DE60120379T2

DE60120379T2 - Hydroperoxidlyase der Warzenmelone (Cucumis Melo) sowie deren Verwendungen

Info

Publication number: DE60120379T2
Application number: DE60120379T
Authority: DE
Inventors: R. Alan Brentwood BRASH; Nathalie Tucson TIJET; M. Ian WHITEHEAD
Original assignee: Firmenich SA; Vanderbilt University
Current assignee: Firmenich SA; Vanderbilt University
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: US7037693B2; US6271018B1; EP1268819B1; EP1268819A2; WO2001073075A3; WO2001073075A2; DE60120379D1; JP2003528613A; JP4951773B2; US20020098570A1; ATE329037T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fettsäurehydroperoxid-Lyaseprotein, das für 9-Hydroperoxid-Substrate aktiv ist und das in Zuckermelone (Cucumis melo) vorkommt, und das für das Protein kodierende Gen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Mittel zur Expression der Hydroperoxid-Lyase und Verfahren zur Verwendung der Lyase auf dem Gebiet der organischen Synthese.
Stand der Technik
Pflanzen produzieren verschiedene flüchtige Verbindungen, die zum charakteristischen Geschmack und Duft der jeweiligen Pflanze führen. Ungesättigte Fettsäuren wie Linol- und Linolensäure sind Vorläufer von Geschmacksstoffen wie n-Hexanal, Hexan-1-ol, 2(E)-Hexen-1-al, 2(E)-Hexen-1-ol, 3(Z)-Hexen-1-al, 3(Z)-Hexen-1-ol (auch als Pipol bekannt), 3-(Z)-Nonenal, (3Z,6Z)-Nonadienal, 3-(Z)-Nonenol, (3Z,6Z)-Nonadienol, 2-(E)-Nonenal, (2E,6Z)-Nonadienal, 2-(E)-Nonenol und (2E,6Z)-Nonadienol. Diese Verbindungen finden weit verbreitet Verwendung in Aromen, besonders Fruchtaromen, und werden von der Aromaindustrie für ein Fruchtaroma verwendet. Die Nachfrage nach diesen Geschmacksstoffen ist so gestiegen, dass sie das Angebot aus herkömmlichen Quellen übersteigt, was die Motivation für Forschungsbemühungen lieferte, andere natürliche Wege zum Erhalt dieser Materialien zu finden.
Die Synthese dieser Geschmacksstoffe geht von freien (mehrfach ungesättigten) Fettsäuren wie Linolsäure (9(Z),12(Z)-Octadecadiensäure) und α-Linolensäure (9(Z),12(Z),15(Z)-Octadecatriensäure) aus. In der Natur werden diese Säuren durch lipolytische Enzyme aus Zellmembranen nach Zellschädigung freigesetzt. Unter der Einwirkung einer Lipoxygenase (LOX) bilden sich Fettsäurehydroperoxide, die anschließend von einer Hydroperoxidlyase zu flüchtigen C₆- und C₉-Geschmacksstoffen zusammen mit ω-Oxosäuren gespalten werden. Die Spaltung von 13-Hydroperoxiden liefert C₆-Verbindungen, einschließlich Hexanal und (3Z)-Hexenal, und die Spaltung von 9-Hydroperoxiden liefert C₉-Verbindungen, (3Z)-Nonenal und (3Z,6Z)-Nonadienal. In Gegenwart von Isomerasen werden diese Aldehyde zu (2E)-Enalen isomerisiert. Außerdem können Alkoholdehydrogenasen die Aldehyde in ihre entsprechenden Alkohole überführen.
Die HPL-Enzyme haben sich als schwer zu untersuchen erwiesen, da sie membrangebunden sind und nur in geringen Mengen im Pflanzengewebe vorkommen. Die HPL-Enzyme wurden entsprechend ihrer Substratspezifität als 13-HPL oder 9-HPL charakterisiert. Das 13-HPL-Enzym wurde erstmals in Bananenfrüchten identifiziert (Tressl und Drawert, 1973) und anschließend in einer Reihe verschiedener Pflanzenmaterialien untersucht, einschließlich Wassermelonensetzlingen (Vick und Zimmerman, 1976), Apfel- und Tomatenfrüchten (Schreier und Lorenz, 1982), Tomatenblättern (Fauconnier et al., 1997), Gurkensetzlingen (Matsui, et al, 1989) und Soyabohnensetzlingen (Olias et al., 1990). Das 13-HPL-Enzym wurde aus Teeblättern (Matsui et al., 1991) und kürzlich aus unreifen Ziegenpfefferfrüchten (Shibata et al., 1995), Tomatenblättern (Fauconnier et al., 1997), Sonnenblumen (Itoh und Vick, 1999), Guave (PCT-Anmeldung WO 9958648 A2) und Banane (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. EP 0801133 A2 ) gereinigt. Eine 9-Hydroperoxid-spezifische HPL wurde bei Birnen identifiziert (Kim und Grosch, 1981). Es gab Untersuchungen, die einen dritten Typ HPL vermuten ließen, der sowohl 9- als auch 13-Hydroperoxide spaltet (Matsui et al. 1989; Hornostaj und Robinson, 1998).
Zurzeit werden bei technischen Verfahren zur Herstellung von Geschmacksstoffen und Aromen unaufgearbeitete Lyasematerialien verwendet (siehe z.B. U.S. Pat. 5,464,761). Bei diesem Verfahren wird mit frisch hergestelltem Sojabohnenmehl als LOX-Quelle eine Lösung der benötigten Substrate aus Linol- und Linolensäure (erhalten aus Sonnenblumen- bzw. Leinsamenöl) hergestellt. Diese Lösung wird dann mit einem frisch präparierten Brei von ganzen Früchten als Rohmaterial für HPL vermischt. Die Aldehydprodukte werden dann durch Destillation isoliert. Wenn die Alkohole gewünscht sind, wird der Hydroperoxidlösung vor Mischen mit dem Früchtebrei frische Bäckerhefe zugegeben. Diese Hefe enthält ein aktives Alkoholdehydrogenaseenzym, das die Aldehyde reduziert, sobald sie von der HPL gebildet werden.
Bei diesen technischen Verfahren gibt es seine Reihe von Nachteilen. Der Hauptnachteil besteht darin, dass große Mengen frischer Früchte benötigt werden. Ein solches Erfordernis bedeutet, dass das Verfahren in einem Land durchgeführt werden muss, in dem frische Früchte billig und ohne weiteres zur Verfügung stehen. Selbst wenn man einen solchen Ort findet, ist die Verfügbarkeit durch die Vegetationszeit der Frucht beschränkt.
Ein zweiter Nachteil ist, dass die gewünschte Enzymaktivität in den eingesetzten Quellen ziemlich verdünnt ist. Dies bedeutet, dass bei dem Verfahren relativ große Mengen Sojamehl, Früchtebrei und Hefe eingesetzt werden müssen. Die großen Volumina dieser Rohmaterialien, die zur Industrieproduktion erforderlich sind, schränken die zu erreichenden Ausbeuten an Geschmacks- und Aromastoffen physikalisch ein.
Ein dritter Nachteil ist, dass es sich um ein Batchverfahren mit großem Volumen handelt, das die katalytische Aktivität der HPL naturgemäß nicht maximal nutzt, relativ arbeitsaufwendig ist und zu großen Mengen organischer Reststoffe führt. Die organischen Reststoffe müssen anschließend zu einer Kompostieranlage transportiert oder auf andere Weise entsorgt werden.
Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Einschränkungen und Nachteile im Zusammenhang mit der Herkunft der Zuckermelonen-9-HPL, indem sie gereinigte und rekombinante 9-HPL-Zuckermelonenproteine, Nukleinsäuren, Expressionssysteme und Verfahren zu deren Verwendung bereitstellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellte eine Fettsäurelyase bereit und eine Nukleinsäure, die für diese Lyase kodiert. Insbesondere wird eine isolierte Fettsäurehydroperoxid-Lyase mit Aktivität für 9-Hydroperoxid-Substrate und 13-Hydroperoxid-Substrate offenbart, wobei die Lyase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst.
Insbesondere stellt die Erfindung eine Lyase bereit, die in Melone (Cucumis melo) vorkommt, und eine Nukleinsäure, die für diese Lyase kodiert. Die Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst, und Expressionssysteme, mit denen die rekombinante Lyase erhalten werden kann.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Lyase bereit, einschließlich einem Verfahren zur Spaltung einer (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure zu einem C9-Aldehyd und einer C9-Oxononansäure und einem Verfahren zur Spaltung einer (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure zu einem C6-Aldehyde und einer C12-Oxocarbonsäure. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 3-(Z)-Nonenal, (3Z,6Z)-Nonadienal, 2-(E)-Nonenal, (2E,6Z)-Nonadienal oder ihren entsprechenden Alkoholen aus (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyocta deca-10,12,15-triensäure mittels der erfindungsgemäßen Lyase bereit. Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von n-Hexanal, 3-(Z)-Hexen-1-al, 2-(E)-Hexen-1-al oder ihren entsprechenden Alkoholen aus (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure mittels der erfindungsgemäßen Lyase bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen für Guave-HPL (HPL-Guava), Bananen-HPL (HPL-Banana), Pfeffer-HPL (HPL-Pepper), Arab-AOS (AOS-Arabi), Flachs-AOS (AOS-Flax), Guayule-AOS (AOS-Guayule), Melonen-AOS (AOS-Melon) und die 9-HPL aus Melone (HPL-Melon), wobei die Bereiche mit dem höchsten Identitätsgrad in schwarzen Kästchen gezeigt sind und die Konsensussequenz mit "Majority" gekennzeichnet ist.
2A ist ein Schema, das die Melonen-cDNA und die Regionen zeigt, an die die degenerierten Primer, die auf anderen HPL und AOS basierten, banden, um sowohl das 150 bp-Klonprodukt als auch das 70 bp-Klonprodukt zu liefern.
2B zeigt ein Alignment partieller Aminosäuresequenzen aus Guave-HPL, Bananen-HPL, Pfeffer-HPL, Arab-AOS, Flachs-AOS, and Guayule-AOS. Die eingerahmten Regionen stellen Bereiche mit hoher Homologie zwischen HPL and AOS dar.
3 zeigt die Sequenzen der degenerierten Primer, die verwendet wurden, um die 150 bp- und 70 bp-Fragmente von Melonen-HPL und -AOS zu erhalten.
4 zeigt das Alignment der Aminosäuresequenzen von drei verschiedenen 150 bp-Klonen von Melonen-HPL und -AOS. Klon A und B haben 65% Identität, während Klon A und C 57% und B und C 72% Identität in der Aminosäuresequenz haben.
5 vergleicht die Identität zwischen den partiellen Aminosäuresequenzen, die von den 3'-Enden der Klone A, B und C aus Melone kodiert werden, und den C-terminalen Sequenzen von 13-HPL aus Guave, Pfeffer und Banane und von AOS aus Flachs, Guayule, und Arabidopsis. Die C-terminalen Sequenzen, die von den Klonen A und B kodiert werden, weisen 42% Identität auf, während Klon A und C 40% and Klon B und C 49% Identität aufweisen.
6 zeigt ein Schema für die zwei primären Enzymprodukte aus 9S-Hydroperoxylinolsäure in Gegenwart von 9-HPL aus Melone: 9-Oxononansäure und 3Z-Nonenal. Ebenfalls dargestellt ist die geringfügige Isomerisierungsreaktion von 3Z-Nonenal zu 2E-Nonenal, die bei Verwendung des gereinigten Enzyms oder des rohen Bakterienlysats in geringem Maße zu beobachten ist. Ferner ist die Oxidationsreaktion dargestellt, die bei dem rohen Bakterienlysat auftritt, durch die 3Z-Nonenal zu einer Mischung aus drei Aldehyden oxidiert wird, nämlich 4-Hydroxy-2E-nonenal (4-HNE) und 4-Hydroperoxy-2E-nonenal (4-HPNE) und einem Halbacetalderivat, das zwischen 9-Oxononansäure und 4-Hydroperoxy-2E-nonenal gebildet wird (Halbacetal).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung lässt sich mit Hilfe der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung und der darin enthaltenen Beispiele leichter verstehen.
Bevor die vorliegenden Verfahren offenbart und beschrieben werden, versteht es sich, dass diese Erfindung nicht auf spezielle Verfahren oder auf bestimmte Formulierungen beschränkt ist, da diese natürlich variieren können. Es versteht sich ferner, dass die hier verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und keinesfalls einschränkend sein soll.
