DE69633343T2

DE69633343T2 - Verbesserte verfahren zur transformation von phaffiastämmen,transformierte phaffiastämme auf diese weise erhaltend, und rekominante dns in besagtem verfahren verwendbar

Info

Publication number: DE69633343T2
Application number: DE69633343T
Authority: DE
Inventors: Albert Johannes Joseph Van Ooijen; Jan Cornelis Verdoes; Jan Wery
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2016-12-24
Also published as: EP1640456A3; US7205123B2; US20040091958A1; EP0870042B1; DE69633343D1; ATE275632T1; ES2229288T3; AU1308797A; US6329141B1; AU725340B2; CA2241267C; EP1640456A2; CA2241267A1; EP0870042A1; WO1997023633A1; JP2000507087A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Transformieren von Phaffia-Hefe, transformierte Phaffia-Stämme sowie eine rekombinante DNA zur Verwendung darin.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zum Transformieren der Hefe Phaffia rhodozyma sind in EP-A-0 590 707 beschrieben. Diese Verfahren beinhalten das Inkubieren von Protoplasten mit DNA oder die Inkubation von Phaffia-Zellen mit DNA unter anschließender Behandlung mit Lithiumacetat. Die rekombinante DNA, die zum Transformieren von Phaffia-Stämmen nach einem dieser Verfahren verwendet wird, besteht aus einem Phaffia-Actin-Gen-Promotor zur Steuerung der Expression der selektierbaren Markergene, die für Resistenz gegen G418 oder Phleomycin kodieren. Die Verfahren beinhalten lange Inkubationszeiten mit PEG und Lithiumacetat und es ergeben sich niedrige Transformationsfrequenzen. Bei Verwendung von Protoplasten ist die Transformationsfrequenz von der Qualität der Protoplastensuspension abhängig, was das Verfahren wenig zuverlässig macht.
Kürzlich wurde von J. L. Adrio und M. Veiga (Biotechnology Techniques, Bd. 9, Nr. 7 (Juli 1995), S. 509–512) über ein Verfahren zum Transformieren von Phaffia-Stämmen berichtet. Bei diesen Verfahren liegen die Transformationsfrequenzen im Bereich von 3 bis 13 Transformanten pro μg DNA, was wenig ist. Ein weiterer Nachteil des von diesen Autoren beschriebenen Verfahrens besteht in einer verlängerten Verdopplungszeit der transformierten Zellen. Die Autoren stellten die Hypothese auf, dass dies auf eine Störung der Chromosamenreplikation durch den autonom replizierenden Vektor zurückzuführen sein könnte.
J. Adrio und M. Veiga (An. Real Acad. Farm., Bd. 61 (1995), S. 463–471) berichteten über erhöhte Phaffia-Transformationsfrequenzen bei Verwendung des Phosphoglycerat-kinase-Promotors und -Terminators von Saccharomyces cerevisiae. Jedoch besteht der Nachteil dieses Verfahrens darin, dass die auf diese Weise erhaltenen transformierten Phaffia rhodozyma-Transformanten eine schlechte Resistenz gegen G418 zeigen.
Somit besteht ein klares Bedürfnis nach einem zuverlässigen und wirksamen Verfahren zur Transformation von Phaffia-Stämmen mit fremder DNA. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren und Mittel zur Erreichung dieses Ziels bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Optimierung der Expression bestimmter Gene in Phaffia rhodozyma, um Phaffia zu einem geeigneteren Produktionswirt für bestimmte wertvolle Verbindungen zu machen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung eines transformierten Phaffia-Stammes bereitgestellt, das folgende Stufen umfasst: Kontaktieren von Zellen oder Protoplasten eines Phaffia-Stammes mit rekombinanter DNA unter Bedingungen, die zu deren Aufnahme führen, wobei die rekombinante DNA einen Transkriptionspromotor und in funktioneller Verknüpfung damit eine zu exprimierende stromabwärtige Sequenz, die zum Transkriptionspromotor heterolog ist, und das Identifizieren von Phaffia rhodozyma-Zellen oder -Protoplasten, die die rekombinante DNA in exprimierbarer Form aufgenommen haben, wobei der Transkriptionspromotor eine Region umfasst, die sich stromaufwärts vom offenen Leseraster eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens befindet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei diesem hochgradig exprimiertem Phaffia-Gen um ein Gen des glykolytischen Stoffwechselwegs und vorzugsweise um das Gen des glykolytischen Stoffwechselwegs, das für Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) kodiert. Gemäß einem Aspekt der Erfindung umfasst die heterologe stromabwärtige Sequenz einen offenen Leseraster, der für Resistenz gegen ein selektives Mittel, wie G418 oder Phleomycin, kodiert.
Bei einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die rekombinante DNA ferner einen Transkriptionsterminator stromabwärts von der zu exprimierenden DNA in funktioneller Verknüpfung hiermit umfasst, wobei der Transkriptionsterminator eine Region umfasst, die sich stromabwärts vom offenen Leseraster eines Phaffia-Gens befindet. Ferner ist es bevorzugt, dass die rekombinante DNA in Form von linearer DNA vorliegt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst neben den vorstehenden Stufen die Stufe der Bereitstellung eines Elektropulses nach Kontaktieren der Phaffia-Zellen oder -Protoplasten mit DNA.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein transformierter Phaffia-Stamm bereitgestellt, der zu einer hochgradigen Expression einer heterologen DNA-Sequenz befähigt ist, wobei der Stamm durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich ist. Vorzugsweise enthält dieser Phaffia-Stamm mindestens 10 Kopien der rekombinanten DNA, die in dessen Genom, z. B. ein Chromosom, insbesondere in den ribosomalen DNA-Locus des Chromosoms, integriert sind.
Die Erfindung stellt ferner eine rekombinante DNA bereit, die einen Transkriptionspromotor und in funktioneller Verknüpfung damit eine zu exprimierende stromabwärtige heterologe Sequenz umfasst, wobei der Transkriptionspromotor eine Region umfasst, die stromaufwärts vom offenen Leseraster eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens, vorzugsweise eines Gens des glykolytischen Stoffwechselweges und insbesondere eines Gens, das für Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase kodiert, auftritt.
Ferner wird erfindungsgemäß eine rekombinante DNA bereitgestellt, wobei die heterologe stromabwärtige Sequenz einen offenen Leseraster umfasst, der für eine verringerte Empfindlichkeit gegen ein selektives Mittel, vorzugsweise G418 oder Phleomycin, kodiert. Diese rekombinante DNA umfasst ferner vorzugsweise einen Transkriptionsterminator stromabwärts von der zu exprimierenden heterologen DNA-Sequenz in funktioneller Verknüpfung hiermit.
Weitere Aspekte der Erfindung betreffen einen Mikroorganismus, in dem die erfindungsgemäße rekombinante DNA enthalten ist, vorzugsweise Phaffia-Stämme und insbesondere Phaffia rhodozyma-Stämme sowie Kulturen hiervon.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden isolierte DNA-Fragmente bereitgestellt, die ein Phaffia-GAPDH-Gen oder ein Fragment davon enthalten, sowie die Verwendung eines derartigen Fragments zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Konstrukts. Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts handelt es sich bei dem Fragment um eine regulatorische Region, die sich stromaufwärts oder stromabwärts vom offenen, für GAPDH kodierenden Leseraster befindet und die in Verbindung mit der unter ihrer Kontrolle zu exprimierenden heterologen Sequenz verwendet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Pigments bereitgestellt, indem man einen Phaffia-Stamm unter Bedingungen, die zur Bildung des Proteins oder des Pigments führen, züchtet, wobei es sich bei dem Phaffia-Stamm um einen erfindungsgemäß transformierten Phaffia-Stamm handelt.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren bereitgestellt, mit dem ein transformierter Phaffia-Stamm erhalten wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
Kontaktieren von Zellen oder Protoplasten eines Phaffia-Stammes mit rekombinanter DNA unter Bedingungen, die zu deren Aufnahme führen,
wobei die rekombinante DNA einen Transkriptionspromotor und in funktioneller Verknüpfung damit eine zu exprimierende stromabwärtige Sequenz umfasst,
Identifizieren von Phaffia rhodozyma-Zellen oder -Protoplasten, die die rekombinante DNA in exprimierbarer Form aufgenommen haben,
wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz eine isolierte DNA-Sequenz umfasst, die für ein Enzym kodiert, das am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt ist. Vorzugsweise weist dieses Enzym eine Aktivität auf, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Geranylgeranylpyrophosphat-synthase (crtE), Phytoen-synthase (crtB), Phytoen-desaturase (crtI) und Lycopen-cyclase (crtY), vorzugsweise ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 17 und SEQ. ID. NO: 19. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Transkriptionspromotor heterolog zur isolierten DNA-Sequenz, z. B. einem Gen des glykolytischen Stoffwechselweges in Phaffia. Besonders bevorzugt gemäß dieser Ausführungsform ist der Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase(GAPDH)-Gen-Promotor.
Ferner wird ein transformierter Phaffia-Stamm bereitgestellt, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist und zur Expression und vorzugsweise zur Überexpression der DNA-Sequenz befähigt ist, die für ein Enzym kodiert, das am Gen des Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweges beteiligt ist.
Die Erfindung betrifft ferner rekombinante DNA, die eine erfindungsgemäße isolierte DNA-Sequenz, vorzugsweise in Form eines Vektors, enthält.
Beansprucht wird ferner die Verwendung eines derartigen Vektors zur Transformation eines Wirts, z. B. eines Phaffia-Stammes.
Ein Wirt, der durch Transformation, vorzugsweise eines Vorfahren, unter Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 befähigt ist, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung, wobei der Wirt vorzugsweise zur Überexpression der erfindungsgemäßen DNA befähigt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Expression eines Enzyms, das am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt ist, bereitgestellt, indem man einen erfindungsgemäßen Wirt unter Bedingungen, die zur Bildung des Enzyms führen, züchtet. Ferner wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Carotinoids bereitgestellt, indem man einen erfindungsgemäßen Wirt unter Bedingungen, die zur Bildung eines Carotinoids führen, züchtet.
Die beigefügten Figuren dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beschreibung der Figuren
1: Kartierung der Restriktionsstellen um das Phaffia rhodozyma-GAPDH-Gen. Mit Ethidiumbromid gefärbtes 0,8%-Agarosegel (A) und Southern-Blot von chromosomaler DNA (B) und Cosmid pPRGDHcos1 (C), verdaut mit verschiedenen Restriktionsenzymen und hybridisiert mit dem 300-bp-PCR-Fragment des Phaffia rhodozyma-GAPDH-Gens. Bahn 1: DNA xKpnI; 2: xPstI; 3: xSmaI; 4: xSphI; L: lambda-DNA, verdaut mit BstEII; 5: xSstI; 6: xXbaI; und 7: xXhoI.
Der Blot wurde in 6 × SSC, 5 × Denhardt, 0,1% SDS, 100 ng/ml Heringssperma-DNA bei 65°C hybridisiert und mit 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Die Expositionszeit des Autoradiogramms betrug 16 h für das Cosmid und 48 h für den Blot mit einem Gehalt an der chromosomalen DNA.
2: Die Organisation der beiden Subklone; pPRGDH3 und Derivat (A) und pPRGDH6 und Derivate (B) mit einem Gehalt an (einem Teil davon) des GAPDH-Gens von Phaffia rhodozyma. Die PCR-Sonde ist durch ein ausgefülles Kästchen gekennzeichnet. Die Richtung und das Ausmaß der Sequenzbestimmung sind durch Pfeile angegeben.
Ausgefüllte Kästchen: GAPDH-Kodierungssequenz
Leeres Kästchen: 5'-stromaufwärtige und Promotorregion von GAPDH
Leeres Kästchen: 3'-nicht-kodierende Phaffia rhodozyma-GAPDH-Sequenz
Durchgezogene Linie: GAPDH-Intron
Schraffiertes Kästchen: Polylinker mit einem Gehalt an Stellen für verschiedene Restriktionsenzyme
Gestrichelte Linie: deletierte Fragmente
3: Klonierungsdiagramm des Phaffia-Transformationsvektors: pPR2
Ausgefülltes Kästchen: 5'-stromaufwärtige und Promotorsequenz von GAPDH
Schraffiertes Kästchen: G418
Durchgezogene Linie: pUC19
Leeres Kästchen: ribosomale DNA von Phaffia rhodozyma
Nur für die Klonierung verwendete Restriktionsstellen sind angegeben.
4: Konstruktion von pPR2 aus pPR2T
Ausgefülltes Kästchen: (BamHI-HindIII-Fragment): GAPDH-Transkriptionsterminator von Phaffia
Sämtliche übrige Kästchen und Linien wie in 3. Nur relevante Einzelheiten sind dargestellt.
5: Ausführliche physikalische Karte von pGB-Ph9. bps = Basenpaare; rDNA = ribosomaler DNA-Locus von Phaffia; act. pro 2 = Actin-Transkriptionspromotor; act. 1: 5'-nicht-translatierte und aminoterminale Region des offenen Leserasters; NON COD. = Nichtcodierungsregion stromabwärts vom G418-Gen.
6: Ausführliche physikalische Karte von pPR2. GPDH pro = GAPDH-Transkriptionspromotorregion aus Phaffia. Die weiteren Symbole entsprechen den Angaben zu 5.
7: Ausführliche physikalische Karte von pPR2T. Tgdh = GAPDH-Transkriptionsterminator von Phaffia. Sämtliche übrigen Symbole entsprechen den Angaben zu den 5 und 6.
8: Überblick über den Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg von Erwinia uredovora.
9a: Darstellung von cDNA-Fragmenten und einer Restriktionsenzymkarte der Plasmide pPRcrtE (A); pPRcrtB (B), pPRcrtI (C) und pPRcrtY (B).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt allgemein ein Verfahren zur Gewinnung eines transformierten Phaffia-Stammes bereit, das folgende Stufen umfasst: Kontaktieren von Zellen oder Protoplasten eines Phaffia-Stammes mit rekombinanter DNA unter Bedingungen, die zu deren Aufnahme führen,
wobei die rekombinante DNA einen Transkriptionspromotor und in funktioneller Verknüpfung damit eine zu exprimierende stromabwärtige Sequenz, die zum Transkriptionspromotor heterolog ist, umfasst,
Identifizieren von Phaffia rhodozyma-Zellen oder -Protoplasten, die die rekombinante DNA in exprimierbarer Form aufgenommen haben,
wobei der Transkriptionspromotor eine Region umfasst, die stromaufwärts vom offenen Leseraster eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens auftritt.
Um die verschiedenen Wege zur Durchführung zu erläutern, werden nachstehend einige Ausführungsformen herausgestellt und die Bedeutung oder der Bedeutungsumfang bestimmter Ausdrücke wird erläutert.
Die Bedeutung des Ausdrucks "rekombinante DNA" ist auf dem Gebiet der gentechnischen Modifikationen bekannt und bedeutet, dass ein DNA-Molekül bereitgestellt wird, das einzel- oder doppelsträngig, linear oder kreisförmig, mit einem Strangbruch (Nick) versehen oder anderweitig beschaffen ist, wobei das charakteristische Merkmal darin besteht, dass mindestens zwei Fragmente unterschiedlichen Ursprungs verbunden werden. Eine derartige Verbindung wird üblicherweise, jedoch nicht notwendigerweise in vitro vorgenommen. Somit fallen unter den Umfang der Ansprüche Moleküle, die DNA aus verschiedenen Organismen oder aus verschiedenen Genen des gleichen Organismus oder sogar aus unterschiedlichen Regionen des gleichen Gens umfassen, vorausgesetzt, dass die Regionen in der Natur nicht benachbart sind. Die erfindungsgemäße rekombinante DNA ist durch einen Transkriptionspromotor gekennzeichnet, der sich stromaufwärts von einem offenen Leseraster eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens befindet und mit einer heterologen DNA-Sequenz fusioniert ist. Unter heterolog ist zu verstehen, dass die Bestandteile in der Natur nicht benachbart sind. Somit kann die heterologe DNA-Sequenz aus unterschiedlichen Organismen, aus unterschiedlichen Genen des gleichen Organismus oder sogar aus dem gleichen Gen wie der Promotor stammen, vorausgesetzt, dass die stromabwärtige Sequenz modifiziert worden ist, üblicherweise in vitro. Bei einer derartigen Modifikation kann es sich um eine Insertion, Deletion oder Substitution handeln, die das kodierte Protein und/oder dessen Eintritt in den Sekretionsweg und/oder dessen posttranslationale Prozessierung und/oder dessen Codonverwendung beeinflusst.
