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Biokatalytische Verfahren haben für die chemische Industrie eine hohe Bedeutung erlangt. Die Durchführung chemischer Reaktionen unter Zuhilfenahme biologischer Katalysatoren ist dabei vor allem in solchen Anwendungsgebieten von Interesse, in denen die oft vorhandene Eigenschaft von Enzymen, bei chemischen Reaktionen mit chiralen oder prochiralen Komponenten eines der bei- den Enantiomeren bevorzugt umzusetzen oder zu bilden, genutzt werden kann.
Wesentliche Voraussetzungen für die Nutzung dieser günstigen Eigenschaften von Enzymen sind ihre Verfügbarkeit in technisch benötigten Mengen und eine ausreichend hohe Reaktivität, sowie Stabilität unter den realen Bedingungen eines technischen Verfahrens.
Eine besonders interessante Klasse von chiralen chemischen Verbindungen sind Cyanhydrine.
Cyanhydrine sind beispielsweise bei der Synthese von a-Hydroxysäuren, a-Hydroxyketonen, #-Aminoalkoholen, die zur Gewinnung biologisch wirksamer Stoffe, z. B. pharmazeutischer Wirk- stoffe, Vitamine oder pyrethroider Verbindungen Verwendung finden, von Bedeutung.
Die Herstellung dieser Cyanhydrine erfolgt durch Addition von Blausäure an die Carbonylgrup- pe eines Ketons oder Aldehyds.
Die technische Herstellung von chiralen Verbindungen, wie etwa (S)-Cyanhydrinen, konnte durch die Erschliessung des Enzyms (S)-Hydroxynitril Lyase aus Hevea brasiliensis realisiert wer- den und ist beispielsweise in WO 97/03204, EP 0 951561 und EP 0 927 766 beschrieben.
Es gibt jedoch eine Vielfalt an interessanten chemischen Verbindungen, bei welchen die R-Enantiomeren für technische Anwendungen von Bedeutung sind. Bisher wurden lediglich Ver- fahren zur Herstellung einer Reihe von Produkten beschrieben, die nur im Labormassstab einge- setzt werden können (z. B.: EP 0 276 375, EP 0 326 063, EP 0 547 655). Dabei wurden vorwiegend Enzympräparationen eingesetzt, die aus Pflanzen der Familie Rosaceae, beispielsweise aus den Kernen von Mandeln (Prunus amygdalus) gewonnen wurden.
In letzter Zeit gewannen Prunus spezies immer mehr an Bedeutung, sodass versucht wurde, diese genauer zu erforschen.
Aus der Fachliteratur, beispielsweise aus Plant Physiology, April 1999, Vol 119, pp. 1535-1546, ist bekannt, dass in Prunus spezies mehrere R-Hnl Isoenzyme vorkommen können. Diese Isoen- zyme sind in verschiedenen Geweben der Pflanze unterschiedlich stark exprimiert. Bei der zu Prunus amygdalus nahe verwandten Pflanze Prunus serotina konnten bislang 5 verschiedene Isoenzyme identifiziert und deren Gene sequenziert werden. Von Prunus amygdalus ist bislang nur ein Isoenzym in Planta (1998) 206 : beschrieben worden, nämlich eines das in der Blüten- knospe am stärksten exprimiert ist. Ein Gen für dieses R-Hnl Isoenzyme wurde bereits isoliert und die cDNA sequenziert.
Es ist jedoch noch kein Bericht einer erfolgreichen (funktionellen) heterologen Expression eines solchen Gens in der Fachliteratur oder Patentliteratur beschrieben.
Auch technische Anwendungen im grösseren Massstab sind bislang nicht realisiert worden. Die wesentliche Ursache dafür ist, dass Enzympräparationen aus Mandelkernen mit Hydroxynitrillyase- Aktivität bisher nicht in ausreichenden Mengen und zu vertretbaren Kosten verfügbar waren.
Ziel dieser Erfindung war es daher eine Basis zu schaffen, die eine R-Hydroxynitrillyase in für technische Anwendungen benötigten Mengen bereitstellen kann.
Zur Erreichung dieses Zieles wurde ein Weg gesucht, ein der R-Hnl Präparation von Prunus amygdalus entsprechendes Enzym durch gentechnische Strategien mit Hilfe eines entsprechenden rekombinanten Mikroorganismenstammes zu produzieren. Ein solches rekombinates Enzym mit R-Hnl Aktivität sollte auf diese Art in ausreichender Menge technisch verfügbar gemacht werden.
Aus den in obiger Literatur beschriebenen DNA Sequenzen kann abgeleitet werden, dass bei den Genen der verschiedenen Isoenzyme bestimmte Bereiche hoch konserviert sind. Das wird erfindungsgemäss als Grundlage herangezogen, Primer für die PCR-Amplifikation von P. amygda- lus R-Hnl Genen bzw. DNA-Sequenzen zu generieren. Mit Hilfe solcher Primer können dann mit aus Mandelkernen (P. amygdalus) isolierter DNA als Template (Vorlage) mittels PCR DNA-Stücke amplifiziert werden, die bei Analyse durch Agarose-Gelelektrophorese konkrete spezifische Ban- den zeigen. Erfindungsgemäss waren dabei Banden zu finden, die der Grösse von mdl Genen (Planta (1998) 206 : entsprachen. Anschliessend werden entsprechende Primer für alle bei Prunus serotina bekannten Isoenzyme generiert und entsprechende PCR Produkte gewonnen.
DNA aus diesem Bereich wird aus entsprechenden präparativen Agarosegelen isoliert und in Stan- dardvektoren für die Klonierung von PCR-generierten Fragmenten in Escherichia coli einkloniert.
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Die Sequenzanalyse von einer Serie ausgewählter Klone ergab, dass Klone mit Homologien zu den jeweiligen bereits bekannten R-Hnl Genen von Prunusarten vorhanden sind, obwohl sich die Sequenzen der so erhaltenen Klone bzw. Gene in mehreren Sequenzpositionen von den bereits bekannten bzw. publizierten Sequenzen unterscheiden, wodurch wichtige funktionelle Unterschie- de festgelegt werden.
Es wurde daher unerwarteterweise eine neue Variante der Hnl Gene gefunden, obwohl Primer- kombinationen verwendet wurden, bei der die bereits bekannte Sequenz einer aus Blütenmaterial von Prunus amygdalus gewonnenen cDNA herangezogen wurde.
Die neuen Gene wurden sequenziert und die genomische DNA-Sequenz ermittelt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von DNA- Sequenzen, codierend für Hydroxynitrillyase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Primerkombination aus einem Primer 1 basierend auf der DNA-Sequenz des 5'-Bereichs der mdl Gene von Prunus serotina und Prunus amygdalus und einem Primer 2 basierend auf dem 3'-Bereich der DNA-Sequenzen eines der Hydroxynitrillyase Isoenzyme aus Prunus serotina oder Prunus amygdalus zur Amplifikation mit einer DNA Polymerase unter Verwendung von DNA aus Organismen die für Hydroxynitrillyasen kodierende Gene enthalten als Vorlage verwendet wird und anschliessend kloniert wird, sowie die durch dieses Verfahren hergestellten DNA-Sequenzen.