So wie hier in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, kann das Wort „ein" abhängig vom Kontext, in dem es verwendet wird, ein oder mehr bedeuten.
A. Proteine und Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt eine Fettsäurelyase und eine Nukleinsäure bereit, die für die Lyase kodiert. Insbesondere wird eine isolierte Fettsäurehydroperoxid-Lyase mit Aktivität für 9-Hydroperoxid-Substrate und 13-Hydroperoxid-Substrate offenbart, wobei die Lyase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst. Insbesondere stellt die Erfindung eine Lyase bereit, die in Melone (Cucumis melo), aber nicht in Gurke (Cucumis sativus) vorkommt, und eine Nukleinsäure, die für ein solches Polypeptid oder Protein kodiert. Die Lyase hat also eine Aminosäuresequenz, die in einem aus Cucumis melo isolierten Protein vorkommt, hat aber nicht die Aminosäuresequenz des aus Gurke (Cucumis sativus) isolierten Proteins.
Der Begriff "Protein" bezeichnet ein Polymer aus Aminosäuren und kann vollständige Proteine und Polypeptide und Fragmente davon umfassen. In der vorliegenden Erfindung bedeutet "Lyase" ein Protein mit wenigstens einer Lyasefunktion. Insbesondere bedeuten die Begriffe "9-Hydroperoxid-Lyase", "9-HPL" und "funktionelle 9-Hydroperoxid-Lyase" ein Lyaseprotein mit wenigstens einer Funktion, die von einer nativen 9-Hydroperoxid-Lyase gezeigt wird. Beispielsweise kann die 9-HPL-Funktion die katalytische Aktivität des Spaltens eines Fettsäure-9-hydroperoxids zu einem C-9-Aldehyd und einer C-9-Oxononansäure beinhalten. Zusätzlich können die offenbarten Lyasen die folgenden Eigenschaften nativer 9-HPL aufweisen: antigene Determinanten, Bindungsregionen oder dergleichen.
Die offenbarte 9-HPL bevorzugt 9-Hydroperoxid-Substrate vor 13-Hydroperoxid-Substraten, hat aber sowohl 9-HPL- als auch 13-HPL-Funktion. Die Begriffe "13-Hydroperoxid-Lyase" "13-HPL" und "funktionelle 13-Hydroperoxid-Lyase" bezeichnen ein Lyaseprotein mit wenigstens einer Funktion, die von einer nativen 13-Hydroperoxid-Lyase gezeigt wird. Beispielsweise kann 13-HPL-Funktion die katalytische Aktivität des Spaltens eines Fettsäure-9-hydroperoxids zu einem C-6-Aldehyd und einer C-12-ω-Oxosäuregruppe beinhalten. Zusätzlich können die offenbarten Lyasen die folgenden Eigenschaften nativer 13-HPL aufweisen: antigene Determinanten, Bindungsregionen oder dergleichen.
Die Lyase der vorliegenden Erfindung kann weitere Aminosäuren umfassen, beispielsweise Aminosäuren, die an das N-terminale Ende gebunden sind, oder Aminosäuren, die an das C-terminale End gebunden sind. Die offenbarte Lyase spaltet 9-Hydroperoxylinolsäure-Substrate (z.B. (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure), 9-Hydroperoxylinolensäure-Substrate (z.B. (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure), 13-Hydroperoxylinolsäure-Substrate (z.B. (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure) und 13-Hydroperoxylinolensäure-Substrate (z.B., (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure). K_m und V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure sind größer als K_m und V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolsäure.
Die Lyase hat eine charakteristische Affinität für verschiedene Substrate. Die Lyase hat eine größere Affinität für 13-Hydroperoxid-Substrate, und die K_m der Lyase für 9-Hydroperoxid-Substrate ist größer für 13-Hydroperoxid-Substrate. Die berechnete K_m ist wie folgt: 9-Hydroperoxylinolensäure > 9-Hydroperoxylinolsäure > 13-Hydroperoxylinolsäure. Die K_m, der Lyase für 13-Hydroperoxylinolsäure ist etwa der gleiche wie die Affinität für 13-Hydroperoxylinolensäure. Genauer gesagt ist die berechnete K_m für 9-Hydroperoxylinolsäure etwa 192 μM mit 95% Vertrauensgrenzen wie 142–242 und beträgt etwa 45–60% und vorzugsweise etwa 54% der K_m der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure. Die berechnete K_m für 13-Hydroperoxylinolensäure ist etwa 50 μM mit 95% Vertrauensgrenzen wie 41–59 und beträgt etwa 15–35% und vorzugsweise etwa 26% der K_m der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure. Die berechnete K_m für 13-Hydroperoxylinolensäure ist etwa 51 μM mit 95% Vertrauensgrenzen wie 37–65 und beträgt etwa 15–35% und vorzugsweise etwa 27% der K_m der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure.
Die offenbarte Lyase spaltet jeden Substrattyp mit einer charakteristischen Geschwindigkeit. Die Lyase reagiert schneller mit dem 9-Hydroperoxid-Substrat, und V_max der Lyase für 9-Hydroperoxid-Substrate ist größer als die V_max für 13-Hydroperoxid-Substrate. Die Spaltungsgeschwindigkeit der verschiedenen Substrate durch die erfindungsgemäße Lyase, wie sie durch V_max angegeben wird, ist wie folgt: 9-Hydroperoxylinolensäure > 9-Hydroperoxylinolsäure > 13-Hydroperoxylinolsäure. Die Geschwindigkeit für 13-Hydroperoxylinolsäure ist etwa die gleiche wie die Geschwindigkeit für 13-Hydroperoxylinolensäure. Genauer gesagt ist V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolsäure etwa 45–60% und vorzugsweise etwa 55% der V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure. V_max der Lyase für 13-Hydroperoxylinolsäure ist etwa 25–35% und vorzugsweise etwa 30% der V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure. V_max der Lyase für 13-Hydroperoxylinolensäure ist etwa 20–30% und vorzugsweise etwa 22% der V_max der Lyase für 9-Hydroperoxylinolensäure. Unter "etwa die gleiche" Geschwindigkeit oder Affinität wird verstanden, dass die Geschwindigkeit oder Affinität für ein Substrat, z.B. 13-Hydroperoxylinolensäure, ausgedrückt als ein Prozentsatz der Geschwindigkeit oder Affinität für 9-Hydroperoxylinolensäure, innerhalb von 10% und vorzugsweise innerhalb von 5% eines zweiten Substrats, z.B. 13-Hydroperoxylinolsäure, liegt, ebenfalls ausgedrückt als ein Prozentsatz der Geschwindigkeit oder Affinität für 9-Hydroperoxylinolensäure.
Die offenbarte Lyase hat ein Molekulargewicht von etwa 45–65 kDa, vorzugsweise von etwa 50–60 kDa, und ganz besonders bevorzugt von etwa 55 kDa. Der optimale pH für die offenbarte Lyase ist größer als 6, vorzugsweise etwa 6,5–8,5, besonders bevorzugt 7,0–8,0, und ganz besonders bevorzugt 7,2–7,6. Das Enzym hat bei pH 5,0 etwa 25% der maximalen Aktivität und bei pH 9,0 etwa 15% der maximalen Aktivität.
Die offenbarte Lyase wird isoliert. Die Isolierung der Lyase kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Lyasen aus einer Quelle wie Cucumis melo mit üblichen biochemischen Methoden gereinigt oder teilweise gereinigt werden (siehe beispielsweise Hornostaj und Robinson (1998)). Alternativ kann die Lyase mit dem Fachmann bekannten Proteinsynthesemethoden synthetisiert werden, oder sie kann mit Hilfe von Methoden der rekombinanten DNA-Technologie und genetisch manipulierten Expressionssystemen rekombinant hergestellt werden. Synthetisierte oder rekombinant hergestellte Lyasen können mit Histidinen als Tag versehen werden, um ihre Isolierung zu erleichtern. Ein bevorzugtes Isolierungsverfahren für eine rekombinant hergestellte Lyase ist daher die Verwendung von Nickelsäulen, die Histidinreste binden. Histidinreste können an das aminoterminale Ende der offenbarten Lyase angehängt werden und als Tag für das Protein fungieren. Die Verwendung von Histidin-Tags oder anderen Tags ist dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt.
Bei einer Ausführungsform umfasst die offenbarte Lyase, wie in 1 veranschaulicht, für Cucumis melo charakteristische Aminosäuren, die dafür verantwortlich sind, dass 9-Hydroperoxid-Substrate mit größerer Aktivität gespalten werden als 13-Hydroperoxid-Substrate, und die dafür verantwortlich sind, dass 9-Hydroperoxylinolsäure mit weniger als der 1,6fachen Aktivität gespalten wird als 9-Hydroperoxylinolensäure.
Das erfindungsgemäße Protein umfasst eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6. Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 wurde bei der GenBank-Datenbank unter der Zugangsnummer AF081955 hinterlegt.
Die Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für die offenbarte Lyase kodiert. Die cDNA der 9-HPL aus Cucumis melo wurde kloniert und sequenziert (SEQ ID NO: 8). Die Aminosäuresequenz des von der Cucumis melo-cDNA kodierten Proteins ist ebenfalls offenbart (SEQ ID NO: 7). Bei einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 8 dargestellte Nukleinsäuresequenz. Ebenfalls offenbart ist die Nukleinsäure, die die in SEQ ID NO: 56 dargestellte Nukleinsäuresequenz umfasst. Die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 56 wurde bei der GenBank-Datenbank unter der Zugangsnummer AF081955 hinterlegt.
Ferner werden isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz kodieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7. Rekombinante Systeme beinhalten Expressionssysteme sowohl in Prokaryonten- als auch in Eukaryontenzellen und beinhalten Expression der Lyase mit der nativen Proteinsequenz oder der Lyase mit einer Proteinsequenz, die in irgendeiner Weise von der nativen Sequenz abweicht. Die Melonen-9-HPL-cDNA wurde kloniert und sequenziert, und die Nukleotidsequenz für die vollständige cDNA wurde mit 1446 Basenpaaren bestimmt (SEQ ID NO: 8), was ein Stopcodon beinhaltet. Die translatierte Sequenz kodiert für insgesamt 481 Aminosäurereste (SEQ ID NO: 7), was einem Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton entspricht.
Wie in 1 gezeigt, zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit einer Reihe von HPL und Allenoxidsynthetasen (AOS) einen gewissen Grad an Homologie (Identität und Ähnlichkeit). Beispielsweise besteht eine gewisse Homologie zwischen der offenbarten Aminosäuresequenz und den 13-HPL von Guave, Banane und Pfeffer. Ferner besteht Homologie zwischen der offenbarten HPL und AOS-Flax, AOS-Guayule, AOS Arabi, and AOS-Melon. 1 zeigt jedoch deutlich, dass es bei der offenbarten Lyase Bereiche gibt, die im Vergleich mit anderen HPL und AOS charakteristisch sind. Insbesondere sind diese Bereiche charakteristisch für 9-HPL, und außerdem sind diese Bereiche charakteristisch für Cucumis melo.
Unter Berücksichtigung von Deletionen und Insertionen zeigt das Alignment in 1 und Tabelle 1, dass die Aminosäuresequenz der Melonen-9-HPL, wenn man das Clustal-Verfahrens mit der durch das MegAlign-Unterprogramm von Lasergene (Dnastar, Madison, Wisconsin) verfügbaren PAM250-Restematrix verwendet, etwa 45,7% Ähnlichkeit mit AOS-Flax, etwa 46% Ähnlichkeit mit AOS-Guayule, etwa 48,0% Ähnlichkeit mit AOS-Arabi, etwa 47% Ähnlichkeit mit AOS-Melon, etwa 60% Ähnlichkeit mit HPL-Guava, etwa 58% Ähnlichkeit mit HPL-Banana und etwa 60% Ähnlichkeit mit HPL-Pepper aufweist.
"Ähnlichkeit" kann Aminosäurereste einschließen, die entweder gleich oder ähnlich sind. Ähnliche Aminosäuren sind in Tabelle 2 angegeben. Trotz diesen Ähnlichkeiten gibt es charakteristische Bereiche der offenbarten Lyase. Bevorzugte charakteristische Bereiche sind in SEQ ID NO: 1 (MATPSSSSPE), SEQ ID NO: 2 (ILFDTAKVEKRNILD), SEQ ID NO: 3 (RLFLSFLA), SEQ ID NO: 4 (SISDSMS), SEQ ID NO: 5 (LLSDGTPD) und SEQ ID NO: 6 (IFSVFEDLVI) dargestellt. Es werden Proteine bereitgestellt, die diese Bereiche enthalten und wie die offenbarte Lyase wirken. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind diejenigen, die wenigstens einen dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche aufweisen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen wenigstens zwei dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche vorkommen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen wenigstens drei dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche vorkommen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen wenigstens vier dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche vorkommen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist. Noch mehr bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen wenigstens fünf dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche vorkommen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist. Ganz besonders bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen wenigstens sechs dieser in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten definierten Bereiche vorkommen und bei denen die 9-HPL-Funktion erhalten ist.
