DE60218033T2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

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Description

  • QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung ist eine unter 35 U.S.C. §111(a) eingereichte Anmeldung, wofür gemäß 35 U.S.C. §119(e)(1) die Rechte des Anmeldetags der Provisional Applications 60/303,086, angemeldet am 6. Juli 2001 und 60/339,389, angemeldet am 14. Dezember 2001 gemäß 35 U.S.C. §111(b), beansprucht werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminosäure, welches die Zugabe von Ammoniak zu einem Acrylsäurederivat unter der Einwirkung eines Pflanzenenzyms umfasst, wobei die entsprechende optisch aktive Aminosäure erhalten wird. Die optisch aktive Aminosäure ist wertvoll als Synthesematerial für Arzneimittel, landwirtschaftliche Chemikalien und andere Feinchemikalien.
  • Eine große Anzahl von Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren. wurde untersucht, wie eine Reaktion der organischen Synthese unter Verwendung eines asymmetrischen Katalysators und eine fermentative Herstellungsmethode, welche die Spezifität eines Mikroorganismus ausnutzt.
  • Es existieren zahlreiche Veröffentlichungen, wie GB Nr. 1489468 und das offengelegte Japanische Patent Nr. 53-96388 (1978), in denen ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Phenylalanin durch optische Selektion beschrieben wird, bei dem Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die aus einem Mikroorganismus abgeleitet ist oder ein Mikroorganismus selbst, der die enzymatische Aktivität hat, auf Zimtsäure zur Einwirkung gebracht wird. Dieses Verfahren benutzt eine Reaktion bei der eine Aminogruppe unter der Einwirkung des Enzyms bei hoher Ammoniakkonzentration an ein α-Kohlenstoffatom von Zimtsäure addiert wird und dadurch L-Phenylalanin mit hoher optischer Reinheit produziert werden kann.
  • Als Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven L-Phenylalaninderivats, das einen Substituenten an seiner Phenylgruppe aufweist, wird eine Methode in Betracht gezogen, bei der ein Substituent in die Phenylgruppe eingeführt wird, wobei verschiedene Arten von Modifizierungsreaktionen auf L-Phenylalanin angewendet werden. Mithilfe dieses Verfahrens ist jedoch eine Verminderung der Ausbeute wegen Nebenreaktionen, die in anderen Teilen als der Phenylgruppe stattfinden und eine Verminderung der optischen Reinheit wegen des Ablaufs einer Razemisierung unter extrem strengen Reaktionsbedingungen unvermeidbar. Da es außerdem schwierig ist, die Positionsspezifität des in eine Phenylgruppe einzuführenden Substituenten zu erhalten, ergeben sich eine niedere Ausbeute oder Schwierigkeiten der Abtrennung und Reinigung. Dieses Verfahren ist daher praktisch nicht geeignet.
  • Es wird ein weiteres Verfahren in Betracht gezogen, bei dem man die vorstehend beschriebene Phenylalanin-Ammoniak-Lyase auf ein Zimtsäurederivat mit einer substituierten Phenylgruppe zur Einwirkung bringt, in die vorher ein gewünschter Substituent eingeführt worden ist. Da eine enzymatische Reaktion bei diesem Verfahren unter gemäßigten Bedingungen stattfindet, ergeben sich keine störenden Wirkungen, bedingt durch eine Nebenreaktion an einer Phenylgruppe und einem Substituenten an der Gruppe und daher wird erwartet, dass ein optisch aktives L-Phenylalaninderivat mit hoher Reinheit mithilfe dieses Verfahrens gebildet wird.
  • Da jedoch die Substratspezifität einer aus einem Mikroorganismus stammenden Phenylalanin-Ammoniak-Lyase im Allgemeinen strikt ist, hat dieses Enzym in den meisten Fällen eine niedere oder fast keine Reaktivität gegenüber einer substituierten Phenylgruppe im Vergleich mit der ursprünglichen Reaktivität für die Reaktion von Zimtsäure zu L-Phenylalanin. Es existieren nur wenige beschriebene Fälle, wie ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem fluorierten Phenylalanin durch Einwirkung des vorstehenden Enzyms, wobei als Ausgangsmaterial ein Zimtsäurederivat verwendet wird, welches eine fluorierte Phenylgruppe aufweist (offengelegtes Japanisches Patent Nr. 63-148992 (1988) oder ein Verfahren zur Herstellung eines Phenylalaninderivats unter Verwendung eines spezifischen Mikroorganismus von Rhodotorula (US-Patent Nr. 5981239). Geeignete Verbindungen sind eingeschränkt und die Produktivität ist industriell nicht ausreichend.
  • Im Allgemeinen ist bekannt, dass Phenylalanin-Ammoniak-Lyase in der gesamten Welt der Lebewesen weit verbreitet ist, wie in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Das heißt, dass Beispiele für Mikroorganismen, die dieses Enzym enthalten, Rhodotorula rubra (offengelegtes Japanisches Patent Nr. 61-043993 (1986), GB1489468), Rhodosporidium toruloides (offengelegtes Japanisches Patent Nr. 60-227670 (1985)), Cladosporidium cladosporioides (offengelegtes Japanisches Patent Nr. 62-111687(1987)) etc. umfassen und abgesehen von diesen Beispielen wurde über viele andere Mikroorganismen berichtet.
  • Beispiele für Pflanzen, welche Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthalten, umfassen Thale-Kresse (Arabidopsis thaliana), Tee (Camellia sinensis), Kichererbse (Cicer arietinum), Zitrone (Citrus limonis), Gurke (Cucumis sativus L.), Karotte (Daucus carota), Murasaki (Lithospermum erythrorhizon), Tomate (Lyco persicon esculentum), Tabak (Nicotiana tabacum), Reis (Oryza sativa), Petersilie (Petroselinum crispum, Petroselinum hortense), Loblolly-Kiefer (Pines taeda), Pappel (Populuskitakamiensis, etc. ), Kirsche (Prunusavium), Brombeere (Rebus idaeus), Aubergine (Solanum tuberosum), Stylo (Stylosanthes humilis), Hop-Klee (hop clover) (Trifolium subterrane), Wein (Vitis vinifera), Buschbohne (Phaseolus vulgaris) etc.
  • Zahlreiche Berichte existieren über ein Strukturgen von aus einer Pflanze stammender Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, pal (nachstehend als "pal-Gen" bezeichnet). So umfassen Beispiele für das bestimmte pal-Gen die von Reis (Oryza sativa, Biochim. Biophys. Acta (1993), 1171(3), 321-322, Plant Mol. Biol. (1995), 29(3), 535-550), Tee (Camellia sinensis, Theor. Appl. Genet. (1994), 89(6), 671-675), Thale-Kresse (Arabidopsis thaliana, Plant Mol. Biol. (1995), 27, 327-338), Murasaki (Lithospermum erythrorhizon, Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), Tomate (Lycopersicon esculentum, J. Biol.Chem. (1992), 267, 11824-11830), Hop-Klee (Trifolium subterraneum, Gene (1994), 138(1-2), 87-92), Erbse (Pisum sativum, Plant Mol. Biol. (1992), 20(1), 167-170, offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-153978 (1993)), Pappel (Populustrichocarpa, Plant Physio. (1993), 102, 71-83), Tabak (Nicotiana tabacum, Plant Mol. Biol. (1996), 30, 711-722), Sojabohne (Glycinemax, DNA Sequence (1991), 1(5), 335-346), Süßkartoffel (Ipomoea batatas, Plant Physiol. (1989), 90(4), 1403-1407), Weizen (Triticum aestivum), Petersilie (Petroselinum crispum), Sonnenblume (Helianthus annuus), Alfalfa (Medicago sativa) etc., und die Zahl der bekannten pal-Gene erreicht mehr als 40 Arten einschließlich der Isomeren in der gleichen Spezies oder der Teilsequenzen.
  • Von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen haben zahlreiche gemeinsame konservierte Sequenzen, ihre Aminosäuresequenzen zeigen mindestens 50% oder mehr Homologie. Es kann daher vorhergesagt werden, dass im Hinblick auf die Funktionen und Eigenschaften viele Gemeinsamkeiten existieren.
  • Von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyase ist als ursprüngliches Enzym des Phenylpropanoid- und Isoflavonoid-Synthesewegs im Sekundärmetabolismus einer Pflanze und außerdem als Enzym bekannt, welches eine Reaktion in einem Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt katalysiert, d. h. der Deaminierungsreaktion von Phenylalanin. Da angenommen wird, dass dieses Enzym und sein Gen mit der Stressresistenz von Pflanzen in Verbindung stehen, wurden die Funktionen dieses Enzyms gründlich untersucht. Außerdem wurden in breitem Umfang sowohl im Hinblick auf die Grundlage und die Anwendung Versuche gemacht, um die Expression des pal-Gens in einem Pflanzenkörper zu ermöglichen, um eine gegen Krankheiten resistente Pflanze zu produzieren.
  • Obwohl, wie vorstehend angegeben ist, anders als für das von einem Mikroorganismus abgeleitete gleiche Enzym, zahlreiche Forschungsberichte über Untersuchungen für die Herstellung einer Substanz existieren, wurden keine Versuche unternommen, eine organische Verbindung herzustellen, die als allgemeines großtechnisches Material verwendet werden kann, mit der Ausnahme eines Versuches zum Erhöhen des Gehalts einiger brauchbarer Substanzen von Phenylpropanoiden oder Isoflavonoiden (Planta. (1979), 14(6), 369-376, Biochim. Biophys. Acta. (1979); 563, 278-292). Es muss nicht erwähnt werden, dass niemals Versuche beschrieben wurden, um eine Substanz mithilfe der umgekehrten Reaktion, d. h. einer Animie rungsreaktion, herzustellen. Erstens wurde nicht nur das vorstehende Enzym, sondern wurden auch andere von einer Pflanze abgeleitete Enzyme selten für die Herstellung einer Substanz verwendet, weil eine allgemeine Übereinstimmung darüber besteht, dass die Eignung dieser Enzyme wegen ihrer niederen Stabilität, hohen Substratspezifität etc. geringer ist als die von Enzymen, die von einem Mikroorganismus abgeleitet sind. Wenn daher Fachleute ein Verfahren zur Herstellung eines L-Phenylalaninderivats konzipierten, das heißt einer der erfindungsgemäßen Verbindung ähnlichen organischen Verbindung, war ein aus einer Pflanze abgeleitetes Enzym für sie eines der am wenigsten beachteten Materialien, da ein Enzym mit der gleichen katalytischen Funktion in anderen Quellen vorhanden war.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren für die vorteilhafte und wirksame Herstellung einer L-Aminosäure mit hoher optischer Reinheit bereitzustellen. Das heißt, es ist einer der Gegenstände der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren für die einfache und wirksame Herstellung einer L-Aminosäure mit hoher optischer Reinheit bereitzustellen, bei dem als Ausgangsmaterial ein Acrylsäurederivat, wie ein Zimtsäurederivat mit einem Substituenten an der Phenylgruppe, verwendet wird.
  • Die vorliegenden Erfinder haben ihre Aufmerksamkeit auf die breite Substratspezifität von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die von einer Pflanze abgeleitet ist, gerichtet und haben die Aktivität des Enzyms zur Erzeugung von verschiedenen Aminosäuren untersucht, die industriell wertvoll sind.
  • Zuerst wurde in der gesamten lebenden Welt, wie in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, nach einer Ammoniak-Lyase geforscht, die hohe Reaktivität gegenüber einem Zimtsäurederivat, das einen Substituenten an der Phenylgruppe hat, aufweist.
