lalfa-sekvensen fra & csr. som probe. Proben var spesifikt et 4 kb StuI-DNA-fragment fra plasmid pYEF46 (Nagata, S. et al. 1984. EMBO J. 2:1825-1830). EF fra K. lactis ble funnet på et 3,5 kb inskudd i pUC13, klon pKLEF52. Et 350 bp Hpal-EcoRI-fragment fra det kodende område til KLEF fra pKLEF52, ble klonet inn i Hind III- (fylt i) EcoRI-setet til pTZ18R, hvilket laget pTZ18RKlef fra hvilken det 250 bp F.rnPT-PvnTT-DNA-fragment ble benyttet som en probe.

K lactis-aktin 200 bp PCR-DNA-fragmentet ble syntetisert med oligonukleotider basert på den publiserte aktin-gen-sekvensen til K lactis (Deshler J.O., Garrett P.L. og Rossi J.J. (1989), Klnyveromyces lactis inneholder Saccharomyces cerevisiae intron-kodede splicing-signaler. Mol. Cell. Biol. 12:2208-2213). Aktin-oligonukleotidene korresponderte spesifikt til bp 830-847 og 1011-1030 i den publiserte KJaclis-sekvensen.

DNA-fragmentene ble P-merket ved vilkårlig DNA-"priming". Probene ble benyttet på separate blottinger. Flere hybridiserings- og vaskestemperaturer ble benyttet, hvilket resulterte i ulike signaler på filmene, avhengig av proben benyttet.

Etter overnatt hybridisering, ble blottingene vasket med 3 x SSC i romtemperatur. Autoradiografene ble eksponert for 3 dager med 2 forsterkerskjermer ved -80°C.

Det eneste sterke hybridiseringssignal på film etter fremkalling, ble funnet når det 1,7 kb ribosomale DNA-fragmentet ble benyttet som en probe.

Probene (TPI, KLef og PGK) ga intet hybridiseringssignal med Phaffia-DNA etter ikke-stringent hybridisering (3 x SSC, 5 x Denhardts, 0,1% SDS, 100/xg/ml med sildemelke-DNA i romtemperatur) og vasking (1 x SSC, 0,1% SDS i romtemperatur).

Filmene viste at 200 bp aktin-sekvensen til K lactis ga et svakt spesifikt

signal i sporet med Ehaffia-kromosomalt-DNA. Blottet som hybridiserte med aktin-gen-fragmentet, viste de følgende bånd i rekkefølge med avtagende intensitet. Det forventede 1,3 kb aktin-båndet til K lactis3et >10 kb bånd til S. cerevisiae, et 7-8 kb bånd til Phaffia, et 6 kb bånd til Penicilliiim Bånd med forskjellig intensitet ble funnet, og det kan tilskrives forskjeller i likhet med K. 1 actis-aktin-proben.

Ved bruk av PCR-teknikken ble et forsøk gjort på å lage en 100% homolog probe. Oligonukleotider basert på de konserverte områdene til GAPDH-genet, TPI-genet og aktin-genet, ble benyttet til å syntetisere et PCR-fragment med kromosomalt DNA fra Phaffia som templat.

Ingen av oligo-settene ga opphav til et DNA-fragment som viste spesifikk hybridisering.

Fksempel 4

Kinning av det Phaffia- rihosnmale PNA- fragmentet

Ribosomalt DNA blir ofte benyttet som et integreringssete etter transformasjon (Szostak J.W. og R. Wu. (1979). Plasmid 2:536 og Lopes et al.

(1989) Gene 22:199-206). Vi bestemte derfor å klone det hybridiserende ribosomale DNA-fragmentet. Et Southern blot ble utført med Phaffia-DNA spaltet med flere restriksjonsenzymer. Kromosomalt DNA spaltet med Sacl, ga et hybridiseringssignal med et DNA-fragment med en lengde på ± 3 kb ved bruk av rDNA fra IL lactis som probe. En kromosomal DNA-fraksjon spalet med Sacl, ble koblet med pUCG418 spaltet med Sacl. Koblingsblandingen ble transformert i kompetente K coli-JM109-celler. Flere pUCG418-plasmider med ribosomalt Phaffia-PNA-innskudd, kunne påvies etter kolonihybridisering av transformanter ved bruk av det 1,7 kb Clal-ribosomale DNA-fragmentet til K lactis som probe. Plasmidet pUCG418 med 3 kb innskuddet til ribosomalt Phaffia-DNA er benevnt pGB-Phll.