So können beispielsweise genspezifische PCR Primer basierend auf der Sequenzhomologie des md15 Gens von Prunus serotina und des MDL1 Gens von Prunus amygdalus hergestellt wer- den, worauf nach Amplifikation und Klonierung ein neues Gen, das hn15 Gen, erhalten wird.
Beispielsweise weist das durch PCR-Amplifikation gewonnene hn15 Gen aus Prunus amygda- lus die in Figur 1 abgebildete Nukleotidsequenz auf, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist.
Gegenstand der Erfindung sind auch hn15 Gene, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zumin- dest zu 80%, bevorzugt zu 85%, identisch ist mit der in Fig. 1 abgebildeten Sequenz.
Das neue hn15 Gen unterscheidet sich von der publizierten Sequenz des MDL1 Gens von Pru- nus amygdalus in 7 Basenpaaren.
In Analogie können erfindungsgemäss weitere genspezifische PCR Primer, beispielsweise ba-
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und des MDL1 Gens von Prunus amygdalus hergestellt werden, worauf nach Amplifikation und Klonierung weitere neue Gene bzw. DNA-Sequenzen, wie etwa hnl1-4, erhalten werden, die alle Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
Die genomischen Klone bzw. deren genomische DNA stellen die Basis für die Gewinnung von Enzympräparationen durch heterologe Expression, beispielsweise durch induzierbare oder konsti- tutive Expression, in verschiedenen Wirtszellen dar.
Weiters ist aus der Sequenzanalyse der genomischen DNA der neuen, erfindungsgemässen Gene bzw. DNA-Sequenzen ersichtlich, dass es sich bei dem von den neuen Genen bzw. DNA- Sequenzen kodierten Proteinen um Proteine handelt, die über eine Signalsequenz bzw. ein pflanz- liches Signalpeptid verfügen, wodurch auch eine sekretorische Expression von heterologen Protei- nen in geeigneten Wirtszellen ermöglicht wird.
Dabei werden spezielle Expressionsvektoren verwendet, mit denen das von einem der einklo- nierten neuen Gene bzw. DNA-Sequenzen codierte Protein als Fusionsprotein mit einem Signal- peptid exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach weiters rekombinante Proteine, herstellbar durch
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Herstellung derselben.
Geeignete Wirtszellen sind dabei beispielsweise Mikroorganismen. Bevorzugt sind eukaryoti- sche Mikroorganismen, besonders bevorzugt Pilze. Beispiele dafür sind Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris.
Beispielsweise ist die aus der Nukleotidsequenz des hn15 Gens abgeleitete Aminosäure- sequenz der Hydroxynitrillyase hn15 aus Prunus amygdalus in Figur 3 dargestellt.
Die Erfindung betrifft ausserdem die Verwendung einer DNA-Sequenz, die für das pflanzliche Signalpeptid von Rosacea spezies codiert, zur sekretorischen Expression von heterologen Protei- nen in Wirtszellen und die derart gewonnenen Proteine.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind demnach Fusionsproteine bzw. heterologe Protei-
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ne, die durch Verwendung einer DNA-Sequenz, die für das pflanzliche Signalpeptid von Rosacea spezies codiert, und durch sekretorische Expression derselben in geeigneten Wirtszellen herstell- bar sind bzw. ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Geeignete Wirtszellen sind dabei wiederum beispielsweise Mikroorganismen. Bevorzugt sind Bakterien oder eukaryotische Mikroorganismen, besonders bevorzugt Pilze, wie etwa Saccharo- myces cerevisiae oder Pichia pastoris.
Beispielsweise ist die Nukleinsäuresequenz des für ein sekretorisches Hybridprotein (PamHNL5xGOX) mit Hnl-Aktivität codierenden DNA Fragments, bestehend aus Sequenzen des hn15 Gens von P. amygdalus und dem Glukoseoxidase-Gen von Aspergillus niger in Figur 4 abge- bildet. Die aus der Nukleotidsequenz (Figur 4) abgeleitete Aminosäuresequenz des Hybridproteins PamHNL5xGOX ist in Figur 5 dargestellt.
Figur 6 zeigt den Vergleich der Aminosäuresequenzen de Hnl5 Proteins aus Prunus amygda- lus und des Hybridproteins PamHNL5xGOX.
Um zu den erfindungsgemässen rekombinanten Proteinen zu gelangen, werden beispielsweise die Klone, die Homologien zu den bekannten Genen für mdl1, mdl2, mdl3, mdl4 und mdl5 von P.serotina und MDL1 von P. amygdalus zeigen, weiter bearbeitet.
Um rekombinante Proteine mit Hydroxynitrillyase Aktivität zu erhalten werden die entsprechen- den Gene z. B. das hn15 Gen, z. B. in einen Expressionsvektor für Pichia pastoris oder für Saccha- romyces cerevisiae eingebaut.
Zuvor kann die genomische DNA mittels PCR gespleisst werden. Bevorzugt wird ein Basis- fragment zur Konstruktion von Expressionsplasmiden für die heterologe Expression des entspre- chenden Gens in Bakterien und Eukaryonten hergestellt. Dazu wird ein Plasmid konstruiert, aus dem ein für ein erfindungsgemässes Gen kodierendes DNA Fragment für den Einbau in verschie- dene Expressionsvektoren durch Ausschneiden mit Restriktionsendonukleasen gewonnen werden kann.
Mit den erfindungsgemässen Genen kann somit durch Expression, beispielsweise mit einem induzierbaren Promotersystem oder einem konstitutiv exprimierenden Promotorsystem, in einem heterologen Wirt eine funktionelle Hnl produziert werden.
Aus einer grossen Anzahl von Transformanten können somit rekombinante Stämme von bei- spielsweise Pichia pastoris gefunden werden, die rekombinantes Protein mit R-Hnl Aktivität über- exprimieren. Das Protein mit R-Hnl Aktivität ist bei diesen Stämmen nach Induktion der Expression zum überwiegenden Teil im Kulturüberstand zu finden.
Somit konnte erstmals ein rekombinantes Protein in für technische Anwendungen nutzbaren Mengen hergestellt werden, das eine zu in Mandelkernen (Kerne von Prunus amygdalus) aufzufin- dende vergleichbare R-Hnl Aktivität aufweist.