Der erfindungsgemäße starke Transkriptionspromotor muss in funktioneller Verknüpfung mit der heterologen stromabwärtigen Sequenz stehen, um zu ermöglichen, dass die Transkriptions- und Translationsmaschinerie die Startsignale erkennt. Die Regionen stromaufwärts von offenen Leserastern von hochgradig exprimierten Phaffia-Genen enthalten TATA-artige Strukturen, die etwa 26 bis etwa 40 Nucleotide stromaufwärts von der cap-Stelle positioniert sind. Die letztgenannte Stelle entspricht der Transkriptionsstartstelle. Um somit zu ermöglichen, dass die Transkription der heterologen stromabwärtigen Sequenz an der richtigen Position beginnt, müssen ähnliche Abstände eingehalten werden. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass eine gewisse Toleranz in der Position des TATA-Signals relativ zur Transkriptionsstartstelle besteht. Typischerweise enthalten mRNAs vom eukaryontischen Typ eine 5'-untranslatierte Leadersequenz (5'-utl), bei der es sich um die Region handelt, die den Bereich von der Transkriptionsstartstelle bis zum Start der Translation umfasst. Diese Region kann von 30 bis mehr als 200 Nucleotiden variieren. Weder die Länge noch die Ursprungsstelle der 5'-utl ist sehr kritisch. Vorzugsweise weist sie 30 bis 200 Nucleotide auf. Sie kann aus dem gleichen Gen wie der Promotor stammen oder sie kann aus dem Gen stammen, das für das heterologe Protein kodiert. Es ist bekannt, dass eukaryontische Gene Signale für die Termination der Transkription und/oder Polyadenylierung stromabwärtig vom offenen Leseraster enthalten. Die Position des Terminationssignals ist variabel, liegt aber üblicherweise 10 bis 200 Nucleotide stromabwärts von der Translationsstoppstelle (das Ende des offenen Leserasters), häufiger etwa 30 bis 100 Nucleotide stromabwärts von der Translationsstoppstelle. Obgleich die Wahl des Transkriptionsterminators nicht kritisch ist, wird festgestellt, dass dann, wenn der Terminator aus einer stromabwärtigen Region eines Phaffia-Gens, vorzugsweise eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens und insbesondere aus dem für GAPDH kodierenden Gen ausgewählt wird, das Expressionsniveau sowie die Transformationsfrequenz verbessert werden.
Es wurde festgestellt, dass Klone in erheblicher Anzahl erhalten wurden, die bei sehr hohen G418-Konzentrationen (bis zu 1 mg/ml und darüber) wachsen können. Es wird die Ausdrucksweise, dass erfindungsgemäße Transkriptionspromotoren aus hochgradig exprimierten Genen stammen, verwendet, wenn sie dazu dienen können, das Wachstum von transformierten Phaffia-Zellen bei Verknüpfung mit einem G418-Resistenzgen gemäß der Offenbarung in den Beispielen in Gegenwart von mindestens 200 μg/ml, vorzugsweise mehr als 400, ganz besonders mehr als 600 und besonders bevorzugt mehr als 800 μg/ml G418 im Wachstumsmedium zu ermöglichen. Zu Beispielen für derartige Promotoren gehören zusätzlich zum Promotor stromaufwärts vom GAPDH-Gen in Phaffia die Promotoren aus Phaffia-Genen, die homolog zu hochgradig exprimierten Genen anderer Hefen, wie Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, oder Pilze, wie Trichoderma, Aspergillus, und dergl. sind. Promotoren, die die erfindungsgemäßen Anforderungen erfüllen, lassen sich aus genomischer DNA unter Anwendung molekularbiologischer Techniken, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, isolieren. Die vorliegende Erfindung stellt eine neuartige Strategie zur Isolierung von starken Promotoren aus Phaffia gemäß den folgenden Ausführungen bereit. Eine cDNA-Bibliothek wird aus Phaffia-mRNA unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt. Anschließend wird eine Anzahl von Klonen mit einem cDNA-Insert, dem DNA-Fragment (das das cDNA-Komplement der exprimierten mRNA repräsentiert), sequenziert. In der Regel repräsentieren sämtliche Fragmente exprimierte Gene aus Phaffia. Ferner sind Gene, die reichlich exprimiert werden (z. B. die glykolytischen Promotoren) in der mRNA-Population überrepräsentiert. Somit ist die Anzahl an zu sequenzierenden DNA-Fragmenten, um ein hochgradig exprimiertes Gen aufzufinden, auf weniger als 100 und vermutlich sogar weniger als 50 begrenzt. Die Sequenzierung als solche stellt eine Routineangelegenheit dar und sollte nicht mehr als einige Wochen dauern. Die aus dieser begrenzten Anzahl von Fragmenten erhaltenen Nucleotidsequenzen werden anschließend mit bekannten Sequenzen, die in elektronischen Datenbanken, wie EMBL oder Geneseq, gespeichert sind, verglichen. Wenn ein Fragment eine mehr als 50%ige Homologie über eine gegebene Länge (vorzugsweise mehr als 100 Basenpaare) aufweist, ist es wahrscheinlich, dass das Fragment das Phaffia-Äquivalent des in der elektronischen Datenbank aufgefundenen Gens repräsentiert. In von Phaffia abweichenden Hefen wurde eine Anzahl von hochgradig exprimierten Genen identifiziert. Diese Gene umfassen die Gene des glykolytischen Stoffwechselweges, die Gene für Phosphoglucoisomerase, Phosphofructokinase, Phosphotrioseisomerase, Phosphoglucomutase, Enolase, Pyruvatkinase, Alkoholdehydrogenase (EP-120 551, EP-0 164 556; S. Rosenberg et al., Meth. Enzymol., Bd. 185 (1990), S. 3410–351; M. F. Tuite, EMBO J., Bd. 1 (1982), S. 603–608; V. Price et al., Meth. Enzymol., Bd. 185 (1990), S. 308–318) und das Galactose-Regulon (S. A. Johnston et al., Cell, Bd. 50 (1987), S. 143–146). Demgemäß sollten solche Phaffia-cDNA-Fragmente verwendet werden, die in hochgradig signifikanter Weise homolog zu den hochgradig exprimierten Hefegenen sind (mehr als 40%, vorzugsweise mehr als 50 Identität in einem Vergleich einer bestmöglichen Übereinstimmung über einen Bereich von mehr als 50 und vorzugsweise von mehr als 100 Nucleotiden), um eine Genombibliothek aus Phaffia mit dem Ziel, das entsprechende Gen aufzufinden, abzusuchen. Unter Anwendung dieses Verfahrens wurden 14 hochgradig exprimierte mRNAs aus Phaffia rhodozyma in DNA kopiert, sequenziert und einem Vergleich ihrer (mutmaßlichen) offenen Leseraster im Vergleich zu Nucleinsäuresequenz- und Aminosäuresequenz-Datenbanken unterzogen. Es stellte sich heraus, dass 13 von diesen 14 cDNAs für ribosomale Proteingene kodierten, von denen eines gleichzeitig für Ubiquitin kodierte. Eine cDNA kodierte für ein Glucose-reprimiertes Gen. Die Isolation der Gene und der Promotoren, die üblicherweise stromaufwärts von den Kodierungsregionen dieser Gene auftreten, wird derzeit durchgeführt. Es wird angenommen, dass jeder dieser Transkriptionspromotoren in vorteilhafter Weise zur Expression von heterologen Genen, z. B. von Carotinoid-Biosynthese-Genen, verwendet werden kann. Zu den erfindungsgemäß besonders bevorzugten Genen und Transkriptionspromotoren gehören der Promotor, der stromaufwärts vom ribosomalen Ubiquitin-40S-Protein auftritt, entsprechend der cDNA in SEQ. ID. NO: 10, die Glucose-reprimierte cDNA gemäß der Darstellung in SEQ. ID. NO: 26, die für ribosomales 40S-Protein S27 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 28, die für ribosomales 60S-Protein P1α kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 30, die für ribosomales 60S-Protein L37e kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 32, die für ribosomales 60S-Protein L27a kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 34, die für ribosomales 60S-Protein L25 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 36, die für ribosomales 60S-Protein P2 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 38, die für ribosomales 40S-Protein S17A/B kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 40, die für ribosomales 40S-Protein S31 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 42, die für ribosomales 40S-Protein S10 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 44, die für ribosomales 60S-Protein L37A kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 46, die für ribosomales 60S-Protein L34 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 48 oder die für ribosomales 40S-Protein S16 kodierende cDNA gemäß Darstellung in SEQ. ID. NO: 50.
Promotoren aus diesen oder anderen hochgradig exprimierten Genen können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt werden, wobei man sich nur folgender routinemäßiger Maßnahmen bedient: (a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek in Bezug auf mRNA, aus einem unter geeigneten Bedingungen gezüchteten Phaffia-Stamm, (b) Bestimmen (partiell) der Nucleotidsequenz der (partiell) in Stufe (a) erhaltenen cDNAs, (c) Vergleichen der in Stufe (b) erhaltenen Sequenzdaten mit bekannten Sequenzdaten, die in elektronischen Datenbanken gespeichert sind, (d) Klonieren von mutmaßlichen Promotorfragmenten des Gens, die entweder direkt stromaufwärts vom offenen Leseraster oder direkt stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle des Gens entsprechend zur exprimierten cDNA positioniert sind, und (e) Bestätigen, ob Promotorsequenzen durch Expression eines geeigneten Markers, z. B. des G418-Resistenzgens, oder eine geeignete nicht-selektierbare "Reporter"-Sequenz stromabwärts von einem in (d) erhaltenen Fragment erhalten worden sind, Transformieren der DNA in einen Phaffia rhodozyma-Stamm und Bestimmen des Expressionsniveaus des Markergens oder der Reportersequenz von Transformanten. Es wird davon gesprochen, dass ein Transkriptionspromotor aus einem hochgradig exprimierten Gen stammt, wenn er dazu befähigt ist, Phaffia rhodozyma-Zellen, die mit einem DNA-Konstrukt transformiert sind, das den Promotor in stromaufwärtiger Verknüpfung zum G418-Resistenzmarker umfasst, gegen G418 in Konzentrationen von mehr als 200 μg pro Liter Kulturmedium, vorzugsweise mindestens 400 und insbesondere mehr als 600 μg/Liter resistent zu machen. Bei besonders bevorzugten Promotoren handelt es sich um solche, die Resistenz gegen mehr als 800 μg/ml G418 im Wachstumsmedium verleihen.
Gegebenenfalls kann die Transkriptionsstartstelle des Gens, das der cDNA in Entsprechung zu einem hochgradig exprimierten Gen entspricht, vor der Klonierung der mutmaßlichen Promotorsequenzen bestimmt werden. Dies kann dazu dienen, die Transkriptionsstartstelle genauer festzustellen, und trägt außerdem zur Bestimmung der Länge des 5'-untranslatierten Leaders des Gens bei. Um die Position der Transkriptionsstartstelle zu bestimmen, kann eine reverse Primerextension oder eine klassische S1-Kartierung auf der Grundlage der Kenntnis der cDNA-Sequenz vorgenommen werden. Somit lässt sich die genaue Position des Transkriptionspromotors ohne übermäßigen Aufwand bestimmen und die Isolierung eines Fragments stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle, das den Promotor enthält, aus einem hybridisierenden Genomklon (z. B. einer Phage oder einem Cosmid) stellt eine Routineangelegenheit dar. Die Klonierung des mutmaßlichen Promotorfragments in Front (stromaufwärts) der Kodierungsregion, beispielsweise des G418-Resistenzgens, und die Transformation der Genkassette in Phaffia, um das Ausmaß der G418-Resistenz und somit das Expressionsniveau des G418-Resistenzgens, als Folge der Anwesenheit des Promotors zu bewerten, stellt eine Routineangelegenheit dar.
In ähnlicher Weise, wie es vorstehend für die Isolierung anderer starker Promotoren beschrieben wurde, lässt sich ein Transkriptionsterminator isolieren, mit der Maßgabe, dass sich der Terminator stromabwärts vom offenen Leseraster befindet. Die Transkriptionsstoppstelle kann unter Anwendung von Verfahren bestimmt werden, die im wesentlichen die gleichen wie für die Bestimmung der Transkriptionsstartstelle sind. Alle diese Maßnahmen sind dem Fachmann geläufig. Ein geeignetes Handbuch hierfür ist "Nucleic Acid Hybridisation", Hrsg. B. D. Hames & S. J. Higgins, IRL Press Ltd., 1985; oder Sambrook (vergl. unten). Es ist jedoch nicht kritisch, dass der Transkriptionsterminator aus einem hochgradig exprimierten Phaffia-Gen isoliert wird, sofern er aus einem exprimierten Gen stammt.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, bei der der offene Leseraster für eine verringerte Empfindlichkeit gegen G418 kodiert, wurde eine Transformationsfrequenz bis zu 160 Transformanten pro μg linearer DNA bei einer G418-Konzentration im Medium von 40 μg/ml erzielt.
Etwa das 10- bis 20-fache an transformierten Kolonien wurden mit dem erfindungsgemäßen Vektor (pPR2) erhalten, verglichen mit dem herkömmlichen Vektor pGB-Ph9, beschrieben in EP-0 590 707-A1 (vergl. Tabelle 2; im Experiment von Beispiel 7 ist die Verbesserung noch auffallender).
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert Bedingungen, die zur Aufnahme der rekombinanten DNA führen. Derartige Bedingungen sind in EP-509 707 beschrieben. Sie umfassen (ohne Beschränkung hierauf) die Herstellung von Protoplasten unter Anwendung üblicher, dem Fachmann geläufiger Verfahren und die anschließende Inkubation mit rekombinanter DNA. Alternativ können Phaffia-Zellen über Nacht in Gegenwart von LiAc und rekombinanter DNA inkubiert werden. Weitere Verfahren beinhalten die Verwendung einer Teilchenbeschleunigung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die zur Aufnahme führenden Bedingungen eine Elektroporation von rekombinanter DNA in Phaffia-Zellen gemäß der Beschreibung von Faber et al. (Current Genetics, Bd. 25 (1994), S. 305–310). Besonders bevorzugte Bedingungen umfassen eine Elektroporation, bei der rekombinante DNA ribosomale Phaffia-DNA umfasst, wobei diese rekombinante DNA in linearer Form vorliegt, insbesondere durch Spaltung der rekombinanten DNA im ribosomalen Bereich. Weitere bevorzugte Bedingungen umfassen die Verwendung von rekombinanter DNA in Mengen von 1 bis 10 μg pro 10⁸ Zellen und insbesondere von etwa 5 μg rekombinanter DNA pro 2 × 10⁸ Zellen, die 16 Stunden bei 21°C gezüchtet wurden.
Nachdem Zellen gemäß diesem Verfahren transformiert worden sind, kann eine Identifikation von transformierten Zellen unter Anwendung beliebiger geeigneter Techniken stattfinden. So kann die Identifikation durch Hybridisierungstechniken, DNA-Amplifikationstechniken, wie Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primern auf der Grundlage der verwendeten rekombinanten DNA, und dergl. durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Identifizieren von transformierten Zellen ist ein Verfahren, das sich der Selektion in Bezug auf die rekombinante DNA bedient, die ein Gen umfasst, das für eine verringerte Empfindlichkeit gegen ein Selektionsmittel dient. Geeignete Selektionsmittel sind G418, Hygromycin, Phleomycin und amdS. Gene, die für eine verminderte Empfindlichkeit gegen diese Selektionsmittel kodieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die offenen Leseraster dieser Gene können als erfindungsgemäße heterologe stromabwärtige Sequenz verwendet werden, die eine selektive Anreicherung von transformierten Zellen vor der Identifizierung von transformierten Zellen ermöglicht. Nachdem transformierte Zellen identifiziert worden sind, können sie zur weiteren Bearbeitung herangezogen werden oder direkt bei der Herstellung wertvoller Verbindungen, vorzugsweise in großtechnischen Fermentern, verwendet werden.