Prozent Ähnlichkeit
Es versteht sich, dass die offenbarte Lyase funktionelle Varianten umfasst. Diese Varianten kommen durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen sowie posttranslationale Modifikationen zustande. Solche Variationen können natürlich als Allelvariationen entstehen (z.B. als Folge von genetischem Polymorphismus), oder sie können durch menschlichen Eingriff erzeugt werden (z.B. durch Mutagenese klonierter DNA Sequenzen), beispielsweise induzierte Punkt-, Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten. Diese Modifikationen können zu Änderungen in der Aminosäuresequenz führen, stille Mutationen liefern, eine Restriktionsstelle modifizieren oder andere spezifische Mutationen liefern.
Modifikationen in der Aminosäuresequenz fallen in ein oder mehr von drei Klassen: Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten. Insertionen umfassen a mino- und/oder carboxyterminale Fusionen sowie Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb der Sequenz. Insertionen sind gewöhnlich kleinere Insertionen als die bei amino- oder carboxyterminalen Fusionen, beispielsweise in einer Größenordnung von ein bis vier Resten. Deletionen sind durch das Entfernen ein oder mehrerer Aminosäurereste aus der Proteinsequenz gekennzeichnet. Üblicherweise sind nicht mehr als etwa 2 bis 6 Reste an irgendeiner Stelle im Proteinmolekül deletiert. Die Varianten werden gewöhnlich durch sequenzspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der für das Protein kodierenden DNA erzeugt, wodurch DNA gebildet wird, die für die Variante kodiert, und anschließend wird die DNA in einer Kultur rekombinanter Zellen exprimiert. Methoden zur Herstellung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind allgemein bekannt, beispielsweise M13-Primer-Mutagenese und PCR-Mutagenese. Aminosäuresubstitutionen erfolgen üblicherweise mit einzelnen Resten, können aber auch mehrere Substitutionen an verschiedenen Positionen beinhalten; Insertionen haben gewöhnlich in einer Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, können aber auch mehr haben; und Deletionen liegen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, können aber auch mehr sein. Deletionen oder Insertionen werden vorzugsweise in Form aufeinander folgender Paare gebildet, d.h. einer Deletion von 2 Resten oder einer Insertion of 2 Resten. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder irgendeine Kombination davon können zu einem gewünschten Endkonstrukt kombiniert werden. Die Mutationen dürfen den Leserahmen der Sequenz nicht verschieben und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die zu mRNA-Sekundärstrukturen führen könnten. Substitutionsvarianten sind solche, bei denen wenigstens ein Rest entfernt wurde und an dessen Stelle ein anderer Rest inseriert wurde. Solche Substitutionen erfolgen im Allgemeinen entsprechend Tabelle 2 und werden als konservative Substitutionen bezeichnet.
Substantielle Veränderungen in Funktion oder immunologischer Identität kommen zustande, indem man Substitutionen wählt, die weniger konservativ als die in Tabelle 2 sind, d.h. durch Auswahl von Resten, die sich in ihrer Wirkung auf den Erhalt (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als eine Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Targetstelle, oder (c) des Volumens der Seitenkette deutlicher unterscheiden. Die Substitutionen, von denen man im allgemeinen erwartet, dass sie zu den größten Änderungen der Proteineigenschaften führen, sind diejenigen, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl substituiert (oder durch diesen substituiert wird); (b) ein Cystein oder Prolin irgendeinen anderen Rest substituiert (oder durch diesen substituiert wird); (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl substituiert (oder durch diesen substituiert wird); oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert (oder durch diesen substituiert wird), in diesem Fall (e) durch Erhöhen der Anzahl an Sulfatierungs- und/oder Glycosylierungsstellen.
Substitutions- oder Deletionsmutagenese lassen sich einsetzen, um Stellen zur N-Glycosylierung (Asn-X-Thr/Ser) oder O-Glycosylierung (Ser oder Thr) einzubauen. Deletionen von Cystein oder anderen labilen Resten können ebenfalls erwünscht sein. Deletionen oder Substitutionen potentieller Proteolysestellen, z.B. Arg, erfolgen beispielsweise, indem man einen der basischen Reste deletiert oder ihn durch Glutaminyl oder Histidylreste substituiert.
Bestimmte post-translationale Derivatisierungen sind das Ergebnis der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig post-translational zu den entsprechenden Glutamyl- und Asparylresten deamidiert. Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Andere post-translationale Modifikationen beinhalten Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der o-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (Creighton, 1983), Acetylierung des N-terminalen Amins und, in manchen Fällen, Amidierung des C-terminalen Carboxyls.
Bei allen Mutationsereignissen versteht sich, dass der limitierende Aspekt der Mutation die Funktion ist, die das Protein anschließend besitzt. Ganz besonders bevorzugte Mutationen sind diejenigen, die die 9-HPL Funktion nicht merklich ändern. Beispielsweise hat die offenbarte Lyase, wie oben beschrieben, eine sehr spezifische kinetische Charakteristik, und bevorzugte Mutationen wären diejenigen, die beispielsweise mutierte 9-HPLs liefern, die bevorzugt 9-Hydroperoxid-Substrate spalten.
Es gibt zahlreiche Tests, um die relative Funktion der offenbarten Lyasen zu bestimmen, einschließlich beispielsweise HPLC-Analyse, spektrophotometrischer Analyse, gaschromatographischer Analyse und Gaschromatographie mit massenspektrometrischer Analyse. Selbstverständlich können Mutationsereignisse manchmal auch Mutationen beinhalten, die die Aktivität in definierter Weise ändern, beispielsweise indem die V_max der Spaltung von 9-Hydroperoxid-Substraten erhöht wird. Sollten diese Arten von Mutationen erwünscht sein, erlaubt eine genaue Analyse der Reaktionsgeschwindigkeiten and -funktion der mutierten Proteine die Isolierung von mutierten Lyasen, die entweder besser oder schlechter als die nativen Lyasen funktionieren. Bevorzugte Mutationen sind diejenigen, die die Aktivität der Lyase für die Spaltung von 9-Hydroperoxid-Substraten erhöhen.
Es versteht sich ferner, dass es im Verhältnis von Nukleinsäuren zu Proteinen Degeneration gibt, so dass es mehrere Nukleinsäurecodons für eine gegebene Proteinsequenz geben kann. Die Melonen-cDNA, obwohl sie nicht die gleiche Sequenz hat wie die aus Cucumis melo isolierte DNA, kodiert also für die gleiche Aminosäuresequenz wie sie die aus Cucumis melo isolierte Lyase hat. Außerdem gibt es zahlreiche Gründe, warum man die Sequenz der Cucumis melo-cDNA ändern und gleichzeitig die charakteristische Codierung des Cucumis melo-Proteins erhalten möchte. Beispielsweise könnte man spezifische Nukleinsäurerestriktionsstellen einbauen oder entfernen wollen, die in der cDNA enthalten oder erwünscht sind.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen umfassen die funktionellen Varianten, die die oben beschriebenen nicht-konservativen Aminosäuren enthalten, in Kombination mit den in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten charakteristischen Bereichen. Ganz besonders bevorzugt wird die aus Cucumis melo isolierte funktionelle 9-HPL mit der in SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz.
Ebenso offenbart sind Nukleinsäuresequenzen, die für die hier offenbarten Proteine kodieren. Diese Nukleinsäuren beinhalten diejenigen, die für ein Protein kodieren, das wenigstens eine der in SEQ ID NO: 1–6 dargestellten Aminosäuresequenzen besitzt. Dies beinhaltet, wie oben diskutiert, alle degenerierten Sequenzen von Nukleinsäuren, die für diese Proteine kodieren. Eine Ausführungsform ist die Nukleinsäure, die die aus Cucumis melo isolierte cDNA darstellt, wie sie in SEQ ID NO: 8 veranschaulicht ist.
Ferner werden isolierte Nukleinsäuren offenbart, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 8 hybridisieren. Vorzugsweise hybridisieren die Nukleinsäuren, die mit der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 8 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, bei den stringenten Bedingungen nicht mit einer Nukleinsäure, die für eine Lyase kodiert, die in Cucumis sativus vorkommt. Ganz besonders bevorzugt kodiert die isolierte Nukleinsäure für ein Protein, das eine 9-HPL-Function hat.
"Stringente Bedingungen" bezieht sich auf die Waschbedingungen bei einer Hybridisierungsvorschrift oder einer Primer/Matrize-Hybridisierung bei einer PCR-Reaktion. Allgemein handelt es sich bei diesen Bedingungen um eine Kombination aus Temperatur- und Salzbedingungen für das Waschen, die so gewählt ist, dass die Denaturierungstemperatur etwa 5–20°C unter der berechneten T_m (Schmelz-/Denaturierungstemperatur) des untersuchten Hybrids liegt. Die Temperatur- und Salzbedingungen lassen sich empirisch leicht in Vorversuchen feststellen, bei denen Proben von Referenznukleinsäuren mit der Primernukleinsäure von Interesse hybridisiert und dann unter Bedingungen unterschiedlicher Stringenz amplifiziert werden. Die Stringenzbedingungen lassen sich leicht testen und die veränderten Parameter sind für einen Fachmann ohne weiteres ersichtlich. Beispielsweise können MgCl₂-Konzentrationen im PCR-Puffer verändert werden, um die Spezifität zu erhöhen, mit der der Primer an die Matrize bindet, der bei Hybridisierungsreaktionen verwendete Konzentrationsbereich dieser Verbindung ist jedoch eng und daher lässt sich der richtige Grad an Stringenz leicht feststellen. Beispielsweise können Hybridisierungen mit Oligonukleotidsonden mit 18 Nukleotiden Länge 5–10°C unter der geschätzten T_m in 6 × SSPE durchgeführt werden, und dann kann bei der gleichen Temperatur mit 2 × SSPE gewaschen werden. Die T_m eines solchen Oligonukleotids lässt sich abschätzen, indem man 2°C für jedes A- oder T-Nukleotid und 4°C für jedes G- oder C rechnet. Eine Sonde mit 18 Nukleotiden und 50% G + C hätte also etwa eine T_m von 54°C. Entsprechend wäre die Anfangssalzkonzentration für einen Primer oder eine Sonde mit 18 Nukleotiden etwa 100–200 mM. Stringente Bedingungen für einen solchen Primer oder eine solche Sonde mit 18 Nukleotiden wären also eine T_m von etwa 54°C und eine Anfangssalzkonzentration von etwa 150 mM, die durch Vorversuche entsprechend modifiziert wird. T_m-Werte können mit handelsüblicher Computersoftware (z.B. OLIGO^®) auch für zahlreiche andere Bedingungen berechnet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäure bereit, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für die Aminosäuresequenz von Melonen-9-HPL kodiert, wie sie in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist. Vorzugsweise hybridisiert die isolierte Nukleinsäure bei stringenten Bedingungen nicht an eine Nukleinsäure, die für eine Lyase kodiert, die in Cucumis sativus vorkommt. Ganz besonders bevorzugt kodiert die isolierte Nukleinsäure für ein Protein mit einer 9-HPL-Funktion.
Vorzugsweise ist die isolierte Nukleinsäure der Erfindung mit der Nukleinsäure, an die sie hybridisiert, zu wenigstens 99, 98, 97, 95, 90, 85, 80, 75 oder 70% komplementär. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind isolierte Nukleinsäuren, die mit der Sequenz, an die sie hybridisieren, zu wenigstens 90% komplementär sind. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind isolierte Nukleinsäuren, die mit der Sequenz, an die sie hybridisieren, zu wenigstens 80% komplementär sind. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind isolierte Nukleinsäuren, die mit der Sequenz, an die sie hybridisieren, zu wenigstens 70% komplementär sind. Die prozentuale Komplementarität kann vorzugsweise darauf basieren, dass man die beiden Stränge Nukleotid für Nukleotid vergleicht. Spezielle Verfahren zur Bestimmung der Komplementarität sind dem Fachmann bekannt. (z.B. die Verfahren von Clustal, Jotun Hein, WilburLipman, Martinez Needleman-Wunsch, Lipman-Pearson und das Dotplot-Verfahren). Ein Fachmann versteht also die Bedeutung dieses Begriffs und wüsste, wie er Komplementarität zwischen zwei Sequenzen bestimmen müsste.