  • Als Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, dass Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen, die von Pflanzen abgeleitet sind, eine höhere Aktivität zur Herstellung eines Phenylalaninderivats haben, als die vorher bekannten gleichen Enzyme, die von einem Mikroorganismus abgeleitet sind. Wie vorstehend angegeben, wurde die Stufe der Ausbildung von Phenylpropanoid, Isoflavonoiden oder dergleichen in einem Pflanzenkörper in Verbindung mit diesen Enzymen, gründlich untersucht, jedoch diese Untersuchungen beziehen sich auf die Herstellung eines Zimtsäurederivats mithilfe einer Eliminierungsreaktion, bei der eine Aminogruppe Phenylalanin verlässt. Die umgekehrte Reaktion, das heißt, die Möglichkeit der Bildung eines Phenylalaninderivats durch Addition einer Aminogruppe an ein Zimtsäurederivat mithilfe der aus einer Pflanze abgeleiteten Enzyme wurde nicht untersucht.
  • Darüber hinaus haben die vorliegenden Erfinder ihre Aufmerksamkeit auf die breite Substratspezifität von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die aus einer Pflanze stammt, gerichtet und haben die Aktivität des Enzyms zur Herstellung von verschiedenen Arten industriell wertvoller Aminosäuren sowie von Phenylalaninderivaten untersucht. Als Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, dass bei Verwendung eines Acrylsäurederivats, das eine aromatische Ringstruktur hat, die Substituenten aufweisen kann und ein Heteroatom enthalten kann, als Substrat dieses Enzym die Wirkung hat, die entsprechende L-Aminosäure zu produzieren.
  • Als Ergebnis von weiteren intensiven Untersuchungen haben die Erfinder festgestellt, dass eine Aminosäure mit äußerst hoher Wirksamkeit hergestellt werden kann, indem ein Mikroorganismus verwendet wird, der eine hohe Expression des von einer Pflanze abgeleiteten pal-Gens zeigt, wodurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt wurde.
  • Die Fähigkeit von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die von einer Pflanze abgeleitet ist, die Reaktion, die zu einer Aminosäure führt unter Verwendung als Substrat eines Acrylsäurederivats mit einer Struktur, die durch die vorstehende allgemeine Formel (1) dargestellt ist, zu katalysieren, war bisher nicht bekannt und dies stellt eine durch die vorliegenden Erfinder erhaltene neue Erkenntnis dar.
  • Darüber hinaus war die Fähigkeit von aus einer Pflanze abgeleiteter Phenylalanin-Ammoniak-Lyase zur Katalyse der Reaktion, die ein Phenylalaninderivat produziert, wobei als Substrat ein Zimtsäurederivat verwendet wird, welches verschiedene Substituenten an seiner Phenylgruppe aufweist, welches durch die vorstehende allgemeine Formel (3) dargestellt ist, bisher nicht bekannt und dies ist eine durch die vorliegenden Erfinder erhaltene neue Erkenntnis.
  • Außerdem war die Fähigkeit der von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyase zur Katalyse der Reaktion, die zu einer L-Aminosäure führt, wobei als Substrat ein Acrylsäurederivat mit einem heterocyclischen Substituenten, das durch die vorstehende allgemeine Formel (4) oder (5) dargestellt ist, verwendet wird, bis hier nicht bekannt und dies ist eine durch die vorliegenden Erfinder erhaltene neue Erkenntnis.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die folgenden Aspekte [1] bis [30]:
    • [1] Ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Wirkenlassen in Gegenwart von Ammoniak einer von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyase auf ein Acrylsäurederivat der folgenden allgemeinen Formel (1) umfasst:
      Figure 00090001
      worin Z eine aromatische Ringgruppe darstellt, die ein Heteroatom aufweisen kann, R einen Substituenten an dem aromatischen Ring darstellt und n eine ganze Zahl von 0 oder höher ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können; wobei die L-Aminosäure durch die folgende allgemeine Formel (2) dargestellt ist:
      Figure 00090002
      worin Z eine aromatische Ringgruppe ist, die ein Heteroatom aufweisen kann, R ein Substituent an dem aromatischen Ring ist, n eine ganze Zahl von 0 oder höher ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
    • [2] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach dem vorstehenden Punkt [1], worin Rn-Z- durch die folgende Formel (3) dargestellt ist:
      Figure 00100001
      worin R ein Substituent an einem Benzolring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe, oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
    • [3] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure gemäß dem obigen Punkt [1], worin Rn-Z- durch die folgende Formel (4) dargestellt ist:
      Figure 00100002
      worin X S, O, NH oder NR1 darstellt, R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, R ein Substituent an einem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe, oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
    • [4] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure gemäß dem obigen Punkt [1], worin Rn-Z- durch die folgende Formel (5) dargestellt ist:
      Figure 00110001
      worin X S, O, NH oder NR1 ist, R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, R ein Substituent an einem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe, oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
    • [5] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [1] bis [4], welches den Einsatz einer Zusammensetzung, erhalten durch Behandeln von Pflanzengewebe, das eine Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthält, umfasst.
    • [6] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [1] bis [4], welches den Einsatz einer kultivierten Pflanzenzelle, die eine Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthält und/oder einer behandelten Zusammensetzung davon umfasst.
    • [7] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [1] bis [4], welches das Zulassen der Exprimierbarkeit eines von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegens in einer Pflanze und den Einsatz von transformierten Pflanzenkulturen oder eines behandelten Produkts der Pflanzenkulturen umfasst.
    • [8] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [1] bis [4], welches das Zulassen der Exprimierbarkeit eines von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegens in einem Mikroorganismus und den Einsatz einer transformierten Mikroorganismuskultur, eines behandelten Produkts davon oder eines von der Kultur erhaltenen Enzyms umfasst.
    • [9] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach dem vorstehenden Punkt [7] oder [8], wobei das von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen ein Gen ist, das für eine Aminosäuresequenz mit 70% oder höherer Homologie zu der Aminosäuresequenz kodiert, die von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens aus Lithospermum erythrorhizon abgeleitet ist.
    • [10] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach dem vorstehenden Punkt [7] oder [8], wobei das von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen ein Gen ist, das für eine Aminosäuresequenz mit 80% oder höherer Homologie zu der Aminosäuresequenz kodiert, die von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens aus Lithospermum erythrorhizon abgeleitet ist.
    • [11] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure gemäß einem der vorstehenden Punkte [1] bis [8], wobei die Pflanze, von der das Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen abgeleitet ist, Lithospermum und/oder Camellia ist.
    • [12] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [8] bis [11], wobei der Mikroorganismus ein Bakterium, Hefe und/oder ein filamentöser Pilz ist.
    • [13] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach dem vorstehenden Punkt [12], wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
    • [14] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Hydroxylgruppe ist.
    • [15] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Cyangruppe ist.
    • [16] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Carboxygruppe ist.
    • [17] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Amidgruppe ist.
    • [18] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13]., wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Halogengruppe ist.
    • [19] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Aminogruppe ist.
    • [20] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Nitrogruppe ist.
    • [21] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Hydroxymethylgruppe ist.
    • [22] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
    • [23] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [1] bis [13], wobei R eine der Gruppen Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Nitrogruppe und Carboxylgruppe ist und n 1 ist.
    • [24] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [2] und [5] bis [13], wobei die L-Aminosäure L-Phenylalanin ist.
    • [25] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [3] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (4) X für Osteht.
    • [26] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [3] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (4) X für S steht.
    • [27] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [3] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (4) X für NH steht.
    • [28] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [4] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (5) X für O steht.
    • [29] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [3] und [5] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (5) X für S steht.
    • [30] Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der vorstehenden Punkte [4] bis [13], wobei in der vorstehenden allgemeinen Formel (5) X für NH steht.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt das Konstrukt eines Lithospermum erythrorhizon PAL-Expressionsplasmids, welches LePAL1 und LePAL2 zeigt;
  • 2 zeigt das Konstrukt eines Camellia sinensis PAL-Expressionsplasmids, welches CAMPAL zeigt; und
  • 3 zeigt ein Beispiel für die Homologie in PAL-Aminosäuresequenzen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
  • Mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer L-Aminosäure kann durch eine einzige Stufe einer enzymatischen Reaktion in einfacher Weise eine optisch aktive Aminosäure aus einem Acrylsäurederivat erhalten werden, welches eine aromatische Ringgruppe aufweisen kann, die verschiedene Substituenten haben kann und ein Heteroatom umfassen kann.
  • Außerdem kann mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer L-Aminosäure durch eine einzige Stufe einer enzymatischen Reaktion eine optisch aktive Aminosäure in einfacher Weise aus einem Acrylsäurederivat erhalten werden, welches eine Benzolring-Gruppe mit verschiedenen Substituenten aufweist.
  • Ein vorher in einen Benzolring eingeführter Substituent, z. B. eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Halogenatom, eine Aminogruppe, eine Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wird unter den moderaten Bedingungen der Reaktion bis zur Beendigung der Reaktion beibehalten, ohne dass er störenden Einflüssen unterliegt, und das entsprechende gewünschte L-Phenylalaninderivat kann in guter Ausbeute bei einer Umwandlungsrate von fast 100 erhalten werden.
  • Darüber hinaus kann mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer L-Aminosäure durch einen einzigen Schritt einer enzymatischen Reaktion eine optisch aktive Aminosäure, die in einer Seitenkette eine heterocyclische Ringstruktur aufweist, in einfacher Weise aus einem Acrylsäurederivat erhalten werden, das in seiner Seitenkette eine heterocyclische Ringstruktur aufweist.
  • Die heterocyclische Ringstruktur, wie eine Furylgruppe, Thienylgruppe, Pyrrolgruppe oder dergleichen in dem vorstehenden Acrylsäurederivat wird bis zur Beendigung der Reaktion unter mäßigen Reaktionsbedingungen beibehalten, ohne dass sie irgendwelchen störenden Einflüssen unterliegt, und die entsprechende gewünschte L-Aminosäure kann in guter Ausbeute bei einer Umwandlungsrate von fast 100 erhalten werden.
  • Ein Acrylsäurederivat mit verschiedenen Substituenten, das erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial für die Reaktion verwendet wird, kann in einfacher Weise wie folgt hergestellt werden: durch die sogenannte Methode der Perkin's-Reaktion, in der die Aldehydgruppe eines Aldehydderivats, in welches irgendein bestimmter Substituent eingeführt wurde, mit Essigsäureanhydrid umgesetzt wird (siehe Arch. Pharm. (Weinheim) (1994), 327 (10), 619-625, etc.), eine Methode, welche die Reaktion von Malonsäure in Gegenwart von Piperidin in einem Pyridin-Lösungsmittel umfasst (siehe J. Chem. Soc. (1939), 357-360, etc.) und verschiedene andere verbesserte Methoden (siehe Synth. Common. (1999), 29 (4), 573-581, etc.).