Es ist ersichtlich, dass vorstehend ein sehr wirksames Verfahren zur Transformation von Phaffia-Stämmen beschrieben worden ist. Ferner ist nicht nur die Transformationsfrequenz hoch, sondern es ergeben sich auch sehr hohe Expressionsniveaus der transformierenden DNA, wie durch die außerordentlich hohe Resistenz gegen G418 der transformiertem Phaffia-Zellen belegt wird, wenn der offene Leseraster des G418-Resistenzgens mit einem erfindungsgemäßen Promotor fusioniert wurde, verglichen mit dem G418-Resistenzgen unter Kontrolle des Actin-Promotors in pGB-Ph9. Es wird daher der Schluss gezogen, dass es sich beim GAPDH-Pomotor um einen Transkriptionspromotor von hohem Niveau handelt, der in geeigneter Weise mit einer beliebigen heterologen DNA-Sequenz eingesetzt werden kann, um hochgradige Expressionsniveaus davon in Phaffia-Stämmen zu erzielen.
Es ist ersichtlich, dass die Verfügbarkeit neuer Expressionswerkzeuge in Form der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA umfangreiche Möglichkeiten zur Herstellung neuer und wertvoller Biomoleküle in Phaffia schafft.
Vorzugsweise umfasst die stromabwärtige Sequenz einen offenen Leseraster, der für Proteine von Interesse kodiert. Beispielsweise können in Phaffia bereits vorhandene Gene, z. B. Gene, die am Carotinoid-Stoffwechselweg beteiligt sind, manipuliert werden, indem man sie unter Kontrolle der erfindungsgemäßen Promotoren von hohem Niveau kloniert. Eine erhöhte Expression kann die Anreicherung der Zwischenprodukte und/oder Endprodukte verändern oder den Stoffwechselweg von β-Carotin, Cantaxanthin, Astaxanthin und dergl. verändern. Die Überexpression des crtB-Gens aus Erwinia uredovora erhöht vermutlich gleichermaßen die Astaxanthin-Konzentrationen, da das Produkt dieses Gens an der geschwindigkeitsbegrenzenden Stufe beteiligt ist. Die Expression eines Proteins von Interesse kann zu Xanthophyllen führen, deren natürliche Bildung in Phaffia nicht bekannt ist, wie Zeaxanthin. Ein offener Leseraster, der in geeigneter Weise bei einem derartigen Verfahren herangezogen werden kann, umfasst (ohne Beschränkung hierauf) den Raster, der für das Protein erzeugende Zeaxanthin (crtZ-Gen), erhalten aus Erwinia uredovora (Misawa et al., J. Bacteriol., Bd. 172 (1990), S. 6704–6712) kodiert. Weitere Gene der Carotinoidsynthese lassen sich beispielsweise aus Flavobacterium (gram-positives Bakterium), Synechococcus (Cyanobakterium) oder Chlamydomonas oder Dunaliella (Algen) erhalten.
Offensichtlich werden Gene der Carotinoidsynthese eines Phaffia-Stammes, nachdem die Gene isoliert und geklont worden sind, in geeigneter Weise in eine erfindungsgemäße rekombinante DNA kloniert und zur Modifikation des Carotinoidgehalts von Phaffia-Stämmen verwendet. Zu Beispielen für klonierte Carotinoid-Gene, die in geeigneter Weise in Phaffia überexprimiert werden können, gehören die in 8 erwähnten Gene. Besonders geeignet ist crtE aus Phycomyces blakesleanus, das für Geranylgeranyl-diphosphat-synthase kodiert und crtB, das für Phytoen-synthase kodiert, da diese Stufe offensichtlich die geschwindigkeitsbeschränkende Stufe bei der Carotinoidsynthese in Thermus thermophylus ist (T. Hoshino et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Bd. 77, Nr. 4 (1994), S. 423–424). Besonders bevorzugte Quellen zum Isolieren von biosynthetischen Carotinoid-Genen oder cDNAs sind die Pilze Neurospora crassa und Blakeslea trispora. Weitere Hefen, von denen gezeigt worden ist, dass sie kreuzhybridisierende Spezies von biosynthetischen Carotinoid-Genen besitzen, sind Cystofylobasidium, z. B. bisporidii und capitatum.
Gene der Carotinoid-Biosynthese wurden auch in Pflanzen identifiziert. Diese Pflanzen-cDNAs oder Gene aus Pflanzen können ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Codonanwendung der Phaffia-Gene oder -cDNAs an die bevorzugte Anwendung im Wirtsorganismus angepasst werden.
Erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind die DNA-Sequenzen, die für vier verschiedene Enzyme im Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg von Phaffia rhodozyma kodieren, die im Sequenzprotokoll aufgeführt sind. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass es mit der Verfügbarkeit dieser DNA-Sequenzen möglich ist, geringfügige Modifikationen der DNA-Sequenz vorzunehmen, ohne die Aminosäuresequenz zu modifizieren. Derartige Modifikationen sind aufgrund der Degeneration des genetischen Codes möglich. Derartige Modifikationen fallen unter die vorliegende Erfindung. Jedoch kommen auch Modifikationen in den kodierenden Sequenzen in Betracht, die zu Modifikationen in der Aminosäuresequenz des Enzyms führen. Dem Fachmann ist es geläufig, dass geringfügige Modifikationen in perfekter Weise in Bezug auf die enzymatische Aktivität zulässig sind. Die meisten Änderungen, wie Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren beeinflussen nicht die enzymatische Aktivität, zumindest nicht in drastischer Weise. Derartige Varianten, die die Deletion, Addition oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren umfassen, lassen sich unter Anwendung des in der Beschreibung offenbarten Komplementierungstests testen. Der Fachmann kennt auch den Ausdruck "konservative Aminosäuresubstitutionen", worunter Substitutionen von Aminosäuren durch ähnliche Aminosäuren, die zu der gleichen Gruppe gehören, zu verstehen sind. Der Fachmann kennt auch den Ausdruck "allele Variante", worunter natürlich auftretende Varianten eines bestimmten Enzyms zu verstehen sind. Diese konservativen Substitutionen und allelen Enzymvarianten liegen nicht außerhalb der Erfindung.
Wie vorstehend erwähnt, sind auf dem DNA-Niveau erhebliche Variationen akzeptabel. Obgleich die Erfindung vier DNA-Sequenzen ausführlich beschreibt, nämlich SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22, fallen auch isokodierende Varianten der DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22 unter den Umfang der Erfindung. Der Fachmann hat keine Schwierigkeiten, die Nucleinsäuresequenz anzupassen, um die Codonanwendung in einem von P. rhodozyma abweichenden Wirt zu optimieren. Der Fachmann weiß, wie allele Varianten einer DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22 aus verwandten Phaffia-Stämmen zu isolieren sind. Derartige allele Varianten weichen in klarer Weise nicht von der vorliegenden Erfindung ab.
Ferner ist es unter Verwendung der DNA-Sequenzen, die im Sequenzprotokoll, insbesondere SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16 oder SEQ. ID. NO: 18, als Sonde möglich, die entsprechenden Gene aus anderen Stämmen oder anderen Spezies oder gegebenenfalls auch aus entfernteren eukaryontischen Spezies zu isolieren, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Sequenzhomologie besteht, um die Gene unter Anwendung von bekannten Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken nachzuweisen.
Typischerweise beinhalten Verfahren zur Gewinnung ähnlicher DNA-Fragmente das Screening von Bakterien- oder Bakteriophagen-Plaques, die mit rekombinanten Plasmiden mit einem Gehalt an DNA-Fragmenten aus einem Organismus transformiert sind, von dem bekannt ist oder erwartet wird, dass er die erfindungsgemäßen Enzyme erzeugt. Nach in situ-Replikation der DNA wird die DNA aus den Zellen oder Plaques freigesetzt und an Filtern (im allgemeinen Nitrocellulose) immobilisiert. Die Filter können sodann auf komplementäre DNA-Fragmente abgesucht werden, indem man eine markierte Nucleinsäuresonde auf der Basis beliebiger, der im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen verwendet. Je nachdem ob der einem Screening zu unterwerfende Organismus weitläufig oder nahe verwandt ist, sollten die Hybridisierungs- und Waschbedingungen angepasst werden, um richtige positive Ergebnisse auszuwählen und den Anteil an falschen positiven Ergebnissen zu verringern. Ein typisches Verfahren für die Hybridisierung von filterimmobilisierter DNA wird im Kapitel 5, Tabelle 3, S. 120 und 121, in "Nucleic acid hybridisation – a practical approach, B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg., (1985), IRL Press, Oxford) beschrieben. Obgleich die optimalen Bedingungen üblicherweise empirisch bestimmt werden, können einige wertvolle Richtlinien für nahe und weniger nahe verwandte Sequenzen gegeben werden.
Um DNA-Fragmente zu identifizieren, die sehr eng mit der Sonde verwandt sind, wird die Hybridisierung gemäß Tabelle 3 von Hames & Higgins (a. a. O.) (der wesentliche Sachverhalt davon ist nachstehend wiedergegeben) durchgeführt, wobei die endgültige Waschstufe bei starker Stringenz in 0,1*SET-Puffer (20-fach SET = 3 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8), 0,1% SDS bei 68°C durchgeführt wird.
Um Sequenzen mit begrenzter Homologie zu der Sonde zu identifizieren, wird das Verfahren gemäß Tabelle 3 von Hames & Higgins (a. a. O.) eingehalten, jedoch bei verringerten Hybridisierungs- und Waschtemperaturen. Ein endgültiger Waschvorgang mit 2*SET-Puffer, 50°C, sollte beispielsweise die Identifizierung von Sequenzen mit etwa 75% Homologie ermöglichen. Dem Fachmann ist es geläufig, dass die genauen Beziehungen zwischen Homologie und Hybridisierungsbedingungen von der Länge der Sonde, der Basenzusammensetzung (% G + C) und der Verteilung der Fehlpaarungen abhängen, wobei eine willkürliche Verteilung einen stärkeren Verringerungseffekt auf T_m hat, als ein nicht-willkürliches oder clusterartiges Muster von Fehlpaarungen.
Die wesentlichen Merkmale des Verfahrens in Tabelle 3, Kapitel 5 von Hames & Higgins sind nachstehend aufgeführt:
(1) Vorhybridisierung der Filter in Abwesenheit der Sonde, (2) Hybridisierung bei einer Temperatur zwischen 50 und 68°C in 0,1- bis 4*SET-Puffer (in Abhängigkeit von der Stringenz), 10*Denhardt-Lösung (100*Denhardt-Lösung enthält 2% Rinderserumalbumin, 2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrrolidon), 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 μg/ml Lachssperma-DNA (aus einer Vorratslösung, die durch Lösen von 1 mg/ml Lachssperma-DNA erhältlich ist, die einer Ultraschallbehandlung auf eine Länge von 200 bis 500 bp unterzogen worden ist, 20 Minuten in einem Wasserbad stehengelassen wurde und mit Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt wurde); die Hybridisierungszeit ist nicht allzu kritisch und kann 1 bis 24 Stunden betragen, vorzugsweise etwa 16 Stunden (über Nacht); die Sonde wird typischerweise durch Nick-Translation unter Verwendung von ³²P als radioaktiver Markierung bis zu einer spezifischen Aktivität von 5*10⁷ bis 5*10⁸ cpm/μg markiert; (3) (wiederholtes) Waschen des Filters mit 3*SET, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von 50 bis 68°C (je nach der angestrebten Stringenz), wiederholtes Waschen unter Senken der SET-Konzentration auf 0,1%, einmaliges Waschen für 20 Minuten in 4*SET bei Raumtemperatur, Trocknen der Filter auf 3 MM-Papier, Auflegen der Filter auf Röntgenfilm in einer Kassette bei –70°C für eine Zeitspanne von 1 bis 96 Stunden und Entwickeln des Films.
Im allgemeinen sollten die Volumina der Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsgemische auf einem Minimum gehalten werden. Sämtliche "nassen" Stufen können in kleinen verschlossenen Beuteln in einem vorerwärmten Wasserbad durchgeführt werden.
Das vorstehende Verfahren dient dazu, festzustellen, dass die DNA-Fragmente einer erfindungsgemäßen Hybridisierung unterliegen. Offensichtlich können zahlreiche Modifikationen an dem Verfahren zur Identifizierung und Isolierung der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente vorgenommen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente immer dann unter die Formulierung der Ansprüche fallen, wenn sie gemäß dem vorstehenden Verfahren nachgewiesen werden können, unabhängig davon ob sie unter Anwendung dieses Verfahrens tatsächlich identifiziert und/oder isoliert worden sind.
Zahlreiche Verfahren, die in geeigneter Weise zum Identifizieren und Isolieren der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente herangezogen werden können, sind in der Literatur und in Handbüchern, einschließlich des vorgenannten Handbuchs von "Hames & Higgins", beschrieben.
Mit dem Auffinden von neuen DNA-Amplifikationstechniken, z. B. einer direkten oder invertierten PCR, ist es auch möglich geworden, DNA-Fragmente in vitro zu klonieren, sobald die Sequenzen der Kodierungsregion bekannt sind.
Unter die Ansprüche fällt auch eine DNA-Sequenz, die bei Bindung an einen Nitrocellulosefilter und nach Inkubation unter Hybridisierungsbedingungen und anschließendem Waschen dazu befähigt ist, eine spezifische Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment mit der in SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16 oder SEQ. ID. NO: 18 dargestellten Sequenz einzugehen, wie durch Autoradiographie des Filters nach Inkubation und Waschen nachweisbar ist, wobei diese Inkubation unter Hybridisierungsbedingungen und anschließendem Waschen durchgeführt wird, indem man die filtergebundene DNA bei einer Temperatur von mindestens 50°C, vorzugsweise mindestens 55°C und insbesondere mindestens 60°C in Gegenwart einer Lösung der radioaktiv markierten DNA in 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH-Wert 7,8, mindestens 1 Stunde inkubiert, wonach der Filter mindestens 2-mal etwa 20 Minuten in 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH-Wert 7,8, bei einer Temperatur von 50°C, vorzugsweise mindestens 55°C und insbesondere mindestens 60°C vor der Autoradiographie gewaschen wird.
Die erfindungsgemäße heterologe DNA-Sequenz kann einen beliebigen offenen Leseraster umfassen, der für wertvolle Proteine oder deren Vorstufen kodiert, z. B. für pharmazeutische Proteine, wie Humanserumalbumin, IL-3, Insulin, Faktor VIII, tPA, EPO, α-Interferon und dergl., Waschmittelenzyme, wie Proteasen, Lipasen und dergl., zellwandabbauende Enzyme, wie Xylanasen, Pectinasen, Cellulasen, Glucanasen, Polygalacturonasen und dergl., und andere Enzyme, die als Additive für Nahrungs- oder Futtermittel wertvoll sind (z. B. Chymosin, Phytasen, Phospholipasen und dergl.). Derartige Gene können mit dem Ziel exprimiert werden, das in Frage stehende Protein vor der anschließenden Verwendung zu gewinnen, wobei dies aber gelegentlich nicht erforderlich ist, da das Protein einem Produkt oder einem Verfahren in ungereinigter Form zugesetzt werden kann, z. B. als Kulturfiltrat oder in eingekapselter Form in Phaffia-Zellen.
Die Hefezellen, die die Carotinoide enthalten, können direkt oder in getrockneter Form als Additive für Tierfutter verwendet werden. Ferner können die Hefen mit anderen Verbindungen, wie Proteinen, Kohlenhydraten oder Ölen, vermischt werden.
Wertvolle Substanzen, wie Proteine oder Pigmente, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA erzeugt worden sind, können extrahiert werden. Carotinoide können auch beispielsweise gemäß dem von Johnson et al. (Appl. Environm. Microbiol., Bd. 35 (1978), S. 1155–1159) beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Gereinigte Carotinoide können als farbgebende Mittel in Nahrungs- und/oder Futtermitteln verwendet werden. Ferner ist es möglich, die Carotinoide in Kosmetika oder pharmazeutischen Zusammensetzungen einzusetzen.
Die heterologe stromabwärtige Sequenz kann ferner einen offenen Leseraster umfassen, der für eine verringerte Empfindlichkeit gegen ein Selektionsmittel kodiert. Der offene Leseraster, der für ein Enzym kodiert, das Resistenz gegen G418 verleiht, wurde im erfindungsgemäßen Verfahren mit zufriedenstellendem Erfolg verwendet, wobei aber die Erfindung nicht auf diesen Selektionsmarker beschränkt ist. Weitere wertvolle Selektionsmarker, wie das Phleomycin-Resistenzgen können verwendet werden (vergl. EP-590 707). Jedes dieser Gene wird in vorteilhafter Weise unter der Kontrolle eines starken Promotors gemäß der Erfindung, z. B. des GAPDH-Promotors, exprimiert.
Nachstehend wird die Erfindung ausführlich anhand der folgenden nicht-beschränkenden Beispiele erläutert.
Experimenteller Teil
Stämme