Fksempel 5

Kloning av aktin- genet fra Phaffia

Kromosomalt DNA isolert fra Phaffia rhodo?yma-stamme CBS 6938, ble spaltet med flere restriksjonsenzymer. DNA-fragmentene ble isolert, blottet og hybridisert som beskrevet tidligere. Autoradiografiet ble fremkalt i 16 timer ved -80°C med 2 forsterkninger ("screens"). Filmen viste DNA-fragmenter med forskjellig lengde spaltet av ulike restriksjonsenzymer og som hybridiserer med 200 bp PCR-fragmentet til K. lactis-aktin-genet.

Kromosomalt DNA spaltet med Ec<q>RI og Sali, ga et hybridiseirngssignal med et DNA-fragment med lengde på 3,8 kb.

En kromosomal DNA-fraksjon på 3,5-4,5 kb spaltet med EcoRI og Sali, ble isolert fra 0,7% agarosegel og koblet med PTZ18R spaltet med EcoRI-Sall. Koblingsblandingen ble transformert til kompentente E^jcoii-JM109-celler. Cellene ble sådd ut på LC<+->agar med 100 jig/ml Amp og 0,1 mM IPTG, 50/ig/ml X-gal. Duplikate filtere med hvite kolonier ble fremstilt og undersøkt med 200 bp fragmentet til KJacktis-aktin-genet ved bruk av hybridiserings- og vaskebetingelser som er like dem benyttet for Southern blot-hybridiseringer.

Flere positive koloner kunne påvises. Innskuddet i pTZ18R tilhørende én klon, ble sekvensert delvis. Én av klonene ble funnet å inneholde en del av aktin-genet til Phaffia rhodo<y>yma basert på sekvenssammenligning med kjente aktin-gener. pTZ18R-klonen med 3,8 kb EhafQa-innskuddet, kalles pGB-Phl, sekvensen til innskuddet er gitt i sekvens-listen (SEK ID NO: 13, hvori Sall-setet starter i posisjon 587 og EcuRI-setet i 4315). 3,8 kb EcoRI-Sall-fragmentet klonet i plasmid pTZ18R i F. r, oli-TM10Q ble deponert hos Centraal Bureau voor de Schimmelcultures in Baarn, The Netherlands 5. oktober 1992, under deposisjonsnummer CBS 442.92.

Den klonede sekvensen inneholdt ikke 5'-delen av aktin-genet, og promotoren er vist ved sammenligning med DNA-sekvensen med kjente aktin-gensekvenser (Deshler et al. (1989). Mol. Cell. Biol. 2:2208-2213 og NG R. og J. Abelson (1980). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 12:3912-3916). Vi bestemte derfor å plukke opp og klone et annet DNA-fragment i 5'-enden til genklonen, aktin-promotorklonen.

Fksempel 6

Kinning av Phaffia- aktinprom ntoren ved hjelp av i nvers PCR Kromosomalt DNA fra Phaffia rhndnzyma (stamme CBS 6938), ble spaltet med Xhol. En mengde på 100 ng totalt kromosomalt DNA x XhnT ble koblet i et volum på 50 ( il med 1,9 U T4-ligase (BRL) i koblingsbuffer (BRL). Koblingsblandingen ble konsentrert ved hjelp av etanolfelling, og DNA ble løst opp i 10 fil H2O.

XhoJ-spaltingen ble valgt på basis av resultatet fra restriksjonskartet til det klonede aktin-genet fra Phaffia og hybridiseirngsstudier med spaltet kromosomalt DNA (fig. 1).

Xhol-spaltet DNA, når det ble hybridisert med 500 bp Sall-RamHI-fragmentet til aktinklonen, resulterte i et 3,1 kb hybridiseirngsbånd. 3,1 kb Xhoi-båndet består av et kjent Sall-XhoI-fragment på 1,4 kb og et 1,7 kb fragment 5' som flankerte SalT-setet. 01igo'ene ble laget på basis av den kjente sekvensen, en 60 bp nedstrøms for Sall-setet og den andre 60 bp oppstrøms for XlioJ-setet (fig. 2).