Unerwarteterweise konnte festgestellt werden, dass die rekombinanten Proteine mit R-Hnl Aktivität, die sich beispielsweise von den erfindungsgemässen hnl1-5 Genen ableiten und mit Pam-Hnl1-5 bezeichnet werden, im Vergleich zum aus Mandelkernen isolierten Enzympräparat wesentlich bessere Eigenschaften als Biokatalysator in Reaktionsansätzen zur Herstellung von Cyanhydrinen aufweisen und somit besonders vorteilhaft für die biokatalytische Synthese von Cyanhydrinen verwendet werden können.
Die Sequenzen der erfindungsgemässen rekombinanten Proteine können weiters auch noch am C-terminalen Ende verkürzt werden, bzw. können die Sequenzen im N- und C-terminalen Bereich durch solche eines verwandten Proteins mit anderen Funktionen ausgetauscht werden.
Die rekombinanten Proteine zeichnen sich insbesondere auch dadurch aus, dass sie eine wirtsspezifische Glykosilierung aufweisen, wodurch die rekombinanten Proteine wesentlich stabiler sind als die nativen Proteine.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemässen rekombinanten Proteine ergibt sich durch die wesentlich höhere Stabilität, durch die wesentlich weniger Enzymmenge im Vergleich zu nativem Enzym benötigt wird um hohe Enantiomerenreinheit zu erzeilen. So zeigten Vergleichsversuche, dass bei Verwendung der erfindungsgemässen rekombinanten Proteine lediglich ein Zehntel der benötigten Menge an nativem Protein benötigt wird, um vergleichbare Enantiomerenreinheiten (ee-Werte) zu erzielen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach die Verwendung der erfindungsgemässen rekombinanten Proteine (HNLs) zur Herstellung von (R)-Cyanhydrinen.
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Als Ausgangsmaterialien zur Herstellung der (R)-Cyanhydrinen werden ein Aldehyd oder ein Keton als Substrat, ein Cyanidgruppendonor und ein erfindungsgemässes rekombinantes Protein eingesetzt.
Unter Aldehyden sind dabei aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Aldehyde zu verstehen. Unter aliphatischen Aldehyden sind dabei gesättigte oder ungesättigte, aliphatische, geradkettige, verzweigte oder cyclische Aldehyde zu verstehen. Bevorzugte aliphatische Aldehyde sind geradkettige Aldehyde mit insbesondere 2 bis 30 C-Atomen, bevorzugt von 2 bis 18 C-Atomen, die gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sind. Der Aldehyd kann dabei sowohl C-C-Doppelbindungen als auch C-C-Dreifachbindungen aufweisen. Die aliphatischen, aromati- schen oder heteroaromatischen Aldehyde können weiters unsubstituiert oder durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen, wie Phenyl-, Phenoxy- oder Indolylgruppen, durch Halogen-, Hydroxy-,
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oder Azidogruppen substituiert sein.
Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Aldehyde sind Benzaldezyd bzw. verschie- den substituierte Benzaldehyde wie etwa 3,4-Difluorbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd, 4-Fluor- 3-phenoxybenzaldehyd, Hydroxybenzaldehyd, Methoxybenzaldehyd, weiters Furfural, Methylfurfu- ral, Anthracen-9-carbaldehyd, Furan-3-carbaldehyd, Indol-3-carbaldehyd, Naphthalin-1-carbalde- hyd, Phthaldialdehyd, Pyrazol-3-carbaldehyd, Pyrrol-2-carbaldehyd, Thiophen-2-carbaldehyd, Isophthalaldehyd oder Pyridinaldehyde, Thienylaldehyde u. s.w..
Ketone sind aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Ketone, bei denen das Carbo- nylkohlenstoffatom ungleich substituiert ist. Unter aliphatischen Ketonen sind gesättigte oder ungesättigte, geradkettige, verzweigte oder cyclische Ketone zu verstehen. Die Ketone können gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein. Sie können unsubstituiert, oder durch unter Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen wie Phenyl- oder Inolylgruppen, durch Halogen-, Ether-, Alkohol-, Carbon- säureester-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein.
Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Ketone sind Acetophenon, Indolylaceton u.s.w..
Aldehyde und Ketone, die sich erfindungsgemäss eignen, sind bekannt oder wie üblich herstell- bar.
Die Substrate werden in Anwesenheit der erfindungsgemässen HNLs mit einem Cyanidgrup- pendonor umgesetzt.
Als Cyanidgruppendonor kommen Blausäure, Alkali-Cyanide oder ein Cyanhydrin der allge- meinen Formel @ R1R2C(OH)(CN), in Betracht. In der Formel 1 bedeuten R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe, oder R1 und R2 gemeinsam eine Alkylengruppe mit 4 oder 5 C-Atomen, wobei R1 und R2 nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten. Die Kohlenwasser- stoffgruppen sind aliphatische oder aromatische, bevorzugt aliphatische Gruppen. Bevorzugt bedeuten R, und R2 Alkylgruppen mit 1 - 6 C-Atomen, ganz bevorzugt ist der Cyanidgruppendonor Acetoncyanhydrin.
Die Herstellung des Cyanidgruppendonors kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Cyan- hydrine, insbesonders Acetoncyanhydrin, sind auch käuflich zu erwerben.
Bevorzugt wird Blausäure (HCN), KCN, NaCN, oder Acetoncyanhydrin, besonders bevorzugt Blausäure als Cyanidgruppendonor eingesetzt.
Die Blausäure kann dabei auch erst kurz vor der Reaktion aus einem ihrer Salze wie etwa NaCN oder KCN freigesetzt und in Substanz oder in gelöster Form dem Reaktionsgemisch zuge- geben werden.
Die Umsetzung kann im organischen, wässrigen oder 2-Phasensystem oder in Emulsion durchgeführt werden.
Als wässriges System wird eine wässrige, die erfindungsgemässe HNL enthaltende Lösung oder Pufferlösung verwendet. Beispiele dafür sind Na-Citratpuffer, Phosphatpuffer u.s.w.
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Als organisches Verdünnungsmittel können mit Wasser nicht oder geringfügig mischbare aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, die gegebenenfalls halogeniert sind, Alkohole, Ether oder Ester oder Gemische davon verwendet werden. Bevorzugt werden Methyl -tert.Butylether (MTBE), Diisopropylether, Dibutylether und Ethylacetat oder deren Gemisch einge- setzt.
Die erfindungsgemässen HNLs können dabei entweder als solche oder immobilisiert in dem or- ganischen Verdünnungsmittel vorliegen, die Umsetzung kann jedoch auch in einem Zweiphasen- system oder in Emulsion mit nicht-immobilisierter HNL erfolgen.