E. coli DH5α: supE44lacU169 (80lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
E. coli LE392: supE44 supF58 hsdR514 galK2 galT22 metB1 trpR55 lacY1
P. rhodozyma CBS6938

Plasmide

pUC19 (Gibco BRL)
pTZ19R
PUC-G418
pGB-Ph9 (Gist-brocades)
pMT6 (1987, H.-J. Breter, Gene, Bd. 53, S. 181–190))

Medien

LB: 10 g/Liter Bacto-Trypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 10 g/Liter NaCl. Platten: +20 g/Liter Bacto-Agar. Gegebenenfalls 50 μg/ml Ampicillin.
YePD: 10 g/Liter Hefeextrakt, 20 g/Liter Bacto-Pepton, 20 g/Liter Glucose. Platten: +20 g/Liter Bacto-Agar. Gegebenenfalls 50 μg/ml Geneticin (G418).

Verfahren
Sämtliche molekularen Klonierungstechniken wurden im wesentlichen gemäß den Angaben von Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Auflg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt.
Enzyminkubationen wurden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Diese Inkubationen umfassen einen Restriktionsenzym-Verdau, eine Dephosphorylierung und eine Ligation (Gibco BRL).
Die Isolierung von chromosomaler DNA aus Phaffia rhodozyma erfolgte gemäß Beispiel 3 von EP-0 590 707-A1 (Gist-brocades). Chromosomale DNA aus K. lactis und S. cerevisiae wurde gemäß den Angaben von Cryer et al., Methods in Cell Biology, Bd. 12, S. 39, D. M. Prescott (Hrsg.), Academic Press, New York, durchgeführt.
Die Isolierung von großen (> 0,5 kb) DNA-Fragmenten aus Agarose wurde unter Verwendung des Geneclean II-Kits durchgeführt, während kleine (< 0,5 kb) DNA-Fragmente oder Fragmente von PCR-Gemischen unter Verwendung des Wizard^® DNA-Clean-Up-Systems (Promega) isoliert wurden.
Die Transformation von E. coli wurde gemäß dem CaCl₂-Verfahren von Sambrook et al. durchgeführt. Die Verpackung von Cosmid-Ligationen und die Transfektion in E. coli LE392 wurde unter Verwendung des Packagene Lambda DNA Packaging-Systems (Promega) gemäß den Promega-Verfahren durchgeführt.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde unter Verwendung von QIAGEN (Westburg B. V., NL) durchgeführt.
Die Transformation von Phaffia CBS6938 wurde gemäß dem Verfahren für H. polymorpha von Faber et al. (a. a. O.) durchgeführt:

– Inokulation von 30 ml YePD mit 1 CBS6938-Kolonie
– 1- bis 2-tägige Züchtung bei 21°C, 300 U/min (Vorkultur)
– Inokulation von 200 ml YePD mit der Vorkultur auf OD₆₀₀ = 0 bis 1 (bei einem Wert von mehr als 1 Verdünnung mit Wasser)
– Züchtung über Nacht bei 21°C, 300 U/min bis zu OD₆₀₀ = 1,2 (Verdünnung vor der Messung)
– 5-minütiges Zentrifugieren bei 8000 U/min und Raumtemperatur, gründliches Entfernen des Überstands.
– Resuspendieren des Pellets in 25 ml 50 mM KPi, pH-Wert 7,0, 25 mM DTT (frisch hergestellt)
– Übertragung der Suspension auf ein frisches, steriles, 30 ml fassendes Zentrifugenröhrchen und 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur
– 5-minütige Zentrifugieren bei 8000 U/min und 4°C, gründliches Entfernen des Überstands
– Resuspendieren des Pellets in 25 ml eiskaltem STM (270 mM Saccharose, 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM MgCl₂)
– 5-minütiges Zentrifugieren bei 8000 U/min und 4°C
– Wiederholung der Waschstufe
– Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml eiskaltem STM (3*10⁹ Zellen/ml), Aufbewahren auf Eis.
– Übertragen von 60 μl Zellsuspension auf vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen mit einem Gehalt an 5 μg, Transformieren der DNA (unter Verwendung von vorgekühlten Spitzen!) Aufbewahrung auf Eis.
– Übertragung des Zell/DNA-Gemisches auf vorgekühlte Elektroporationsküvetten (von oben nach unten)
– Puls: 1,5 kV, 400 Ω, 25 μF
– Sofortige Zugabe von 0,5 ml eiskaltem YePD. Rückübertragung auf "ep" unter Verwendung einer sterilen Pasteur-Pipette
– 2,5-stündige Inkubation bei 21°C
– Ausstreichen von 100 μl auf YePD-Platten mit einem Gehalt an 40 μg/ml G418
– Inkubieren bei 21°C bis zum Auftreten von Kolonien.

Die gepulste Feldelektrophorese wurde unter Verwendung eines GENE-Navigators + Zubehör (Pharmacia) durchgeführt. Bedingungen: 0,15*TBE, 450 V, Pulszeit 0,5 s, 1,2 Agarose, Laufzeit 2 Stunden.
Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Experimente wurden in Gemischen der folgenden Zusammensetzung durchgeführt.

– 5 ng Plasmid-DNA oder 1 μg chromosomale DNA
– 0,5 μg Oligonucleotide (5 μg degenerierte Oligos in Kombination mit chromosomaler DNA)
– 10 nm der einzelnen dNTP
– 2,5 μm KCl
– 0,5 μm Tris, pH-Wert 8,0
– 0,1 μm MgCl₂
– 0,5 μg Gelatine
– 1,3 U Taq-Polymerase (5 U in Kombination mit chromosomaler DNA)

H₂O wurde auf ein Gesamtvolumen von 50 μl zugegeben.
Die Umsetzungen wurden in einem automatischen Thermozykler-Gerät (Perkin-Elmer) durchgeführt. Bedingungen: 5 Minuten 95°C, anschließend 25 Wiederholungszyklen: 2' 94°C, 2' 45°C, 3' 72°C, Ende: 10 Minuten 72°C.
Fusions-PCR-Reaktionen wurden gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 2 DNA-Fragmente mit kompatiblen Enden als Matrize in äquimolaren Mengen zugegeben wurden. Nachstehend sind die Oligonucleotidsequenzen angegeben:
Beispiel 1
G-418-Resistenz von der Phaffia-Transformante G418-1
Zur Bestimmung der Expression des G418-Resistenzgens in pGB-Ph9 wurde die Transformante G418-1 (EP-0 590 707-A1) wachsenden Konzentrationen an G418 ausgesetzt.
Zwei Verdünnungen einer G418-1-Kultur wurden auf YepD-Agar mit einem Gehalt an 0–1000 μg/ml G418 ausgestrichen (Tabelle 1).
Tabelle 1 Überleben der Phaffia-Transformante G418-1 auf YepD-Agar-Medium mit einem Gehalt an zunehmenden Konzentrationen an G418
Bei einer Konzentration von 600 μg/ml G418 überlebten weniger als 1% der ausgestrichenen Zellen. Daraus kann geschlossen werden, dass G418-1 trotz der Multikopienintegration von pGB-Ph9 eine recht schwache Resistenz gegen G418 zeigt (Scorer et al., Bio/Technology, Bd. 12 (1994), S. 181 ff.; Jimenez und Davies, Nature, Bd. 187 (1980), S. 869 ff.), höchstwahrscheinlich aufgrund einer schwachen Wirkung des Phaffia-Actin-Promotors im Plasmid. Die Ergebnisse, dass der Phaffia-Actin-Promotor nur schlecht funktioniert, veranlassten uns Promotorsequenzen von Phaffia mit starker Promotoraktivität zu isolieren.
Beispiel 2
Synthese von spezifischen Sonden glykolytischer Gene aus Phaffia rhodozyma durch PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Technik wurde in einem Versuch zur Synthese einer homologen Sonde der Gene, die für folgende Enzyme aus Phaffia rhodozyma kodieren, herangezogen: Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), Phosphoglycerat-kinase (PGK) und Triosephosphat-isomerase (TPI).
Ein Satz von degenerierten Oligonucleotiden wurde auf der Grundlage der konservierten Regionen im GAPDH-Gen konstruiert (Michels et al., EMBO J., Bd. 5 (1986), S. 1049–1056), PGK-Gen (Osinga et al., EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 3811–3817) und TPI-Gen (Swinkels et al., EMBO J., Bd. 5 (1986), S. 1291–1298).
Sämtliche möglichen Oligo-Kombinationen wurden zur Synthese eines PCR-Fragments mit chromosomaler DNA aus Phaffia rhodozyma (Stamm CBS6938) als Matrize verwendet. Chromosomale DNA von Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis als Matrize wurden zur Überwachung der Spezifität der Amplifikation verwendet. Die PCR wurde gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt. PCR-Bedingungen: 1' 95°C, 2' Annealing-Temperatur (T_a) in 5' von der Annealing-Temperatur auf 72°C, 5 Zyklen 2' 72°C, anschließend 25 Zyklen 1' 95°C, 2' 55°C und 2' 72°C und eine weitere Verlängerungsstufe für 10' 72°C. Drei verschiedene T_a-Werte wurden herangezogen: 40°C, 45°C und 50°C.
Unter diesen Bedingungen erzeugte nur eine einzige Primerkombination ein Fragment der erwarteten Größe an chromosomaler DNA von Phaffia als Matrize. Unter Verwendung der Oligo-Kombination Nr. 3005 und 3006 und einem T_a-Wert von 45°C wurde ein 0,3 kb-Fragment gefunden. Speziell entsprechen die GAPDH-Oligonucleotide den Aminosäuren 241–246 und 331–338 der veröffentlichten S. cerevisiae-Sequenz. (Es wurde der Schluss gezogen, dass zur Isolierung der Promotoren entsprechend den PGK- und TPI-Genen von Phaffia entweder eine weitere Optimierung der PCR-Bedingungen erforderlich ist oder homologe Primer verwendet werden sollten.) Ein weiteres alternatives Verfahren zur Isolierung von hochgradigen Promotoren ist in der ausführlichen Beschreibung (vergl. oben) beschrieben.
Das amplifizierte Fragment wurde aus der PCR-Reaktion gereinigt, mit BamHI verdaut und in die dephosphorylierte BamHI-Stelle von pTZ19R ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli DH5α-Zellen, die durch das CaCl₂-Verfahren gebildet worden waren, transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Amp und 0,1 mM IPTG/50 μg/ml X-gal ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde aus den weißen Kolonien isoliert. Der pTZ19R-Klon mit dem richtigen Insert (mit der Bezeichnung pPRGDH1) wurde anschließend für die Sequenzanalyse des Inserts verwendet.
Die klonierte Sequenz kodierte für das carboxyterminale Fragment von GAPDH aus Phaffia, wie sich durch Vergleich mit der GAPDH-Gensequenz von S. cerevisiae ergibt (Holland und Holland, J. of Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 9839–9845).
Beispiel 3
Isolierung des GAPDH-Gens aus Phaffia
Um das vollständige GAPDH-Gen einschließlich der Expressionssignale zu erhalten, wurde das 0,3 kb-BamHI-Fragment von pPRGDH1 verwendet, um eine Cosmid-Bibliothek von Phaffia abzusuchen.
Herstellung des Vektors für die Cosmid-Klonierung
Die Vektorpräparation war aufgrund der Anwesenheit einer doppelten cos-Stelle in pMT6 vereinfacht. pMT6 wurde vollständig mit stumpfendigem Cutter-PvuII verdaut, um die cos-Stellen freizusetzen. Der Verdauungswirkungsgrad wurde durch Transformation auf E. coli DH5α geprüft und zu > 99% befunden.
Das PvuII-verdaute pMT6 wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Fällung mit Ethanol gereinigt und schließlich in einer Konzentration von 2 μg/μl in 30 μl TE gelöst.
Der Vektor wurde anschließend mit dem Klonierungsenzym BamHI verdaut. Die Vektorarme wurden gemäß den vorstehenden Ausführungen (experimenteller Teil) gereinigt.
Präparation von Ziel-DNA
Die Isolierung von genomischer DNA aus dem Phaffia-Stamm CBS6938 wurde gemäß den Ausführungen im experimentellen Teil durchgeführt. Die das Cosmid pMT6 enthaltenden Inserts mit 25–38 kb waren am wirksamsten gepackt. Daher wurde genomische DNA einem partiellen Verdau mit dem Restriktionsenzym Sau3A unterzogen. Ziel-DNA wurde mit verschiedenen Mengen an Enzym inkubiert. Unmittelbar nach dem Verdau wurden die Reaktionen durch Extraktion von DNA aus dem Restriktionsgemisch mit Phenol/Chloroform gestoppt. Die DNA wurde unter Anwendung des Ethanolverfahrens gefällt. Die nach Zentrifugation pelletisierte DNA wurde in einem geringen Volumen an TE gelöst. Eine CHEF-Elektrophorese (Contour clamped homogeneous electric field) wurde zur Bestimmung der Konzentration und der Größe der Fragmente herangezogen (Dawkins, J. of Chromatography, Bd. 492 (1989), S. 615–639).
Konstruktion einer genomischen Cosmid-Bibliothek
Eine Ligation von etwa 0,5 μg Vektorarm-DNA und 0,5 μg Ziel-DNA wurde in einem Gesamtvolumen von 10 μl in Gegenwart von 5 mM ATP (zur Verhinderung einer stumpfendigen Ligation) durchgeführt.
Die Packung in Phagenköpfe und die Transfektion auf E. coli LE 392 wurde gemäß den Angaben im experimentellen Teil durchgeführt. Die primäre Bibliothek bestand aus 7582 Transfektanten mit einem durchschnittlichen Insert von 28 kb (bestimmt durch Restriktionsanalyse). Die Bibliothek repräsentiert das 3,5-fache des Genoms, wobei die Wahrscheinlichkeit, dass sämtliche Gene in der Bibliothek vorhanden sind, 0,97 beträgt, berechnet gemäß Sambrook (a. a. O.). Aus der Bibliothek-Amplifikation wurden die Transfektanten unter Resuspendieren in 8 ml LB-Brühe vereinigt. Weitere 4,8 ml Glycerin wurden zugegeben. Das Transfektantengemisch wurde in 16 Proben von jeweils 800 μl aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt. Diese amplifizierte Bibliothek bestand aus 2,9*10⁹ Transfektanten.
Screening der Cosmid-Bibliothek
Eine 100 μl-Probe wurde dieser Bibliothek entnommen und ferner in LB-Brühe (10⁶) verdünnt. 200 μl wurden auf 10 LB-Platten mit einem Gehalt an Ampicillin ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Jede Platte enthielt 300–400 Kolonien. Es wurden Filter präpariert. Diese Filter wurden mit der GAPDH-Sonde unter Anwendung der vorstehenden Hybridisierungs- und Waschbedingungen (experimenteller Teil) abgesucht. Nach 16-stündiger Einwirkung wurden drei starke Hybridisierungssignale im Autoradiogramm festgestellt.
Aus diesen positiven Kolonien isolierte Cosmid-DNA erhielt die Bezeichnungen pPRGDHcos1, pPRGDHcos2 und pPRGDHcos3.
Aus Phaffia rhodozyma Stamm CBS 6938 isolierte chromosomale DNA und Cosmid-pPRGDHcos1 wurden mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut. Die DNA-Fragmente wurden gemäß den vorstehenden Angaben aufgetrennt, einem Blotting unterworfen und hybridisiert. Das Autoradiogramm wurde für verschiedene Zeitspannen bei –80°C erstellt. Der Film zeigte durch die verschiedenen Restriktionsenzyme verdaute DNA-Fragmente von unterschiedlicher Länge, die mit der GAPDH-Sonde hybridisierten (1).
Ferner wurde aus der Southern-Analyse der genomischen DNA von Phaffia unter Verwendung des GAPDH-Fragments als Sonde der Schluss gezogen, dass das GAPDH-kodierende Gen als ein Gen in einer einzigen Kopie in Phaffia rhodozyma vorhanden ist, während in Saccaromyces cerevisiae GAPDH durch drei eng verwandte, jedoch nicht verknüpfte Gene kodiert wird (Boucherie et al., FEMS Microb. Letters, Bd. 135 (1995), S. 127–134).
Hybridisierungsfragmente von pPRGDHcos1, für die ein Fragment der gleichen Länge in chromosomaler DNA, die mit dem gleichen Enzym verdaut war, festgestellt wurde, wurden aus einem Agarosegel isoliert. Die Fragmente wurden in die entsprechenden Stellen in pUC19 ligiert. Die Ligationsgemische wurden auf kompetente E. coli-Zellen transformiert. Die Plasmide mit einem 3,3 kb-SalI-Insert und einem 5,5 kb-EcoRI-Insert erhielten die Bezeichnungen pPRGDH3 bzw. pPRGDH6. Die Restriktionskarte von pPRGDH3 und pPRGDH6 ist in 2 dargestellt. Eine Analyse der Sequenzdaten des Inserts in pPRGDH1 zeigte, dass eine HindIII-Stelle am C-terminalen Teil des GAPDH-Gens vorlag. Diese Daten ließen darauf schließen, dass das Insert in pPRGDH6 die vollständige Kodierungssequenz von GAPDH, einschließlich der Promotor- und Terminatorsequenzen, enthielt.
Beispiel 4
Charakterisierung des GAPDH-Gens
Um eine Sequenzanalyse ohne die Notwendigkeit zur Synthese einer Anzahl von spezifischen Sequenzprimern durchzuführen, wurden eine Anzahl von Deletionskonstrukten der Plasmide pPRGDH3 und pPRGDH6 unter Verwendung von zweckmäßigen Restriktionsstellen in oder nahe der mutmaßlichen Kodierungsregion des GAPDH-Gens hergestellt.
Die Plasmide wurden verdaut. Nach Inkubation wurde eine Probe des Restriktionsgemisches durch Gelelektrophorese analysiert, um die vollständige Verdauung zu überwachen. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform wurde die DNA mit Ethanol gefällt. Nach 30-minütiger Inkubation der DNA bei –20°C wurde eine Pelletisierung durch Zentrifugation durchgeführt. Anschließend wurde das Produkt getrocknet und in einem großen Volumen (0,1 ng/μl) TE gelöst. Anschließend wurden die Ligationsgemische in E. coli transformiert. Die aus diesen Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsanalyse analysiert, um die korrekten Konstrukte aufzudecken. Auf diese Weise wurden die folgenden Deletionskonstrukte festgestellt: pPRGDH3δHIII, pPRGDH6δBamHI, pPRGDH6δSstI und pPRGDH6δSalI (1).
Zusätzlich wurden die 0,6 kb- und 0,8 kb-SstI-Fragmente, die von pPRGDH6 abgeleitet waren, in die entsprechende Stelle von pUC19 subkloniert.
Eine Sequenzanalyse wurde unter Verwendung von pUC/M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Promega) durchgeführt. Die Sequenzierungsstrategie ist in 2 dargestellt (vergl. die Pfeile).
Auf der Basis der Homologie mit der GAPDH-Gensequenz von S. cerevisiae (Holland und Holland, J. of Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 9839–9845) und K. lactis (Shunter, Nucl. Acids Res., Bd. 18 (1990), S. 4271) und dem bekannten Spleißstellen-Konsensus (J. L. Woolford, Yeast, Bd. 5 (1989), S. 439–457) wurden die Introns und die mögliche ATG-Startstelle postuliert.
Das GAPDH-Gen weist 6 Introns auf (1) und kodiert für ein Polypeptid mit 339 Aminosäuren. Dies war im Hinblick auf die genomische Organisation der GAPDH-Gene von K. lactis und S. cerevisiae völlig unerwartet, da diese keine Introns aufweisen und beide aus 332 Aminosäuren bestehen. Die Homologie auf dem Aminosäureniveau zwischen dem GAPDH-Gen von Phaffia einerseits und K. lactis und S. cerevisiae andererseits beträgt 63% bzw. 61%.
Die meisten der Introns im GAPDH-Gen befinden sich am 5'-Teil des Gens. Mit Ausnahme des Introns III enthalten sämtliche Introns eine konservierte Verzweigungssequenz 5'-CTPuAPy-3', die für S. cerevisiae und S. pombe gefunden wird.
Durch Computeranalyse der stromaufwärtigen Sequenz unter Verwendung des PC-Gens wurden 2 mutmaßliche eukaryontische Promotorelemente, die TATA-Box (Position 249–263 in SEQ. ID. NO: 11) und eine Anzahl von mutmaßlichen Cap-Signalen (zwischen Position 287 und 302 in SEQ. ID. NO: 11) identifiziert.
Beispiel 5
Klonierung des GAPDH-Promotors in Fusion mit G418 in pUCG418
Um eine Transkriptionsfusion zwischen dem GAPDH-Promotor und dem für G418-Resistenz kodierenden Gen zu konstruieren, wurde die Fusions-PCR-Technik herangezogen.
Unter Verwendung des Plasmids pPRGDH6 konnte der GAPDH-Promotor durch übliche PCR-Verfahren (experimenteller Teil) amplifiziert werden.
Im PCR-Gemisch wurden pPRGDH6 und die Oligos Nr. 5177 und 5126 (Sequenzen im experimentellen Teil) verwendet. Ein 416 bp-DNA-Fragment wurde erzeugt, das die gesamte GAPDH-Promotorsequenz enthielt. Zusätzlich enthält dieses Fragment auch eine HindIII-, XhoI- und KpnI-Restriktionsstelle an ihrem 5'-Ende und eine 12 nt-Überlappung mit dem 5'-Ende des für die G418-Resistenz kodierenden Gens.
Der 217 bp-Teil des 5'-Endes der G418-Kodierungssequenz wurde ebenfalls durch PCR unter Verwendung von pUC-G418 und der Oligos 4206 und 5127 amplifiziert. Ein 226 bp DNA-Fragment wurde erhalten, das das 217 bp 5'-Ende von G418 enthielt und 9 Nucleotide in Überlappung mit dem 3'-Ende des früher erzeugten GAPDH-Promotorfragments aufwies. Es enthielt ferner eine MscI-Stelle an ihrem 3'-Ende.
Die PCR-Fragmente wurden aus dem PCR-Gemisch unter Verwendung des WIZARD-Kits gereinigt.
Etwa 1 μg des GAPDH-Promotorfragments und 1 μg des G418 PCR-Fragments wurden zusammen mit den Oligos 5177 und 4206 in einem Fusions-PCR-Experiment (experimenteller Teil) verwendet. Ein 621 bp-DNA-Fragment wurde erzeugt, das den GAPDH-Promotor in direkter Fusion mit dem 5'-Teil von G418 enthielt. Nach Reinigung wurde das DNA-Fragment mit MscI und KpnI verdaut. Das 3,4 kb-MscI-KpnI-Fragment von pUC-G418 mit einem Gehalt an pUC-Sequenzen und dem 3'-Teil von G418 wurde als Vektor verwendet.
Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli DH5α-Zellen transformiert. Transformantenkolonien mit einem Gehalt an der inserierten Fusions-PCR-DNA wurden durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen identifiziert.
Auf diese Weise wurde das Plasmid pPR1 erhalten, das den GAPDH-Promotor in direkter Fusion mit dem G418-Markergen enthielt. Drei pPR1-Vektoren, die aus unterschiedlichen Transformanten isoliert worden waren, wurden in weiteren Klonierungsversuchen eingesetzt.
Um das Plasmid nach der Transformation zielgerichtet einer speziellen Integrationsstelle zuzuordnen, wurde ein 3,0 kb-SstI-Fragment mit einem Gehalt an einem Teil der ribosomalen DNA von Phaffia in pPR1 kloniert. Das ribosomale DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel nach Verdau mit SstI des Plasmids pGB-Ph1l (EP-590 707-A1) isoliert. Dieses Fragment wurde in die dephosphorylierte SstI-Stelle von pPR1 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde isoliert. Unter Anwendung der Restriktionsanalyse wurde gezeigt, dass mehrere Kolonien das erwartete Plasmid pPR2 enthielten. Die vollständige Klonierungsstrategie ist in 3 dargestellt.
Beispiel 6
Transformation von Phaffia mit pPR2
Die Transformation von Phaffia-Stamm 6938 wurde unter Anwendung eines Elektroporationsverfahrens gemäß den früheren Angaben von Faber et al. (Curr. Genet., Bd. 25 (1994), S. 305–310) mit folgenden Modifikationen durchgeführt:

– Ein Elektropulsiervorgang wurde unter Verwendung des Bio-rad Gene Pulser-Geräts mit dem Puls-Kontroller und mit 2 mm-Bio-rad-Küvetten durchgeführt.
– Phaffia wurde 16 Stunden bei 21°C gezüchtet.
– Zur Transformation wurden 2 × 10⁸ Zellen zusammen mit 5 μg linearisiertem Vektor verwendet. Die Linearisierung wurde in der rDNA-Sequenz unter Verwendung von ClaI durchgeführt, um eine Integration am rDNA-Locus im Phaffia-Genom zu ermöglichen. Im Anschluss an den elektrischen Puls (7,5 kV/cm, 400 Ω, 25 μF) wurden 0,5 ml YePD-Medium zum Zell/DNA-Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden bei 21°C inkubiert und anschließend auf 5 selektive YEDP-Agarplatten mit einem Gehalt an 40 μg/ml G418 verteilt.

Wie in Tabelle 2 dargelegt, konnten wir Transformanten erzeugen (115 Transformanten pro μg DNA). Die durchschnittliche Transformationsfrequenz betrug 50 Transformanten/μg pPR2 gemäß Beurteilung einer Anzahl von Experimenten. Die Transformation der geschlossenen kreisförmigen Form von pPR2 führte nicht zu einer Transformation, was darauf schließen lässt, dass es keine autonome Replikationssequenz, die in den Vektorsequenzen vorhanden ist, gibt. Unter Verwendung von pPR2 wurde eine 10- bis 50-fache Erhöhung der Transformationsfrequenz festgestellt, verglichen mit einem früher konstruierten Transformationsvektor für Phaffia mit der Bezeichnung pGB-Ph9. Im letztgenannten Vektor wurde eine Translationsfusion zwischen dem 5'-Teil des Actin-Gens von Phaffia und G418 durchgeführt.
Um den Grad der Resistenz von Transformanten zu analysieren wurde das Gemisch von DNA/Zellen auf selektive Platten mit einem Gehalt an verschiedenen Mengen an G418 ausgestrichen. Obgleich die Gesamtzahl der Transformanten mit zunehmenden Mengen an G418 abnimmt, waren wir immer noch in der Lage, eine erhebliche Anzahl an Transformanten zu erhalten (Tabelle 3).
In einem weiteren Experiment wurden 30 Transformanten, die unter standardmäßigen Selektionsbedingungen (40 μg/ml) erhalten worden waren, auf Platten mit einem Gehalt an 50, 200 oder 1000 μg/ml übertragen. Nach 4- bis 5-tägiger Inkubation der Platten bei 21°C waren 23 Transformanten der 30 getesteten Transformanten dazu in der Lage, auf Platten mit einem Gehalt an 200 μg/ml G418 zu wachsen. Eine Transformante war zum Wachstum auf Platten mit einem Gehalt an bis zu 1000 μg/ml G418 und darüber befähigt.
Tabelle 2 Transformationsfrequenz von pGB-Ph9 und pPR2
Gesamtzahl von Transformanten (< 1 mm) in verschiedenen Transformationsexperimenten nach 4- bis 5-tägiger Inkubation.
Tabelle 3 Vergleich der G418-Empfindlichkeit als Folge von zwei verschiedenen G418-Resistenzgenen in pGB-Ph9 und pPR2
Analyse von pPR2-Transformanten
Zur Analyse des Integrationsereignisses und der Anzahl von integrierten Vektorkopien wurde die gesamte genomische DNA von 6 unabhängigen Transformanten isoliert. Diese Transformanten wurden unter selektiven Bedingungen gezüchtet, d. h. YePD + 50 μg/ml G418. Chromosomale DNA wurde mit ClaI verdaut. Die DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese getrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Der Southern-Blot wurde einer Sondenbehandlung mit Phaffia-DNA unterzogen.
Neben der rDNA-Bande von 9,1 kb wurde eine zusätzliche Bande von 7,1 kb mit ähnlicher Fluoreszenzintensität in den Transformanten beobachtet. Diese Bande entspricht der linearisierten Form von pPR2. Aus der Intensität dieser Banden wurde der Schluss gezogen, dass die Kopienanzahl etwa 100–140 Kopien von pPR2 betrug. Diese Ergebnisse sind ähnlich wie die für pGB-Ph9 beobachteten Ergebnisse, was es ausschließt, dass die verbesserte G418-Resistenz allein auf Unterschiede in der Kopienanzahl von integrierten Vektoren zurückzuführen ist. Es ist nicht bekannt, ob dieses Mehrfachkopienereignis auf eine mehrfache Kopienintegration von pPR2 oder auf eine Amplifikation einer einzelnen Kopie in rDNA oder auf eine Kombination beider Ereignisse zurückzuführen ist.
Beispiel 7
Konstruktion von pPR2T durch Klonierung des GAPDH-Terminators in pPR2
Eukaryontische mRNAs enthalten modifizierte terminale Sequenzen, speziell die 3'-terminale poly(A). Da dem prokaryontischen Gen, das für G418-Resistenz kodiert, eukaryontische Terminationssignale fehlen, die eine einwandfreie Transkriptionstermination und eine mRNA-Stabilität bewirken könnten (H. A. Raue, TIBTECH, Bd. 12 (1994), S. 444–449) wurde ein Teil der 3'-nicht-kodierenden Sequenz von GAPDH eingeführt.
Zu diesem Zweck wurde ein 307 bp-Fragment, das aus 281 bp der 3'-nicht-kodierenden Region von GAPDH und weiteren zusätzlichen Klonierungssequenzen bestand, durch PCR unter Verwendung der Oligos 5137 und 5138 amplifiziert (experimenteller Teil). Das stromaufwärtige Oligo 5137 besteht aus mindestens 14 Nucleotiden der kodierenden Region und 17 Nucleotiden der 3'-nicht-kodierenden Region von GAPDH. Durch Basensubstitutionen des 5. Nucleotids (T → A) und des 8. Nucleotids (T → C) der nicht-kodierenden Sequenz wurde eine BamHI-Restriktionsstelle eingeführt. Ferner enthält dieses Fragment eine XhoI- und eine HindIII-Restriktionsstelle an ihrem 3'-Ende.
Das PCR-Fragment wurde aus dem PCR-Gemisch unter Verwendung des WIZARD-Reinigungskits gereinigt und mit BamHI und HindIII verdaut. Ein 288 bp-Fragment wurde isoliert und in die entsprechenden Stellen des vorher konstruierten Phaffia-Transformationsvektors pPR2 kloniert, wodurch man pPR2T erhielt.
Bei Transformation von Phaffia unter Verwendung von G418 als Selektionsmittel betrugen die Transformationsfrequenzen (Anzahl von Transformanten pro μg DNA), die mit dem verbesserten Konstrukt pPR2T erhalten wurden, etwa das 5- bis 10-fache der Transformationssequenz von pPR2 (d. h. ohne ein Phaffia-homologes Transkriptionsterminationssignal). Die Ergebnisse eines typischen Experiments sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4 Transformationsfrequenz bei 50 μg/ml G418 für pGB-Ph9, pPR2 und pPR2T
Mit pPR2T transformierte Phaffia-Zellen wurden auf ihre Fähigkeit zum Wachstum bei hohen Konzentrationen an G418 getestet. Die Konzentration an G418, bei der Wachstum noch möglich war, wurde als Maß für das Expressionsniveau des G418-Resistenzgens in den Transformanten genommen, und zwar als Ergebnis der Anwesenheit des Phaffia-Promotors und/oder -Terminators. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass die Anzahl an Transformanten, die zu einem Wachstum bei hohen Konzentrationen an G418 fähig sind, signifikant höher als ohne Terminator ist.
Zusammenfassung
Aus den vorstehenden Ergebnissen wurde der Schluss gezogen, dass die Anwesenheit des GAPDH-Promotors (pPR2) zu einer erheblichen Zunahme der Transformationsfrequenz (1 bis mindestens 50 pro μg DNA) führte, verglichen mit dem Vektor, der den Actin-Promotor (pGB-Ph9) enthielt. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen überein, die beim G418-Empfindlichkeitstest (Tabellen 3 und 4) erhalten wurden, die einen Hinweis auf überlegene Expressionsniveaus unter der Kontrolle des GAPDH-Promotors geben. Die Möglichkeit, dass der Unterschied in der Transformationsfrequenz nur auf den Unterschied in der Linearisierung der Vektoren zurückzuführen sein könnte (BglII, ClaI und SfiI schneiden alle innerhalb des ribosomalen DNA-Locus, jedoch an unterschiedenen Positionen), wurde durch einen Vergleich von pPR2(xSfiI) mit pGB-Ph9(xSfiI) ausgeschlossen. Der Unterschied in der Transformationsfrequenz zwischen den beiden mit SfiI linearisierten Produkten pPR2 und pGB-Ph9 war immer noch erheblich. Es wurde jedoch der Schluss gezogen, dass die Wahl der Linearisierungsstelle einen Einfluss auf die Transformationsfrequenz ausübt. Eine Linearisation mit ClaI wird bevorzugt.
Die durch Verwendung eines Promotors von hohem Niveau, wie GAPDH, erzielten Verbesserungen sind unabhängig davon, ob ein homologer Terminator verwendet wird (pPR2 (ohne homologen Terminator) verhält sich weitaus besser als pGB-Ph9, sowohl beim G418-Empfindlichkeitstest als auch in Bezug auf die Transformationsfrequenz).
Die Anwesenheit eines homologen Terminators führt sowohl zu höheren Transformationsfrequenzen als auch zu höheren Expressionsniveaus. Man kommt zu dem Schluss, dass dieses Ergebnis unabhängig vom verwendeten Promotor ist. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass erhebliche Verbesserungen erzielt werden, wenn das pGB-Ph9-Konstrukt mit einem Transkriptionsterminator vervollständigt wird, z. B. mit dem in pPR2T verwendeten GAPDH-Terminator.
Die folgenden Beispiele erläutern die Isolierung von DNA, die für Enzyme kodiert, die am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg von Phaffia rhodozyma beteiligt sind. Diese DNA-Sequenzen können in geeigneter Weise für eine Vielzahl von Aufgaben verwendet werden: beispielsweise zum Nachweisen und Isolieren von DNA-Sequenzen, die in anderen Organismen, wie Hefe, für ähnliche Enzyme kodieren, indem man routinemäßige Hybridisierungsverfahren vornimmt, um die Transkriptionspromotoren und/oder -terminatoren zu isolieren, die zur Konstruktion von Expressionsvektoren sowohl für heterologe als auch für homologe stromabwärtige Sequenzen, die zu exprimieren sind, verwendet werden können. Die DNA-Sequenzen, die für Carotinoid-Biosynthesegene kodieren, können in geeigneter Weise zur Untersuchung der Überexpression entweder unter der Kontrolle ihrer eigenen Promotoren oder unter der Kontrolle von heterologen Promotoren, z. B. der vorstehend erläuterten Promotoren des glykolytischen Stoffwechselwegs, verwendet werden. Beispielsweise führt eine Transformation von Phaffia rhodozyma mit erfindungsgemäßen, für Carotinoide kodierenden DNA-Sequenzen in wirksamer Weise zu einer Amplifikation des Gens in Bezug zur Wildtypsituation und als Folge davon zu einer Überexpression des kodierten Enzyms.
Somit kann der Einfluss einer Überexpression von einem oder mehreren Genen, die für Carotinoid-Biosynthesegene kodieren, untersucht werden. Es kommt in Betracht, dass mutante Phaffia-Stämme erhalten werden können, die größere Mengen an wertvollen Carotinoiden erzeugen, z. B. β-Carotin, Cantaxanthin, Zeaxanthin und/oder Astaxanthin.
Gleichermaßen können die DNA-Sequenzen, die für Enzyme, die am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt sind, kodieren, in andere Wirte, wie Bakterien, z. B. E. coli, Hefen, z. B. der Spezies Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, Candida, Yarrowia, Phycomyces, Hansenula und Picchia, Pilze, wie Aspergillus und Fusarium, und Pflanzen, wie Karotten, Tomaten und dergl., eingeführt werden. Die Transformationsverfahren und die Expressionserfordernisse sind dem Fachmann geläufig.
Stämme

E. coli XL-Blue-MRF'Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMRmrr) 173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F' proAB laq^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)]
ExAssist^® Interferenz-resistente Helferphage (Stratagene^®)
P. rhodozyma CBS6938 oder
P. rhodozyma asta 1043-3

Für die Klonierung verwendete Plasmide

pUC19 Ap^r (Gibco BRL)
Uni-ZAP^® XR-Vektor (lambda ZAP^®II-Vektor, verdaut mit EcoRI-XhoI, CIAP-behandelt; Stratagene^®)

Medien

LB: 10 g/Liter Bacto-Trypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 10 g/Liter NaCl, Platten: +20 g/Liter Bacto-Agar.