Die Nukleinsäuren können auch eine Sonde oder ein Primer sein, um beispielsweise Target-Nukleinsäuren nachzuweisen oder zu amplifizieren. Eine charakteristische Nukleinsäure, die sich als Primer oder Sonde eignet, ist gewöhnlich etwa 20 bis etwa 25 Nukleotide lang, abhängig vom speziellen Nukleotidgehalt der Sequenz. Fragmente können außerdem eine Länge von beispielsweise wenigstens etwa 30, 40, 50, 75, 100, 200, 400 Nukleotiden oder irgendeiner Zahl dazwischen haben. Alternativ kann auch eine vollständige Sequenz eingesetzt werden oder eine Sequenz, die länger als die vollständige Sequenz ist.
B. Vektoren
Die Erfindung stellt einen Vektor bereit, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren bereit, die eine Nukleinsäure umfassen, die für eine 9-Hydroperoxid-Lyase kodiert, einschließlich, beispielsweise, einer Lyase mit einer Aminosäuresequenz, die in einem aus Cucumis melo isolierten Protein vorkommt. Der Vektor kann insbesondere ein Plasmid sein. Insbesondere kann der Vektor einen Promotor umfassen, der funktionsfähig mit einer der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung verbunden ist.
"Vektor" bedeutet jeden Träger, der exogene DNA enthält. Vektoren sind also Mittel, die die exogene Nukleinsäure ohne Abbau in eine Zelle transportieren und enthalten einen Promotor, der zur Expression der Nukleinsäure in der Zelle führt, in die sie transportiert wurde. "Vektoren" umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmide, virale Nukleinsäuren, Viren, Phagennukleinsäuren, Phagen, Cosmide und artifizielle Chromosomen. Es lassen sich zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionsvektoren herstellen, die zur Expression der funktionellen Lyase der Erfindung geeignet sind. Solche Expressionsvektoren umfassen beispielsweise pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC und Hefevektoren. Die Vektoren können die beschriebene Lyase beispielsweise in zahlreichen verschiedenen Situationen in vivo und in vitro exprimieren.
Virale Vektoren beinhalten Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Poliovirus, AIDS-Virus, neurotrophes Virus, Sindbis- und andere RNA-Viren, einschließlich solcher Viren mit HIV-Gerüst. Bevorzugt sind auch Virusfamilien, die die Eigenschaften dieser Viren teilen, die sie zur Verwendung als Vektoren geeignet machen. Retrovirale Vektoren, die bei Verma (1985) beschrieben sind, umfassen Moloney-Maus-Leukämie-Virus, MMLV, und Retroviren, die die gewünschten Eigenschaften von MMLV als Vektor exprimieren. Gewöhnlich enthalten Virusvektoren frühe Nichtstrukturgene, späte Strukturgene, ein RNA-Polymerase III-Transkript, invertierte terminale Sequenzwiederholungen, die zur Replikation und Enkapsidation erforderlich sind, und Promotoren zur Kontrolle der Transkription und Replikation des Virusgenoms. Bei der Modifikation zu Vektoren werden den Viren üblicherweise ein oder mehrere frühe Gene entfernt, und anstelle der entfernten Virus-DNA wird eine Gen- oder Gen/Promotor-Kassette in das Virusgenom eingebaut.
Bei einem "Promotor" handelt es sich generell um eine DNA-Sequenz oder um DNA-Sequenzen, die wirken, wenn sie sich in einer relativ zur Transkriptionsstartstelle fixierten Position befinden. Ein "Promotor" enthält Core-Elemente, die für die grundlegende Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase and Transkriptionsfaktoren erforderlich sind, und kann Upstream-Elemente und Response-Elemente enthalten.
"Enhancer" bezeichnet generell eine DNA-Sequenz, die nicht in einem festen Abstand von der Transkriptionsstartstelle wirkt und sich entweder 5' (Laimins, 1981) oder 3' (Lusky et al., 1983) zur Transkriptionseinheit befinden kann. Enhancer können außerdem in einem Intron (Banerji et al., 1983) sowie der kodierenden Sequenz selbst liegen (Osborne et al., 1984). Sie haben üblicherweise eine Länge zwischen 10 und 300 bp und wirken in cis. Enhancer wirken so, dass sie die Transkription nahe gelegener Promotoren erhöhen. Enhancer enthalten, wie Promotoren, auch häufig Response-Elemente, die die Transkriptionsregulation vermitteln. Enhancer bestimmen häufig die Expressionsregulation. Es wird bevorzugt, dass die Promotor- und/oder Enhancerregion als konstitutiver Promotor und/oder Enhancer wirken, um die Expression des zu transkribierenden Bereichs der Transkriptionseinheit zu maximieren.
Expressionsvektoren, die in eukaryontischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Humanzellen oder kernhaltige Zellen) verwendet werden, können auch zur Transkriptionstermination notwendige Sequenzen enthalten, die die Expression der mRNA beeinträchtigen können. Diese Regionen werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Teil der mRNA, die für Tissue Factor-Protein kodiert, transkribiert. Die 3'-untranslatierten Regionen beinhalten ebenfalls Transkriptionsterminationsstellen. Es wird bevorzugt, dass die Transkriptionseinheit auch eine Polyadenylierungsregion enthält. Ein Vorteil diese Region besteht darin, dass sie die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die transkribierte Einheit wie mRNA prozessiert und transportiert wird. Die Identifizierung und Verwendung von Polyadenylierungssignalen in Expressionskonstrukten ist allgemein etabliert. Die Verwendung homologer Polyadenylierungssignale in dem Transgenkonstrukt ist bevorzugt.
Der Vektor kann eine Nukleinsäuresequenz beinhalten, die für ein Markerprodukt kodiert. Dieses Markerprodukt wird verwendet, um festzustellen, ob das Gen in die Zelle transportiert wurde und nach seinem Transport exprimiert wird. Bevorzugte Markergene sind das E. Coli-lacZ-Gen, das für β-Galactosidase kodiert, und Grün Fluoreszierendes Protein.
Bei manchen Ausführungsformen kann der Marker ein selektierbarer Marker sein. Wenn solche selektierbaren Marker erfolgreich in eine Wirtszelle transferiert werden, kann die transformierte Wirtszelle unter Selektionsdruck überleben. Es gibt zwei allgemein angewandte unterschiedliche Kategorien von Selektionsregimen. Die erste Kategorie basiert auf dem Metabolismus einer Zelle und der Verwendung einer mutierten Zelllinie, die nicht ohne supplementiertes Medium wachsen kann. Die zweite Kategorie ist dominante Selektion, was ein Selektionsschema bezeichnet, das bei jedem Zelltyp verwendet werden kann und nicht die Verwendung mutierter Zelllinie erfordert. Diese Schemata verwenden üblicherweise einen Wirkstoff, um das Wachstum einer Wirtszelle zu arretieren. Diejenigen Zellen, die ein neues Gen haben, sollten ein Protein exprimieren, das Wirkstoffresistenz vermittelt, und sollten die Selektion überleben. Beispiele für eine solche dominante Selektion sind die die Verwendung der Wirkstoffe Neomycin (Southern und Berg, 1982), Mycophenolsäure (Mulligan and Berg, 1980) oder Hygromycin (Sugden et al., 1985).
Ferner werden Zellen offenbart, die eine exogene Nukleinsäure enthalten, die die Nukleinsäure umfasst, die für die Lyase oder das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert. Eine bevorzugte Zelle ist eine Prokaryontenzelle. Besonders bevorzugte Prokaryontenzellen sind Escherichia coli-Zellen, Bacillus-Zellen und Streptomyces-Zellen. Diese Bakterien besitzen die Fähigkeit, rekombinante Proteine zu sezernieren, was es überflüssig macht, die Zellen zu lysieren, um das Protein zu isolieren.
Ein weiterer bevorzugter Zelltyp, der eine exogene Nukleinsäure enthält, die die Nukleinsäure umfasst, die für die Lyase oder das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, ist eine Eukaryontenzelle. Besonders bevorzugte Eukaryontenzellen sind Hefezellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen. Beispielsweise können Pichia pastoris oder Saccharomyces cerevisiae als Expressionssystem verwendet werden. Geeignete Mittel zur Transfektion der Zellen mit exogener Nukleinsäure, einschließlich viraler Vektoren, chemischer Transfektanten, oder physikomechanischer Verfahren wie Elektroporation und direkter DNA-Diffusion, sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe beispielsweise Wolff et al. (1990) und Wolff (1991), die vollinhaltlich Teil der vorliegenden Offenbarung bilden). Die transfizierten Zellen können in einem Verfahren zur Expression der Proteine und Lyasen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es können viele verschiedene Strategien verwendet werden, um die Expression des Proteins oder der Lyase der vorliegenden Erfindung zu optimieren. Unterschiedliche Enhancer werden basierend auf dem Wirtszellentyp, dem Vektor und dem Promotor ausgewählt. Beispielsweise kann Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) als Induktor für den P_lac-Promotor und Derivate des P_lacPromotors verwendet werden, wenn E. coli die Wirtszelle ist. Die Induktorkonzentrationen für IPTG liegen zwischen 0 und 1 mM. Alternativ kann in E. coli ein pBAD-Vektor mit einem Promotor verwendet werden, der von L-Arabinose induziert wird. Wirtszellentyp, Vektor, Promotor, Induktionszeiten, Medienzusammensetzungen, Temperatur, Cofaktoren, Kultivierungsbedingungen und Kultivierungsdauer können verändert werden, um die Expression zu optimieren. Außerdem kann ein Vorläufer prosthetischer Gruppen wie Häm (einschließlich, beispielsweise, δ-Aminolävulinsäure) zugesetzt werden, um die Expression zu optimieren.
C. Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzungen
Offenbart wird ein Verfahren zum Spalten einer (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder einer (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure in einen C9-Aldehyd und eine C9-Oxononansäure, umfassend die Schritte des In-Kontakt-Bringens der offenbarten Lyase mit der (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder der (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure. Wenn (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure das Substrat ist, ist der C9-Aldehyd 3Z-Nonenal. Wenn (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure das Substrat ist, ist der C9-Aldehyd 3Z,6Z-Nonadienal.
Ferner werden Verfahren zum Spalten von (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure in einen C6-Aldehyd und eine C12-Oxocarbonssäure offenbart, umfassend das In-Kontakt-Bringen der offenbarten Lyase mit der 13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder der 13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure.
Ferner werden Verfahren zur Herstellung von 3-(Z)-Nonenal, (3Z,6Z)-Nonadienal, 2-(E)-Nonenal, (2E,6Z)-Nonadienal oder ihrer entsprechenden Alkohole aus (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäureoder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure offenbart, umfassend die Schritte des In-Kontakt-Bringens der (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder der (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure mit der offenbarten 9-HPL, wodurch die (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure in 3-(Z)-Nonenal oder die (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure in (3Z,6Z)-Nonadienal überführt wird; und Gewinnung des 3-(Z)-Nonenals oder (3Z,6Z)-Nonadienals; Reduktion des 3-(Z)-Nonenals zu 3-(Z)-Nonenol oder des (3Z,6Z)-Nonadienals zu (3Z,6Z)-Nonadienol und Gewinnung des 3-(Z)-Nonenols oder (3Z,6Z)-Nonadienols; oder Isomerisierung des 3-(Z)-Nonenals oder (3Z,6Z)-Nonadienals unter Bedingungen von Temperatur und pH, unter denen man 2-(E)-Nonenal oder (2E,6Z)-Nonadienal erhält, und entweder Gewinnung des gebildeten 2-(E)-Nonenals oder (2E,6Z)-Nonadienals oder Reduktion des 2-(E)-Nonenals zu 2-(E)-Nonenol oder des (2E,6Z)-Nonadienals zu (2E,6Z)-Nonadienol und Gewinnung des 2-(E)-Nonenols oder (2E,6Z)-Nonadienols aus dem Medium. Der Reduktionsschritt erfolgt vorzugsweise mit einer hefevermittelten enzymkatalysierten Reduktion (z.B. mit Alkoholdehydrogenase) nach dem Fachmann bekannten Methoden (siehe, beispielsweise, EP 0 597 069 B1 , die hier vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung bildet). Der Isomerisierungsschritt kann enzymatisch optimiert werden. Die Isomerisierung kann durch eine Isomerase oder einen nicht-enzymatischen Isomerisierungsfaktor katalysiert werden. Die Isomerase kann beispielsweise eine 3Z:2E-Enal-Isomerase sein (siehe z.B. Noordermeer et al. (1999), die hier vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung bildet).