Phaffia-DNA ble spaltet med XhøJ, fenolekstrahert, utfelt med EtOH og løst opp til en konsentrasjon på 50/Ag/ml. Et total på < 100 ng i 50fi\, ble koblet over weekenden ved 14°C og benyttet som startmateriale for PCR-reaksjonene. I den inverse PCR (polymerasekjedereaksjon) benyttet vi 10-40 ng XhnT spaltet og ligert kromosomalt DNA og 0,5 fig av hver oligo (nr.: 3390, 3391, SEK ID NO: 5 og 6). PCR ble utført som beskrevet ovenfor, PCR-betingelsene var 2 min. 94°C, 2 min. 55°C, 3 min. 72°C i 25 cykluser og et annet forlengelsestrinn i 7 min. ved 72°C.

Et PCR-produkt med den forventede lengden på 1,8 kb ble funnet. DNA ble isolert fra en lav geldannende agarosegel med Magic PCR prep kit (Promega). DNA ble spaltet med Sali og XhnT og koblet til Sall-setet i PTZ18R. Koblingsblandingen ble transformert til kompetente E. coli JM109-celler. Fremstilling av de kompetente celler ble utført med DMSO-fremgangsmåten, og cellene ble sådd ut på LC<+->skåler med 100 ug/ ml Amp og 0,1 mM IPTG/50 pg/ml X-gal. Plasmid-DNA ble isolert fra hvite kolonier, og innskuddene kartlagt ved hjelp av restriksjonsanalyse. Klonen pGB-Ph2 med aktinpromotorfragmentet, ble delvis sekvensert (sekvensliste, SEK ID NO: 13 fra start til Sall-sete i posisjon 587).

Aktin-genet og promotoren ble klonet i to fragmenter. Aktinpromotorfragmentet ender med et Sall-sete, og aktin-genfragmentet starter med et Sall-sete. Fordi vi ikke klonet de flankerende sekvensene til dette Sall-sete, var vi ikke sikre på at det kun er ett Sall-sete. Det er mulig at der er to eller flere Sall-seter på en liten bit av sekvensen. For å være sikre på at dette ikke er tilfelle, klonet vi Sali-flankerende områder ved å utføre en PCR på kromosomalt DNA. To oligo'er (no: 3457, 3475, SEK ID NO: 7 og 8) ble benyttet, og de forøket et 660 bp kromosomalt DNA-fragment (fig. 2). Dette PCR-produkt ble klonet likeendet inn i Smal-setet til PTZ18R og sekvensert. Sekvensen viste oss at der er kun ett Sall-sete, og at promotoren og genklonen passer perfekt.

Eksempel 7

Karakterisering av aktin- genet

Aktinpromotoren og genet er tilstede på en 5,6 kb klonet Phaffia-DNA-sekvens. På basis av homologi med K. lactis og S^cerevisiae-aktinsekvensene (Deshler et al, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2208-2213 og NG R. og J. Abelson, 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 22:3912-3916) og det kjente "splice"-konsensussete (Rambosek, J. og J. Leach, 1987, Crit. Rev. Biotechnol., 6:357-359 og J.L. Woolford, 1989, Yeast, 5:439-457), ble intronene og det mulige ATG-startsete postulert.

For å bekrefte disse antagelsene, ble et 5'-"primer"-forlengelseseksperiment (se eksperimentell del) utført på Phaffia-RNA med<32>P-merket oligo no: 3457 (SEK ID NO: 7) og på S cerevisiae-RNA med aktinoligo no: 3538 (SEK ID NO: 10) som positiv kontroll. "Primer"-forlengelsesproduktene ble analysert på en sekvensgel ved siden av en kjent sekvens. På basis av lengden til den kjente sekvensen, kan lengden av "primer"-forlengelsesproduktene kalkuleres. Den positive kontrollen SL cerevisiae ble funnet å ha en lengde på 185 bp foran ATG. En lengde på 140 ± 30 bp er beskrevet (Ng og Abelson, eit. ovenfor) som er i samme område. RNA-lederen til PJaaffia-aktin foran ATG, var omtrent ± 115 bp.

Ved omhyggelig DNA-analyse ble et sannsynlig ATG-startkodon funnet. Dette postulerte at korrekte ATG ble undersøkt ved hjelp av PCR. Flere oligo'er plassert i introner og eksoner i områdene til det antatte ATG, ble laget. PCR ble utført med den normale PCR-protokollen på RNA isolert fra Phaffia Resultatene ble DNA-bånd med ulike lengder (se tabell 2).

Tabell 2. Resultater fra PCR-eksperimentene for å identifisere ATG-startsetet i PJiaffia-aktin.