Gegebenenfalls wurden 50–100 μg/ml Ampicillin (Ap), 30 μg/ml Chloramphenicol (Cm) und 1 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) zugegeben.
YePD: 10 g/Liter Hefeextrakt, 20 g/Liter Bacto-Pepton, 20 g/Liter Glucose. Platten: +20 g/Liter Bacto-Agar.
Sämtliche molekularen Klonierungstechniken wurden im wesentlichen gemäß den Angaben von Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Auflg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), durchgeführt. Eine Transformation von E. coli wurde gemäß dem von Sambrook et al. beschriebenen CaCl₂-Verfahren vorgenommen.
Enzyminkubationen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Diese Inkubationen umfassen einen Restriktionsenzym-Verdau, eine Dephosphorylierung und eine Ligation (Gibco BRL). Die Isolierung der Plasmid-DNA aus E. coli wurde unter Verwendung von QIAGEN (Westburg B. V., NL) durchgeführt.
Für die Sequenzanalyse wurden Deletionskonstrukte und Oligonucleotide hergestellt, um die vollständige Sequenz unter Verwendung eines Taq DYE Primer Cycle Sequencing-Kits (Applied Biosystems) zu sequenzieren.
Beispiel 8
Beschreibung der Plasmide
Plasmide (pACCAR25ΔcrtE, pACCAR25ΔcrtB, pACCRT-EIB, pACCAR16ΔcrtX und pACCAR25ΔcrtX), die verschiedene Kombinationen an Genen, die an der Carotinoid-Biosynthese in Erwinia uredovora beteiligt sind, wurden von Prof. Misawa, Kirin Brewery Co., Ltd., Japan, zur Verfügung gestellt. Der Biosyntheseweg der Carotinoid-Synthese in Erwinia uredovora ist in 8 dargestellt.
Ferner wurde ein Derivat von pACCAR25ΔcrtX, bezeichnet als pACCAR25ΔcrtXΔcrtI, in unserem Labor hergestellt. Durch die Einführung einer Rasterverschiebung in der BamHI-Restriktionsstelle wurde das crtI-Gen inaktiviert. E. coli-Stämme, die dieses Plasmid enthalten, reichern Phytoen an, das durch den roten Phänotyp der Kolonie überwacht werden kann.
Sämtliche Plasmide stellen Derivate von pACYC184 dar (R. E. Rose, Nucl. Acids Res., Bd. 16 (1988) S. 355), das einen Marker enthält, der Chloramphenicol-Resistenz verleiht. Ferner enthalten diese Plasmide und Derivate davon eine Replikationsursprungsstelle, die mit Vektoren, wie pUC und pBluescript, verträglich ist. Jedes Plasmid enthält einen Satz von Genen der Carotinoid-Biosynthese von Erwinia uredovora, die die Bildung von verschiedenen Carotinoiden in E. coli vermitteln. Die vollständige Liste von bei dieser Untersuchung verwendeten Plasmiden ist in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5 Zusammenstellung von bei dieser Untersuchung verwendeten, Carotinoide bildenden E. coli-Stämmen
Kodierende Gene: crtE, Geranylgeranylpyrophosphat-synthase; crtB, Phytoen-synthase; crtI, Phytoen-desaturase; crtY, Lycopen-cyclase; crtX, β-Carotin-hydroxylase; crtZ, Zeaxanthin-glycosylase
Beispiel 9
Konstruktion einer cDNA-Bibliothek von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung der gesamten RNA aus Phaffia rhodozyma
Sämtliche Lösungen wurden in mit DEPC behandeltem destilliertem Wasser hergestellt. Sämtliche Ausrüstungsgegenstände wurden über Nacht in 0,1% DEPC eingeweicht und sodann autoklavisiert.
Ein 300 ml fassender Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 60 ml YePD-Kulturmedium wurde mit Phaffia rhodozyma Stamm CBS6938/1043-3 aus einer Vorkultur bis zu einem End OD₆₀₀-Wert von 0,1 inokuliert. Diese Kultur wurde bei 21°C (300 U/min) bis zum Erreichen eines OD₆₀₀-Werts von 3–4 inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (4°C, 8000 U/min, 5 Minuten) und in 12 ml eiskaltem Extraktionspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5; 0,1 M LiCl; 0,1 mM EDTA) resuspendiert. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in 2 ml eiskaltem Extraktionspuffer resuspendiert und mit 4 g Glasperlen (0,25 mm) und 2 ml Phenol versetzt.
Das Gemisch wurde 5-mal 30 Sekunden mit maximaler Drehzahl aufgewirbelt, wobei Inkubationsabstände von 30 Sekunden auf Eis eingehalten wurden.
Das Gemisch aus Zellen, Glasperlen und Phenol wurde zentrifugiert (5 Minuten, 15300 U/min, 4°C). Die wässrige Phase (sup 1) wurde in ein frisches Röhrchen übertragen und auf Eis gehalten.
Die Phenolphase wurde durch Zugabe eines weiteren Volumens von 1 ml Extraktionspuffer und 2 ml Phenol reextrahiert.
Nach Zentrifugation (5 Minuten, 15300 U/min, 4°C) wurde die wässrige Phase auf sup 1 übertragen und mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform extrahiert.
Nach Zentrifugation (5 Minuten, 15300 U/min, 4°C) wurde die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen übertragen und mit 0,1 Volumenteilen 3 M NaAc, pH-Wert 5,5, und 2,5 Volumenteilen EtOH versetzt, um RNA auszufällen (Inkubation über Nacht bei –20°C).
Der Überstand wurde durch Zentrifugation (10 Minuten, 15300 U/min, 4°C) gewonnen. Nach Ablaufen von überschüssiger Flüssigkeit wurde das RNA-Pellet mit 70 eiskaltem EtOH gewaschen.
Nach Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit wurde die RNA in 200–800 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Die RNA wurde bei –70°C aufbewahrt. Eine 60 ml-Kultur ergab 400–1500 μg gesamte RNA. Die Integrität der gesamten RNA wurde durch Formaldehyd-RNA Gelelektrophorese geprüft.
b) Selektion von poly(A)⁺-RNA
Die Isolierung von poly(A)⁺ aus der gesamten RNA wurde im wesentlichen gemäß den Angaben von Sambrook et al., (Molecular Aloning, A Laboratory Manual, 2. Auflg. 1989) unter Verwendung der folgenden Lösungen durchgeführt.
Sämtliche Lösungen wurden in DEPC-behandeltem Wasser hergestellt und autoklavisiert.
RNA-Denaturierungspuffer: 1 M NaCl, 18% (Vol./Vol.) DMSO.
Säulenaufsetzpuffer (HEND): 10 mM Hepes, pH-Wert 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 9% (Vol./Vol.) DMSO.
Elutionspuffer (HE): 10 mM Hepes, pH-Wert 7,6; 1 mM EDTA.
Oligo(dT)-Cellulose Typ 7 wurde von der Fa. Pharmacia Biotech geliefert. 0,1 g (Trockengewicht) oligo(dT)-Cellulose wurde zu 1 ml HEND gegeben. Die Suspension wurde vorsichtig 1 Stunde bei 4°C geschüttelt. Die gesamte RNA (1,5 mg, gelöst in 500 μl) und 1 ml 1 M NaCl, 18% (Vol./Vol.) DMSO wurde 5 Minuten auf 65°C erwärmt. Anschließend wurde die RNA mit 600 μl NaCl/DMSO versetzt, vermischt und 5 Minuten auf Eis gestellt. Die poly(A)⁺-Isolierung wurde durch zwei Reinigungszyklen durchgeführt. Die endgültige Ausbeute betrug etwa 45 μg poly(A)⁺-RNA.
c) cDNA-Synthese
cDNAs wurden aus 7,5 μg poly(A)⁺-RNAs unter Verwendung des cDNA-Synthesekits (#200401, Stratagene^®) synthetisiert. Die Synthese wurde gemäß den Angaben des Herstellers unter einigen geringfügigen Modifikationen durchgeführt.
SuperScript^®II RNase H^– reverse Transkriptase (Gibco BRL) wurde bei der ersten Strangreaktion anstelle von MMLV-RT verwendet.
Die folgenden Reagenzien wurden in einer Mikrozentrifuge zugesetzt:
3 μl poly(A)⁺-RNAs
2 μl Linker-Primer
23,5 μl DMQ
10-minütige Inkubation bei 70°C, rasche Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge und Zugabe von:
10 μl 5 × First Strand Buffer (Produkt der Fa. Gibco BRL)
5 μl 0,1 M DTT (Produkt der Fa. Gibco BRL)
3 μl des First-Strand-Methylnucleotidgemisches
1 μl RNase-Block-Ribonuclease-Inhibitor (40 U/μl)
Einem Annealling von Matrize und Primern durch 10-minütige Inkubation des Gemisches bei 25°C schloss sich eine 2-minütige Behandlung bei 42°C und schließlich die folgende Zugabe an:
2,5 μl SuperScript^®II RNase H^– reverse Transkriptase
Die erste Strangreaktion wurde 1 Stunde bei 42°C durchgeführt.
Die Größenfraktionierung wurde unter Verwendung des Geneclean^®II-Kits (Produkt der Fa. BIO 101, Inc.) durchgeführt. Das Volumen des cDNA-Gemisches, das nach XhoI-Verdau erhalten wurde, wurde durch Zugabe von DMQ auf ein Endvolumen von 200 μl gebracht. 3 Volumenteile NaI wurden zugegeben und das Mikrozentrifugenröhrchen wurde 5 Minuten auf Eis gestellt. Das glasige Pellet wurde 3-mal unter Verwendung von 500 μl "New Wash" gewaschen. Schließlich wurde die cDNA in 20 μl DMQ eluiert.
Unter diesen Bedingungen betrug die Ausbeute an cDNA etwa 1 μg.
d) cDNA-Klonierung
Eine cDNA-Bibliothek wurde im Uni-ZAP^® XR-Vektor unter Verwendung von 100 ng cDNAs konstruiert. Die Ligation wurde durch 2-malige Inkubation über Nacht bei 12°C durchgeführt. Die cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des Packagene^®-lambda-DNA-Packungssystems (Promega) gemäß der Bedienungsanleitung gepackt. Der berechnete Titer der cDNA-Bibliothek betrug 3,5 × 10⁶ pfu.
e) Massenexzision
Eine Massenexzision wurde gemäß den Verfahrensangaben unter Verwendung von Derivaten von E. coli XL-Blue-MRF' als Akzeptorstamm (vergl. Tabelle 5) durchgeführt. Eine Verdünnung von Zellgemischen wurde auf 145 mm-LB-Agarplatten mit einem Gehalt an Ampicillin, Chloramphenicol und IPTG ausgestrichen, wobei auf jeder Platte 250–7000 Kolonien erhalten wurden. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und sodann ein oder zwei weitere Tage bei Raumtemperatur inkubiert.
Beispiel 10
Klonierung des Geranylgeranylpyrophosphat-synthase-Gens (crtE) von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung eines cDNA-Klons
Die gesamte Bibliothek wurde in Farnesylpyrophosphat/Isopentenyl-pyrophosphat anreichernde Zellen von E. coli XL-Blue-MRF (mit dem Plasmid pACCAR25ΔcrtE (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE] bezeichnet) geschnitten. Das Screening des crtE-Gens beruhte auf der Farbe der Transformanten. Die Einführung des crtB-Gens in einen genetischen Hintergrund von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE] führt zu einer Wiederherstellung des vollständigen Biosynthesewegs von Zeaxanthin-diglucosid, was durch das Auftreten einer gelb/orangefarben pigmentierten Kolonie überwacht werden kann. Etwa 8000 Kolonien wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an entsprechenden Antibiotika und IPTG ausgestrichen. Es wurde festgestellt, dass bei einer Kolonie ein Farbwechsel zu gelb/orangefarben eingetreten war.
b) Charakterisierung eines komplementierenden cDNA-Klons
Diese Kolonien wurden auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde aus diesen gelben Kolonien isoliert. Es wurde festgestellt, dass sie ein 1,85 kb-Fragment enthielten (2A). Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pPRcrtE wurde für Retransformationsexperimente verwendet (Tabelle 6). Nur die Transformation von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtE] mit pPRcrtE führte zu einer Farbänderung im Phänotyp von Weiß nach Gelb. Um zu testen, ob die Farbänderung auf eine Komplementierung zurückzuführen war und nicht durch cDNA allein verursacht wurde, wurde pPRcrtE in XL-Blue-MRF' transformiert. Eine Selektion von Transformanten auf einer LB-Ampicillin-Agarplatte mit einem Gehalt an IPTG führte nicht zu Farbänderungen der Kolonien (Tabelle 6). Daher schlossen wir vorläufig, dass wir eine cDNA von P. rhodozyma kloniert hatten, die für GPPP-Synthase kodierte, die an der Umwandlung von IPP und FPP zu GGPP beteiligt ist.
Tabelle 6 Farb-Phänotyp von Carotinoid-erzeugenden, mit pPRcrtE transformierten E. coli-Stämmen
Transformation: jeweils 10 ng Plasmid wurden mit CaCl₂-kompetenten E. coli-Zellen vermischt. Transformantenzellen wurden durch Ausstreichen von 1/10 und 1/100 Volumen des DNA/Zellgemisches auf LB-Agarmedium mit einem Gehalt an den entsprechenden Antibiotika (in Klammern) selektiert.
c) Sequenzanalyse eines cDNA-Fragments
Das Plasmid pPRcrtE wurde zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der 1,85 kb-cDNA verwendet.
Die Sequenz umfasst 1830 Nucleotide und einen 31 bp poly(A)-Schwanz. Ein offener Leseraster (ORF) von 375 Aminosäuren wurde vorhergesagt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind als SEQ. ID. NO: 14 bzw. 15 angegeben. Eine Recherche in der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank unter Verwendung des Blitz-Aminosäuresequenz-Zuordnungsprogramms ergab eine Aminosäurehomologie (52% in einer Überlappung von 132 Aminosäuren; Neurospora crassa) insbesondere in Bezug auf die konservierte Domäne I in Geranylgeranyl-PPi-synthase-Enzymen verschiedener Organismen (Botella et al., Eur. J. Biochem., Bd. 233 (1995), S. 238–248).
Beispiel 11
Klonierung des Phytoen-synthase-Gens (crtB) von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung eines cDNA-Klons
Die gesamte Bibliothek wurde in Geranylgeranylpyrophosphat anreichernden Zellen von E. coli XL-Blue-MRF' mit einem Gehalt an dem Plasmid pACCAR25ΔcrtB (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB] bezeichnet) geschnitten. Das Screening auf das crtB-Gen beruhte auf der Farbe der Transformanten. Eine Einführung des crtB-Gens in einen genetischen Hintergrund von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB] würde zu einer Wiederherstellung des vollständigen Wegs für die Biosynthese von Zeaxanthindiglucosid führen, was durch die Anwesenheit einer gelb/orangefarben pigmentierten Kolonie überwacht werden könnte.
Etwa 25000 Kolonien wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an den entsprechenden Antibiotika und IPTG inkubiert. Es wurde festgestellt, dass 3 Kolonien sich gelb/orangefarben verfärbt hatten.
b) Charakterisierung eines komplementierenden cDNA-Klons
Diese Kolonien wurden auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen. Plasmid-DNA mit der Bezeichnung pPRcrtB1 bis 3 wurden aus diesen gelben Kolonien isoliert. Es wurde festgestellt, dass sie ein 2,5 kb-Fragment enthielten (2B). Eines der erhaltenen Plasmide, nämlich pPRcrtB1, wurde für Retransformationsexperimente verwendet (Tabelle 7). Nur die Transformation von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB] mit pPRcrtB führte zu einer Farbänderung des Phänotyps von Weiß nach Gelb. Daher schlossen wir vorläufig, dass wir eine cDNA von P. rhodozyma kloniert hatten, die für Phytoen-synthase kodiert, die an der Umwandlung von 2 GGPP-Molekülen über Präphytoenpyrophosphat zu Phytoen beteiligt ist.
Tabelle 7 Farb-Phänotyp von Carotinoid-erzeugenden E. coli-Stämmen nach Transformation mit pPRcrtB
Legende: vergl. Tabelle 6.
c) Sequenzanalyse eines cDNA-Fragments
Das Plasmid pPRcrtB2, das das längste cDNA-Insert enthält, wurde zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der 2,5 kb-cDNA verwendet. Die Sequenz umfasste 2483 Nucleotide und einen 20 bp poly(A)-Schwanz. Es wurde ein offener Leseraster (ORF) von 684 Aminosäuren vorhergesagt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NO: 12 bzw. 13 aufgeführt. Eine Recherche in der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank unter Verwendung des Blitz-Aminosäuresequenz-Zuordnungsprogramms ergab eine gewisse Aminosäurehomologie (26% Identität in einer Überlappung von 441 Aminosäuren des crtB-Gens von Neurospora crassa) mit crtB-Genen anderer Organismen.
Beispiel 12
Klonierung des Phytoen-desaturase-Gens (crtI) von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung eines cDNA-Klons
Die gesamte Bibliothek wurde in ein Phytoen anreichernde Zellen von E. coli XL-Blue-MRF' mit dem Plasmid pACCAR25ΔcrtXΔcrtI (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI] bezeichnet) geschnitten. Das Screening auf das crtI-Gen beruhte auf der Farbe der Transformanten. Die Einführung des crtI-Gens in einen genetischen Hintergrund von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔcrtI] führt zu einer Wiederherstellung des vollständigen Biosyntheseweges von Zeaxanthin, was durch das Vorliegen einer gelb/orangefarben pigmentierten Kolonie überwacht werden kann.
Etwa 14000 Kolonien wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an entsprechenden Antibiotika und IPTG inkubiert. Es wurde festgestellt, dass 2 Kolonien sich gelb/orangefarben verfärbt hatten.