  • Pflanzen, die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase-Aktivität besitzen, die erfindungsgemäß angewendet werden, sind nicht besonders eingeschränkt. Wie vorher bereits erwähnt, umfassen spezifische Beispiele Thale-Kresse (Arabidopsis thaliana), Tee (Camellia sinensis), Kichererbse (Cicer arietinum), Zitrone (Citrus limonis), Gurke (Cucumis sativus L.), Karotte (Daucus carota), Murasaki (Lithospermum erythrorhizon), Tomate (Lycopersicon esculentum), Tabak (Nicotiana tabacum), Reis (Oryza sativa), Petersilie (Petroselinum crispum, Petroselinum hortense), Loblolly-Kiefer (Pines taeda), Pappel (Populuskitakamiensis, etc. ), Kirsche (Prunusavium), Brombeere (Rubes idaeus), Aubergine (Solanum tuberosum), Stylo (Stylosanthes humilis), Hop-Klee (hop clover) (Trifolium subterrane), Wein (Vitis vinifera) , Buschbohne (Phaseolus vulgaris) etc., dieses Enzym ist jedoch in Pflanzen fast universell vorhanden.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird aus einer Pflanze abgetrennte Phenylalanin-Ammoniak-Lyase verwendet. Das heißt, als Reaktionskatalysator wird das vorstehende Enzym bereitgestellt, welches mithilfe von bekannten konventionellen Verfahren zur Abtrennung und Reinigung eines Enzyms aus einer Pflanze abgetrennt und gereinigt wurde, beispielsweise durch Anwendung der Acetonfällung, Ammoniumsulfatfällung, von verschiedenen Trennkolonnen etc. auf einen Extrakt von gemahlenen Pflanzenkörpern. Bezüglich eines spezifischen Verfahrens zum Abtrennen und Reinigen von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase von verschiedenen Typen von Pflanzenkörpern, ist ein Bericht von J. Koukol et al. (J. Bio1. Chem. (1961), 236(10), 2692-2698), sowie ein Bericht von E. A. Havir et al. (Biochemistry (1973), 22, 1583-), etc. bekannt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Behandlungsprodukt der vorstehend beschriebenen Pflanzenkörper für eine interessierende Reaktion bereitgestellt. Beispiele für das Behandlungsprodukt der Pflanzenkörper, welches zur Durchführung einer Reaktion verwendet wird, umfassen ein gemahlenes Produkt, ein gefriergetrocknetes Produkt oder einen Extrakt aus Pflanzenkörpern, ein Produkt, das durch Konzentrieren und Extrahieren eines Bestandteils, der eine interessierende Reaktion katalysiert, aus dem Extrakt erhalten wird, ein Produkt, das durch Immobilisieren des Behandlungsprodukts, des Extrakts oder des extrahierten Bestandteils der Pflanzenkörper auf einen schwer löslichen Träger erhalten wird, etc.
  • Beispiele für einen solchen Träger zur Immobilisierung umfassen Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylamid, Poly vinylalkohol, Poly-N-vinylformamid, Polyallylamin, Polyethylenimin, Methylcellulose, Glucomannan, Alginat, Carrageenan und (vernetzte) Copolymere dieser Verbindungen. In anderen Worten kann eine Verbindung, die einen wasserunlöslichen Feststoff, der einen Pflanzenextrakt als Bestandteil enthält, einzeln oder in Form eines Gemisches verwendet werden.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden kultivierte Zellen der vorstehend beschriebenen Pflanze verwendet: Dabei wird eine Pflanzenzelle mithilfe einer üblichen Methode zum Erhalten einer kultivierten Pflanzenzelle gezüchtet. So werden beispielsweise Pflanzenzellen in Gegenwart eines Pflanzenhormons, wie Indolessigsäure oder Kinetin, in verschiedenen bekannten Medien für die Pflanzenzellenkultur, wie Murashige & Skoog-Komplettmedium, LS-Medium, M9-Medium und Gamborg B-5-Medium gezüchtet, welche in Abhängigkeit von der Art der Pflanze ausgewählt werden, und die erhaltene Zellkultur wird dann einer Reaktion unterworfen. Zu diesem Zeitpunkt können auch ein Medium und Kulturbedingungen angewendet werden, die verbessert sind, um die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase-Aktivität zu erhöhen.
  • Beispielsweise existieren einige bekannte Berichte, wie ein Bericht von Yazaki et al. im Hinblick auf die Kulturbedingungen zum Erhalten von Zellkulturen, in welche die enzymatische Aktivität von Lithospermum erythrorhizon eingeführt wurde (Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), ein Bericht von Klaus et al. über den Zusammenhang zwischen der obigen enzymatischen Aktivität und den Kulturbedingungen in einer Zellkultur von Petroselinum hortense (Archiv. Biochem. Biophis. (1975), 66, 54-62) usw. Darüber hinaus können auch ein gemahlenes Produkt, ein gefriergetrocknetes Produkt oder ein Extrakt der so erhaltenen kultivierten Pflanzenzellen, ein Produkt, das durch Konzentrieren und Extrahieren eines Bestandteils, der eine interessierende Reaktion katalysiert, aus dem Extrakt erhalten wird, ein Produkt, das durch Immobilisieren des Extrakts oder eines extrahierten Bestandteils der kultivierten Pflanzenzellen auf einem schwer löslichen Träger erhalten wird, etc., der Reaktion unterworfen werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das aus einer Pflanze stammende pal-Gen so in einen Mikroorganismus oder eine Pflanze eingeschleust, dass das Gen darin exprimiert werden kann, und der resultierende transformierte Mikroorganismus oder die entsprechende transformierte Pflanze kann verwendet werden. Ein Wirtsorganismus, der für die Genexpression verwendet wird, unterliegt keiner speziellen Beschränkung sofern es sich um einen Organismus handelt, der für die Aufnahme und Expression eines Fremdgens befähigt ist. Beispiele für solche Organismen umfassen Bakterien, wie Escherichia, Pseudomonas oder Bacillus, Hefen, wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces und Fadenpilze, wie Aspergillus.
  • Das erfindungsgemäß verwendete pal-Gen kann nicht nur ein pal-Gen sein, das natürlich in der Umgebung vorhanden ist, sondern auch ein Gen, welches die gleichen Funktionen hat (welches für Mutantenenzyme mit der gleichen Aktivität kodiert). Zu Beispielen für ein solches Gen gehören ein pal2-Gen, abgeleitet von Lithospermum erythrorhizon (Datenbank-Hinterlegungsnummer D83076), ein pal-Gen, welches für eine Aminosäuresequenz kodiert, die 70% oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz hat, welche von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens deduziert wurde, die von Lithospermum erythrorhizon stammt, oder vorzugsweise ein pal-Gen, welches für eine Aminosäuresequenz kodiert, die 80% oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz zeigt, die von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens abgeleitet ist, welches von Lithospermum erythrorhizon stammt. Wie vorstehend angegeben ist, können von Pflanzen abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen im Hinblick auf diese Funktionen und Eigenschaften zahlreiche Gemeinsamkeiten miteinander haben, wie eine ausreichend hohe Sequenzhomologie der pal-Gene von Pflanzen und identische Funktionen in einem Pflanzenkörper und daher kann bei der beschriebenen Herstellungsmethode eine äquivalente Wirkung erwartet werden.
  • Bezüglich einer Methode zum Isolieren der cDNA des Gens für das Enzym aus einer Pflanze und Herstellung eines transformierten Mikroorganismus unter Verwendung des Gens oder einer Methode zum Abtrennen und Gewinnen des Enzyms aus dem transformierten Mikroorganismus sind zahlreiche Berichte bekannt, wie ein Bericht von Yazaki et al. über einen Fall der Verwendung von Lithospermum erythrorhizon (Biosci. Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), ein Bericht von W. Schulz et al. über einen Fall der Verwendung von Petroselinum crispum (FEBS Letter (1989), 258(2), 335-338), etc.
  • Danach wird ein Verfahren zum Erhalten eines pal-Gens, ein Verfahren zur Herstellung von exprimierbaren Plasmiden und ein Verfahren für das Einschleusen dieser Plasmide in verschiedene Arten von Organismen und die Expression dieser in diesen weiter spezifisch beschrieben.
  • <Verfahren zum Erhalten des pal-Gens>
  • Das von einer Pflanze stammende pal-Gen kann aus einer cDNA-Bibliothek, die mithilfe einer bekannten Methode hergestellt wurde, erhalten werden, wobei als Sonde ein Teilfragment verwendet wird, welches der konservierten Sequenz von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase entspricht. Nach dem Isolieren und Reinigen von konventioneller mRNA kann die erforderliche cDNA mit Reverse-Transcriptase erhalten werden, wobei die so erhaltene mRNA als Matrize verwendet wird. In den letzten Jahren wird jedoch eine ausreichende Menge der cDNA leicht mithilfe der PCR-Methode mit wärmebeständiger Reverse-Transcriptase erhalten, wobei die gesamte RNA oder mRNA als Matrize verwendet wird. Die so erhaltene cDNA wird mit einem geeigneten Plasmidvektor, wie pBR322 oder pUC18 ligiert, mit dem Escherichia coli, das als Wirtsorganismus verwendet wird, transformiert wird.
  • Um das interessierende pal-Gen aus der wie vorstehend hergestellten cDNA-Bibliothek zu erhalten, kann eine Methode der Kolonie-Hybridisierung angewendet werden, in der Oligo-DNA, die für die konservierte Sequenz von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase kodiert, als Sonde verwendet wird. Da, wie vorstehend angegeben wurde, von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyase über die gesamte Sequenz Sequenzen mit hoher Homologie aufweist, die als konservierte Sequenzen betrachtet werden, kann als eine Sonde verwendete Oligo-DNA durch Auswahl einer Position in Abhängigkeit von dem Zweck hergestellt und verwendet werden.
  • Ein Plasmid wird aus einem positiven als Kandidat verwendeten Transformanten hergestellt, der durch Kolonie-Hybridisierung erhalten wurde. Dann wird das Plasmid in Kombination mit geeigneten Primern der PCR unterworfen, um die Position und Richtung des in das Plasmid eingeschleusten pal-Gens zu bestätigen. Die primären Sequenzen von vielen pal-Genen, die sich von Pflanzen ableiten, sind in Datenbanken, wie GenBank oder EMBL dokumentiert, daher ist es auch für Gene mit Sequenzinformation möglich, die Herstellung und Richtung durch Herstellung einer Restriktionskarte zu bestätigen.
  • <Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmids und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Mikroorganismen, die zur Produktion verwendet werden>
  • Mithilfe eines geeigneten Vektors (spezifische Beispiele für diesen werden später beschrieben) wird das pal-Gen in ein Bakterium, wie Escherichia coli oder einen Mikroorganismus, wie Hefe, einschließlich Saccharomyces cerevisiae eingeschleust und darin exprimiert, sodass ein Rekombinant erhalten wird, der Aktivität zur Erzeugung eines interessierenden Phenylalaninderivats hat. Ein bevorzugter Wirtsorganismus ist hier ein Bakterium, wie Escherichia coli. Wie später beschrieben wird, kann das erzeugte Phenylalaninderivat mithilfe einer konventionellen Methode zur Abtrennung eines Reaktionsprodukts eines Mikroorganismus aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines Plasmids, welches ein Fremdgen enthält, und ein Verfahren oder eine Methode zum Einschleusen des Plasmids in einen Mikroorganismus, wie Escherichia coli, und zu seiner Expression kann nach Maßnahmen oder Methoden durchgeführt werden, die gewöhnlich auf dem Gebiet der Gentechnologie eingesetzt werden (siehe z. B. "Vectors for cloning genes", Methods in Enzymology, 216, S. 469-631, 1992, Academic Press und "Other bacterial systems", Methods in Enzymology, 204, S. 305-636, 1991, Academic Press).
  • Als Methode zum Einführen beziehungsweise Einschleusen von Fremdgenen (eine Gruppe von pal-Genen) in Escherichia coli wurden bereits mehrere wirksame Methoden ausgearbeitet, wie die Hanahan-Methode oder die Rubidium-Methode und somit können diese Methoden zum Einschleusen der Gene angewendet werden (siehe z. B. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning – A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • Die Expression eines Fremdgens in Escherichia coli kann mithilfe einer konventionellen Methode erfolgen (siehe z. B. das vorstehend erwähnte "Molecular cloning – A laboratory manual") und es kann ein Vektor für Escherichia coli verwendet werden, der einen lac-Promotor oder dergleichen enthält, wie pUC, pBluescript etc. Unter Verwendung eines Vektors für Escherichia coli, pBluescript II SK – der einen lac-Promotor aufweist, fügten die Erfinder ein pal-Gen stromabwärts des lac-Promotors ein und ermöglichten dann die Genexpression in Escherichia coli.