Oligosettet 3457-3500 (SEK ID NO: 7 og 9) plassert på en antatt intron, ga ikke et PCR-bånd med RNA som templat. Oligosett 3457-3475 (SEK ID NO: 7 og 8) var i stand til å binde til cDNA ifølge lengden til RNA-lederen (5'-"primer"-forlengelse), men ga ikke et PCR-bånd med RNA som templat. 01igo'ene 3618 og 3619 (SEK ID NO: 11 og 12) konstruert på basis av en eksonsekvens, bandt både til DNA og RNA som templat.

Aktin-genet har 4 introner (fig. 3) og en lengde på 375 aminosyrer (for bp og aa-sekvens se SEK ID NO: 13 og 14), dette er i motsetning til K. lactis og cexevisiae-aktin-genene som har kun 1 intron og består henholdsvis av 375 aminosyrer og 374 aminosyrer.

Homologien med ELJaciis-aktin er 85% på proteinnivået, men 3'setet er mindre homologt enn 5'-setet, hvor kun 5 aminosyrer av de første 100 aminosyrer adskiller seg.

Fksempel 8

Plasmidknnstmksjnner med bruk av aktinprnmntnren

For å unngå problemer for å lage optimale konstruksjoner, som har en nøyaktig forbindelse mellom promotorsekvensene og markørgenet(ene) og klonig av PJiaffia-termineringssignalene, bestemte vi oss for å konstruere fusjonsgener. I litteraturen har slike konstruksjoner blitt beskrevet med G418 (Chen, XJ. og H. Fukuhara, 1988, Gene, 62:181-192) og mellom lac-Z-genet og fleomycingenet (Baron et al., 1992, Gene, 114:239-243). Disse fusjoner uttrykte markørgenet meget effektivt.

Kinning av marknrgenene

Plasmid pGB-Phl ble spaltet med RamHI eller med Xhol, fortynnet og koblet for å oppnå plasmider som har ulike delesjoner i det strukturelle aktin-genet. Dette resulterte i plasmid pGB-Ph3 som har en BamHI-delesjon på 3246 bp og plasmid pGB-Ph4 som har en XhoJ-delesjon på 2048 bp i de strukturelle og 3' ikke-kodende sekvensene til aktin-genet (se kloningsdiagrammer i fig. 4 og fig. 5).

Plasmidene pUCG418 og pUT701 ble benyttet som donorplasmider for henholdsvis 1,1 kb G418 JiamHI-fragmentet og 0,9 kb fleo RamHI-Bglll-fragmentet. Fragmentene ble isolert ved elektroforese og agarose-behandling som beskrevet i den eksperimentelle delen.

Plasmidene pGB-Ph3 og pGB-Ph4 ble spaltet henholdsvis med RamHI og BgHI som er unike (har kun ett sete) i disse plasmidene.

Fleo-fragmentet (som omfatter sin egen ATG-startkodon) ble koblet inn i BamHI-setet i posisjon 472 til det strukturelle aktin-genet i pGB-Ph3, og G418-fragmentet (inkluderer sin egen ATG-startkodon) ble koblet inn i BgUI-setet i posisjon 934 til det strukturelle aktin-genet i pGB-Ph4. Etter transformasjon i K coli, ble kolonier som inneholdt plasmidet av interesse, funnet ved hjelp av hybridisering.

Restriksjonsanalyser fremviste de forventede plasmidene pGb-Ph5 (G418) og pGB-Ph6 (fleo). Sekvensering bekreftet at fusjonene var korrekte.

Kloning av aktinpromotoren foran fiisjonskonstruksjonene

Plasmid pGB-Ph2, som inneholdt aktinpromotoren og videre oppstrøms-sekvenser, og plasmid pGB-Ph5, som inneholdt aktin-G418-fusjonen, ble begge spaltet med Hindlll og Sali. Fragmentene av interesse, dvs. 1,8 kb aktin-promotoren og 5,2 kb fusjons-skjelettfragmentet, ble isolert som beskrevet og koblet sammen. Dette resulterte i plasmid pGB-Ph7 (fig. 5).

DNA isolert fra E. coli-transformanter inneholdt et plasmid med den forventede lengde. Restriksjonsanalyse med Hindlll x Sali, BamHI og EcoRV, bekreftet at plasmidet som ble funnet var riktig.