b) Charakterisierung von komplementierenden cDNA-Klonen
Diese Kolonien wurden auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen. Plasmid-DNA mit der Bezeichnung pPRcrtI.1 und pPRcrtI.2 wurden aus diesen gelben Kolonien isoliert. Es wurde festgestellt, dass sie ein 2,0 kb-Fragment enthielten (2C). Eines der erhaltenen Plasmide, nämlich pPRcrtI.1 wurde für Retransformationsexperimente verwendet (Tabelle 8). Nur die Transformation von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtXΔCrtI] mit pPRcrtI führte zu einer Farbänderung des Phänotyps von Weib nach Gelb. Daher schlossen wir vorläufig, dass wir eine cDNA von P. rhodozyma kloniert hatten, die für Phytoen-desaturase kodiert, die an der Umwandlung von Phytoen zu Lycopen beteiligt ist.
Tabelle 8 Farb-Phänotyp von Carotinoid-erzeugenden, mit pPRcrtI transformierten E. coli-Stämmen
Legender vergl. Tabelle 6.
c) Sequenzanalyse eines cDNA-Fragments
Eines der Plasmide, nämlich pPRcrtI, wurde zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der 2,0 kb-cDNA verwendet. Die Sequenz umfasst 2038 Nucleotide und einen 20 bp poly(A)-Schwanz. Ein offener Leseraster (ORF) mit 582 Aminosäuren wurde vorhergesagt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NO: 16 bzw. 17 angegeben. Eine Recherche in der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank unter Verwendung des Blitz-Aminosäuresequenz-Zuordnungsprogramms (Data) ergab eine Aminosäurehomologie zum Phytoen-desaturase-Gen von N. crassa (53% Identität bei einer Überlappung von 529 Aminosäuren).
Beispiel 13
Klonierung des Lycopen-cyclase-Gens (crtY) von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung eines cDNA-Klons
Die gesamte Bibliothek wurde in Lycopen-anreichernde Zellen von E. coli XL-Blue-MRF' mit dem Plasmid pACCRT-EIB (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] bezeichnet) geschnitten. Das Screening auf das crtY-Gen beruhte auf der Farbe der Transformanten. Die Einführung des crtY-Gens in einen genetischen Hintergrund von XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] führt zu einer Wiederherstellung des vollständigen Biosynthesewegs von β-Carotin, was durch die Anwesenheit einer gelbgefärbten Kolonie überwacht werden kann. Etwa 8000 Kolonien wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an den entsprechenden Antibiotika und IPTG inkubiert. Es wurde festgestellt, dass sich eine Kolonie gelb verfärbt hatte.
b) Charakterisierung eines komplementierenden cDNA-Klons
Diese Kolonie wurde auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde von dieser gelben Kolonie isoliert. Es wurde festgestellt, dass sie ein 2,5 kb-Fragment enthielt (2B). Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pPRcrtY wurde für Retransformationsexperimente verwendet (Tabelle 9). Überraschenderweise führte nicht nur eine Transformation von XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB], sondern auch eine Transformation von XL-Blue-MRF'[pACCAR25ΔcrtB] mit pPRcrtY zu einer Farbänderung des Phänotyps von Rot nach Gelb.
Tabelle 9 Farb-Phänotyp von Carotinoid-erzeugenden, mit pPRcrtY transformierten E. coli-Stämmen
Legende: vergl. Tabelle 6.
Ein zweites Transformationsexperiment wurde unter Einbeziehung der vorher klonierten cDNA von pPRcrtB durchgeführt. Wie in Tabelle 6 dargelegt ist, war die cDNA, die vorher (Beispiel 3) als Kodierungssequenz für Phytoen-synthase isoliert worden war, zur Komplementierung der crtY-Deletion befähigt, was zur Biosynthese von β-Carotin in XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] führte.
Eine Sequenzanalyse des cDNA-Inserts von pPRcrtY (SEQ. ID. NO: 18 und 19) ergab eine Ähnlichkeit zur Sequenz des cDNA-Fragments von pPRcrtB.
Aus diesen Daten schließen wir vorläufig, dass wir eine cDNA von P. rhodozyma kodiert haben, die für Phytoen-synthase und Lycopen-cyclase kodiert, die an der Umwandlung von 2 GGPP-Molekülen über Präphytoen-pyrophosphat zu Phytoen bzw. von Lycopen zu β-Carotin beteiligt sind. Es handelt sich um das erste Gen in einem biosynthetischen Stoffwechselweg der Carotinoidsynthese, das für zwei enzymatische Aktivitäten kodiert.
Tabelle 10 Farb-Phänotyp von Carotinoid-erzeugenden, mit unterschiedlichen cDNAs von Phaffia rhodozyma (Ap, Cm, IPTG) transformierten Stämmen
Legende: vergl. Tabelle 6.
Beispiel 14
Klonierung des Isopentenyl-diphosphat(IPP)-isomerase-Gens (idi) von Phaffia rhodozyma
a) Isolierung eines cDNA-Klons
Die gesamte Phaffia-cDNA-Bibliothek wurde in Lycopen anreichernde Zellen von E. coli XL-Blue-MRF', die jeweils das Plasmid pACCRT-EIB (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] bezeichnet) tragen, geschnitten. Etwa 15000 Kolonien wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an entsprechenden Antibiotika und IPTG inkubiert. Es wurde festgestellt, dass eine Kolonie einen dunkelroten Farb-Phänotyp aufwies.
b) Charakterisierung eines komplementierenden cDNA-Klons
Diese Kolonie wurde auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde von dieser gelben Kolonie isoliert. Es wurde festgestellt, dass sie ein 1,1 kb-Fragment enthielt. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pPRcrtX, wurde für Retransformationsexperimente verwendet (Tabelle 11).
Sämtliche Kolonien von XL-Blue-MRF'[pACCAR-EIB], die mit pPRcrtX transformiert waren, zeigten einen dunkeltroten Phänotyp. Aus diesen Daten schlossen wir vorläufig, dass wir eine cDNA von P. rhodozyma kloniert hatten, deren Expression zu einer erhöhten Lycopen-Bildung in einem gentechnisch bearbeiteten E. coli-Stamm führt.
Tabelle 11 Farb-Phänotyp von Carotinoid-bildenden, mit pPRcrtY transformierten E. coli-Stämmen
Legende: vergl. Tabelle 6.
c) Sequenzanalyse eines cDNA-Fragments
Um die Natur dieses Gens aufzuklären, wurde die vollständige Nucleotidsequenz des cDNA-Inserts in pPRcrtX bestimmt. Die Nucleotidsequenz besteht aus 1144 bp. Die Sequenz umfasst 1126 Nucleotide und einen poly(A)-Schwanz von 18 Nucleotiden. Ein offener Leseraster (ORF) von 251 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von 28,7 kDa wurde vorhergesagt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NO: 20 bzw. 21 aufgeführt.
Eine Recherche in der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank unter Verwendung des Blitz-Aminosäuresequenz-Zuordnungsprogramms (Data) ergab eine Aminosäurehomologie zu Isopentenyldiphosphat(IPP)-isomerase (idi) von S. cerevisiae (42,2% Identität bei einer Überlappung von 200 Aminosäuren). IPP-Isomerase katalysiert eine wesentliche Aktivierungsstufe im Isopren-Biosynthese-Stoffwechselweg, der den Baustein von Carotinoiden mit 5 Kohlenstoffatomen synthetisiert. In Analogie zu Hefe erhielt das Gen von Phaffia die Bezeichnung idi1. Der cDNA-Klon, der diese Gene trägt, erhielt dann die Bezeichnung pPRidi.
Beispiel 15
Überexpression des idi-Gens von P. rhodozyma in einem carotinogenen E. coli
Lycopen anreichernde Zellen von E. coli XL-Blue-MRF', die das Plasmid pACCRT-EIB (nachstehend als XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB] bezeichnet) enthielten, wurden mit pUC19 und pPRidi transformiert. Transformanten wurden auf verfestigtem LB-Medium mit einem Gehalt an Amp und Cm selektiert. Die Transformanten mit der Bezeichnung XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB/pUC19 und pACCRT-EIB/pPRidi] wurden in 30 ml LB-Medium mit einem Gehalt an Amp, Cm und IPTG 16 Stunden bei 37°C und 250 U/min gezüchtet. Aus diesen Kulturen wurde 1 ml für die Carotinoid-Extraktion und Analyse verwendet. Nach Zentrifugation wurde das Zellpellet in 200 μl Aceton gelöst und 30 Minuten bei 65°C inkubiert. 50 μl der zellfreien Acetonfraktion wurden sodann für die Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC)-Analyse verwendet. Die Säule (chrompack cat. 28265; Packung Nucleosil 100C18) wurde mit Wasser/Acetonitril/2-Propanol (von 0 bis 45 Minuten 9 : 10 : 81 und nach 45 Minuten 2 : 18 : 80) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 ml pro Minute entwickelt und mit einem Photodioden-Gitterdetektor bei 470 ± 20 nm aufgezeichnet. Es wurde gezeigt, dass Lycopen unter diesen Bedingungen eine Retentionszeit von etwa 23 Minuten aufweist. Die Peakfläche wurde als relative Lycopen-Erzeugung herangezogen (mAu*s). Die relative Lycopen-Erzeugung betrug 395 und 1165 für XL-Blue-MRF'[pACCRT-EIB/pUC19] bzw. [pACCRT-EIB/pPRidi].
Diese Daten zeigen die Möglichkeiten der Manipulation des Stoffwechselweges in Phaffia, da eine erhöhte Expression des idi von Phaffia rhodozyma eine 3-fache Steigerung der Carotinoid-Biosynthese in E. coli bewirkt.
Diese cDNA kann in einer transformierten Phaffia-Zelle im Hinblick auf die Erhöhung der Carotinoid- und/oder Xanthophyll-Konzentrationen überexprimiert werden. Die cDNA wird in geeigneter Weise unter der Kontrolle eines Promotors, der in Phaffia aktiv ist, kloniert, z. B. eines starken erfindungsgemäßen Promotors, wie eines Promotors des glykolytischen Stoffwechselwegs in Phaffia, wie der hier beschriebene GAPDH-Gen-Promotor, oder eines erfindungsgemäßen ribosomalen Phaffia-Protein-Gen-Promotors (siehe unten). Gegebenenfalls wird die cDNA in Front eines transkriptionalen Terminators und/oder einer Polyadenylierungsstelle gemäß der Erfindung, z. B. der GAPDH-Gen-Terminator/Polyadenylierungsstelle, kloniert. Die Möglichkeit hierfür wird im nächsten Beispiel erläutert, wobei beispielsweise das crtB-Gen aus Erwinia uredovora in Phaffia rhodozyma überexprimiert wird.
Beispiel 16
Heterologe Expression des carotinogenen Gens aus Erwinia uredovora in Phaffia rhodozyma
Die Kodierungssequenz für Phytoen-synthase (crtB) von Erwinia uredovora (Misawa et al., 1990) wurde zwischen den Promotor- und Terminatorsequenzen des gpd (GAPDH-Gen) von Phaffia durch Fusions-PCR geklont. In zwei getrennten PCR-Reaktionen wurden die Promotorsequenz von gpd und die Kodierungssequenz von crtB amplifiziert. Die erstgenannte Sequenz wurde unter Verwendung der Primer 5177 und 5128 und von pPR8 als Matrize amplifiziert. Dieser letztgenannte Vektor ist ein Derivat des Phaffia-Transformationsvektors pPR2, in dem die Promotorsequenz vergrößert worden ist und die BglII-Restriktionsstelle entfernt worden ist. Die Promotorsequenz von gpd wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5226 und 5307 und des Plasmids pPRgpd6 als Matrize amplifiziert. Das amplifizierte Promotorfragment wurde isoliert, mit KpnI und BamHI verdaut und in das KpnI-BglII-Fragment des Vektors pPR2 kloniert, wodurch man pPR8 erhielt. Die Kodierungssequenz von crtB wurde unter Verwendung der Primer 5131 und 5134 und von pACCRT-EIB als Matrize amplifiziert. In einer zweiten Fusions-PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer 5177 und 5134 wurden 1 μg des amplifizierten Promotors und das crtB-Kodierungsregionfragment als Matrize verwendet, wodurch man das Fusionsprodukt Pgpd-crtB erhielt. Die Terminatorsequenz wurde unter üblichen PCR-Bedingungen unter Verwendung der Primer 5137 und 5138 und des Plasmids pPRgdh6 als Matrize amplifiziert. Der Primer 5137 enthält am 5'-Ende die letzten 11 Nucleotide der Kodierungsregion des crtB-Gens von E. uredovora und die ersten 16 Nucleotide der Terminatorsequenz des gpd-Gens von P. rhodozyma. Durch eine Substitution von zwei Basenpaaren wurde eine BamHI-Restriktionsstelle eingeführt. Das amplifizierte Fusionsprodukt (Pgpd-crtB) und die amplifizierten Terminatorfragmente wurden gereinigt und mit HindIII und BamHI verdaut sowie in die dephosphorylierte HindIII-Stelle des Klonierungsvektors pMTL25 kloniert. Der Vektor mit dem Konstrukt Pgpd-crtB-Tgpd erhielt die Bezeichnung pPREX1.1.
Das HindIII-Fragment mit einem Gehalt an der Expressionskassette Pgpd-crtB-Tgpd wurde aus pPREX1.1 isoliert und in die dephosphorylierte HindIII-Stelle des Phaffia-Transformationsvektors pPR8 ligiert. Nach Transformation des Ligationsgemisches in E. coli wurde ein Vektor (pPR8crtB6.1) mit dem korrekten Insert für Phaffia-Transformationsexperimente ausgewählt.
Der Phaffia-Stamm CBS6938 wurde mit pPR8crtB6.1, das die Expressionskassette Pgpd-crtB-Tgpd trägt, transformiert und Transformanten wurden auf Platten mit einem Gehalt an G418 selektiert. Die relative Menge an Astaxanthin pro OD₆₀₀ in drei G418-resistenten Transformanten und den Wildtyp-Phaffia-Stämmen wurde durch HPLC-Analyse bestimmt (Tabelle 12). Zur Carotinoid-Isolierung aus Phaffia wurde das Verfahren der DMSO/Hexan-Extraktion von Sedmak et al. (Biotechn. Techniq., Bd. 4 (1990), S. 107–112) herangezogen.
Tabelle 12 Relative Astaxanthin-Erzeugung in einer Phaffia-Transformante mit dem crtB-Gen von E. uredovora
Die gpd-Sequenzen sind mit Fettschrift und die crtB-Sequenzen mit Kursivschrift gekennzeichnet. Zusätzliche Restriktionsstellen für die Klonierung sind unterstrichen und Basensubstitutionen sind doppelt unterstrichen.
Beispiel 17
Isolierung und Charakterisierung des crtB-Gens von Phaffia
Es ist ferner möglich, das Phaffia rhodozyma-Gen, das crtB entspricht, zu exprimieren und es unter der Kontrolle seiner eigenen regulatorischen Regionen oder unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Promotors eines hochgradig exprimierten Gens zu exprimieren. Das hier beschriebene Phaffia-Transformationsverfahren führt in unveränderlicher Weise zu stabil integrierten hohen Kopienzahlen der eingeführten DNA. Es ist zu erwarten, dass die Expression des Gens unter der Kontrolle seines eigenen Promotors auch zu einer verstärkten Bildung von Carotinoiden, einschließlich Astaxanthin, führt. Um das Prinzip zu erläutern, ist nachstehend ein Verfahren für die Klonierung der crtB-Genomsequenz angegeben.
Um das genomische crtB-Gen unter Einschluss von Expressionssignalen zu erhalten, wurde das 2,5 kb-BamHI-XhoI-Fragment aus dem Vektor pPRcrtB isoliert und als Sonde verwendet, um eine Cosmidbibliothek von Phaffia abzusuchen.
Die Konstruktion und das Screening der Bibliothek wurden gemäß den Angaben in Beispiel 3 unter Verwendung des crtB-Gens als Sonde anstelle des gapdh-Gens durchgeführt.
Nach den Hybridisierungsrunden wurden zwei Kolonien identifiziert, die nach der Einwirkung auf dem Autoradiogramm ein starkes Hybridisierungssignal ergaben. Aus diesen Kolonien isolierte Cosmid-DNA erhielt die Bezeichnung pPRgcrtB#1.1 bzw. pPRgcrtB#7.
Aus Phaffia rhodozyma Stamm 6938 isolierte chromosomale DNA und Cosmid-pPRgcrtB#7 wurden mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut. Die DNA-Fragmente wurden getrennt, einem Blotting unterzogen und mit einer aminoterminalen spezifischen Sonde (0,45 kb XbaI-Fragment) von crtB unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Nach der Einwirkung zeigte das Autoradiogramm DNA-Fragmente von unterschiedlicher Länge, die durch verschiedene Restriktionsenzyme verdaut worden waren und mit der crtB-Sonde hybridisierten. Auf der Grundlage, dass keine EcoRI-Stelle im cDNA-Klon vorliegt, wurde ein EcoRI-Fragment von etwa 4,5 kb für Subklonierungsexperimente ausgewählt, um die Sequenz in der Promotorregion zu bestimmen und um die Anwesenheit von Intronsequenzen im crtB-Gen zu bestätigen. Ein Hybridisierungsfragment ähnlicher Größe wurde auch in der chromosomalen DNA, die mit EcoRI verdaut worden war, gefunden. Das Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und in die entsprechende Stelle von pUC19 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde auf kompetente E. coli-Zellen transformiert. Plasmide mit dem korrekten Insert in beiden Orientierungen mit den Bezeichnungen pPR10.1 und pPR10.2 wurden aus den Transformanten isoliert. Ein Vergleich der Restriktionsmuster von pPR10.1/pPR10.2 und von mit XbaI verdautem pPRcrtB ergab einen Hinweis auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Introns, da festgestellt wurde, dass das interne 2,0 kb XbaI-Fragment im cDNA-Klon größer als in den erstgenannten Vektoren war. Der Subklon pPR10.1 wurde für die Sequenzanalyse der Promotorregion und des Strukturgens nach dem sogenannten Primer-Walking-Verfahren verwendet. Die partielle Sequenz des Inserts ist in SEQ. ID. NO: 22 aufgeführt. Ein Vergleich der cDNA und der genomischen Sequenz ergab die Anwesenheit von 4 Introns.