Beispiel 1:
Isolierung von genomischer DNA aus Mandelkernen (Kerne von Prunus amygdalus)
Getrocknete Mandelkerne (Farmgold, Chargennummer L4532, Ernte 1999) wurden mit einem Messer fein gehackt und in einer Reibschale mit flüssigem Stickstoff eingefroren und unter flüssi- gem Stickstoff mit einem Pistill zu einem feinen Pulver aufgerieben. 0,1 Gramm gefrorenes Man- delkernpulver wurden direkt mit 65 C warmem #Breaking Puffer" (100 mM NaAc ; mM EDTA; 500 mM NaCI, eingestellt auf pH 5,5 ; 1,4%SDS und 20 g / ml RNAse A) versetzt. Nach 15 minüti- ger Inkubation unter ständigem Schütteln wurden die unlöslichen Zellrückstände durch Zentrifuga- tion (10 min. bei 7000 g) abgetrennt und der Überstand mit einem gleichen Volumen 10M Ammo- niumacetat versetzt und anschliessend 10 min auf Eis inkubiert.
Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 10.000g wurde der Überstand 2 x mit Phenol/Chloroform (1/1, Phenol äquilibriert mit 50 mM Tris, pH 8. 0) extrahiert. Nach einer weiteren Extraktion mit doppeltem Volumen Chloroform/Iso- amylalkohol (24/1 ) wurde die DNA aus dem Überstand mit einem gleichen Volumen Isopropanol gefällt, abzentrifugiert, das DNA Pellet mit 70% Äthanol gewaschen und luftgetrocknet. Die DNA wurde dann für 20 min bei 68 C in 200 l Wasser gelöst und durch eine Ethanolfällung (Ausubel et al., 1999) gereinigt. Nach der Zentrifugation wurde das DNA Pellet luftgetrocknet und in 50 l Wasser gelöst.
Beispiel 2 :
Amplifikation und Klonierung eines genomischen DNA Abschnittes von Mandel (Prunus amyg- dalus) DNS mit Homologie zu bekannten mdl Genen von Rosaceae.
Da bekannt war, dass in Prunus spezies mehrere Isoenzyme von Hydroxyntrillylasen mit hoher Sequenzhomologie zueinander auftreten können (Hu und Poulton, 1999), wurden genspezifische PCR Primer basierend auf der Sequenzhomologie des mdl5 Gens von Prunus serotina und des MDL1 Gens von Prunus amygdalus (Suelves et al., 1998) hergestellt:
Primer 1: 5'- CGGAATTCACAATATGGAGAAATCAACAATGTCAG-3'
Primer 2:
5'- CGGAATTCTTCACATGGACTCTTGAATATTATG-3'
Die Amplifikation erfolgte in einem 50 l Ansatz mit 1,2 U #Hotstar" Taq DNA Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland), mit 50 ng genomischer Mandel-DNA als "Template", je 200 ng
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des #Hotstar Kit" (Qiagen, Hilden, Deutschland), beginnend mit einem 15 minütigen Denaturie- rungsschritt bei 95 C, gefolgt von 30 Zyklen (1 min 95 C, 30 sec64 C. 1 min 72 C) zur Amplifikati- on und einer abschliessenden Inkubation für 5 min bei 72 C zur Herstellung vollständiger Produkte.
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Analyse mittels Agrose-Gelelektrophorese) erhalten.
Dieses PCR Produkt wurde mittels #Qiaquick Kit" (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend dem beigefügten Manual gereinigt und unter Verwendung des "Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" Kits (Applied Biosystems Inc., Forster City, CA, USA) nach der Strategie des #Primer walking" ausgehend von den beiden zur PCR eingesetzten Primern sequenziert. Die erhaltene DNA Sequenz des insgesamt 2162 Basenpaare langen PCR Fragments ist in Figur 1 dargestellt.
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Ca. 0,5 g des gereinigten PCR Produktes wurden mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und in den Piasmidvektor pBSSK(-) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) über die EcoRI Schnittstelle einkloniert. Das Insert eines resultierenden rekombinanten Moleküls (das entsprechende Plasmid wurde mit pBSPamHNL5g bezeichnet) wurde nach der oben beschriebenen Methode sequenziert und die Sequenz des klonierten Fragmentes war zu 100 % ident mit der Sequenz des oben beschriebenen mit den beiden Primern (1 & 2) erhaltenen PCR Produktes.
Beispiel 3 :
Sequenzanalyse des durch PCR Amplifikation mit den Primern 1 und 2 erhaltenen genomischen Prunus amygdalus DNA Fragmentes.
Im Bereich des durch PCR amplifizierten und sequenzierten DNA Abschnitts wurde ein offener Leserahmen gefunden, der durch 3 Introns unterbrochen ist. Diese drei Introns wurden mit mit Hilfe der Intron Consensus Sequenz "GT.....AG" identifiziert.
Der Leserahmen beginnt mit einem ATG Codon bei Position +13 und endet mit einem Stop Codon bei Position +2151.
Für den kodierenden Bereich wurden die Fragmente von Position 13 bis 115 (Exon I), Position 258 bis 917 (Exon 11), 1121 bis 1961 (Exon IM) und 2078 bis 2150 (Exon IV) zusammengefügt. Die zusammengefügte DNA Sequenz kodiert für ein Protein mit 559 Aminosäuren und einem berechneten Molekulargewicht von 61 kDa, bzw. 57,9 kDa für eine N-terminal prozessierte Form. Die Peptidmassen wurden mit Hilfe des Programmpakets GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) berechnet. Für dieses Protein wurde die Bezeichnung PamHnl5 festgelegt.
Die für den offenen Leserahmen (ohne Introns) abgeleitete Proteinsequenz ist in Figur 3 gezeigt. Es konnten ausgeprägte Homologien zu bekannten Hydroxynitrillyasen von Rosaceae festgestellt werden ("Blast" Programm, GCG Paket, Version 10. 1, Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) wobei die höchsten Homologien zu den publizierten Sequenzen von Mdl1 aus Prunus amygdalus (99 prozentige Identität, Suelves et al. 1998) und von Mdl5 aus Prunus serotina (94 prozentige Identität, Hu und Poulton, 1999) bestehen. Mit Hilfe dieser Homologie wurde auch eine spaltbare Signalsequenz mit Spaltung zwischen S27 und L28 identifiziert. Eine solche Spaltstelle konnte bei den beiden Isoenzymen Mdl1 und Mdl4 von Prunus serotina durch N-terminale Sequenzierung der aus Pflanzenmaterial gereinigten nativen Proteine nachgewiesen werden (Zihua Hu und Jonathan E.
Poulton, Plant Physiology, 119,1535 - 1546,1999). Die Sequenzen von verschiedenen in Rosacea species vorhandenen HNL Isoenzymen sind nur von Prunus serotina bekannt. Aufgrund der höchsten Homologien zur Sequenz von Mdl5 aus Prunus serotina wurde das neue hnl Gen aus Prunus amygdalus als hnl5 festgelegt. Die Suche nach Sequenzmotiven in der PROSITE-Sequenzmotiv Datenbank (GCG Paket, Version 10. 1, Genetics Computer Group, Wisconsin, USA) ergab das Vorhandensein von 13 potentiellen N-Glykosilierungsstellen (in Figur 3 eingezeichnet).