  • Im Hinblick auf eine Methode zum Einschleusen eines pal-Gens in Hefe, Saccharomyces cerevisiae, wurden bereits Methoden etabliert, wie die Lithium-Methode, und die Einführung des Gens kann unter Verwendung einer solchen Methode durchgeführt werden (siehe z. B. "New Biotechnology of Yeast" redigiert von Yuichi Akiyama, herausgegeben von Bioindustry Association, veröffentlicht von Igaku Syuppan Center). Unter Verwendung eines Promotors, wie PGK oder GPD (GAP) und eines Terminators, kann die Expression eines Fremdgens in Hefe wie folgt durchgeführt werden: Konstruktion einer Expressionskassette, in welche zwischen dem Promotor und dem Terminator zur Kontrolle der Transcription ein Fremdgen eingefügt ist und Insertieren dieser Expressionskassette in einen Vektor von S. cerevisiae, z. B. YRp (ein Mehrkopienvektor für Hefe, der als Replikations-Startpunkt die ARS-Sequenz des Hefechromosoms aufweist), YEp (ein Mehrkopienvektor für Hefe, der den Replikations-Startpunkt von 2 μm DNA der Hefe hat), YIp (ein Vektor für das Einschleusen eines Hefechromosoms, der keine Replikations-Startpunkte der Hefe aufweist) usw. (siehe die vorstehend erwähnte "New Biotechnology of Yeast" Igaku Syuppan Center und "Genetic Engineering for Production of Substances", Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, ABC-Serie, herausgegeben von Asakura Shoten).
  • <Verfahren zum Kultivieren eines rekombinanten Mikroorganismus>
  • Die Kultur des erfindungsgemäßen Transformanten kann gemäß einer üblichen Methode für die Kultur eines Wirtsmikroorganismus durchgeführt werden.
  • Eine Kohlenstoffquelle zum Züchten eines transformierten Mikroorganismus kann ein Material sein, welches der Wirtsmikroorganismus als Kohlenstoffquelle verwenden kann und Beispiele für eine solche Kohlenstoffquelle umfassen Saccharide, wie Glucose, Saccharose, Fructose und Blackstrap-Melassen, organische Materialien, wie Ethanol, Essigsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Benzoesäure und Fettsäuren oder deren Alkalimetallsalze, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine und natürliche organische Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Fischextrakt, Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Malzextrakt und Kartoffelextrakt. Diese Materialien können einzeln oder in Kombination in einer Konzentration von gewöhnlich etwa 0,01 bis 30% und vorzugsweise etwa 0,1% bis 10% verwendet werden. Wenn Escherichia coli als Transformant verwendet wird, können vorzugsweise Glucose, Pepton, Fleischextrakt, Malzextrakt etc. eingesetzt werden.
  • Eine Stickstoffquelle für die Kultur eines transformierten Mikroorganismus kann ein Material sein, welches ein Wirtsmikroorganismus als Stickstoffquelle verwerten kann und Beispiele für eine solche Stickstoffquelle umfassen anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat und Kaliumnitrat, Stickstoff enthaltende organische Materialien, wie Harnstoff und Harnsäure und natürliche organische Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Fischextrakt, Sojabohnenmehl, Malzextrakt und Kartoffelextrakt. Diese Materialien können einzeln oder in Kombination in einer Konzentration von gewöhnlich etwa 0,01 bis 30% und vorzugsweise etwa 0,1% bis 10% verwendet werden. Wenn Escherichia coli als Transformant verwendet wird, kann vorzugsweise Ammoniumsulfat, Pepton, Fleischextrakt, Malzextrakt etc. verwendet werden.
  • Ferner können erforderlichenfalls Phosphate, wie Kaliumdihydrogenphosphat oder Metallsalze, wie Magnesiumsulfat, Ferrosulfat, Calciumacetat, Manganchlorid, Kupfersulfat, Zinksulfat, Cobaltsulfat oder Nickelsulfat zugesetzt werden, um das Wachstum der Bakterienzellen zu beschleunigen. Die Konzentration des Zusatzes hängt von den Kulturbedingungen ab, im Allgemeinen beträgt jedoch die Konzentration etwa 0,01 bis 5% für Phosphat, etwa 10 ppm bis 1% für Magnesiumsalze und etwa 0,1 ppm bis 1.000 ppm für andere Verbindungen. In Abhängigkeit von dem gewählten Medium können außerdem etwa 1 ppm bis 100 ppm Hefeextrakt, Casaminosäure, Hefenukleinsäure oder dergleichen als Quelle für die Zufuhr von Vitaminen, Aminosäuren oder Nukleinsäuren zugesetzt werden, um das Wachstum der Bakterienzellen zu beschleunigen.
  • Außerdem kann, falls erforderlich, ein Induktor, der dem Expressionspromotor eines Vektors entspricht, während der Kul tivierung zugesetzt werden, um zu ermöglichen, dass das für die Transformation vorgesehene Enzymgen in einem Wirtsmikroorganismus eine hohe Expression zeigt.
  • Wenn ein lac-Promotor verwendet wird, werden etwa 0,01 mM bis 10 mM IPTG (Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid) zugegeben und wenn ein Promotor für Arzneimittelresistenz, wie gegen Ampicillin oder Kanamycin verwendet wird, werden etwa 0,1 ppm bis 1.000 ppm des entsprechenden Arzneimittels zugesetzt.
  • In allen Fällen wird bei Verwendung einer beliebigen Zusammensetzung der pH-Wert bei 5 bis 9 und vorzugsweise 5,5 bis 8 für die Kultur gehalten. Darüber hinaus sind Verfahrensschritte, in denen Mikroorganismenzellen, die vorher in dem vorstehend beschriebenen Medium gezüchtet wurden, mithilfe einer Methode, wie Zentrifugieren oder Membranfiltration aus der Kulturlösung abgetrennt und gewonnen werden und der Reaktion unterworfen werden, geeignet, um Verunreinigungen, die aus der Kulturlösung stammen, zu vermindern und die spätere Trennung und Gewinnung eines Produkts zu erleichtern.
  • Der durch die Kultur erhaltene transformierte Mikroorganismus kann mithilfe einer bekannten Methode, wie Zentrifugieren oder Membranfiltration, gewonnen und für eine interessierende Reaktion eingesetzt werden, andernfalls kann die Kulturlösung direkt der interessierenden Reaktion unterworfen werden. Darüber hinaus können auch ein gemahlenes oder gefriergetrocknetes Produkt des transformierten Mikroorganismus, ein zellfreier Extrakt der Mikroorganismenzellen, ein Produkt, erhalten durch Konzentrieren und Extraktion eines Bestandteils, der die interessierende Reaktion katalysiert, aus dem zellfreien Extrakt, ein Produkt, erhalten durch Immobilisieren dieser transformierten Mikroorganismenzellen und ein behandeltes Produkt, ein Extrakt und ein daraus extrahierter Be standteil auf einem schwer löslichen Träger etc. der interessierenden Reaktion unterworfen werden.
  • Beispiele von Trägern für die Immobilisierung, die für den vorstehenden Zweck eingesetzt werden, umfassen Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Poly-N-vinylformamid, Polyallylamin, Polyethylenimin, Methylcellulose, Glucomannan, Alginate, Carrageenan, etc. und (vernetzte) Copolymere dieser Verbindungen. In anderen Worten kann eine Verbindung, die einen wasserunlöslichen Feststoff, der einen Mikroorganismus oder einen extrahierten Bestandteil davon enthält, einzeln oder in Form eines Gemisches verwendet werden. Darüber hinaus kann ein transformierter Mikroorganismus, ein Extrakt oder ein Bestandteil des Extrakts auf eine feste Substanz, wie Aktivkohle, poröser Keramik, Glasfasern, einem porösen Polymer-Formkörper oder einer Nitrocellulosemembran vor der Anwendung aufgebracht werden.
  • <Verfahren zur Herstellung und zum Kultivieren einer rekombinanten Pflanze die zur Produktion verwendet wird>
  • Wie vorstehend angegeben wurde, kann eine Pflanze, die ein Phenylalaninderivat produziert, durch Einschleusen eines pal-Gens in die Pflanzenzellen hergestellt werden. Als bevorzugtes Beispiel wird ein Plasmid, welches das pal-Gen enthält, hergestellt und das Plasmid wird dann in Zellen einer geeigneten Pflanze, wie Nicotiana tabacum eingeschleust, und zur Expression gebracht, wobei eine Pflanze erhalten wird, die ein interessierendes Phenylalaninderivat bildet. Über Methoden zum Einschleusen und für die Expression von verschiedenen Typen von Genen in eine Pflanze wurden zahlreiche Studien veröffentlicht und eine Pflanze mit erhöhter Aktivität für die interessierende Reaktion kann mithilfe dieser bekannten Methoden erhalten werden (Plant Mol. Biol. (1999), 39(4), 683-693, Plant Biotechnol. (Tokyo) (1998), 15(4),189-193, Plant Physiol. (1996), 112(4), 1617-1624).
  • Beispiele für bekannte Methoden zum Einführen eines Fremdgens in eine Pflanzenzelle umfassen eine Methode, bei der das phytopathogene Bakterium Agrobacterium tumefaciens verwendet wird, die Elektoporationsmethode, eine Methode unter Verwendung einer Teilchenkanone (particle gun) etc. und eine geeignete Methode kann in Abhängigkeit von der Art der Pflanze, in welche man das Gen einführen möchte, ausgewählt werden. Als Promotor kann nicht nur der 35S Promotor aus Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV), der ein Promotor für systemische hohe Expression ist, verwendet werden, sondern es können auch andere Promotoren verwendet werden, die spezifisch in verschiedenen Organismen exprimiert werden. Ein binärer Vektor pBI121, der den 35S-Promotor von CaMV enthält, kann von Clontech erhalten werden und dieser Vektor wird in großem Umfang als Vektor zur Mediation von Agrobacterium tumefaciens verwendet. Es wurde bereits gezeigt, dass das pal-Gen in eine Pflanze, wie Nicotiana tabacum unter Verwendung einer Teilchenkanone eingeschleust werden kann und das eingeschleuste pal-Gen darin exprimiert wird und funktioniert (Shokubutsu Soshiki Baiyo (1995), 12(2), 165-171).
  • Beispiele einer Methode zur Herstellung eines Plasmids, welches ein Fremdgen enthält, und ein Verfahren oder eine Methode des Einschleusens und der Expression eines Plasmids in einer Pflanze (Zelle eines Blattes, eines Stamms, einer Wurzel usw.) umfassen nicht nur die in der vorliegenden Erfindung gezeigten Methoden, sondern umfassen auch Methoden, die konventionell auf dem Gebiet der Gentechnologie eingesetzt werden und daher können die Herstellung, das Einschleusen und die Expression eines Plasmids gemäß diesen Techniken oder Me thoden durchgeführt werden (siehe z. B. Isao Ishida, Norihiko Misawa, Saibo Kogaku Jikken Sosa Nyumon (An Introduction to Experiments of Cell Technology), Kodansha, 1992). Eine wie vorstehend hergestellte rekombinante Pflanze kann gemäß üblichen Methoden für die Pflanzenzellkultur, wie vorstehend angegeben ist, eingesetzt werden.