For å oppnå fleo-konstruksjonen, ble begge plasmidene pGB-Ph2 og pGB-Ph6 spaltet med EcoRI og Sali, og fragmentene, dvs. 1,4 kb fusjonsfragmentet og 4,6 kb promotor-skjelett-fragmentet, ble isolert og koblet sammen. Etter transformasjon i F. coli, ble DNA isolert fra vilkårlig valgte kolonier analysert ved hjelp av spalting med restriksjonsenzymer. På denne måten ble plasmidet pGB-Ph8 identifisert (fig. 4).

Rekloning av 3 kh SacI- rDN A- fragmentet til P. rhodnzyma

For å finne frem til plasmider som inneholdt andre Phaffia-sekvenser, klonet vi et 3 kb SacJ-rDNA-fragment som førte til plasmid pGB-Phll som beskrevet ovenfor.

Vi isolerte på nytt rDNA-fragmentet fra dette plasmid, og koblet det til SacJ-spaltingsproduktene til pGB-Ph7 og 8. Etter transformasjon i E^coli, ble plasmidene pGB-Ph9 og 10 isolert. For restriksjonskart over plasmidene pGB-Ph7 til 10, se fig. 4 og 5. ( F. coli som inneholdt pGB-Ph9, ble deponert i Centraal Bureau voor de Schimmelcultures in Baarn, The Netherlands 23. juni, 1993, under nummer CBS 359.93).

Eksempel

Transformasjonseksperimenter med bruk av Phaffia- aktin- genet

koblettil fleo- resistensmarkt* ren

Som fremstilt i tabell 3, var vi istand til å utvikle transformanter med en meget lav frekvens når vi brukte fremgangsmåten der vi koblet Phaffia-aktin-genet til fleo-markøren. Transformasjon ble utført som beskrevet i eksempel 2 med følgende modifikasjoner.

0,7 M KC1 -10 mM sitronsyre pH 6,2, ble erstattet med 1M sorbitol, inkubasjon med Novozym 234 skjedde i 10 til 20 min.,

plasmider ble lineariserte før transformasjon,

før utsåing ble protoplastene resuspendert i 0,5 ml YePDS og inkubert i 1-2

timer ved romtemperatur.

Protoplaster ble fortynnet i 5 ml 0,7% lavgel-temperatur- agarose/1 M sorbitol (holdt ved 37°C) og straks helt over på osmotisk stabiliserte (1M sorbitol) selektive agarskåler.

Alternativt ble protoplastene sådd ut på toppen av dobbeltlagskåler, dvs. 15 ml YEPD-bunn-agar som inneholdt en selektiv mengde med den nødvendige antibiotikum, og 1 M sorbitol + etter størkning, 15 ml YEPD-agar som inneholdt 1M sorbitol uten antibiotika.

Vi benyttet også en kortere protoplastdannende periode som øket regenera-sjonen fra + 0,5% til 5-10%. For å bekrefte transformasjon, isolerte vi total-DNA

(som beskrevet) fra flere transformanter fra fem uavhengige transformasjonseksperimenter, dyrket under selektive betingelser, dvs. YEPD+0,1-0,2 [ ig fleomycin pr.ml.

Tabell 3. Antall transformanter i ulike transformasjonseksperimenter etter 4-5

dagers inkubasjon på selektive agarskåler

(1 fig fleomycin/ml).

~ = ikke tilsatt DNA, nd = ikke gjort,<*>= protoplaster ikke sådd i agarose og selektert på 5/ig/ml fleo på tolags agarskåler.

Kromosomalt DNA ble spaltet med både BamHT og KcoRI, og etter overnatts elektroforese blottet over på nitrocellulose og hybridisert med tre ulike prober, dvs. pTZ18R, et 430 bp BamHI-SM-fleo-fragment og et 1,8 kg B^mHI-Sall-aktinpro-motorfragment. Som vist i fig. 6, viser tre av de undersøkte DNA'ene et spesifikt signal med pTZ18R-proben, og minst ett DNA viser et tydelig signal med fleoproben Aktinproben viser det forventede 2,2 kb båndet og noen andre uforklarlige bånd.