Beispiel 4 :
Gewinnung eines intronfreien Prunus amygdalus hnl5 Gens durch PCR Splicing. Mittels einer speziellen PCR Strategie unter Verwendung von überlappenden Primern wurden die kodierenden Bereiche durch 4 aufeinanderfolgende PCR Reaktionen miteinander verbunden (entsprechend Figur 2).
In der ersten PCR Runde (PCR1-1 und PCR1-2) wurden die Exons 11 und 111 mit den Primerpaaren PamHNL5b/PamHNL5c (PCR1-1) bzw. PamHNL5d/PamHNL5e (PCR1-2) amplifiziert. Die 50 l PCR Ansätze in 1x PCR Puffer (Qiagen) enthielten : 100 pmol der entsprechenden Primer, 2,5 U "Hotstar" Taq DNA Polymerase (Qiagen), 5 l eines dNTP (je 2 mM) Mix, 10 ng des Plas- mids pBSPamHNL5g als Template. Es wurde folgendes Programm gefahren : min 95 C, 30 Zyklen 1 min 95 C, 30 sec. 68 C, 1 min 72 C und zum Abschluss 5 min 72 C zur Herstellung vollständiger Produkte). Die Produkte aus PCR1-1 und PCR1-2 wurden nach elektrophoretischer
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Trennung in einem Agarosegel mittels Qiaexll Kit aus dem Gel eluiert.
Durch Amplifikation von ca. 50 ng des Produktes aus PCR1-1 mit je 100 pmol der Primer PamHNL5a2 und PamHNL5c erfolgte in der zweiten PCR-Runde (PCR2) eine Verlängerung dieses ersten PCR Produktes. Es wurde folgendes Programm gefahren : min 95 C, 30 Zyklen 1 min 95 C, 30 sec. 68 C, 1 min 72 C und zum Abschluss 5 min 72 C zur Herstellung vollständiger Produkte). Die sonstigen Bedingungen waren gleich wie bei PCR1. Dieses PCR Produkt wurde nach elektrophoretischer Trennung ebenfalls über ein Agarosegel gereinigt und eluiert.
Durch primerlose PCR wurden in der dritten PCR-Runde (PCR3) die Produkte aus PCR1-2 und PCR2 mit Hilfe der überlappenden Enden miteinander verbunden 95 Zyklen mit 1 min bei 94 C, 30 sec bei 68 C und 1,5 min 72 C, je ca. 100 ng der beiden Produkte aus PCR1-1 und PCR2 in 50 l Ansätzen in 1x PCR Puffer (Qiagen), 5 l des dNTP (je 2 mM) Mix und 2,5 U nHotstar" Taq DNA Polymerase (Qiagen).
Die Ergänzung zur vollen Länge des kodierenden Prunus amygdalus hnl5 Gens und zur Ampli- fikation des vollständigen Produktes erfolgte in einer vierten PCR-Runde (PCR4) mit je 100 pmol der Primer PamHNL5a1 und PamHNL5f. Diese wurden direkt zum Reaktionsgemisch der PCR 3 zugegeben. Es wurde folgendes Programm gefahren : Zyklen mit 1 min 95 C, 30 sec. 63 C, 1,5 min 72 C und zum Abschluss 5 min 72 C). Die sonstigen Bedingungen waren gleich wie bei PCR1.
Das in der letzten PCR-Runde erhaltene Produkt wurde über ein präparatives Agarosegel auf-
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eluiert und über die EcoRI Schnittstelle in das Plasmid pBSSK (-) einkloniert. Ein Klon mit korrek- tem Restriktionsmuster wurde ausgewählt und sequenziert.
Die Sequenz im kodierenden Bereich war zu 100 % ident mit den Exons der genomischen DNA Sequenz. Dieser Klon wurde als pBSPamHNL5orf bezeichnet.
Oligonukleotid-Primer
PamHnl5a1
5'-
GAAGATCTGAATTCCATGGAGAAATCAACAATGTCAGTTATACTATTTGTGTTGC
ATCTTCTTG-3'
PamHnl5a2
5'-
CTATTTGTGTTGCATCTTCTTGTTCTTCATCTTCAGTATTCAGAGGTTCACTCGCT
TGCCAATACTTC-3'
PamHn15b
5'-
GTTCACTCGCTTGCCAATACTTCTGCTCATGATTTTAGCTACTTGAAGTTTGTGT
ACAACGCCACTG-3' PamHnl5c
5'-GATGTATTGGAAGAGAAGAGGATCTTCTCTACT-3'
PamHn15d
5'-
GATCCTCTTCTCTTCCAATACATCAAATTTGTCAGCTATTGGAGTCATATATACG G 3'
PamHn15e
5'-
CAACCGGATTGACCTTTCTTGCAGGATTTGAAGGCCCACATACCTTCCTAACATC
AGATAGAAGCC-3'
PamHn15f
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5'-
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GATTGACCTTTCTTGCAG-3'
Beispiel 5
Herstellen eines Basisfragments zur Konstruktion von Expressionsplasmiden für heterologe Expression des Prunus amygdalus hnl5 Gens in Bakterien und Eukaryonten.
Ziel dieses Experiments war die Konstruktion eines Plasmides, aus dem ein für Prunus amyg- dalus hnl5 kodierendes DNA Fragment für den Einbau in verschiedene Expressionsvektoren durch Ausschneiden mit Restriktionsendonukleasen gewonnen werden kann. Dabei wurden durch PCR Amplifikation über entsprechende Primer an den Enden des in pBSPamHNL5orf enthaltenen Prunus amygdalus hnl5 Gens geeignete Sequenzen addiert.
Mit den Primern PCRHNL5-a und PCRHNL5-e wurde das Insert des Plasmids pBSPamHNL5orf mittels PCR amplifiziert (10 ng DNA des Plasmids pBSPamHNL5orf als Templa- te, 400 ng Primer PCRHNL5-a, 200 ng Primer PCRHNL5-e). Die PCR Reaktion erfolgte in 50 l
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Taq DNA Polymerase (Qiagen). Es wurde folgendes Programm gefahren : min 95 C, 30 Zyklen 1 min 95 C, 30 sec. 68 C, 1,5 min 72 C und zum Abschluss 5 min 72 C zur Herstellung vollständiger Produkte.