  • Die Reaktion zum Erzeugen einer L-Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung wird wie folgt durchgeführt: Zugabe von 1 ppm bis 20%, vorzugsweise 10 ppm bis 10% eines Acrylsäurederivats als Reaktions-Ausgangsmaterial und Ammoniak bis zur Endkonzentration von 2 M bis 12 M, Einstellen des pH-Werts auf 8,5 bis 11, vorzugsweise 9 bis 10,5 und Durchführen einer Reaktion während etwa 1 bis 200 Stunden in Gegenwart von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die sich von einer Pflanze ableitet, welche mithilfe der vorstehend beschriebenen verschiedenen Methoden hergestellt wurde, eines Pflanzen-Behandlungsprodukts oder von kultivierten Zellen, welche die Aktivität des Enzyms aufweisen, des gleichen Enzyms, welches durch einen Mikroorganismus gebildet wurde, der mit dem aus der Pflanze isolierten Gen für das Enzym transformiert wurde, einer transformierten Mikroorganismenzelle und einem Behandlungsprodukt davon, des gleichen Enzyms, welches aus einer mit dem Enzym-Gen transformierten Pflanze erhalten wurde oder einer transformierten Pflanze oder einem Behandlungsprodukt davon.
  • Beispiele für Säuren, die zum Einstellen des pH-Werts verwendet werden, umfassen anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Borsäure oder Kohlensäure, organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure und Salze davon. Die Verwendung einer flüchtigen Säure erfordert hier demnach nur die Abtrennung und Eliminie rung von Zellen aus einer Reaktionslösung und ermöglicht es, eine Entsalzungsstufe wegzulassen und das Produkt leicht abzutrennen und zu gewinnen. Eine bevorzugt verwendete Säure ist daher Kohlensäure. Beispiele für die Kohlensäure in diesem Fall umfassen auch Kohlensäure, die in einer wässerigen Lösung als Kohlendioxid durch Einleiten oder dergleichen gelöst ist und die dann durch Dissoziation gebildet wird. Außerdem können diese Säuren und Ammoniumsalze auch als Ammoniumquellen für eine Reaktionslösung verwendet werden. Aus den vorstehend angegebenen Gründen wird bevorzugt, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumhydrogencarbonat als Teil oder als Gesamtheit der Ammoniumquelle zu verwenden.
  • Es wird festgestellt, dass das Auflösen der gesamten Menge des zugesetzten Acrylsäurederivats nicht notwendigerweise erforderlich ist, sondern dass es auch möglich ist, ein Lösungsmittel, ein oberflächenaktives Mittel oder dergleichen zuzugeben, um die Löslichkeit oder Dispergierbarkeit des Derivats in der Reaktionslösung zu verbessern. In Abhängigkeit von dem Verbrauch der Verbindung durch Fortschreiten der Reaktion kann die Verbindung kontinuierlich oder intermittierend zugesetzt werden. Die Konzentration der Verbindung in der Reaktionslösung ist in diesem Fall nicht stets innerhalb des vorstehend angegebenen Bereiches.
  • Die in der Reaktionslösung erzeugte L-Aminosäure wird mithilfe einer bekannten Methode abgetrennt und gewonnen, wie durch Zentrifugieren, Membranfiltration, Vakuumtrocknung, Destillation, Lösungsmittelextraktion, Aussalzen, Ionenaustausch oder verschiedene Arten der Chromatografie, in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Derivats in der Reaktionslösung. Ein Beispiel für die einfache Abtrennung und Gewinnung der L-Aminosäure daraus ist wie folgt. Ein Enzym, ein Behandlungs produkt des Enzyms, ein transformierter Mikroorganismus oder ein Behandlungsprodukt davon etc. wird aus der Reaktionslösung durch Filtration, Zentrifugieren, Dialyse oder dergleichen entfernt und danach wird eine Lösungsmittelextraktion durchgeführt oder die Reaktionslösung wird angesäuert, sodass das nicht-umgesetzte Ausgangsmaterial, das Acrylsäurederivat, ausgefällt wird und der Niederschlag wird entfernt.
  • Der pH-Wert des erhaltenen Überstandes wird wieder auf etwa den isoelektrischen Punkt der L-Aminosäure eingestellt und das ausgefällte Derivat wird in gleicher Weise wie vorstehend gewonnen. Somit kann ein Produkt wirksam mit hoher Reinheit aus der Reaktionslösung gewonnen werden. Außerdem ist es auch praktisch, vorher restliches Ammoniak durch Destillation oder dergleichen aus der Reaktionslösung zu entfernen und die Konzentration durch Entfernen von Wasser zu erhöhen, um die Ausbeute des Produkts am isoelektrischen Punkt zu verbessern.
  • Vorteilhafter erfolgt die Regelung des pH-Werts der Reaktionslösung mithilfe einer flüchtigen Säure. Wenn die Umwandlungsrate relativ hoch ist, kann das Produkt direkt als Ammoniumsalz eines L-Phenylalaninderivats isoliert werden, nachdem die Zellen aus der Reaktionslösung abgetrennt wurden. Wenn nach der Abtrennung des Mikroorganismus immer noch eine große Menge des Ausgangsmaterials zurückbleibt, wird die Reaktionslösung vor der Lösungsmittelextraktion angesäuert, wodurch Wasser und Basen (acid base) entfernt werden und das Produkt als Ammoniumsalz einer L-Aminosäure isoliert wird. Bevorzugte Beispiele für eine volatile Säure, die zur Durchführung einer solchen Methode geeignet ist, sind Kohlensäure und deren Ammoniumsalz.
  • In Abhängigkeit von den Eigenschaften des Reaktionsprodukts reichert sich in manchen Fällen das Produkt in der Reaktions lösung an, wodurch die Reaktionsrate vermindert wird. In diesem Fall wird bevorzugt, eine Methode der Zugabe von wässerigem Ammoniak, einer Ammoniak enthaltenden physiologischen Salzlösung und eines Ammoniak enthaltenden Reaktionspuffers in die Reaktionslösung anzuwenden, in Abhängigkeit von der Konzentration des Produkts, danach die Reaktionslösung zu verdünnen. Darüber hinaus existiert eine weitere Methode zum Erhöhen der Reaktionsrate, bei der Zellen abgetrennt und gewonnen werden, wenn die Reaktionsrate vermindert ist, der Überstand als ein Produkt enthaltende Lösung gewonnen wird und die gewonnenen Zellen wiederum in die Lösung oder Suspension zurückgegeben werden, welche die Ausgangsmaterialien für die Reaktion enthält. Diese Methoden können wiederholt in dem Ausmaß durchgeführt werden, solange die Ammoniak-Lyase-Aktivität des Mikroorganismus beibehalten wird.
  • Eine Verbindung, die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist ein Acrylsäurederivat, das durch die vorstehend beschriebene allgemeine Formel (1) dargestellt wird:
    Figure 00330001
    worin
    Z eine aromatische Ringgruppe darstellt, die ein Heteroatom enthalten kann,
    R einen Substituenten an dem aromatischen Ring darstellt und
    n eine ganze Zahl von 0 oder größer darstellt und wobei dann, wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können.
  • Die erhaltene Verbindung ist eine Verbindung, die durch die vorstehend erwähnte allgemeine Formel (2) dargestellt wird:
    Figure 00340001
    worin
    Z eine aromatische Ringgruppe bedeutet, die ein Heteroatom enthalten kann,
    R einen Substituenten an dem aromatischen Ring darstellt,
    n eine ganze Zahl von 0 oder mehr darstellt, wobei dann, wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können.
  • In den vorstehenden allgemeinen Formeln umfassen Beispiele für Z: Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (6) bis (10) dargestellt werden:
    Figure 00340002
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (11) bis (15) dargestellt sind:
    Figure 00340003
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (16) bis (20) dargestellt werden:
    Figure 00350001
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (21) bis (25) dargestellt sind:
    Figure 00350002
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (26) bis
    Figure 00350003
    (30) dargestellt sind:
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (31) bis (35) dargestellt sind:
    Figure 00360001
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (36) bis (40) dargestellt sind:
    Figure 00360002
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (41) bis (45) dargestellt sind:
    Figure 00370001
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (46) bis (50) dargestellt sind:
    Figure 00370002
    und
  • Gruppen, die durch die folgenden allgemeinen Formeln (51) bis (55) dargestellt sind:
    Figure 00380001
  • Beispiele für R in den vorstehenden allgemeinen Formeln umfassen Cyangruppen, Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, Amidgruppen, Fluoratome, Chloratome, Bromatome, Aminogruppen, Nitrogruppen, Hydroxymethylgruppen oder Alkyl- oder Alkoxygruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
  • In den vorstehenden allgemeinen Formeln kann n eine ganze Zahl von 0 oder größer sein, welches die Zahl ist, die durch Subtrahieren von 1 von der Zahl der Positionen erhalten wird, in denen ein aromatischer Ring substituiert werden kann, oder ist kleiner als diese. Wenn n 2 oder mehr ist, können die Reste R gleich oder verschieden sein.
  • In der als Ausgangsmaterial erfindungsgemäß verwendeten Verbindung, die durch die vorstehende allgemeine Formel (1) dargestellt ist, ist Rn-Z- eine Verbindung, die durch die folgende allgemeine Formel (3) dargestellt ist:
    Figure 00390001
    worin
    R einen Substituenten am Benzolring darstellt, und für eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht. n stellt eine ganze Zahl von 0 bis 5 und vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 5 dar. Wenn n 2 oder mehr bedeutet, können die Reste R gleich oder verschieden sein.
  • Die erhaltene Verbindung ist eine Verbindung, in der in der vorstehenden allgemeinen Formel (2) Rn-Z- durch die vorstehend angegebene allgemeine Formel (4) dargestellt ist, worin R einen Substituenten am Benzolring darstellt und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe, oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet. n stellt eine ganze Zahl von 0 bis 5 und vorzugsweise eine ganze Zahl von 1 bis 5 dar. Wenn n 2 oder mehr ist, können die Reste R gleich oder verschieden sein.
  • Spezifische Beispiele für ein solches Ausgangsmaterial umfassen 2-Cyanzimtsäure, 3-Cyanzimtsäure, 4-Cyanzimtsäure, 2-Hydroxyzimtsäure, 3-Hydroxyzimtsäure, 4-Hydroxyzimtsäure, 3,4-Dihydroxyzimtsäure, 2-Nitrozimtsäure, 3-Nitrozimtsäure, 4-Nitrozimtsäure, 2-Carboxyzimtsäure, 3-Carboxyzimtsäure, 4-Carboxyzimtsäure, 2-Aminozimtsäure, 3-Aminozimtsäure, 4-Amino zimtsäure, 2-Chlorzimtsäure, 3-Chlorzimtsäure, 4-Chlorzimtsäure, 2-Fluorzimtsäure, 3-Fluorzimtsäure, 4-Fluorzimtsäure, 2-Bromzimtsäure, 3-Bromzimtsäure, 4-Bromzimtsäure, 2-Iodzimtsäure, 3-Iodzimtsäure,4-Iodzimtsäure, 2-Methylzimtsäure, 3-Methylzimtsäure, 4-Methylzimtsäure, 2-Methoxyzimtsäure, 3-Methoxyzimtsäure, 4-Methoxyzimtsäure, 4-Isopropylzimtsäure, 4-t-Butylzimtsäure, 4-Methoxy-3-methylzimtsäure usw.