Fksem<p>el 10

Transformasjon av totalt Phaffia- DNA fra transformanter til R coli F. coli-.TMIOQ ble transformert med de totale DNA-isolatene til et antall av transformanter fra eksempel 9. Overraskende fant vi transformanter i F. coli med noen av DNA-prøvene. I ett tilfelle fant vi transformanter i F. coli med et totalt DNA-preparat som viste ingen hybridiseringssignal med hensyn til pTZ18R og fleomycin. Vi isolerte plasmid-DNA'et ved Qiagen-metoden og analyserte det ved hjelp av restriksjon og hybridisering.

Resultatene viste at vi isolerte plasmider som hadde blitt rearrangert. I to av tre tilfeller inneholdt plasmidet flere (av det samme?) aktinfragmenter og manglet fleomycin-sekvensen.

Den totale lengde var 11 kb som er + 5 kb lengere enn plasmidet som vi benyttet for transformasjonen. Det tredje plasmidet hadde ikke lenger fleomycinet og aktinsekvensene og var 1 kb mindre.

Det kan konkluderes at det eksisterer en strukturell ustabilitet i fleo-plasmidene som ble transformert til Phaffia.

Fksempel 11

Phaffia- transformasjon med aktm- G418- fiisjorier med hmk av litinmmetoden med lineariserte plasmider

Flere transformasjonseksperimenter med bruk av LiCl-metoden, som den ble benyttet for transformasjon av S. cerevisiae og K. lactis, ble utført (se eksperimentell del). Konstruksjonen benyttet var pGB-Ph7 linearisert med FcoRV inne i promotorsekvensen (fig. 6).

Linearisering ble utført i promotorsekvensen for å sikre integrering i aktin-lokus i Phaffia-genomet. Etter transformasjon ble cellene sådd ut på YEPD-skåler med G418. Standard- fremgangsmåten ga ingen transformanter med Phaffia-CBS 6938. Transformasjon ble utført som beskrevet i eksempel 2 med de følgende modifikasjoner.

0,7 M KC1 -10 mM sitronsyre pH 6,2, ble erstattet med 1 M sorbitol, inkubasjon med Novozym 234 var mellom 10 og 20 min.,

plasmider ble linearisert før transformasjon,

før utsåing ble protoplastene resuspendert i 0,5 ml YEPDS og inkubert i 1-2

timer ved romtemperatur,

hygromycin ble ikke benyttet som seleksjonsmarkør.

Protoplaster ble fortynnet i 5 ml 0,7% lavgel-temperatur-agarose/1 M sorbitol (holdt ved 37°C) og straks helt over på osmotisk stabiliserte (1 M sorbitol) selektive agarskåler.

Alternativt ble protoplastene sådd ut på toppen av tolags skåler, dvs. 15 ml YEPD-bunn-agar som inneholdt en selektiv mengde av det nødvendige antibiotikum og 1 M sorbitol + etter størkning, 15 ml YEPD-agar som inneholdt 1M sorbitol uten

antibiotikum.

Det ble bestemt å benytte LiAc-fremgangsmåten (skål-metoden, se eksperimentell del) og å variere ulike faktorer i protokollen, og i denne protokollen blir PEG og litium inkuberingen utført samtidig og over natt eller lengere.

De følgende faktorene ble variert;

G418-konsentrasjon, antall celler,

DNA-konsentrasjon, celletettheten ved høsting,

YEPD-inkubasj onstid.

Transformasjonseksperimentene i tabell 4 ble utført med plasmid pGB-Ph9.

Tabell 4. Resultater fra transformasjonseksperimentene ved bruk av pGB-Ph9

og skål-metoden.

A = 10" celler/eksp., B = = D60o, C = mengde DNA(plasmid), D = G418-konsentrasjon, E = YEPD-inkubasj onstid, T = antall transformanter.

Kulturer for kromosomale DNA-isolater ble gjort fra;

2 kolonier av CBS 6938

2 kolonier av CBS 6938 uten G418,

2 kolonier fra kjøring 1 (er negativ kontroll)

10 kolonier fra kjøring 2

2 kolonier fra kjøring 3 (er negativ kontroll)

10 kolonier fra kjøring 4

Alle kolonier ble dyrket i 20 ml YEPD-medium med 25 fig G418/ml (bortsett for CBS 6938). Etter 4 dager ved romtemperatur var det noen kolonier som ikke

eller knapt grodde:

3a / 3 b (neppe) / 4b / 4d (neppe) / 4i (neppe) / 4j / CBS 6938 (på G418).

Kromosomale DNA-isolater ble laget fra alle kulturer som vokste eller vokste svakt. DNA fra 2e var degradert. For Southern blot ble alle DNA'ene spaltet med BamHT og blottet. På denne måte ble 3 blott laget. De ble hybridisert med ulike prober.