Das erhaltene DNA Fragment wurde nach Schneiden mit der Restriktionsendonuklease EcoRI in den Vektor pBSSK(-) (Stratagene, USA) einkloniert und durch Sequenzierung verifiziert. Das resultierende Plasmid wurde pBSPamHNL5ex benannt. Oligonukleotid-Primer:
PCRHNL5-a
5'-
TCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTA
AGAAGGAGATATACATATGGAGAAATCAACAATGTCAGTTATACTATTTGTGTTG
CATC-3'
PCRHNL5-e
5'-
CGAATTCGCCCTTTCGCATGCTCACATGGACTCTTGAATATTATGAATAGCCTC-3'
Beispiel 6
Konstruktion von Expressionskonstrukten zur heterologen Expression des hnl5 Gens in Pichia pastoris.
DNA des Plasmids pBSPamHNL5ex wurde mit EcoRI geschnitten und das / /-Fragment vom
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mittels Qiaex 11 Kit (Qiagen) wurde dieses über die EcoRI Schnittstellen in die Plasmide pHILD2 und pGAPZ (Invitrogen, San Diego, CA, USA) einkloniert. Die richtige Orientierung der Inserts zu den Promotoren wurde mit Hilfe von Kontrollschnitten überprüft. Jeweils ein Klon mit einem korrekt orientierten Insert wurde ausgewählt und konserviert. Die korrekten Übergänge vom Vektoranteil
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nen Expressionsplasmide für Pichia pastoris wurden als pHILD-PamHNL5a (für induzierbare Expression) und pGAPPamHNL5a (für konstitutive Expression) bezeichnet.
Beispiel 7
Induzierbare Expression des Prunus amygdalus hnl5 Gens in Pichia pastoris
DNA des Plasmids pHILDPamHNL5a wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl geschnitten
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und in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) transformiert. Die Transformation erfolgte nach den Vorschriften des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen, San Diego, CA, USA). 100 Histidin-prototrophe Klone wurden nach den Vorschriften des #Pichia Expression Kit" in Flüssigme- dium (500 ml Schüttelkulturen) angezüchtet und 48 Stunden mit Methanol induziert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und mit Aufschlusspuffer (50 mM Tris-HCL, pH 7,6) zu einer optischen
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Protocolls in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1999) in einem "Merckenschlager" Homogenisator (Fa.
Braun, Melsungen, BRD) aufgeschlossen.
Sowohl die Kulturüberstände als auch die Zelllysate wurden auf Hnl-Enzym Aktivität mit einem Standard Aktivitätsassay (analog WO 97/03204) unter Verwendung von racemischem Mandelonitril als Substrat bestimmt. Zwei Klone, die bei diesen Schüttelkolbenexperimenten die besten Aktivitäten im Kulturüberstand zeigten (Pichia pastoris PamHNL5-a37 und Pichia pastoris PamHNL5-a4) wurden ausgewählt und konserviert. Eine Analyse des Methanolverwertungstyps ergab den Phänotyp Mut+ (gute Verwertung von Methanol) für Pichia pastoris PamHNL5-a37 und den Phänotyp Muts (langsame Verwertung von Methanol) für Pichia pastoris PamHNL5-a4.
Beispiel 8
Konstitutive Expression des Prunus amygdalus hn15 Gens in Pichia pastoris
Das Plasmid pGAPPamHNL5a wurde in P. pastoris GS115 transformiert. Die Transformation erfolgte nach den Vorschriften des Pichia Expression Kit der Invitrogen Corp (San Diego, CA, USA). Die Selektion von Transformanten erfolgte auf YPD Vollmediumplatten mit 100 mg/1 Zeocin.
100 Zeocin-resistente Klone wurden in je 500 ml YPD Vollmedium angezüchtet und 96 Stunden bei 30 C geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und die Hnl Aktivität im Kulturüberstand bestimmt. Ein Klon der die beste Aktivität im Kulturüberstand zeigte wurde konserviert und mit Pichia pastoris PamHNL5-a2 bezeichnet.
Beispiel 9
Produktion von Hnl mit einem mit dem hn15 Gen aus Prunus amygdalus transformierten Stamm von Pichia pastoris (durch Methanol indizierbares Expressionssystem) im Laborbioreaktor.
Die Züchtung von Pichia pastoris PamHNL5-a37 erfolgte in einem Standard-Laborbioreaktor (42 L Gesamtvolumen) in einem dreiphasigen Verfahren. Dieses bestand aus einer ersten exponentiellen und einer zweiten linearen Wachstumsphase zur Bildung von Biomasse und einer anschliessenden Expressionsphase zur Bildung des rekombinanten Prunus amygdalus Hnl Enzyms, wobei im Prinzip nach der für die Produktion von rekombinanter Hevea brasiliensis Hnl beschrie-
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H., Kohlwein, S.D., Schwab, H.: High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts. Protein Expression and Puriftcation 11, 61-71, 1997) vorgegangen wurde.
Im Detail wurden folgende Bedingungen eingehalten:
Die Chemikalien 1. -8., bemessen für 20 Liter wurden in 15 Liter Wasser gelöst im Bioreaktor vorgelegt und zusammen mit dem Reaktor bei 121 C für 1 Stunde sterilisiert. Nach Abkühlung auf 29 C wurde der pH Wert im Medium mit Ammoniak (Chemikalium 9, in steriler Zulaufflasche vorge- legt) auf pH 5,0 eingestellt. Danach wurden ca. 200 ml einer steril filtrierten Spurenelemente- Lösung (Chemikalien 10-18, entsprechende Mengen für 20 L) über eine Zulaufflasche in den Bioreaktor eingebracht.
Der so vorbereitete Bioreaktor wurde mit 2 Liter Vorkultur, die in Schüttelkolben bei 30 C nach den im Handbuch des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) angegebe- nen Bedingungen angezüchtet wurde, beimpft. Die Kultivierung wurde bei einer konstanten Tem- peratur von 29 C durchgeführt. Durch Regelung der Belüftung (zwischen 15 und max. 40 Lit Luft/min) und der Rührerdrehzahl (zwischen 250 bis 500 Upm) wurde der {)2-Partialdruck auf einem Wert von grösser als 30% der Sättigungskonzentration gehalten. Nach 21 Stunden war die
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Biomasse auf einen Wert im Bereich von 22 g/L Zelltrockengewicht (ZTG) angewachsen. Ab diesem Zeitpunkt wurde steriles Glycerin in konstanten kleinen Portionen in Abständen von 15 min zudosiert, wobei pro Stunde 130 g Glycerin zugesetzt wurden.
In dieser zweiten linearen Wachs- tumsphase konnte in einem Zeitraum von 42 Stunden eine Biomassekonzentration im Bereich von 70 g/L ZTG erreicht werden.
Danach wurde die dritte Phase mit der Induktion der Expression durch Zudosierung von Metha- nol eingeleitet. Dabei wurde der Methanolgehalt in der Kulturbrühe auf einen Wert von 0,8-1 Ge- wicht % eingestellt. Zu Induktionsbeginn und nach zwei Tagen Induktion wurde jeweils eine weitere Portion sterile Spurenelementelösung (Chemikalien 10-18, entsprechende Mengen für 20 L, gelöst in ca. 200 ml Wasser) zugegeben. Nach 110 Stunden Induktionsphase konnte eine Enzymmenge von 110 U/ml Kulturbrühe erhalten werden. Nach Abtrennen der Zellen durch beispielsweise Zentrifugation kann eine Rohenzympräparation erhalten werden, die direkt für biokatalytische Umsetzungen eingesetzt werden kann.