Beispiel 18
Isolierung von Promotorsequenzen mit hohen Expressionsniveaus
Dieses Beispiel erläutert die Möglichkeit des in der ausführlichen Beschreibung erwähnten "cDNA-Sequenzierungsverfahrens", um Transkriptionspromotoren aus hochgradig exprimierten Genen zu erhalten.
Für die Isolierung und Identifizierung von Transkriptionspromotorsequenzen aus Phaffia rhodozyma-Genen mit hohen Expressionsniveaus wurde die cDNA-Bibliothek von Phaffia rhodozyma nach dem folgenden Verfahren analysiert.
Die cDNA-Bibliothek wurde auf verfestigtes LB-Medium mit einem Gehalt an Amp ausgestrichen. 96 Kolonien wurden willkürlich für die Plasmidisolierung herausgenommen. Das gereinigte Plasmid wurde mit XhoI und XbaI verdaut und auf ein Agarosegel aufgesetzt. Die Größe der cDNA-Inserts variierte von 0,5 bis 3,0 kb. Anschließend wurden diese Plasmide als Matrize für eine Einzelsequenzreaktion unter Verwendung des T3-Primers verwendet. Für 17 cDNA-Klone wurden keine Sequenzdaten erhalten. Die erhaltenen Sequenzen wurden in alle drei Leseraster translatiert. Für jede cDNA-Sequenz wurden die längsten abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit der SwissProt-Proteindatenbank beim EBI unter Verwendung des Blitz-Programms verglichen. Für 18 abgeleitete Aminosäuresequenzen wurde keine Homologie zu bekannten Proteinen festgestellt, während 6 Aminosäuresequenzen eine signifikante Homologie zu hypothetischen Proteinen zeigten. Es wurde festgestellt, dass 55 Aminosäuresequenzen eine signifikante Homologie zu Proteinen aufweisen, deren Funktion bekannt ist. Bei etwa 50% (38/79) wurde festgestellt, dass sie für ribosomale Proteine kodieren, von denen 12 Sequenzen von voller Länge erhalten wurden.
Tabelle 13 Überblick über exprimierte cDNAs, kodierte Proteine und Hinweis auf das Sequenzprotokoll
Durch Sequenzhomologie wurde der Schluss gezogen, dass in Phaffia das ribosomale 40S-Protein S37 mit Ubiquitin fusioniert ist, wie auch in anderen Organismen festgestellt wird. Die Nucleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der cDNA-Klone von voller Länge sind im Sequenzprotokoll aufgeführt. 6 ribosomale Proteine wurden im willkürlichen Pool durch mehr als einen individuellen cDNA-Klon repräsentiert. Die ribosomalen 40S-Proteine S10 (SEQ. ID. NO: 44), S37 (+ Ubiquitin) (SEQ. ID. NO: 24) und S27 (SEQ. ID. NO: 28) waren 2-mal repräsentiert und die ribosomalen (sauren) 60S-Proteine P2 (SEQ. ID. NO: 38), L37 (SEQ. ID. NO: 46) und L25 (SEQ. ID. NO: 36) wurden 3-mal gefunden. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass diese Proteine durch Mehrfachgene kodiert werden oder dass diese Gene hochgradig exprimiert sind. Daher führt die Isolierung dieser Promotorsequenzen zu neuen und vielversprechenden Zielsequenzen zur Isolierung von Expressionssignalen von hohem Niveau aus Phaffia rhodozyma. Ferner wurde ein cDNA-Klon isoliert, der eine 50%ige Homologie zu einem reichlich vorhandenen, Glucose-reprimierbaren Gen aus Neurospora crassa zeigte (Curr. Genet., Bd. 14 (1988), S. 545–551). Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NO: 26 dargestellt. Einer der Vorteile einer derartigen Promotorsequenz besteht darin, dass sie getrennt für das Wachstum (Anreicherung von Biomasse) und die Genexpression (Anreicherung von Produkt) bei der großtechnischen Phaffia-Fermentation verwendet werden können.
Für die Isolierung der Promotorsequenzen von Interesse (wie vorstehend angegeben) kann ein Fragment aus dem entsprechenden cDNA-Klon als Sonde verwendet werden, um die Genombibliothek von Phaffia rhodozyma gemäß dem für den GAPDH-Gen-Promotor (vorstehendes Beispiel 3) beschriebenen Verfahren abzusuchen. Auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenz des Promotors lassen sich spezielle Oligonucleotide konzipieren, um eine Transkriptionsfusion zwischen dem Promotor und einem beliebigen Gen von Interesse durch Fusions-PCR-Technik gemäß dem im vorstehenden Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zu konstruieren.
Beispiel 19
Isolierung von carotinogenen Genen durch heterologe Hybridisierung
Zur Identifizierung und Isolierung von entsprechenden Genen des biosynthetischen Carotinoid-Stoffwechselwegs aus mit Phaffia rhodozyma verwandten Organismen wurden heterologe Hybridisierungsexperimente unter den Bedingungen einer mäßigen Stringenz durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde chromosomale DNA aus zwei carotinogenen Pilzen (Neurospora crassa und Blakeslea trispora) und der Hefe S. cerevisiae und drei Hefe- und Pilzspezies der Gattung Cystofylobasidium verwendet. Die drei carotinogenen Hefen waren aufgrund von phylogenetischen Untersuchungen am stärksten mit P. rhodozyma verwandt.
Chromosomale DNA aus der Hefespezies Cystofylobasidium infirmo-miniatum (CBS 323), C. bisporidii (CBS 6346) und C. capitatum (CBS 6358) wurden gemäß dem für Phaffia rhodozyma entwickelten Verfahren (beschrieben in Beispiel 3 von EP-A-0 590 707-A1) isoliert. Auf die einschlägigen Teile dieser Druckschrift wird hier durch Verweis Bezug genommen. Die Isolierung von chromosomaler DNA aus den Pilzen Neurospora crassa und Blakeslea trispora wurde im wesentlichen gemäß Kolar et al. (Gene, Bd. 62, S. 127–134), wobei auf die einschlägigen Teile dieser Druckschrift durch Verweis Bezug genommen wird, durchgeführt.
Chromosomale DNA (5 μg) von C. infirmo-miniatum, C. bisporidii, C. capitatum, S. cerevisiae, P. rhodozyma, N. crassa und B. trispora wurde unter Verwendung von EcoRI verdaut. Die DNA-Fragmente wurden auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, einem Blotting unterzogen und unter den folgenden Bedingungen hybridisiert.
Die Hybridisierung wurde bei zwei Temperaturen (50°C und 55°C) unter Verwendung von vier verschiedenen ³²P-markierten Phaffia-Sonden durchgeführt. Die Sonden wurden unter Verwendung von willkürlichen Primer-Hexanucleotid-Markierungsreaktionen unter Einsatz der XhoI-XbaI-Fragmente aus den cDNA-Klonen pPRcrtE, pPRcrtB, pPRcrtI und pPRidi als Matrize hergestellt. Die Hybridisierung wurde über Nacht (16 Stunden) bei den angegebenen Temperaturen durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter 2-mal 30 Minuten bei den Hybridisierungstemperaturen unter Verwendung einer Lösung von 3*SSC, 0,1% SDS und 0,05% Natriumpyrophosphat gewaschen. Die Filme wurden nach 20-stündigem Auflegen der Filter auf Röntgenfilme in einer Kassette bei –80°C entwickelt.
Unter Verwendung des cDNA-Klons von crtE von P. rhodozyma wurden schwache Signale für C. infirmo-miniatum und C. capitatum erhalten. Unter Verwendung des cDNA-Klons von crtB von P. rhodozyma wurden starke Signale in Bezug auf den hochmolekularen Bereich der DNA aus C. infirmominiatum und C. capitatum erhalten. Ferner wurde ein starkes Signal in der Bahn, die mit verdauter chromosomaler DNA aus B. trispora beladen war, erhalten. Nur ein schwaches Signal wurde für C. capitatum bei 50°C unter Verwendung des cDNA-Klons von crtI von P. rhodozyma erhalten. Unter Verwendung des cDNA-Klons von idi von P. rhodozyma wurden schwache Signale mit chromosomaler DNA aus C. infirmo-miniatum, C. bisporidii und C. capitatum bei beiden Temperaturen erhalten. Ein starkes Signal wurde in der Bahn, auf die verdaute chromosomale DNA auf B. trispora aufgesetzt worden war, erhalten.
Wir ziehen den Schluss, dass Carotinoid-Biosynthese-cDNAs oder -Gene oder idi-cDNAs oder -Gene aus anderen Organismen, insbesondere aus anderen Hefespezies, isoliert werden können, und zwar durch Kreuzhybridisierung mit den cDNA-Fragmenten, die für P. rhodozyma-Carotinoid-Biosynthese-Enzyme kodieren, bzw. mit Kodierungssequenzen für Isopentenylpyrophosphat-isomerase, wobei man sich mäßig stringenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen (50°C bis 55°C, 3-mal SSC) bedient.
Hinterlegte Mikroorganismen
E. coli mit einem Gehalt an pGB-Ph9 wurde beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, Niederlande, am 23. Juni 1993 unter der Hinterlegungsnummer CBS 359.3 hinterlegt.
Die folgenden Stämme wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, Niederlande, am 26. Februar 1996 hinterlegt:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante DNA, umfassend einen Transkriptionspromotor und in funktioneller Verknüpfung damit eine zu exprimierende stromabwärtige Sequenz, wobei der Transkriptionspromotor eine Region umfasst, die stromaufwärts vom offenen Leseraster eines hochgradig exprimierten Phaffia-Gens auftritt und befähigt ist, eine Transformation von Phaffia rhodozyma mit einem DNA-Konstrukt zu transformieren, das diesen Promotor in Verknüpfung stromaufwärts vom G418-Resistenzmarker, der gegen G418 in Konzentrationen von mehr als 200 μg pro Liter Kulturmedium resistent ist, umfasst, wobei das den Transkriptionspromotor umfassende Konstrukt eine Phaffia-Transformationsfrequenz von mindestens 50 Transformanten pro μg DNA mit G418 als Selektionsmarker aufweist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei es sich beim hochgradig exprimierten Phaffia-Gen um ein Gen des Glycolyse-Stoffwechselweges handelt.
Rekombinante DNA nach Anspruch 2, wobei es sich beim Gen des glycolytischen Stoffwechselweges um ein für Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase kodierendes Gen handelt.
Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hochgradig exprimierten Phaffia-Gen um ein für ein ribosomales Protein kodierendes Gen handelt.
Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei der Transkriptionspromotor eine Region umfasst, die stromaufwärts vom offenen Leseraster auftritt, der für ein Protein gemäß einer der in SEQ. ID. NOs: 24 bis 50 dargestellten Aminosäuresequenzen kodiert.
Rekombinante DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz heterolog in Bezug zur Transkriptionspromotorsequenz ist.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die stromabwärtige Sequenz einen offenen Leseraster umfasst, der für ein Polypeptid kodiert, das für die verringerte Empfindlichkeit gegen ein Selektionsmittel verantwortlich ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Selektionsmittel um G418 handelt.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz für ein Enzym kodiert, das am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 9, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz für ein Enzym kodiert, das eine Aktivität aufweist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Isopentenyl-pyrophosphat-isomerase, Geranylgeranyl-pyrophosphat-synthase, Phytoen-synthase, Phytoen-desaturase und Lycopen-cyclase.
Rekombinante DNA nach Anspruch 10, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz für ein Enzym kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 21 oder SEQ. ID. NO: 23.
Rekombinante DNA nach Anspruch 9, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz für ein am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligtes Enzym kodiert, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist: (i) eine DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22; (ii) eine isokodierende Variante der DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22; (iii) eine allele Variante einer DNA-Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22; (iv) eine DNA-Sequenz, die bei Bindung an einen Nitrocellulose-Filter und nach Inkubation unter hybridisierenden Bedingungen und anschließendem Waschen zur spezifischen Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment befähigt ist, das die Sequenz gemäß SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 18, SEQ. ID. NO: 20 oder SEQ. ID. NO: 22 aufweist, wie durch Autoradiographie des Filters nach Inkubation und Waschen nachweisbar ist, wobei die Inkubation unter hybridisierenden Bedingungen und das anschließende Waschen durchgeführt werden, indem man die an den Filter gebundene DNA bei einer Temperatur von mindestens 50°C und vorzugsweise von mindestens 55°C in Gegenwart einer Lösung der radioaktiv markierten DNA in 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH-Wert 7,8, mindestens 1 Stunde inkubiert, wonach der Filter mindestens zweimal etwa 20 Minuten in 0,3 M NaCl, 40 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, pH-Wert 7,8, bei einer Temperatur von 50°C und vorzugsweise von mindestens 55°C vor der Autoradiographie gewaschen wird.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die zu exprimierende stromabwärtige Sequenz für ein pharmazeutisches Protein kodiert.
Rekombinante DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die rekombinante DNA in funktioneller Verknüpfung damit einen Transkriptionsterminator stromabwärts von der zu exprimierenden DNA-Sequenz umfasst.
Rekombinante DNA nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Terminator um einen Phaffia-Terminator handelt.
Rekombinante DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die rekombinante DNA in Form eines Vektors vorliegt, der zur Replikation und/oder Integration in einem Wirtsorganismus befähigt ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 16, ferner umfassend DNA, die für ribosomale Phaffia-RNA kodiert.
Rekombinante DNA nach Anspruch 17, die durch Spaltung im Innern des für ribosomale Phaffia-RNA kodierenden DNA-Teils linearisiert ist.
Transformierter Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA nach einem der vorstehenden Ansprüche beinhaltet.
Tranformierter Mikroorganismus nach Anspruch 19, bei dem es sich um einen Phaffia-Stamm handelt.
Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 20, bei dem die rekombinante DNA in sein Genom in einer Menge von mindestens 10 und vorzugsweise von mindestens 50 Kopien integriert ist.
Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 20 oder 21, bei dem es sich um Phaffia rhodozyma handelt.
Transformierter Phaffia rhodozyma-Stamm nach Anspruch 22, der zur Überexpression einer DNA-Sequenz befähigt ist, die für ein Enzym kodiert, das am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt ist.
Transformierter Phaffia rhodozyma-Stamm nach Anspruch 23, der im Vergleich zum untransformierten Vorfahren erhöhte Mengen an Astaxanthin erzeugt.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das am Carotinoid-Biosynthesestoffwechselweg beteiligt ist, durch Züchten eines transformierten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 19 oder 23 unter Bedingungen, die zur Bildung des Enzyms führen.
Verfahren zur Herstellung eines Carotinoids, dadurch gekennzeichnet, dass ein transformierter Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 19 bis 24 unter Bedingungen gezüchtet wird, die zur Herstellung des Carotinoids führen.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei dem Carotinoid um Astaxanthin handelt.
Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Proteins durch Züchten eines transformierten Phaffia-Stammes nach Anspruch 20 oder 21 unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Proteins führen.