Blott 1: PTZ-probe (fig. 7A)

Blott 2: G418-probe (fig. 7B)

Blott 3: rDNA-probe (fig. 7C)

Resultatene av blottene er vist i figurene.

Blottet som ble hybridisert med PTZ-proben (fig. 7A) skulle i tilfelle med transformanter vise et ± 2,8 kb-bånd. En av 15 mulige transformanter i blott 12, ga det riktige signalet. De andre 3 ga ikke noe signal i det hele tatt. De 3 negative kontrollene (CBS 6938, lb og 3b) ga ikke noe signal.

Blottet som hybridiserte med G418-proben (fig. 7B) skulle i tilfelle med transformanter vise et ± 2,4 kb-bånd. De samme 12 som med PTZ-proben, ga det riktige båndet. De andre 3 ga ikke noe signal. De negative kontrollene ga heller ikke noe signal.

Hvis de ble hybridisert med rDNA-proben (fig. 7C), viste de 12 DNA'ene som ga de riktige båndene med de andre to probene, alle sammen et ± 8,5 kb-bånd og et ± 5,2 kb-bånd. De andre 3 og de negative kontrollene viste bare et ± 8,5 kb-bånd som forventet.

Plasmidet (pGB-Ph9), benyttet i de ovenfor nevnte transformasjons-eksperimentene, inneholdt G418-genet under kontroll av Ehaffia-aktinpromotoren. I tillegg inneholder dette plasmidet et Phaffia-rDNA-sekvens. Det høye utbytte av transformanter antyder at plasmidet bevares ekstra kromosomalt. Dette antyder at rDNA-sekvensen inneholder en ARS. Dette ville korrespondere med funnet av at rDNA-sekvensen til S c . er . inneholder en ARS.

Phafia rhodo7yma transformert med pGB-Ph9, ble deponert i Centraal Bureau voor de Schimmelcultures, Barn, the Netherlands, 15. mai 1993 under nummer CBS 303.93.

Claims (12)

1. Phaffia celle,karakterisert vedat den er transformert med DNA, idet DNA omfatter: a) et ønsket gen som skal bli uttrykt i nevnte Phaffia celle, b) en Phaffia promoter heterolog med nevnte ønskede gen som skal bli uttrykt og som er i operabel kobling dermed.

2. Phaffia celle ifølge krav 1,karakterisert vedat Phaffia promoteren er aktinpromoteren.

3. Phaffia celle ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat nevnte DNA videre omfatter en seleksjonsmarkør.

4. Phaffia rhodozyma,karakterisert vedat den er CBS 303.93.

5. E. coli,karakterisert vedat den er CBS 359.93.

6. E. coli,karakterisert vedat den er CBS 442.92.

7. Fremgangsmåte for transformering av Phaffia,karakterisert vedat den omfatter: dyrking av Phaffia celler til eksponensialfasen, fremstilling av protoplaster fira disse cellene, tilsetting av en vektor inneholdende et ønsket gen klonet nedstrøms fra en Phaffia promotor heterolog for nevnte ønskede gen, utsåing av protoplaster på et selektivt regenereringsmedium, selektering av transformerte Phaffia celler.

8. Fremgangsmåte for transformering av Phaffia, karakterisert vedat den omfatter: dyrking av Phaffia celler til ønsket tetthet, høsting av cellene, inkubering av cellene med transformerende DNA omfattende et ønsket gen klonet nedstrøms fra en Phaffia-promoter i nærvær av litiumacetat, utsåing av blandingen på selektive skåler, selektering av transformerte Phaffia celler.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av Phaffia celler inneholdende en mengde av et ønsket protein eller karotenoid,karakterisert vedat den omfatter: transformering av Phaffia celler med en vektor som inneholdende et ønsket gen klonet nedstrøms fra en Phaffia-promoter som kan være et proteinkodende gen eller et regulatorisk gen, selektering av transformerte celler, dyrking av transformerte celler under egnede betingelser for å fremstille et ønsket protein eller karotenoid.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket produkt,karakterisert vedat den omfatter dyrking av transformerte Phaffia celler ifølge krav 1 til 3 under ønskede betingelser for å fremstille ønskede produkt.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat det ønskede produktet er et protein.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat det ønskede produktet er et karotenoid.