Folgende Chemikalien wurden zur Herstellung des Kulturmediums benutzt (Menge pro Liter):
1.85% ortho-Phosphorsäure 21 ml
2. CaS04 0,9 g
3. K2S04 14,3 g
4. MgS04.7H20 12,2 g
5. KOH 3,3 g (Chemikalien 1 bis 5 in p. a. Qualität)
6. Glycerin, technische Qualität 50 ml
7. Entionisiertes Wasser, Hausqualität, Leitfähigkeit 5,5-9,1 S/cm
8. Antischaummittel 10 % Acepol 83E 1 ml (Carl Becker Chemie GmbH, Hamburg, Deutschland
9.25% Ammoniak, technische Qualität
Spurenelemente und Vitamin H (alle Chemikalien in p. a. Qualität):
10. Biotin 0,8 mg
11. CuS04.5H20 24,0 mg
12. KI 0,32 mg
13. MnSO4.H2O 12,0 mg
14. Na2Mo04.2 H20 0,2 mg
15. H3B03 0,08 mg
16. CoCI2 2,0 mg
17. ZnS04.7H20 80 mg
18.
Fe(11)SO4.7H2O 260 mg
Beispiel 10 :
Konstruktion eines Klones zur Expression des Prunus amygdalus hn15 Gens als Fusionsprotein mit N-terminalen und C-terminalen Anteilen der Glukoseoxidase von Aspergillus niger.
Diese Konstruktion wurde so konzipiert, dass das gebildete Fusionsprotein über die heterologe Signalsequenz in den sekretorischen Weg gelenkt wird.
Durch eine PCR in einem 50 l Ansatz in 1x PCR Puffer (Qiagen) mit je 100 pmol der Primer Glucox2 und Glucoxct, 10 ng Plasmid pPamHNL5orf als Template , 5 l dNTP (je 2 mM) Mix, und 1,2 U nHotstar" Taq Polymerase (Qiagen) wurden das C-terminale und das N-terminale Ende des hn15 Gens durch eine von der Glukoseoxidase abgeleitete Sequenz ersetzt bzw. verkürzt. (Pro- gramm : 15 min 95 C, 30 x : min 95 C, 1 min 68 C, 2 min 72 C, und zum Abschluss 10 min 72 C) In einer 2.
PCR in einem 50 l Ansatz in 1x PCR Puffer (Qiagen) 0,1 l Produkt aus der ersten PCR als Template, je 100 pmol der primer Glucox1 und Glucoxct, 2 l dNTP (je 2 mM) Mix, und 2,5 U Pwo Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland), (Programm: 5 min
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95 C, 30 mal: 1 min 95 C, 0,5 min 68 C, 3 min 72 C und zum Abschluss 3 min 72 C) wurde abschliessend der 5' Bereich des Gens ergänzt.
Über die gleichzeitig eingeführten EcoRI Schnittstellen an den Enden des DNA Fragments wurde das PCR Produkt nach Schneiden mit EcoRI in das Plasmid pHILD2 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) eingebaut. Ein Klon mit der richtigen Orientierung des Inserts zum aox Promoter des pHILD2 Plasmids wurde durch Sequenzieren der Übergangsbereiche von Vektor zu Insert verifiziert und konserviert. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid wurde mit pHILDPamHNL5gox bezeichnet.
Mit Notl linearisierte DNA des Plasmids pHILDPamHNL5gox wurde in den Stamm Pichia pastoris GS115 sowie in den proteasedefizienten Stamm Pichia pastoris SMD1168 transformiert. Von jedem Ansatz wurden mehrere Histidin-prototrophe Klone in Schüttelkolben kultiviert und die HnlAktivität im Kulturüberstand (Standard-assay) bestimmt. Diese Experimente wurden analog wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Im Kulturüberstand war bei einigen Klonen HNL Aktivität aufzufinden womit festgestellt werden konnte, dass die Signalsequenz des Aspergillus niger gox Gens befähigt ist, das heterologe Hnl5 Protein bei Expression in Pichia pastoris in den sekretorischen Weg zu dirigieren.
Verwendete Oligonukleotid-Primer
GLUCOX1
5'-
GACGAATTCATCATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCT
GCGGCCCTGCCACACTAC - 3'
GLUCOX2
5'-
TGCGGCCCTGCCACACTACATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCTACAACGCCA
CTGATACAAGCTCGGAAGGATC-3'
GLUCOXCT
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Die Nukleinsäuresequenz des für ein sekretorisches Hybridprotein (PamHNL5xGOX) mit HnlAktivität codierenden DNA Fragments ist in Figur 4 dargestellt, die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Figur 5 wiedergegeben. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der Hn15 aus Prunus amygdalus und des Hybridproteins PamHNL5xGOX ist aus Figur 6 zu entnehmen.
Beispiel 11:
Rekombinantes Protein mit Hnl-Aktivität, das mit dem rekombinanten Stamm Pichia pastoris PamHnl5-a37 wie in Beispiel 9 beschrieben produziert wurde, wurde einer Analyse der Glykosylierung durch Verdau mit Endoglykosidasen unterzogen. Dazu wurden 100 ml des Kulturüberstandes durch Ultrafiltration (Biomax 30,000 NMWL, Millipore, Bedford, MA, USA) 10 fach konzentriert. Die Proben 1-2 wurden mit N-Glycosidase F (N-Glykosidase F Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, D) behandelt. Bei den Proben 4-5 wurde eine HNL Präparation aus Mandeln der Fa. Roche verwendet und bei den Proben 6 und 7 wurde der aufkonzentrierte Kulturüberstand mit Endoglykosidase H (Roche, Diagnostics, Mannheim, D) behandelt. Alle Ansätze wurden in 10 l Gesamtvolumen durchgeführt.
Std. Molekulargewichtsstandard aus dem N-Glykosidase F Kit (5 l = 5 t)
Probe 1: 2 U PamHnl5 mit 2,4 U Enzym nach Vorschrift des Kits behandelt.
Probe 2 : U PamHnl5 mit 2,4 U Enzym nach Vorschrift des Kits jedoch ohne Denaturie- rungspuffer und ohne Hitzedenaturierung behandelt Probe 3 : 2PamHnl5 ohne Behandlung
Probe 4: 0,25 U der Roche R-HNL Präparation grade 111 aus Mandeln (10,3 U/mg) behandelt
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mit 2,4 U N-Glycosidase F nach Vorschrift des Kits
Probe 5: 0,25 U der Roche Präparation grade 111 (10,3 U/mg) unbehandelt Probe 6 : U PamHnlS wurden mit 50 mU Endoglykosidase H in 20 mM Phosphatpuffer, ohne Denaturierung für 12 Stunden bei 37 C inkubiert.