  • Wenn ein von Lithospermum erythrorhizon abgeleitetes Enzym verwendet wird, sind zu verwendende bevorzugte Ausgangsmaterialien 2-Cyanzimtsäure, 4-Cyanzimtsäure, 3-Hydroxyzimtsäure, 4-Hydroxyzimtsäure und 3,4-Dihydroxyzimtsäure. Wenn diese Ausgangsmaterialien verwendet werden, können 2-Cyan-L-phenylalanin, 4-Cyan-L-phenylalanin, 3-Hydroxy-L-phenylalanin (Metatyrosin), 4-Hydroxy-L-phenylalanin (Tyrosin) und 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA) jeweils erhalten werden. Erfindungsgemäß umfassen die Zimtsäurederivate auch Zimtsäure selbst und daher umfasst das entsprechende Phenylalaninderivat auch Phenylalanin.
  • Insbesondere ist die als Ausgangsmaterial erfindungsgemäß verwendete Verbindung eine Verbindung, in der in der vorstehenden allgemeinen Formel (1) Rn-Z- durch die folgende allgemeine Formel (4) dargestellt ist:
    Figure 00400001
    worin
    X für S, O, NH oder NR1 steht,
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,
    R ein Substituent an dem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, und
    n eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt, wobei dann, wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können.
  • Die erhaltene Verbindung ist eine Verbindung, in der in der vorstehenden allgemeinen Formel (2) Rn-Z- durch die vorstehende allgemeine Formel (4) dargestellt ist, worin
    X für S, O, NH oder NR1 steht,
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,
    R ein Substituent an dem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und
    n eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt, und wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können.
  • In der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindung, die durch die vorstehende allgemeine Formel (1) dargestellt ist, wird Rn-Z- durch die folgende allgemeine Formel (5) dargestellt:
    Figure 00420001
    worin
    X für S, O, NH oder NR1 steht,
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,
    R ein Substituent an dem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und
    n eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt, und wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können, und die erhaltene Verbindung ist eine Verbindung, in der in der vorstehenden allgemeinen Formel (2) Rn-Z- durch die vorstehende allgemeine Formel (5) dargestellt ist,
    worin
    X für S, O, NH oder NR1 steht,
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,
    R ein Substituent an dem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und
    n eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt, und wenn n 2 oder mehr ist, die Reste R gleich oder verschieden sein können.
  • Spezifische Beispiele für ein solches Ausgangsmaterial umfassen 2-Furanacrylsäure, 3-Furanacrylsäure, 2-Thienylacrylsäu re, 3-Thienylacrylsäure, 2-Pyrrolylacrylsäure, 3-Pyrrolylacrylsäure usw.
  • Wenn ein von Lithospermum erythrorhizon stammendes Enzym verwendet wird, sind bevorzugte zu verwendende Ausgangsmaterialien 2-Furanacrylsäure, 3-Furanacrylsäure, 2-Thienylacrylsäure, 3-Thienylacrylsäure, 2-Pyrrolylacrylsäure und 3-Pyrrolylacrylsäure. Wenn diese Ausgangsmaterialien verwendet werden können α-Amino-2-furanpropionsäure, α-Amino-3-furanpropionsäure, α-Amino-2-thienyl-propionsäure, α-Amino-3-thienylpropionsäure, α-Amino-2-pyrrol-propionsäure, und α-Amino-3-pyrrol-propionsäure erhalten werden.
  • Nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine L-Aminosäure mit hoher optischer Reinheit wirksam mithilfe einer einzigen Reaktionsstufe erhalten werden, wobei als Substrat ein Acrylsäurederivat verwendet wird, welches bequem durch organische Synthese erhalten wird. Die so hergestellte L-Aminosäure ist wertvoll als Synthese-Zwischenprodukt auf dem Gebiet der Feinchemikalien, wie der Arzneimittel und der landwirtschaftlichen Chemikalien, welche hohe optische Reinheit erfordern.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter speziell beschrieben. Die Beispiele werden nur zur Erläuterung gegeben und sind nicht dazu bestimmt, den Umfang der Erfindung einzuschränken.
  • Es ist festzuhalten, dass in den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen anstelle der freien Säuren ihre Salze oder Ester als Ausgangsmaterialien verwendet werden können. Außerdem ist "1 Einheit" als die Menge des Enzyms definiert, die 1 μmol Zimtsäure pro Minute bei 30°C in Gegenwart von 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 8,5) und 10 mM L-Phenylalanin als Substrat freisetzt.
  • Die Menge des Enzymproteins wird unter Verwendung eines Standards, wie Rinderserum-Albumin mithilfe der Biuret-Methode bestimmt und die spezifische Aktivität des Enzyms wird in "Einheiten/mg Protein" ausgedrückt. Die Identifizierung des Acrylsäurederivats und der Aminosäure erfolgte durch 1H-NMR und 13C-NMR und durch HPLC an der Reaktionslösung und Vergleich der UV-Absorptionsintensität mit einem Standard.
  • Die Abtrennung und Bestimmung des erhaltenen Acrylsäurederivats erfolgte unter den nachstehenden Analysebedingungen.
  • Bedingungen der Umkehrphasen-HPLC-Analyse
    Kolonne: Shodex (Warenzeichen der Showa Denko K. K.),
    RSpak NN-614 (hergestellt von Showa Denko K. K.)
    Kolonnentemperatur: 40°C
    Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser/50 mM H3PO4-KH2PO4-Lösung
    (pH 3) = 20/70/10
    Fließrate: 1,0 ml/min
    Nachweis: durch UV-Absorption bei 210 nm
  • Die Analyse der optischen Reinheit der erhaltenen Aminosäure erfolgte durch optische Trennung durch HPLC unter den folgenden Bedingungen.
  • Bedingungen der Analyse durch optische Auflösungs-HPLC
    Kolonne: Shodex (Warenzeichen der Showa Denko K. K.),
    ORpak CRX-853 (hergestellt von Showa Denko K. K.)
    Kolonnentemperatur: Raumtemperatur (22°C)
    Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser = 15/85, 2,5 mM CuSO4
    Fließrate: 1,0 ml/min
    Nachweis: durch UV-Absorption bei 256 nm
  • Beispiel 1: Reaktion mithilfe einer Zellkultur (Petroselinum hortense)
  • Die Zusammensetzung des Mediums A ist in Tabelle 1 gezeigt. [Tabelle 1]
    Figure 00450001
  • 10 l des Mediums A mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung wurden anteilweise in Erlenmeyer-Kolben gegossen und dann wurde in jedes Medium eine Petersilie (Petroselinum hortense)-Zellkultursuspension, die vorher im gleichen Medium im Dunklen unter Belüftung bei 27°C vorkultiviert worden war (5. Generation der Subkultur) eingeimpft, wonach die Schüttelkultur bei 200 UpM im Dunklen bei 27°C und unter Belüften während 10 Tagen durchgeführt wurde. Dann wurde die Kultivierung weiter 24 Stunden lang fortgesetzt, während Licht einer Fluoreszenzlampe eingestrahlt wurde. Die erhaltene Kulturlösung wurde mithilfe eines Glasfaserfilters der Vakuumfiltration unterworfen, wobei etwa 1,6 kg der kultivierten Zellen, die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthielten, erhalten wurden. Die Aktivität betrug 0,0051 μ/g des Gewichts der frischen Zellen.
  • 2 g der erhaltenen kultivierten Zellen wurden in 10 ml einer 2 M Ammoniak/Ammoniumcarbonat-Lösung (pH 10) suspendiert (diese wurde durch Einstellen des pH-Werts durch Vermischen einer 2 M wässerigen Ammoniaklösung und einer 2 M Ammoniumcarbonatlösung erhalten), welche 0,1% von verschiedenen Acrylsäurederivaten enthielt und die Reaktion wurde durch Rühren bei 30°C während 24 Stunden durchgeführt. Tabelle 2 zeigt die Produkte, deren Konzentrationen und optische Reinheiten, die in jeder Reaktion erhalten wurden.
  • Vergleichsbeispiel 1: Reaktion mithilfe eines von Mikroorganismen abgeleiteten Enzyms
  • Eine Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass 0,025 mg handelsübliche Phenylalanin-Ammoniak-Lyase aus Rhodotorula glutinis (Sigma) mit einer spezifischen Aktivität von 0,44 Einheit/mg anstelle der Zellkultur in Beispiel 1 zugesetzt wurde. Die erhaltenen Produkte, deren Konzentrationen und optische Reinheiten sind in Tabelle 2 gezeigt. [Tabelle 2]
    Figure 00470001
  • Beispiel 2: Reaktion mithilfe des Behandlungsprodukts einer Zellkultur (Petroselinum hortense)
  • Kultivierte Zellen von Petroselinum hortense (1,5 kg) erhalten durch Kultur in gleicher Weise wie in Beispiel 1, wurden in 3 1 einer 0,1 M Natriumborat-Pufferlösung (pH 8,8) suspendiert und die Suspension wurde 20 Minuten über Eis der Homogenisierung durch Ultraschall unterworfen. Aus dem erhaltenen behandelten Produkt schied sich durch Zentrifugieren bei 10.000 UpM während 15 Minuten eine unlösliche Fraktion ab und der Überstand wurde gewonnen.
  • Zerkleinertes Ammoniumsulfat wurde allmählich zu dem erhaltenen Extrakt auf Eis während 30 Minuten und unter Rühren zugesetzt, sodass die Konzentration eine 40%ige Sättigung erreichte und danach wurde die Lösung 15 Minuten lang bei 10.000 UpM zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Ebenso wurde Ammoniumsulfat zu dem erhaltenen Überstand gegeben, sodass die Konzentration eine 55%ige Sättigung erreichte und danach wurde die Lösung 15 Minuten bei 10.000 UpM zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 150 ml einer 0,05 M Tris-HCl-Pufferlösung gelöst und danach wurde eine Dialyse bei 4°C gegen das 100-fache Volumen der gleichen Pufferlösung während 24 Stunden durchgeführt. Nach der Dialyse wurden 170 ml der Lösung als rohe Enzymextrakt-Lösung von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase erhalten. Die Gesamtmenge des Proteins war 620 mg und die spezifische Aktivität war 0,0205 U/mg.
  • Zu einer Mischlösung von 1 ml der erhaltenen rohen Extraktlösung und 9 ml 2 M Ammoniak/Ammoniumcarbonat-Lösung (pH 10) (erhalten durch Einstellen des pH-Werts durch Mischen einer 2 M wässerigen Ammoniaklösung und einer 2 M Ammoniumcarbonat-Lösung) wurden verschiedene Zimtsäurederivate zugesetzt, sodass die Mischlösung 0,5% der Derivate enthielt, und die Reaktion wurde danach durch 24-stündiges Rühren bei 30°C durchgeführt. Die Tabelle 3 zeigt die Produkte und deren Konzentrationen und optische Reinheiten, die durch jede Reaktion erhalten wurden.
  • Vergleichsbeispiel 2: Reaktion mithilfe eines aus einem Mikroorganismus stammenden Enzyms
  • Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass 0,175 mg handelsübliche Phenylalanin-Ammoniak-Lyase aus Rhodotorula graminis (Sigma) mit einer spezifischen Aktivität von 0,44 Einheit/mg anstelle der rohen Enzymextrakt-Lösung des Beispiels 2 zugesetzt wurde. Die erhaltenen Produkte und deren Konzentrationen und optische Reinheiten sind in Tabelle 3 gezeigt. [Tabelle 3]
    Figure 00490001
  • Beispiel 3: Reaktion mithilfe des Behandlungsprodukts aus Pflanzengewebe (Cucumis sativus L.; Gurke)
  • Samen von Gurke (Cucumis sativus L.) wurden in einer Petrischale, in die ein mit Wasser befeuchtetes Filter gelegt worden war, 72 Stunden lang bei 25°C kultiviert, um sie auszukeimen. Dann wurde 4 Stunden lang mit Licht einer Fluoreszenzlampe bestrahlt und danach wurden etwa 50 g der Hypokotylen gewonnen.