Ferner werden Verfahren zur Herstellung von n-Hexanal, 3-(Z)-Hexen-1-al, 2-(E)-Hexen-1-al oder ihren entsprechenden Alkoholen aus (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure offenbart, umfassend die Schritte des In-Kontakt-Bringens der (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder der (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure mit den offenbarten 9-HPLs, wodurch die (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure in n-Hexanal oder die (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca 9,11,15-triensäure in 3-(Z)-Hexen-1-al überführt wird; und entweder Gewinnung des n-Hexanals oder 3-(Z)-Hexen-1-als; Reduktion des n-Hexanals zu n-Hexanol oder des 3-(Z)-Hexen-1-als zu 3-(Z)-Hexen-1-ol und Gewinnung des Hexanols oder 3-(Z)-Hexen-1-ols; oder Isomerisierung des 3-(Z)-Hexen-1-als unter Bedingungen von Temperatur und pH, unter denen man 2-(E)-Hexen-1-al erhält, und entweder Gewinnung des 2-(E)-Hexen-1-als oder Reduktion des 2-(E)-Hexen-1-als zu 2-(E)-Hexen-1-ol und Gewinnung des 2-(E)-Hexen-1-ols aus dem Medium. Der Reduktionsschritt erfolgt vorzugsweise mit der oben beschriebenen enzymkatalysierten Reduktion, und der Isomerisierungsschritt kann mit dem oben beschriebenen enzymatischen Verfahren optimiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer beschrieben, die nur der Erläuterung dienen sollen, da es für den Fachmann offensichtlich ist, dass zahlreiche Modifikationen und Varianten möglich sind.
Beispiele
Beispiel 1. Klonierung partieller cDNAs von Melone-Lyasen, einschließlich 9-Hydroperoxid-Lyase.
Ein auf Homologie basierendes Klonierungsverfahren wurde verwendet, um Zuckermelone zu isolieren (Cucumis melo). Allgemein gesagt wurde die Melonen-mRNA präpariert und Reverse Transkriptase wurde verwendet, um Melonen-mRNA in cDNA zu überführen. Diese cDNA war das Substrat für die Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) mit degenerierten Primern, die so konstruiert waren, dass sie zu den Konsensussequenzen in der Cytochrom P450-Familie 74 (CYP74) passten. Diese PCR lieferte die partiellen cDNA-Klone mit Sequenzhomologie zur CYP74-Genfamilie. Die partiellen Klone wurden mit 3'-RACE-(Rapid Amplification of cDNA Ends) und 5'-RACE-Reaktionen verlängert, was die komplette cDNA (d.h. den zur mRNA vollständig komplementären Strang) für jeden partiellen Klon ergab. Die vollständige cDNA wurde durch PCR kloniert und in E. coli exprimiert. Die katalytische Aktivität der in E. coli exprimierten Produkte wurde mit 9-Hydroperoxy- und 13-Hydroperoxyfettsäuren als Substraten charakterisiert.
A. Präparation von Melonen-RNA
Das Ausgangsmaterial war Cantaloupe-Melone ("Muskmelon" oder "Zuckermelone"), Cucumis melo, der Sorte Caravelle (Asgrow, Texas). Zur Isolierung vom Gesamt-RNA wurde ein TRI REAGENT-Kit (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio) verwendet. Gesamt-RNA wurde aus 20 g unreifer Melonenfrucht präpariert. Es wurden 400 μg Gesamt-RNA erhalten. Ein Reinigungskit für mRNA (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) wurde verwendet um die mRNA aus Gesamt-RNA aufzureinigen. Der Kit sieht Oligo-dT-Cellulose-Spinsäulen zur Affinitätsreinigung polyadenylierter RNA vor. Es wurde nach der Vorschrift des Herstellers gearbeitet. Es wurden 3,7 μg mRNA aus 400 μg Gesamt-RNA isoliert.
B. RT-PCR Klonierung mit degenerierten Primern auf Basis konservierter CYP74-Sequenzen
Der erste cDNA-Strang wurde aus Gesamt-RNA oder Poly(A)+RNA mit einem Oligo-dT-Adapter synthetisiert. Die Reaktion mit Reverser Transkriptase enthielt 80 pmol Oligo-dT-Adapter (SEQ ID NO: 49, A 1678, 5'-ATG AAT TCG GTA CCC GGG ATC CTT TTT TTT TTT TTT TTT-3' oder SEQ ID NO: 50, A 1677, 5'-ATG AAT TCG GTA CCC GGG ATC-3'), 10 μl 5 × Erststrang-Puffer (GibcoBRL, Rockville, Maryland), 1 mM DTT, 1 mM von jedem dNTP, 50 Einheiten RNAsin, 400 U MMV-RT, und H₂O auf ein Endreaktionsvolumen von 50 μl. Diese RT-Reaktionsmischung wurde bei 37°C eine Stunde inkubiert. Der erste cDNA-Strang wurde ohne weitere Reinigung direkt in PCR-Reaktionen eingesetzt. Die PCR-Reaktion enthielt 20–100 ng Melonen-cDNA-Matrize, 200 μM von jedem dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 20 pmol Upstream-Primer (GGTGAGTTGCTNTGYGGNTAYCA (SEQ ID NO: 16), GGTGAGTTGCTNTGYGGNTA (SEQ ID NO: 17), oder TACTGGTCNAAYGGNCCNSARAC (SEQ ID NO: 19)) und 20 pmol Downstream-Primer (TGGTCNAAYGGNCCRGAGAC (SEQ ID NO: 18), AAYAARCARTGYGCNGCTAAGGAC (SEQ ID NO: 20), oder AARCARTGYGCNGCTAAGGAC (SEQ ID NO: 21) (siehe 2 und 3). Die PCR-Reaktion beinhaltete ferner 1,25 Einheiten Enzym und H₂O auf ein Endreaktionsvolumen von 50 μl. Die cDNA-Matrize wurde zugegeben, wenn die Reaktionstemperatur 80°C betrug. Die Parameter des Reaktionszyklus waren 94°C 2 Minuten lang (nur 1 Zyklus); 57° bis 62°C 1 Minute lang, 72°C eine Minute lang, 94° eine Minute lang (typischerweise 30 Zyklen); und 72°C 10 Minuten lang (letzter Zyklus). Die Reaktionsbedingungen waren für alle Reaktionen gleich, es wurden jedoch zwei verschiedene DNA-Polymerasen verwendet: (1) AmpliTaq DNA-Polymerase (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) und (2) AdvanTaq (Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA)).
i. Amplifikation des 150 bp cDNA-Fragments
Es wurde eine PCR mit einem Zyklus und mit Melonen-cDNA als Matrize durchgeführt. Der degenerierte Upstream-Primer (SEQ ID NO: 16, Primer 1A, 2 und 3) wurde mit dem degenerierten Downstream-Primer (SEQ ID NO: 18, Primer 2, 2 und 3) verwendet, jedoch wurde bei dieser ersten PCR keine Bande erhalten. Daher wurde eine zweite PCR mit 0,1 μl der Reaktionsprodukte der PCR der ersten Runde als Matrize und dem degenerierten Upstream-Primer 1B (SEQ ID NO: 17, 2 and 3) als einem „nested" Upstream-Primer durchgeführt. Diese zweite PCR lieferte ein Produkt, das im Agarosegel als charakteristische Bande (150 bp) lief. Das 150 bp-PCR-Produkt ist der Größe nach mit dem erwarteten Produkt der Cyp74-Genfamilie vergleichbar.
Das 150 bp-Produkt wurde in einen Vektor (pCR2.1 von Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert und etwa 50 Klone wurden sequenziert. Es wurden drei verschiedene mit P450 verwandte Sequenzen erhalten (4) und diese wurden als partieller Klon A (SEQ ID NO: 28), Klon B (SEQ ID NO: 29) und Klon C (SEQ ID NO: 30) bezeichnet. Die partiellen Klone A und B haben 65% identische Homologie; die partiellen Klone A und C haben 57% identische Homologie; und die partiellen Klone B und C haben 72% identische Homologie.
ii. Amplifikation des 70 bp-cDNA-Fragments
Die PCR mit einem Zyklus wurde mit Melonen-cDNA als Matrize durchgeführt. Der degenerierte Upstream-Primer (SEQ ID NO: 18, Primer 2, 2 und 3) wurde mit einem degenerierten Downstream-Primer (SEQ ID NO: 20, Primer 4A, 2 und 3) verwendet. Es wurde keine Bande im Agarosegel erhalten. Daher wurde eine zweite PCR mit 0,1 μl der ersten PCR als Matrize durchgeführt. Der degenerierten Downstream-Primer, Primer 4B (SEQ ID NO: 21, 2 and 3) wurde als ein „nested" Upstream-Primer verwendet. Diese zweite PCR lieferte ein Produkt, das im Agarosegel als charakteristische Bande mit etwa 70 bp lief. Dies ist der Größe nach mit dem erwarteten Produkt vergleichbar. Da die Größe dieser 70 bp-Bande auf Agarosegelen nur schwer genau zu bestimmen war, wurde die Größe einzelner Klone (48 Klone) durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf einem 10%-Gel mit einer 10 bp-DNA-Leiter zur Kalibrierung bestimmt. Die PAGE zeigte an, dass eine komplexe Mischung von Produkten (60–90 bp) amplifiziert worden war. Zwölf Klone nahe der vorhergesagten Größe wurden sequenziert. Einer dieser Klone kodierte für eine P450-ähnliche Sequenz. Dieser partielle Klon stellte eine unterschiedliche Region des partiellen 150 bp-Klons B dar.
Beispiel 2. Bildung vollständiger Klone mit Primern aus 3'-RACE und 5'-RACE
Das 3'-RACE (3'-Rapid Amplification of cDNA Ends)-Verfahren verwendet einen degenerierten Upstream-Primer zur PCR, und bei durch Reverse Transkriptase katalysierten cDNA-Synthese wird ein Downstream-Primer auf Basis der Adaptersequenz am 5'-Ende des Primers wird verwendet. Die cDNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Der Marathon cDNA-Amplification-Kit (Clontech) wurde zur 5'-RACE (5'-Rapid Amplification of cDNA Ends) verwendet. Dieses Verfahren soll mRNA (1 μg) in doppelsträngige cDNA überführen und die cDNA-Enden mit einer Adaptersequenzkassette als Tag versehen. Es wurde nach der Vorschrift des Herstellers gearbeitet.
A. 3'-RACE
Die cDNA wurde wie oben beschrieben präpariert. Es wurden drei verschiedene Präparationen von Gesamt-RNA verwendet: (1) aus dem Gemisch von saftigem Fleisch und harter Schale der Melone, (2) aus der harten Schale der Melone, (3) aus dem saftigen Fleisch der Melone. Ein genspezifischer Upstream-Primer von Klon A
(5'-GGTTATCAGCCGCTGGTGATG-3' (SEQ ID NO: 34) oder
5'-ATGAACCGGAGGCGTTTAATCCG-3' (SEQ ID NO: 35)),
B (5'-ACAGAGCGGACGAGTTCGTACCT3' (SEQ ID NO: 36)) oder
C (5'-AGGATTCGGAGAAGTTCGTGGGC-3' (SEQ ID NO: 37))
wurde mit einem Downstream-Primer auf Basis der Oligo-dT-Adaptersequenz (SEQ ID NO: 49 und 50) verwendet.
Zur Isolierung der vollständigen Klone von Klon B und C wurden die genspezifischen Primer für Klon B (SEQ ID NO: 36) und für Klon C (SEQ ID NO: 37) sowie der Primer auf Basis der Adaptersequenz des Oligo-dT-Primers (SEQ ID NO: 50) verwendet. Die PCR wurde mit der cDNA-Matrize geprimt, die aus der RNA erhalten wurde, die aus dem Gemisch von saftigem Fleisch und harter Schale der Melone erhalten worden war. PCR-Reaktionen mit diesen Primern lieferten ein 350 bp-Produkt (Klon B) und ein 550 bp-Produkt (Klon C), die auf einem Agarosegel als charakteristische Banden liefen.
Diese 350- und 550 bp-PCR-Produkte waren der Größe nach mit dem erwarteten Produkt der Amplifikation des 3'-Endes der AOS- und 13-HPL-cDNA vergleichbar. Diese Produkte wurden in pCR2.1 subkloniert und sequenziert.