Probe 7 : U PamHnlS wurden mit 5 mU Endoglykosidase H in 20 mM Phosphatpuffer,
0,2% SDS, 0,4 % Merkaptoethanol für 12 Stunden bei 37 C inkubiert.
Nach den Behandlungen mit den Glykosidasen wurden die Proben auf einem 12-prozentigen SDS-Polyacrylamid Gel getrennt und mit Commassie Blue gefärbt.
Diese Ergebnisse (siehe Figur 7) zeigen, dass ein Grossteil der an PamHnl5 gebundenen Oligosaccharide durch Endoglykosidase H auch ohne Denaturierung des PamHn15 Proteins ent- fernt werden kann.
Durch die Abspaltung der Oligosaccharide entsteht aus einem bei Grössen von 70 bis über 100 kDa sichbaren Proteinschmier eine scharfe Bande bei etwa 60 kDa, was dem berechneten Molekulargewicht eines nicht glykosylierten PamHnlS Proteins entspricht.
Eine vergleichbare Proteinbande ist im Roche Präparat nicht oder nur in stark untergeordnetem Ausmass vorhanden. Ausserdem kann kein signifikanter Unterschied zwischen einer unbehandelten Proteinpräparation und einer mit Endoglykosidase F behandelten Präparation gesehen werden.
Aus diesem Befund kann eindeutig festgestellt werden, dass sich das rekombinante PamHnlS Enzym komplett vom aus Mandelkernnen gewonnenen Enzymmaterial unterscheidet.
Beispiel 12 :
0,5 g (3,9 mmol) Octanal wurden in 6 ml tert-Butylmethylether gelöst und mit 7,5 ml einer wäss- rigen Enzymlösung mit rekombinanter R-HNL aus Beispiel 9 (pH 3,8) versetzt. Nach Zugabe von 0,33 ml (8,4 mmol) Blausäure wurde zur Bildung einer Emulsion am Magnetrührer bei Raumtempe- ratur heftig gerührt und die Reaktion mittels GC an einer Cyclodextrinsäule verfolgt. Nach 3 Stun- den Reaktionszeit wurde Cyanhydrin mit 81,1 %ee und 48 % Umsatz gebildet.
Beispiel 13 :
80 ml (34 units/ mmol Aldehyd) einer wässrigen Enzymlösung mit rekombinanter R-HNL (34 units/ mmol Aldehyd) wurden mit 10 ml 200 mM Kaliumphosphat / Natriumcitratpuffer pH 3,8 verdünnt und in eine auf 10 C vorgekühlte Lösung aus 42,2 g (300 mmol) 2-Chlorbenzaldehyd und 42 ml tert-Butylmethylether gegeben. Anschliessend wurden unter Rühren mit 950 rpm 19,6 ml (501 mmol) Blausäure innerhalb von 40 min in die Reaktionsmischung dosiert. Der Reaktionsver- lauf wurde, nach Derivatisierung des Cyanhydrins mit Acetylchlorid, mittels GC an einer Cyclo- dextrinsäule verfolgt.
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<tb>
Stunden <SEP> % <SEP> Umsatz <SEP> %ee
<tb>
<tb> 3,5 <SEP> 7,15 <SEP> 90,6
<tb>
<tb> 22 <SEP> 99,7 <SEP> 90
<tb>
Vergleichsbeispiel:
0,25 bis 1 ml R-OxynitrilaseLösung (E. C.4.1.2.10; 2187 units/ml) wurden mit 50 mM Citrat/Phosphatpuffer (pH 4,0) auf 4 ml verdünnt und der pH-Wert der Enzymlösung gegebenenfalls mit einigen Tropfen Citronensäurelösung auf pH 4,0 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 3 ml tert.-Butylmethylether und 0,8g (5,69 mmol) 2-Chlorbenzaldehyd zugegeben und anschliessend 445 l (11,38 mmol) Blausäure zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Magnetrührer bei Raumtemperatur mit 900 rpm gerührt.
Der Umsatz und die Enantiomerenreinheit des gebildeten (R)-Cyanhydrins wurde mittels GC analysiert.
<Desc/Clms Page number 13>
Dazu wurde eine Probe der Reaktionslösung zentrifugiert und 50 l der organischen Phase mit Dichlormethan verdünnt. Nach einer Derivatisierung mit Acetylchlorid wurde auf einer Cyclo- dextrinsäule gaschromatografisch analysiert.
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<tb>
Zeit <SEP> 0,25 <SEP> ml <SEP> Enzyml <SEP> entspricht <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> Enzyml <SEP> entspricht <SEP> 1,0 <SEP> ml <SEP> Enzyml <SEP> entspricht
<tb>
<tb> (h) <SEP> 96 <SEP> units <SEP> / <SEP> mmol <SEP> Aldehyd <SEP> 192 <SEP> units <SEP> @ <SEP> mmol <SEP> Aldehyd <SEP> 384 <SEP> units <SEP> / <SEP> mmol <SEP> Aldehyd
<tb>
<tb> ¯¯¯ <SEP> % <SEP> Umsatz <SEP> %ee <SEP> % <SEP> Umsatz <SEP> %ee <SEP> %Umsatz <SEP> %ee
<tb>
<tb>
<tb> 1,5 <SEP> 79,1 <SEP> 77,5 <SEP> 97,6 <SEP> 81,6 <SEP> 98,7 <SEP> 89,4
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 98 <SEP> 77,4 <SEP> --r <SEP> 100 <SEP> 81,5 <SEP> 100 <SEP> 89,1
<tb>
Der Vergleichsversuch zeigte, dass bei Verwendung der erfindungsgemässen rekombinanten Proteine analog Beispiel 13 lediglich ein Zehntel der benötigten Menge an nativem Protein benötigt wird, um vergleichbare Enantiomerenreinheiten (ee-Werte) zu erzielen.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Herstellung von DNA-Sequenzen, codierend für Hydroxynitrillyase, dadurch gekennzeichnet, dass eine Primerkombination aus einem Primer 1 basierend auf der DNA-Sequenz des
5'-Bereichs der mdl Gene von Prunus serotina und Prunus amygdalus und einem Primer 2 basierend auf dem 3'-Bereich der DNA-Sequenzen eines der Hydroxynitrillyase Isoenzyme aus Prunus serotina oder Prunus amygdalus zur Amplifikation mit einer DNA Polymerase unter Verwendung von DNA aus Organismen, die für Hydroxynitrillyasen kodierende Gene enthalten als Vorlage verwendet wird und anschliessend kloniert wird.