  • Das erhaltene Hypokotylen-Gewebe wurde in einem Mörser auf Eis homogenisiert und dann wurde die Gesamtmenge des homogenisierten Produkts in 100 ml einer 0,1 M Natriumborat-Pufferlösung (pH 8,8), die 1 mM Glutathion enthielt, suspendiert, wonach eine Homogenisierung durch Ultraschall während 20 Minuten erfolgte. Aus dem erhaltenen behandelten Produkt wurde eine unlösliche Fraktion durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 UpM abgeschieden und der Überstand wurde gewonnen.
  • Zu dem erhaltenen Extrakt auf Eis wurde zerkleinertes Ammoniumsulfat nach und nach während 30 Minuten unter Rühren zugesetzt, sodass die Konzentration 30%ige Sättigung erreichte, wonach die Lösung 15 Minuten lang bei 10.000 UpM zentrifugiert wurde, um den Niederschlag zu entfernen. In gleicher Weise wurde Ammoniumsulfat zu dem erhaltenen Überstand gegeben, sodass die Konzentration 70% der Sättigung erreichte und danach wurde die Lösung 15 Minuten lang bei 10.000 UpM zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 20 ml einer 0,05 M Tris-HCl-Pufferlösung gelöst und dann wurde während 24 Stunden bei 4°C eine Dialyse gegen die 100-fache Volumenmenge der gleichen Pufferlösung durchgeführt. Nach der Dialyse wurden 2,2 ml der Lösung als rohe Enzymextrakt-Lösung erhalten.
  • Die Gesamtmenge des Proteins war 50,7 mg und seine spezifische Aktivität betrug 0,0307 U/mg.
  • Zu einer Mischlösung aus 0,1 ml der erhaltenen rohen Extraktlösung und 9,9 ml einer 2 M Ammoniak/Ammoniumcarbonat-Lösung (pH 10) (erhalten durch Einstellung des pH-Werts durch Vermischen von 2 M wässerigem Ammoniak und einer 2 M Ammoniumcarbonatlösung) wurden verschiedene Zimtsäurederivate zugesetzt, sodass die Mischlösung 0,5% der Derivate enthielt, und die Reaktion wurde dann durch 24-stündiges Rühren bei 30°C durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die Produkte und deren Konzentrationen und optische Reinheiten, die mithilfe jeder Reaktion erhalten wurden.
  • Vergleichsbeispiel 3: Reaktion mithilfe eines von einem Mikroorganismus abgeleiteten Enzyms
  • Als Vergleichsbeispiel wurde die Reaktion unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass 0,16 mg handelsübliche Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, die aus Rhodotorula graminis abgeleitet war (Sigma) und eine spezifische Aktivität von 0,44 Einheit/mg hatte, anstelle der rohen Enzymextrakt-Lösung des Beispiels 3 zugesetzt wurde. Die erhaltenen Produkte und deren Konzentrationen und optische Reinheiten sind in Tabelle 4 gezeigt. [Tabelle 4]
    Figure 00510001
  • Beispiel 4: Kultur des Transformanten und Reaktion mithilfe des Transformanten
  • Zellen wurden 24 Stunden auf einer Agarplatte kultiviert, die durch Einmischen von 2% Agar in eine L-Brühe (1% Polypepton, 0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, pH 7,0) und Flachformen des Gemisches erhalten worden war. Dann wurde eine Impfschlaufe der Zellen mit 5 ml bis 100 ml der L-Brühe bei 30°C während 16 Stunden weiter kultiviert, wobei ein für eine Reaktion verwendeter Transformant erhalten wurde. Nach der Kultur wurden die Zellen gewonnen und mit dem gleichen Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung wie der Kulturlösung gewaschen.
  • Die Zellkörper wurden dann in einer Lösung entsprechend dem halben Volumen der Kulturlösung (4 M Ammoniak/Ammoniumcarbonat (pH 10,3)) suspendiert und dazu wurde ein Substrat zugesetzt, sodass dessen Endkonzentration 0,2% (2.000 mg/l) betrug, wonach eine Reaktion bei 30°C unter Rühren erfolgte. In bestimmten stündlichen Abständen wurde jeweils ein Anteil dieser Reaktionslösung entnommen, die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand wurde der HPLC-Analyse unterworfen, um die Menge eines Produkts zu bestimmen.
  • Beispiel 5: Herstellung einer cDNA-Bibliothek und Entnahme des pal-Gens
  • Die Zellkultur von Murasaki (Lithospermum erythrorhizon), die Herstellung der cDNA-Bibliothek und das Erhalten des pal-Gens sind ausführlich in dem Bericht von Yazaki et al. (Plant Cell Physiol. (1995), 36, 1319-1329 Biosci. Biotech. Biochem.
  • (1997), 61(12), 1995-2003), und die Herstellung der cDNA-Bibliothek von Tee (Camellia sinensis) und der Erhalt des pal-Gens sind ausführlich in dem Bericht von Matsumoto et al.
  • (Theor. Appl. Genet. (1994), 89(6), 671-675) beschrieben. Im Hinblick auf die existierende Information haben die vorliegenden Erfinder einige Modifizierungen zugefügt und haben das pal-Gen aus jeder Pflanze erhalten. Eine Serie von Versuchen lassen sich auf die pal-Gene aus allen Pflanzen anwenden, deren Nukleotidsequenz aufgeklärt wurde. Zusätzlich zu kultivierten Zellen können auch Pflanzengewebe unter Bedingungen, unter denen das pal-Gen exprimiert wird, als Materialien zum Erhalten der mRNA verwendet werden.
  • (Herstellung einer cDNA-Bibliothek von Lithospermum erythrorhizon)
  • Aus den Geweben von Lithospermum erythrorhizon hergestellte Zellen wurden in einem LS-Medium (konventionelles Wachstumsmedium, enthaltend 10 μM Indolessigsäure und 0,1 μM Kinetin) 1 Woche lang bei 25°C kultiviert. Die erhaltenen kultivierten Zellen wurden dann in ein M9-Medium (ein Shikonin-Wachstumsmedium, enthaltend 10 μM Indolessigsäure und 0,1 μM Kinetin) übergeführt und weiter 2 Tage kultiviert. Unter Verwenden eines "QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) wurde mRNA gemäß einer Standardmethode der Gebrauchsanweisung des Gerätes (Kit) hergestellt. Anschließend wurde unter Verwendung eines "First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia Biotech)" und von Oligo (dT) 12-18 Primern, RT-PCR mit der erhaltenen mRNA als Matrize durchgeführt. Ein Gemisch aus den erzeugten DNA-Fragmenten wurde als cDNA-Bibliothek bereitgestellt und als Matrize für eine PCR zur Amplifikation des Gens verwendet.
  • (Herstellung einer cDNA-Bibliothek von Camellia sinensis)
  • DNA-Fragmente wurden aus gefrorenen jungen Blättern von Camellia sinensis (die am Nachmittag bei gutem Sonnenschein gepflückt worden waren) durch RT-PCR in gleicher Weise wie vorher für Lithospermum erythrorhizon erhalten und ein Gemisch aus den erhaltenen DNA-Fragmenten wurde als cDNA-Bibliothek verwendet, die als Matrize für die Gen-Amplifikations-PCR eingesetzt wurde.
  • (Erhalten des pal-Gens)
  • In Lithospermum erythrorhizon existieren zwei Arten von palGenen (nachstehend als "LePAL1" und "LePAL2" bezeichnet). Die beiden Arten von Genen wurden bereits von Yazaki et al. in den Datenbanken wie GenBank und EMBL als SEQ ID NR: D83075 und D83076 offenbart. Ein in Camellia sinensis vorkommendes pal-Gen (nachstehend als "CAMPAL" bezeichnet) wurde bereits von Matsumoto et al. in den vorstehenden Datenbanken als SEQ ID NR: D26596 offenbart. Unter Verwendung des 5'-Terminus und des 3'-Terminus dieser wurden Primer hergestellt, die spezifisch für die pal-Gene sind. Die Primer wurden hier so konstruiert, dass sie geeignete Restriktionsstellen an beiden Enden hatten, sodass das erhaltene DNA-Fragment mit einem Plasmidvektor ligiert werden kann.
  • Aufgrund der Suche nach geeigneten Restriktionsenzymen (die keine Schnittstellen in der Sequenz des pal-Gens hatten) unter Restriktionsenzymen, die häufig für die Mehrfachklonierungsstellen von verschiedenen Typen von Plasmidvektoren verwendet wurden, wurde festgelegt, dass für LePAL2 eine EcoRI-Schnittstelle auf der Seite des 5'-Terminals verwendet wurde und dass eine SalI-Schnittstelle am 3'-Terminal verwendet wurde und dass für CAMPAL eine SmaI-Schnittstelle an dessen 5'-Terminal verwendet wurde und eine HindIII-Schnittstelle auf der Seite des 3'-Terminals verwendet wurde. Da keine geeigneten Schnittstellen für die Seite des 5'-Terminals von LePAL1 gefunden wurden, wurde am 5'-Terminus eine EcoRV-Schnittstelle verwendet und das nach der Spaltung erzeugte stumpfe Ende wurde so konstruiert, dass es mit dem stumpfen Ende der SmaI-Schnittstelle eines Vektors ligierte. Für die Seite des 3'-Terminals von LePAL1 wurde ebenso wie bei LePAL2 eine SalI-Schnittstelle verwendet.
  • Sequenzen der Primer:
  • (LePAL1)
  • [Sequenz 1]
    • 5'-Terminus (mit einer EcoRV-Schnittstelle): Ein 23-mer-Oligonukleotid, welches eine in Sequenzliste 1 gezeigte Sequenz hat
  • [Sequenz 2]
    • 3'-Terminus (mit einer SalI-Schnittstelle): Ein 23-mer-Oligonukleotid, das eine in Sequenzliste 2 gezeigte Sequenz hat
  • (LePAL2)
  • [Sequenz 3]
    • 5'-Terminus (mit einer EcoRI-Schnittstelle): Ein 25-mer-Oligonukleotid, das eine in Sequenzliste 3 gezeigte Sequenz hat
  • [Sequenz 4]
    • 3'-Terminus (mit einer SalI-Schnittstelle): Ein 23-mer-Oligonukleotid, das eine in Sequenzliste 4 gezeigte Sequenz hat
  • (CAMPAL)
  • [Sequenz 5]
    • 5'-Terminus (mit einer SmaI-Schnittstelle): Ein 23-mer-Oligonukleotid, das eine in Sequenzliste 5 gezeigte Sequenz hat
  • [Sequenz 6]
    • 3'-Terminus (mit einer HindIII-Schnittstelle): Ein 23-mer-Oligonukleotid, das eine in Sequenzliste 6 gezeigte Sequenz hat
  • Zusammensetzung der Reaktionslösung:
    Templat-cDNA 0,5 bis 2 μg
    Primer 100 pmol jeweils
    dNTPs-Lösung 1 mM jeweils
    10 × Reaktionspuffer 10 μl
    ExTaq-DNA-Polymerase (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) 2,5 U
    Insgesamt: 50 μl
    Reaktionsbedingungen:
    Wärmedenaturierung 94°C, 30 Sekunden
    Anellierung 55° C, 60 Sekunden
    Verlängerung 72° C, 120 Sekunden
    Anzahl der Zyklen 24 Zyklen
  • Bei dem Versuch der Amplifizierung von Genfragmenten unter den obigen Bedingungen, wobei die Menge der Matrizen-cDNA mehrere Male variiert wurde, wurde ein Fragment einer Länge von etwa 2,1 kb jedes von LePAL1, LePAL2 und CAMPAL, das theoretisch berechnet wurde, fast spezifisch amplifiziert. Das so amplifizierte Fragment jeder der Gene LePAL1, LePAL2 und CAMPAL wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen und dann extrahiert, gewonnen und gereinigt. Wenn danach die Analyse der Nukleotidsequenzen mit den für die Amplifizierung verwendeten Primern durchgeführt wurde, wurde bestätigt, dass die erhaltene Information der Nukleotidsequenzen denen der Sequenzen von LePAL1, LePAL2 und CAMPAL entsprach.