Zur Isolierung des vollständigen Klons von Klon A wurde die PCR mit der cDNA-Matrize aus saftigem Fleisch oder harter Schale der Melone geprimt. Der genspezifische Upstream-Primer für Klon A (SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NO: 35) und ein Downstream-Primer auf Basis der Oligo-dT-Adaptersequenz (SEQ ID NO: 50) wurden zur Amplifikation eingesetzt. Wenn die PCR-Reaktion mit der cDNA aus harter Schale geprimt wurde, wurde kein PCR-Produkt erhalten, wie durch Agarosegelelektrophorese festgestellt wurde. Wenn die PCR-Reaktion mit der cDNA aus saftigem Fleisch geprimt wurde, wurden jedoch zwei Produkte erhalten, die als charakteristische Banden auf einem Agarosegel liefen. Das mit dem Primer der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 34 gebildete Produkt hatte 450 bp und das mit dem Primer der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 35 gebildete Produkt hatte 400 bp. Der Größenunterschied dieser zwei PCR-Produkte (50 bp) passte zu dem erwarteten Abstand zwischen den beiden Upstream-Primern, die SEQ ID NO: 34 und SEQ ID NO: 35 entsprachen.
Die 400- und 450 bp-PCR-Produkte, die mit den Primern gebildet wurden, die sich von Klon A ableiteten, waren der Größe nach mit dem erwarteten Produkt des 3'-Endes der AOS- und 13-HPL-cDNA vergleichbar. Diese Produkte wurden in pCR2.1 subkloniert und sequenziert.
5 vergleicht die Identität zwischen den C-terminalen Sequenzen der von den Klonen A, B und C von Melone kodierten Aminosäuresequenzen mit den C-terminalen Sequenzen der 13-HPLs von Guave, Pfeffer und Banane und den AOS von Flachs, Guayule und Arabidopsis. Dieses Alignment zeigt, dass Klon A mit den 13-HPL-Sequenzen die höchste Homologie aufweist. Klon B und C zeigen mehr Homologie mit AOS als mit 13-HPL. Klon B ist AOS ähnlicher als Klon C, und daher divergiert Klon C am meisten sowohl von AOS als auch von 13-HPL.
B. 5'-RACE
Gesamt-RNA wurde wie oben beschrieben aus dem saftigen Fleisch der Melone präpariert. Die cDNA-Synthese für 5'-RACE erfolgte mit dem Clonetech-Verfahren (Marathon cDNA-Amplification-Kit). Es wurde nach der Vorschrift des Herstellers gearbeitet. Es wurde 1 μg der mRNA aus unreifer Melonenfrucht eingesetzt. Eine erste PCR erfolgte mit Melonen-cDNA als Matrize, die mit der Marathon-Adaptersequenz an den 5'- und 3'-Enden als Tag versehen wurde. Der Upstream-Primer AP1 wurde mit einem genspezifischen Downstream-Primer (5'-CCG TCA GCA CCA CCA AAT CCT TC-3' (SEQ ID NO: 39)) für Klon A, 5'-CTG AAC CGA CCG CGA CTG TGT-3'(SEQ ID NO: 41) für Klon B und 5'-TCC GCG TCG GCT CCA CTG TC-3' (SEQ ID NO: 43) für Klon C) verwendet. Bei der ersten PCR wurde für jeden Klon ein Produkt erhalten, das als diffuse verschmierte Bande auf einem Agarosegel lief. Eine zweite PCR wurde mit 0,05 μl Produkt der ersten PCR als Matrize durchgeführt (eine 50 μl-PCR-Reaktion). Der Upstream-Primer war der Adapter AP2 (Marathon cDNA Amplification Kit) und der genspezifische Downstream-Primer war entweder 5'-GAA CAG ATA ATC CAG CAG GGC-3' (SEQ ID NO: 40) für Klon A, 5'-TCG CCC GTG AAC CGA TCA GGT A-3'(SEQ ID NO: 42) für Klon B, oder 5'-TCT CCC ACG AAC CTA TCG CCC A-3' (SEQ ID NO: 44) für Klon C. Diese zweite PCR lieferte ein 1000 bp-Produkt für Klon A, ein 1400 bp-Produkt für Klon B und ein 1200 bp-Produkt für Klon C. Die 1000 bp-, 1400 bp- und 1200 bp-PCR-Produkt sind der Größe nach mit dem erwarteten Produkt auf Basis der Größe der AOS- und 13-HPL-cDNA vergleichbar. Diese Produkte wurden in einen Vektor (pCR2.1, Invitrogen) subkloniert und sequenziert.
Nach Sequenzierung der 5'- und 3'-RACE-Produkte der Klone B und C wurden genspezifische Primer synthetisiert, die dem mutmaßlichen Start der kodierenden Sequenz and der Sequenz am Stopcodon entsprachen. Für Klon B wurden NcoI- und EcoRI-Restriktionsstellen (einmalige Stellen) am 5'- bzw. 3'-Ende eingebaut, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: 5'-GCC ATG GCC TCC ATT GTC ATT CCT TC-3' (SEQ ID NO: 45) (NcoI-Stelle fett und fettes ATG kodiert für MET) (5'-Up) und 5'-GGA ATT CTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GGA AAC TTG CTT TCT TTA G-3' (SEQ ID NO: 46) (EcoRI-Stelle fett und AGT-Codon stellt das Stop-Codon dar) (3'-Down).
Für Klon C wurden einmalige NdeI- und ClaI-Restriktionsstellen am 5'- bzw. 3'-Ende eingebaut, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: 5'-GCA TAT GGC TAC TCC TTC TTC CTC CTC-3' (SEQ ID NO: 47) (NdeI-Stelle fett und fettes ATG kodiert für MET) (5'-Up) und 5'-CAT CGA TTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GAT TAG TCA TTA GCT TTA A-3' (SEQ ID NO: 48) (ClaI-Stelle fett und AGT ist ein Stopcodon) (3'-Down). Eine NcoI-Stelle befindet sich in der kodierenden Sequenz.
Die PCR-Reaktion wurde mit der Melonen-cDNA geprimt, die aus 1 μg mRNA präpariert worden war (wie oben beschrieben), wobei entweder der Primer mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 45 und der Primer mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 46 oder der Primer mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 47 und der Primer mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 48 als Primer verwendet wurden. Die Reassoziierungstemperatur für diese Reaktionen betrug 60°C und es wurde die Advantage cDNA-Polymerase-Mischung von Clontech verwendet. Es wurden ein 1,6 kb-Produkt für Klon B und ein 1,4 kb-Produkt für Klon C amplifiziert. Jedes dieser Produkte wurde in einen Vektor (pCR2.1) subkloniert und sequenziert. Die Nukleotidsequenz von Klon B ist als SEQ ID NO: 51 gezeigt und die Nukleotidsequenz von Klon C ist als SEQ ID NO: 7 gezeigt.
Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen, die von dem 1,6 kb-Produkt von Klon B, SEQ ID NO: 51, (in 1 als AOS-Melon bezeichnet mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 52) und dem 1,4 kb-Produkt von Klon C kodiert werden (in 1 als HPL-Melon bezeichnet mit der SEQ ID NO: 7) wurden mit den Aminosäuresequenzen der AOS von Flachs (SEQ ID NO: 53), Guayule (SEQ ID NO: 54) und Arabidopsis (SEQ ID NO: 55) und den Aminosäuresequenzen der 13-HPL von Guave (SEQ ID NO: 38), Banane (SEQ ID NO: 33) und Pfeffer (SEQ ID NO: 32) verglichen. Es ist zu beachten, dass der Anfang der Sequenzen (kodiert von den 5'-Enden) erhebliche Variationen in Länge und Aminosäuresequenz aufweist, bevor alle Sequenzen konvergieren und nähere Verwandtschaft zu zeigen beginnen. Klon B hat ein sehr langes 5'-Ende, was das im Vergleich mit Klon C mit einem vergleichsweise kurzen 5'-Ende längere 5'-RACE-Produkt zur Folge hat.
Bei einem Sequenzvergleich des zur Verfügung stehenden 3'-Endes ähnelt Klon A den bekannten 13-HPL-Enzymen am meisten. Klon B ist eine Melonen-AOS. Klon C ist eine Melonen-9-Hydroperoxid-Lyase.
Beispiel 3. Expression in E. coli.
Klon B-cDNA in pCR2.1 wurde mit NcoI und EcoRI geschnitten und in das Expressionsvektorplasmid pET3d (ebenfalls mit NcoI und EcoRI verdaut) subkloniert. Klon C-cDNA in pCR2.1 wurde mit NdeI und ClaI geschnitten und in das Expressionsvektorplasmid pET3b (ebenfalls mit NdeI und ClaI verdaut) subkloniert. Die beiden verschiedenen Konstrukte wurden zur Transformation von E. coli, Stamm BL21 (DE3), verwendet, um das Genprodukt der Klone B und C zu exprimieren. Diese Konstrukte führten zu einer bakteriellen Expression der nativen Pflanzensequenzen ohne zusätzliche Aminosäuren oder andere Modifikationen an den 5'-Enden.
Zur Expression wurden die transformierten BL21-Zellen über Nacht bei 37°C und 280 Upm in LB-Medium kultiviert (3 ml, hergestellt durch Lösen von Trypton (10 g), Hefeextrakt (5 g) und NaCl (10 g) in 1 Liter Wasser, einstellen des pH auf 7,0 und Autoklavieren). Nach dem Autoklavieren wurde das Antibiotikum Kanamycin (30 mg) keimfrei zugegeben. Ein Teil der resultierenden Kultur (0.2 ml) wurde dann in Terrific Broth überführt (TB, 10 ml, hergestellt durch Lösen von Bacto-Trypton (12 g), Bacto-Hefeextrakt (12 g) und Glycerin (4 ml) in deionisiertem Wasser (900 ml), Autoklavieren und anschließend Zugabe einer sterilen Lösung (100 ml) mit 50 μg/ml Ampicillin, 0,17 M KH₂PO₄, und 0,72 M K₂HPO₄) und bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 260 nm (OD²⁶⁰) wachsen gelassen. Diese Kultur wurde zum Animpfen von 50 ml TB mit 50 μg/ml Ampicillin verwendet, das dann bei 28°C und 200 Upm gehalten wurde, und dann wurde ein Häm-Vorläufer, 6-Aminolävulinsäure (1 mM), zugegeben und eine Stunde später der Induktor IPTG (0,4 mM). Die induzierten Kulturen wurden noch weitere Zeit belassen (4 oder 16 Stunden) und die Zellen wurden durch Abzentrifugieren geerntet (7 min bei 4°C und 5.000 Upm). Die präzipitierten Zellen wurde durch Resuspendieren in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,9) und erneutes Zentrifugieren wie zuvor gewaschen.
Das resultierende Zellpellet wurde in Tris-Acetat-Puffer (0,1 M, pH 7,6) mit Sucrose (0,5 M), EDTA (0,5 mM) und Lysozym (1 mg/ml) resuspendiert. Nach 30 min auf Eis wurde die Mischung wie zuvor abzentrifugiert und es wurde ein Pellet von Sphäroplasten erhalten. Diese wurden in Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,6) mit Magnesiumacetat (6 mM), Glycerin (20% v/v) und DTT (0,1 mM) resuspendiert und die Mischung wurde 10 min bei –80°C belassen. Danach wurde ein Proteaseinhibitor zugegeben (PMSF, 1 mM) und die Zellen wurden mit Ultraschall behandelt (2 × 30 Sekunden). Analyse der Expressionsprodukte durch SDS-PAGE zeigte für beide Klone B und C kaum erkennbare Banden. Verglichen mit dem Kontrollprotein, das aus Vektor allein ohne cDNA-Insert gebildet wurde, gab es weniger Protein, die Bakterienlysate zeigten jedoch leicht messbare katalytische Aktivität. Bei Verfolgen des Verschwindens der UV-Extinktion bei 235 nm der Fettsäurehydroperoxid-Substrate wurde weniger als 1 μl (< 10 μg rohes Protein) der suspendierten und lysierten Bakterienpellets benötigt um in einer 1 ml UV-Küvette eine Reaktion zu sehen.