  • Beispiel 6: Herstellung eines Transformanten mit PAL-Aktivität
  • Die erhaltenen Genfragmente wurden der Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, wonach die Extraktion und Gewinnung erfolgte. Die so erhaltenen Fragmente von LePAL1, LePAL2 und CAMPAL mit Restriktionsschnittstellen wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRV und SalI, EcoRI und SalI beziehungsweise SmaI und HindIII geschnitten. Danach wurden Verfahrensschritte wie Agarosegel-Elektrophorese, Extraktion und Gewinnung erneut durchgeführt. Diese Fragmente wurden mit pUC18, welches durch Schneiden mit EcoRV und SalI, EcoRI und SalI und SmaI und HindIII erhalten worden war, ligiert und dann der Agarosegel-Elektrophorese, Extraktion und Gewinnung unterworfen (1 und 2).
  • Die Transformanten, die durch Transformieren von Escherichia coli JM109 mit diesen Plasmiden erhalten worden waren, wurden auf eine L-Agarplatte, die 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und 0,1% X-Gal enthielt, aufgetragen, wonach die Kultur bei 37°C während 24 Stunden erfolgte. Unter den gebildeten Kolonien wurden einige Kolonien, die weiße Färbung zeigten, selektiert und die Plasmide daraus wurden hergestellt, um die Restriktionsenzym-Spaltungsmuster zu prüfen. Als Ergebnis wurden zahlreiche Transformanten mit interessierenden Plasmiden, pULePAL1, pULePAL2 und pUCAMPAL, erhalten.
  • Aus jedem Typ der erhaltenen Transformanten wurden 3 Stämme willkürlich ausgewählt. Nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode wurden Duplikate jedes Stammes (2 Spezies × 3 Stämme × 2 Linien) in 5 ml L-Brühe kultiviert. 12 Stunden nach dem Start der Kultur wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer der 2 Linien gegeben, sodass die IPTG-Konzentration in der Kulturlösung 0,1 mM wurde, wonach 4 Stunden lang kultiviert wurde. Die erhaltenen Kulturlösungen wurden gesondert zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen und die erhaltenen Zellen wurden dann einer Reaktion gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methode unterworfen. Nach 10-stündiger Reaktion wurde das erhaltene Produkt durch HPLC bestimmt. Wie in Tabelle 5 gezeigt ist, besaß jeder Transformant Phenylalanin-Ammoniak-Lyase-Aktivität, unabhängig davon, ob Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) anwesend war oder fehlte. [Tabelle 5]
    Figure 00570001
    Figure 00580001
  • Beispiel 7: Herstellung eines Phenylalaninderivats unter Verwendung des Transformanten
  • Ein Stamm aus jedem Typ von Transformanten mit pULePAL1, pU-LePAL2 und pUCAMPAL, die in Beispiel 6 erhalten wurden, wurde in 100 ml einer L-Brühe, die 100 ppm Ampicillin enthielt, nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode kultiviert. Die erhaltene Kulturlösung wurde in einen 5 l-Krugfermenter übergeführt, der 2 1 L-Brühe mit einem Gehalt an 100 ppm Ampicillin enthielt, und danach wurde eine Rührkultur bei 800 UpM bei 30°C unter Belüftung von 1 ml/min während 10 bis 12 Stunden durchgeführt.
  • Die durch zentrifugieren der Kulturlösung im Bereich von der späten logarithmischen Wachstumsphase bis zu der frühen stationären Phase erhaltenen Zellen wurden wieder in 1 1 einer 4 M Ammoniak/Ammoniumcarbonat-Lösung (pH 10,3) suspendiert und 20 g Substrat (siehe Tabelle 6) wurde zugesetzt, wonach die Reaktion bei 30°C unter Rühren mit 800 UpM durchgeführt wurde. Jede Stunde wurde ein Anteil der Reaktionslösung entnommen und das in der Reaktionslösung gebildete Produkt (siehe Tabelle 6) wurde durch HPLC bestimmt. Während das Substrat nach und nach zugefügt wurde, sodass die Konzentration des Substrats bei etwa 2% gehalten wurde, wurde die Reaktion fortgesetzt. Nach etwa 10 Stunden war das Produkt in einer Konzentration von 1% bis 3% in der Reaktionslösung angereichert (Tabelle 6).
  • Nach der Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung eines Rotationsverdampfers im Vakuum konzentriert, um überschüssiges Ammoniak zu entfernen, und dann wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um den pH-Wert auf 1 einzustellen und die verbliebene Substanz auszufällen. Die Lösung wurde mithilfe eines Filters filtriert und dann wurde der Überstand mit einem Rotationsverdampfer konzentriert. Das kristallisierte Produkt wurde durch Filtration gewonnen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (0,1 n) gewaschen, wonach es im Vakuum getrocknet wurde. Die Reinheit dieser getrockneten Probe war 99% oder mehr. In jedem System wurde als Verunreinigung ein Zimtsäurederivat oder ein Acrylsäurederivat, das als Substrat verwendet worden war, aufgefunden. Wenn die optische Reinheit dieser Derivate mithilfe der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt wurde, wurde lediglich die L-Form in beiden Derivaten festgestellt, während die D-Form unterhalb der Nachweisgrenze war. [Tabelle 6]
    Figure 00600001
  • In den vorliegenden Beispielen wurden zahlreiche Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen verwendet, um zu zeigen, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Phenylalanin-Ammoniak-Lyasen aus Pflanzen allgemein wirksam sind (die Aminosäuresequenz von Cucumis sativus L. ist nicht identifiziert).
  • Die Sequenzhomologie in den Aminosäuresequenzen ist in 3 gezeigt. Es wurde gefunden, dass erfindungsgemäß jedes dieser Enzyme ausreichend wirksam ist, obwohl die Enzyme sich in ihren Aminosäuresequenzen um 10% bis 20% unterscheiden, das heißt, dass diese Enzyme eine weit höhere Fähigkeit zum Umwandeln der Substrate zur Bildung eines Phenylalaninderivats haben, als das gleiche Enzym, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyase aus einem Acrylsäurederivat als Ausgangsmaterial die entsprechende Aminosäure bequem und wirksam erhalten werden. So kann insbesondere ein L-Phenylalaninderivat, das verschiedene Substituenten an der Phenylgruppe enthält, einfach und wirksam erhalten werden.
  • Die mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Aminosäure erhaltene L-Aminosäure eignet sich als chiraler Baustein für eine biologisch aktive organische Verbindung, wie als Arzneimittel-Zwischenprodukt oder landwirtschaftliches Zwischenprodukt auf einem breiten Gebiet und ist hauptsächlich als Arzneimittel-Zwischenprodukt wertvoll. SEQUENZLISTE
    Figure 00620001
    Figure 00630001

Claims (30)

  1. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Wirkenlassen in Gegenwart von Ammoniak einer von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyase auf ein Acrylsäurederivat der folgenden allgemeinen Formel (1) umfasst:
    Figure 00640001
    worin Z eine aromatische Ringgruppe darstellt, die ein Heteroatom aufweisen kann, R einen Substituenten an dem aromatischen Ring darstellt und n eine ganze Zahl von 0 oder höher ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können; wobei die L-Aminosäure durch die folgende allgemeine Formel (2) dargestellt ist:
    Figure 00640002
    worin Z eine aromatische Ringgruppe ist, die ein Heteroatom aufweisen kann, R ein Substituent an dem aromatischen Ring ist, n eine ganze Zahl von 0 oder höher ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
  2. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 1, worin Rn-Z- durch die folgende Formel (3) dargestellt ist:
    Figure 00650001
    worin R ein Substituent an einem Benzolring ist und eine Cyangruppe, Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellt und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
  3. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 1, worin Rn-Z- durch die folgende allgemeine Formel (4) dargestellt ist:
    Figure 00650002
    worin X S, O, NH oder NR1 darstellt, R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, R ein Substituent an einem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Heteroxygruppe, Carboxygruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt und n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
  4. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 1, worin Rn-Z- durch die folgende allgemeine Formel (5) dargestellt ist:
    Figure 00660001
    worin X S, O, NH oder NR1 ist, R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, R ein Substituent an einem Heteroring ist und eine Cyangruppe, Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Amidgruppe, ein Fluoratom, Chloratom, Bromatom, eine Aminogruppe, Nitrogruppe, Hydroxymethylgruppe oder eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt und n eine ganze Zahl von 0 bis 3 darstellt und, wenn n 2 oder höher ist, die Substituenten R gleich oder unterschiedlich sein können.
  5. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches den Einsatz einer Zusammensetzung, erhalten durch Behandeln von Pflanzengewebe, das eine Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthält, umfasst.
  6. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches den Einsatz einer kultivierten Pflanzenzelle, die eine Phenylalanin-Ammoniak-Lyase enthält, und/oder einer behandelten Zusammensetzung davon umfasst.
  7. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches das Zulassen der Exprimierbarkeit eines von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegens in einer Pflanze und den Einsatz von transformierten Pflanzenkulturen oder eines behandelten Produkts der Pflanzenkulturen umfasst.
  8. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches das Zulassen der Exprimierbarkeit eines von einer Pflanze abgeleiteten Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegens in einem Mikroorganismus und den Einsatz einer transformierten Mikroorganismuskultur, eines behandelten Produkts davon oder eines von der Kultur erhaltenen Enzyms umfasst.
  9. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 7 oder 8, wobei das von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen ein Gen ist, das für eine Aminosäuresequenz mit 70% oder höherer Homologie zu der Aminosäuresequenz kodiert, die von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens aus Lithospermum erythrorhizon abgeleitet ist.
  10. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 7 oder 8, wobei das von einer Pflanze abgeleitete Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen ein Gen ist, das für eine Aminosäuresequenz mit 80% oder höherer Homologie zu der Aminosäuresequenz kodiert, die von der Nukleotidsequenz des pal2-Gens aus Lithospermum erythrorhizon abgeleitet ist.
  11. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze, von der das Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen abgeleitet ist, Lithospermum und/oder Camellia ist.
  12. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium, Hefe und/oder ein filamentöser Pilz ist.
  13. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach Anspruch 12, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
  14. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Hydroxygruppe ist.
  15. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Cyangruppe ist.
  16. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Carboxygruppe ist.
  17. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Amidgruppe ist.
  18. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Halogengruppe ist.
  19. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Aminogruppe ist.
  20. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Nitrogruppe ist.
  21. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Hydroxymethylgruppe ist.
  22. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei in der allgemeinen Formel (3) mindestens einer der Substituenten R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
  23. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei R eine unter einer Cyangruppe, Hydroxygruppe, Nitrogruppe und Carboxygruppe ausgewählte Gruppe ist und n 1 ist.
  24. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 2 und 5 bis 13, wobei die L-Aminosäure L-Phenylalanin ist.
  25. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 3 und 5 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (4) 0 ist.
  26. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 3 und 5 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (4) S ist.
  27. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 3 und 5 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (4) NH ist.
  28. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (5) 0 ist.
  29. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (5) S ist.
  30. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei X in der allgemeinen Formel (5) NH ist.
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