Beispiel 4. Partielle Reinigung der 9-HPL aus Klon C
Das 9-HPL-Enzym wurde in E. coli (BL21-Zellen) wie in Beispiel 3 diskutiert exprimiert, am Carboxyterminus des Proteins wurde jedoch mittels SEQ ID NO: 31 ein His-6-Tag exprimiert. Die solubilisierten Sphäroplastenpräparate aus drei 50 ml-Bakterienkulturen wurden gepoolt und nach den Vorschriften des Herstellers auf eine Nickel-NTA-Säule (gekauft von Qiagen) aufgetragen. Die Säule (Bettvolumen 1 ml) wurde mit dem Auftragpuffer (enthaltend 50 mM Glycin und 0,1% Emulphogen) gewaschen und das Enzym wurde dann mit Auftragpuffer, der 40 mM Histidin und 0,1% Emulphogendetergens enthielt, eluiert. Die gepoolten Fraktionen wurden anschließend zur Entfernung des Histidins über Nacht dialysiert. Dies ergab etwa 5 ml Lösung, die entsprechend Analyse auf SDS-PAGE die erwartete 55 kD-Bande des 9-HPL als Hauptproteinkomponente enthielt. Das UV-sichtbare Spektrum der gereinigten 9-HPL zeigte eine Haupt-Soretbande des Hämoproteins mit einer Extinktion von 0,35 AU bei 416 nm.
Beispiel 5: Katalytische Aktivitäten des exprimierten Melone-Klons C
A. Turnover number der 9-HPL mit 9S-Hydroperoxylinolsäure bei Raumtemperatur, pH 7,6
Die Messung erfolgte spektrophotometrisch (Abnahme der Extinktion bei 235 nm) und mit den Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten. Die Turnover number des gereinigten 9-HPL-Enzyms (Anzahl Produktmoleküle, die pro Enzymmolekül gebildet werden) mit 9S-Hydroperoxylinolsäure als Substrat wurde aus der bekannten Konzentration des Enzyms (gemessen am Soretmaximum bei 416 nm und mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 100.000) und den gemessenen Geschwindigkeiten für die Änderung der Substratkonzentration (mit dem molaren Extinktionskoeffizienten von 23.000 bei 235 nm des konjugierten Diens) berechnet. Die erhaltenen Werte waren 3000 Turnover pro Sekunde für das aktivste Präparat des 9-HPL-Enzyms.
Diese Berechnung bezieht sich auf die beobachteten Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten. Die Geschwindigkeiten nahmen mit der Zeit ab, da das Enzym abhängig vom Turnover inaktiviert wird.
B. Identifizierung von Produkten, die mit dem gereinigten 9-HPL-Enzym aus 9S-Hydroperoxylinolsäure gebildet werden
Das gereinigte Enzym (etwa 0,4 μg in 2 μl) wurde mit 3 μg [U-14C]9S-Hydroperoxylinolsäure in 100 μl Puffer (Kaliumphosphat, 0,1 M, pH 7,6) umgesetzt. Nach 30 Sekunden bei Raumtemperatur, nach denen die Umsetzung vollständig war, wurde Methanol (200 μl) zugegeben. Die Lösung wurde gemischt, kurz in einer Benchtop-Zentrifuge abzentrifugiert, und der Überstand wurde in eine HPLC eingespritzt.
Das eingesetzte HPLC-System waren eine 5 μm-Beckman Ultrasphere-ODS Säule (25 × 0.46 cm), ein Lösungsmittel aus Methanol/Wasser/Eisessig (75/25/0,01, v/v/v) und eine Durchflussgeschwindigkeit von 1,1 ml/min. Die Säule wurde zum Nachweis von UV-absorbierenden Verbindungen an einen Hewlett-Packard 1040A-Diodenarray-Detektor gekoppelt, und dann wurde das Elutionsmittel zur Aufzeichnung des Profils von ¹⁴C-Metaboliten durch einen Packard Flo-One On-line-Radioaktivitätsdetektor laufen gelassen.
Das Substrat, das gleichmäßig mit ¹⁴C markiert war, wurde in zwei radiomarkierte Hauptprodukte überführt, die die gleiche Fläche aufwiesen. Das früh eluierende Produkt (Retentionszeit 3,5 min) wurde anschließend durch GC-MS als 9-Oxononansäure identifiziert (siehe unten); dieses Produkt stellt die ersten 9 Kohlenstoffe des 18-Kohlenstoffsubstrats dar. Das zweite Hauptprodukt bei einer Retentionszeit von 9 min stimmte in seiner Retentionszeit genau mit 3Z-Nonenal überein. Dieses Produkt stellt die Kohlenstoffe 10–18 des Substrats dar. Eine sehr kleine rückseitige Schulter an diesem Peak, etwa 5% der Peakfläche, war mit 2E-Nonenal authentisch.
C. Identifizierung von 9-Oxononansäure
Das früh eluierende Produkt (3,5 min Retentionszeit) aus der Reaktion der 9-HPL mit 9S-Hydroperoxylinolsäure zeigte nur schwache Endextinktion im UV. Dies Produkt wurde mit dem oben beschriebenen HPLC-System gereinigt und aus dem Säulenlösungsmittel mit Diethylether extrahiert. Ein Aliquot wurde erneut in 20 μl Methanol gelöst und mit etherischem Diazomethan behandelt, um die freie Säure in den Methylester zu überführen. Ein Teil dieser methylierten Probe wurde durch Behandlung der Probe mit 2% Methoxylaminhydrochlorid (MOX) in Pyridin ebenfalls in das Methoximderivat überführt.
Die beiden Proben (Methylester und Methylester-Methoximderivate) wurden mit GC-MS analysiert (Gaschromatographie-Massenspektrometrie), wobei im Elektronenstoß-Modus mit einem Finnigan Incos 50-Massenspektrometer gearbeitet wurde, das an einen Hewlett-Packard 5890-Gaschromatographen mit einer SPB-5 Quarz-Kapillarsäule (30 m × 0.25 mm Innendurchmesser) gekoppelt war. Proben wurden bei 50°C eingespritzt und die Temperatur wurde anschließend auf 300°C bei 10°/min programmiert. Unter diesen Bedingungen eluierte 9-Oxononansäuremethylester bei einer Retentionszeit von 13 Minuten. Das Massenspektrum zeigte charakteristische Fragments bei m/z 185 (M+-H), 158 (M+-CO), 155 (M+-OCH₃), 143 (M+-CH₂CHO), 111 und die McLafferty-Methylester-Fragmentionen bei m/z 74 und 87. MOX-Derivatisierung des Methylesters lieferte einen doppelten gaschromatographischen Peak, der aus den syn- und anti-Oximisomeren bestand, die gemeinsam bei etwa 14,5 Minuten eluierten. Ihre Massenspektren zeigten die gleichen Hauptfragmentionen mit leichten Unterschieden in der Ionenintensität. Hauptionen wurden bei m/z 215 (M+), 184 (M+-NH₂OCH₃), 152 (M+-NH₂OCH₃-H₃OH) 124 (184-CH₃CO₂H) und 73 (CH₃-CNH-OCH₃+) nachgewiesen.
D. Identifizierung von 3Z-Nonenal
Ein Reaktionsansatz von 9S-Hydroperoxylinolsäure mit gereinigter 9-HPL wurde mit Hexan extrahiert und ein Aliquot des Hexanextrakts wurde in das oben beschriebene GC-MS-System eingespritzt. Zwei Peaks eluierten bei der GC-MS bei den Retentionszeiten der authentischen Standards 3Z-Nonenal (≈ 8 Minuten) und 2E-Nonenal (≈ 9 Minuten). Wie aufgrund der Peakfläche abgeschätzt wurde, wurden die beiden Aldehyde in einem Verhältnis von 10:1 von 3Z zu 2E gebildet. Zur Identifizierung der beiden Aldehyde wurde ein 3Z-Nonenal-Standard chemisch synthetisiert (siehe Beispiel 6), und 2E-Nonenal wurde von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen. Die Massenspektren der beiden durch die Reaktion der 9-HPL mit 9S-Hydroperoxylinolsäure gebildeten Aldehyde sind im Wesentlichen identisch mit den authentischen Standards. 3Z-Nonenal zeigt charakteristische Fragmentionen bei m/z 140 (M+), 122 (M+-H₂O) und 111 (M+-CHO), während 2E-Nonenal Ionen bei m/z 139 (M+-H), 122 (M+-H₂O) und 111 (M+-CHO) zeigte.
Beispiel 6. Chemische Synthese von 3Z-Nonenal
Die Synthese von 3Z-Nonenal erfolgte durch leichte Modifikationen der Verfahren von Corey und Suggs (1975) und Andre und Funk (1986). Kurz gesagt wurde zu einer NaOAc-gepufferten Lösung von Pyridiniumchlorochromat in Methylenchlorid in Methylenchlorid gelöstes 3Z-Nonenol gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von Diethylether gestoppt und direkt durch eine mit Methylenchlorid eluierte Silicagelsäule filtriert, um das Oxidationsmittel zu entfernen. DSC-Analyse zeigte an, dass die Umwandlung in 3Z-Nonenal zu etwa 50% erfolgt war. Das rohe Produkt wurde durch Planar-Säulenchromatographie isoliert und durch RP-HPLC gereinigt. Bei allen Schritten während der Reinigung wurde darauf geachtet, dass eine Oxidation von 3Z-Nonenal zu 4-Hydroperoxy-2E-nonenal vermieden wurde. Eine GC-MS-Analyse des chemisch synthetisierten 3Z-Nonenals zeigte, dass das Massenspektrum des chemisch synthetisierten 3Z-Nonenals im Wesentlichen mit dem authentischen Standard identisch ist und die charakteristischen Fragmentionen zeigt.
Beispiel 7. Identifizierung von Produkten, die von dem 9-HPL-Enzym im rohen Bakterienlysat aus 9S-Hydroperoxylinolsäure gebildet werden
Wenn das Rohlysat der bakteriellen Expression als Quelle für 9-HPL verwendet wurde, erhielten wir ein anderes Produktprofil als das, das mit dem gereinigten Enzym erhalten wurde. Die nachfolgend beschriebenen analytischen Untersuchungen (insbesondere das Trapping-Experiment) führten zu der Schlussfolgerung, dass die Enzymprodukte zu Beginn die gleichen waren, die bei dem gereinigten Enzym charakterisiert wurden. In dem rohen Bakterienlysat wird jedoch eines der beiden primären enzymatischen Produkte, 3Z-Nonenal, leicht zu einer Mischung aus drei Aldehyden oxidiert (wahrscheinlich nichtenzymatisch), die aus 4-Hydroxy-2E-nonenal (4-HNE), 4-Hydroperoxy-2E-nonenal (4-HPNE) und einem Halbacetalderivat besteht, das sich zwischen 9-Oxononansäure und 4-Hydroperoxy-2E-nonenal (Halbacetal) bildet. Die Struktur der drei polaren Aldehyde und ihre Bildung aus 3Z-Nonenal sind in 6 dargestellt. Diese zeigt auch die geringe Isomerisierung von 3Z-Nonenal zu 2E-Nonenal, die in kleinem Maße sowohl mit dem gereinigten Enzym als auch mit dem rohen Bakterienlysat beobachtet wird. Bei dem rohen Bakterienlysat wird das andere primäre 9-HPL-Product, 9-Oxononansäure, im Wesentlichen unverändert gewonnen. Ein kleiner Bruchteil wird in das Halbacetal umgewandelt, wie in 6 dargestellt.
Bei dem rohen Bakterienlysat, das die Melonen-9-HPL exprimiert, wurden die Reaktionen mit 9S-Hydroperoxylinolsäure mit einer Sauerstoffelektrode verfolgt (die Elektrode zeichnet die O₂-Konzentration in der Lösung gegen die Zeit auf). Bei Inkubationen in der geschlossenen 2 ml Zelle der Sauerstoffelektrode wurde beobachtet, dass Reaktionen der 9-HPL aus dem Rohlysat mit 9S-Hydroperoxylinolsäure mit einem Abfall der O₂-Konzentration in der Lösung einhergingen. Diese Abnahme der O₂-Konzentration entspricht der Reaktion von O₂ mit 3Z-Nonenal zu den drei polaren Aldehyden. Quantitativ entspricht der Abfall der O₂-Konzentration (nmol verbrauchtes O₂) etwa dem nmol polarer Aldehydderivate, die durch HPLC-Analyse nachgewiesen wurden. Im Gegensatz zu dem rohen Enzympräparat ging die Reaktion der gereinigten 9-HPL mit 9S-Hydroperoxylinolsäure nicht mit einer Änderung der O₂-Konzentration in der Lösung einher.
Bei dem rohen Bakterienlysat, das die Melonen-9-HPL exprimiert, wurden die Reaktionen mit 9S-Hydroperoxylinolsäure wie oben beschrieben entweder mit der O₂-Elektrode oder spektrophotometrisch bei 235 nm verfolgt. Die Lösungen wurden dann mit einer C18-Extraktionskartusche (Bond-Elut von Varian) extrahiert und mit Diethylether eluiert. Die Etherextrakte wurden bis zur Trockne eingedampft und mit HPLC analysiert. Das Profil radiomarkierter Produkte wurde unter Verwendung von [1-¹⁴C]9S-Hydroperoxylinolsäure (¹⁴C an Kohlenstoff-1) und [U-¹⁴C]9S-Hydroperoxylinolsäure (¹⁴C gleichmäßig an allen 18 Kohlenstoffen) als Substraten erhalten. Das Profil UV-absorbierender Materialien wurde durch Monitoring bei 205 nm und 220 nm bestimmt. Bei Verwendung des 1-¹⁴C-Substrats sind nur Produkte radiomarkiert, die Kohlenstoff-1 des Substrats behalten (d.h. 9-Oxononansäure und das Halbacetalprodukt), und mit dem U-¹⁴C-Substrat sind alle Produkte radiomarkiert.
Der größte radiomarkierte Peak, der sowohl mit dem 1-¹⁴C- als auch dem gleichmäßig markierten ¹⁴C-Substrat gebildet wird, wurde als 9-Oxononansäure identifiziert. Dies entspricht den Kohlenstoffen 1–9 des ursprünglichen Substrats, und dieses primäre Aldehydprodukt der 9-HPL wird im Wesentlichen intakt aus den Inkubationen erhalten. Eine kleine Menge wird in Halbacetal umgewandelt, wie in 6 gezeigt ist.
Die drei Produkte werden über die Oxygenierung von 3Z-Nonenal zu Beginn erhalten. Diese Oxidation von 3Z-Nonenal, bei der zunächst 4-Hydroperoxy-2E-nonenal (4-HPNE) gebildet wird, ist wahrscheinlich eine nicht-enzymatische Reaktion, die in dem rohen Bakterienlysat leicht abläuft. Das 4-HPNE wird teilweise zu 4-HNE reduziert. Das 4-HPNE reagiert auch mit 9-Oxononansäure zu dem Halbacetalderivat (6).
Beispiel 8. Beweis, dass die Primärprodukte der 9-HPL in dem rohen Bakterienlysat 9-Oxononansäure und 3Z-Nonenal sind
Für diese Reihe von Versuchen wurde die Sauerstoffkonzentration im Puffer vor Umsetzung mit der rohen 9-HPL auf 0 reduziert. Dies erfolgte durch Zugabe kleiner Aliquote einer Lösung von Natriumdithionit, wobei die O₂-Konzentration mit der Sauerstoffelektrode verfolgt wurde.
Mit sauerstoffverarmtem Puffer wurde gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der 9-HPL mit 9S-Hydroperoxylinolsäure durch die Abwesenheit von O₂ nicht geringer wird. Dies wurde mit dem spektrophotometrischen Test gezeigt (Geschwindigkeit des Verschwindens der UV-Extinktion bei 235 nm).
Die Reaktion von [U-¹⁴C]9S-Hydroperoxylinolsäure (40 μg) mit 9-HPL aus dem rohen Bakterienlysat erfolgte in O₂-verarmtem Puffer in der 2 ml-Zelle der Sauerstoffelektrode. Nach 1 Minute, nach der zu erwarten war, dass die Umsetzung nahezu vollständig war, wurden 50 μl einer frisch hergestellten Lösung von 10 mg/ml NaBH₄ eingespritzt, und man ließ die Reduktionsreaktion noch 5 Minuten weiterlaufen. Diese Vorgehensweise reduzierte (und stabilisierte dadurch) die Aldehyde zu den entsprechenden Alkoholen (9-Hydroxynonansäure und 3Z-Nonenol).
Die 2 ml-Lösung wurde anschließend mit einer C18-Extraktionskartusche (Bond-Elut, von Varian) extrahiert und die Produkte wurden durch Elution mit Diethylether erhalten. 50 μg unmarkiertes authentisches 3Z-Nonenol und 50 μg 2E-Nonenol (erhalten von Aldrich) wurden zu einem Aliquot der Probe gegeben und dann wurde die Probe mit HPLC analysiert.
Ein Chromatogramm zeigte die radiomarkierten Produkte und ein anderes Chromatogramm stellte das UV-Profil bei 205 nm dar. Die beiden Hauptpeaks im UV-Chromatogramm entsprachen den beiden Standards und bewiesen so die genauen Retentionszeiten von 3Z-Nonenol und 2E-Nonenol. Die späteren Peaks im UV-Chromatogramm entsprechen dem Reduktionsprodukt von unverbrauchtem Substrat (9-Hydroxylinolsäure) und seinem 10trans-12trans-Isomer, mit dem das ursprüngliche Substrat geringfügig verunreinigt gewesen sein könnte.
Das ¹⁴C-Chromatogramm zeigte einen früh eluierenden Peak bei 3 Minuten, der als 9-Hydroxynonsäure identifiziert wurde, das NaBH₄-Reduktionsprodukt des primären Enzymprodukts, 9-Oxononansäure. Der zweite radiomarkierte Hauptpeak, der bei 8,8 Minuten eluierte, entsprach 3Z-Nonenol, dem NaBH₄-Reduktionsprodukt von 3Z-Nonenal. 2E-Nonenol wurde bei dem NaBH₄-Trapping-Experiment nicht nachgewiesen. Dies ließ vermuten, dass der entsprechende Aldehyd, 2E-Nonenal, kein primäres Enzymprodukt war, sondern vielmehr durch nicht-enzymatische Isomerisierung gebildet wurde. Bei dem NaBH₄-Trapping-Experiment war seine Bildung wegen der sofortigen Umwandlung des 3Z-Nonenals in den stabileren Alkohol geringer.
Die Ergebnisse des Trapping-Experiments zeigen an, dass die Aktivität der 9-HPL in dem rohen Bakterienlysat auf die Umwandlung von 9S-Hydroperoxylinolsäure in die beiden primären Aldehyde, 9-Oxononansäure und 3Z-Nonenal, beschränkt war. Die anderen bei den Reaktionen der 9-HPL in dem rohen Bakterienlysat erhaltenen Aldehyde wurden durch anschließende Reaktionen der Primärprodukte mit molekularem Sauerstoff oder durch Isomerisierung zu 2E-Nonenal gebildet.
Beispiel 9. Identifizierung von 4-Hydroperoxy-2E-nonenal (4-HPNE) und 4-Hydroxy-2E-nonenal (4-HNE)
4-HPNE wurde aus den in Beispiel 7 beschriebenen Inkubationsansätzen durch Reversed-Phase-HPLC isoliert and durch ¹H-NMR-Spektroskopie charakterisiert (9,58 ppm, d, J = 7,8, H1; 6,9 ppm, dd, J = 15,9, 6,2, H3; 6,25, ddd, J = 15,9, 7,8 1,2, H2; 4,6 ppm, q (mit gewisser Feinstruktur), J >> 6,95, H4). Die Bildung von 4-Hydroxy-2E-nonenal (4-HNE) wurde ebenfalls bei den Reaktionen im Bakterienlysat beobachtet, wo es durch unspezifische Reduktion von 4-HPNE gebildet wurde (siehe Beispiel 7). Das mit den Enzyminkubationen erhaltene 4-HNE war in seinem UV-Spektrum und den HPLC-Retentionszeiten identisch mit einer authentischen 4-HNE-Probe, die von Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI) erhalten wurde.
Zur massenspektrometrischen Charakterisierung von 4-HPNE wurde ein Aliquot mit Triphenylphosphin zum entsprechenden Alkohol, 4-HNE, reduziert und erneut durch HPLC gereinigt. Das 4-HNE wurde direkt und nach Behandlung mit BSTFA zum Trimethylsilyletherderivat mit dem zuvor beschriebenen GC-MS-System analysiert. Die für das nichtderivatisierte 4-HNE erhaltenen Fragmentionen stimmen mit der Literatur überein (Gardner et al., 1992). Im Einzelnen wurden die folgenden Fragmentionen beobachtet: m/z 138 (M+-H₂O),127 (M+-CHO), 109 (M+-CHO-H₂O), 99, 86 und 85. Das Trimethylsilyletherderivat zeigte diagnostische Ionen bei m/z 199 (M+-CHO), 157 (CHO-C₂H₂-CH-OSi(CH₃)3+) und 129 (CHO-C₂H₂-CH-OSi(CH₃)3+-CO).
Zitierte Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Fettsäurehydroperoxid-Lyase mit Aktivität für 9-Hydroperoxid-Substrate und 13-Hydroperoxid-Substrate, wobei die Lyase die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst.
Lyase nach Anspruch 1, die von einer Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 8 hybridisiert, und die bei den stringenten Bedingungen nicht mit einer Nukleinsäure hybridisiert, die eine Lyase in Cucumis sativus codiert.
Lyase nach Anspruch 1, wobei die Lyase eine Aminosäuresequenz aufweist, die in einem aus Cucumis melo isolierten Protein vorkommt.
Lyase nach Anspruch 1, welche die für Cucumis melo spezifischen und in 1 dargestellten Aminosäuren umfasst, die für die Aktivität verantwortlich sind, 9-Hydroperoxid-Substrate mit höherer Aktivität zu spalten als 13-Hydroperoxid-Substrate.
Isolierte Nukleinsäure, die die Lyase nach Anspruch 1 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, umfassend die in SEQ ID NO: 8 dargestellte Nukleinsäuresequenz.
Fettsäurehydroperoxid-Lyase nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6.
Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 5.
Zelle, die eine exogene Nukleinsäure enthält, die die Nukleinsäure nach Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zur Spaltung einer (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure in einen C₉-Aldehyd und eine C9-Oxononansäure, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Lyase nach Anspruch 1 mit der (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure.
Verfahren zur Spaltung einer (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure in einen C6-Aldehyd und eine C₁₂-Oxocarbonsäure, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Lyase nach Anspruch 1 mit der (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure.
Verfahren zur Herstellung von 3-(Z)-Nonenal, (3Z,6Z)-Nonadienal, 2-(E)-Nonenal, (2E,6Z)-Nonadienal oder ihren entsprechenden Alkoholen aus (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure, umfassend (a) In-Kontakt-Bringen der (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure oder (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure mit dem Protein nach Anspruch 1, wodurch die (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12-diensäure in 3-(Z)-Nonenal oder die (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydroperoxyoctadeca-10,12,15-triensäure in (3Z,6Z)-Nonadienal umgewandelt wird; und (b) Gewinnung des 3-(Z)-Nonenals oder (3Z,6Z)-Nonadienals; (c) Reduzieren des 3-(Z)-Nonenals zu 3-(Z)-Nonenol oder des (3Z,6Z)-Nonadienals zu (3Z,6Z)-Nonadienol und Gewinnung des 3-(Z)-Nonenols oder (3Z,6Z)-Nonadienols; oder (d) Isomerisieren des 3-(Z)-Nonenals oder (3Z,6Z)-Nonadienals unter Bedingungen von Temperatur und pH, die geeignet sind, 2-(E)-Nonenal oder (2E,6Z)-Nonadienal zu erhalten, und entweder Gewinnung des gebildeten 2-(E)-Nonenals oder (2E,6Z)-Nonadienals oder Reduzieren des 2-(E)-Nonenals zu 2-(E)-Nonenol oder des (2E,6Z)-Nonadienals zu (2E,6Z)-Nonadienol und Gewinnung des 2-(E)-Nonenols oder (2E,6Z)-Nonadienols aus dem Medium.
Verfahren zur Herstellung von n-Hexanal, 3-(Z)-Hexen-1-al, 2-(E)-Hexen-1-al oder ihren entsprechenden Alkoholen aus (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure, umfassend (a) In-Kontakt-Bringen der (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure oder (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure mit der Lyase nach Anspruch 1, wodurch die (9Z,11E,13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-diensäure in n-Hexanal oder die (9Z,11E,13S,15Z)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11,15-triensäure in 3-(Z)-Hexen-1-al umgewandelt wird; und entweder (b) Gewinnung des n-Hexanals oder 3-(Z)-Hexen-1-als; (c) Reduzieren des n-Hexanals zu n-Hexanol oder des 3-(Z)-Hexen-1-als zu 3-(Z)-Hexen-1-ol und Gewinnung des Hexanols oder 3-(Z)-Hexen-1-ols; oder (d) Isomerisieren des 3-(Z)-Hexen-1-als unter Bedingungen von Temperatur und pH, die geeignet sind, 2-(E)-Hexen-1-al zu erhalten, und entweder Gewinnung des gebildeten 2-(E)-Hexen-1-als oder Reduzieren des 2-(E)-Hexen-1-als zu 2-(E)-Hexen-1-ol und Gewinnung des 2-(E)-Hexen-1-ols aus dem Medium.