CN1568368A - 产生l－氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
产生光学活性氨基酸的方法，包括在植物酶作用下向丙烯酸衍生物添加氨并获得相应的光学活性氨基酸。产生L－氨基酸的方法包括在氨存在下允许来自植物的苯丙氨酸脱氨酶作用于丙烯酸衍生物，其中所述丙烯酸衍生物具有含不同取代基及杂原子的芳环基。
Description
发明背景
本发明涉及产生光学活性氨基酸的方法，它包括在植物酶的作用下向丙烯酸衍生物添加氨，因此获得相应的光学活性氨基酸。光学活性氨基酸用作药物、农用化学品及其他精细化学品的合成原料。
已经研究了很多用于获得光学活性氨基酸的方法，例如涉及到使用非对称催化剂的有机合成反应及涉及到使用微生物特异性的发酵方法。
有许多出版物例如英国专利号1489468及日本专利申请公开53-96388(1978)报道了通过光学选择产生光学活性苯丙氨酸的方法，其中将来自微生物的苯丙氨酸脱氨酶或自身有该酶活性的微生物作用于肉桂酸。此方法使用在高氨浓度下通过酶的作用在肉桂酸的α-碳上添加氨基的反应，并因此可以产生有高光学纯度的L-苯丙氨酸。
作为获得在其苯基上有取代基的光学活性L-苯丙氨酸衍生物的方法，要考虑在苯基上引入取代基、对L-苯丙氨酸应用不同类型修饰反应的方法。然而通过这种方法，产量减少是不可避免的，这是由于发生在非苯基部分的副反应，并且降低了光学纯度，这是由于在极端严酷反应条件下的外消旋增进。而且，由于获得引入苯基的取代基的位置特异性是困难的，所以导致了低产量或分离和纯化的难度。因此，此方法是不可行的。
本文考虑了另一个方法，它使上述苯丙氨酸脱氨酶作用于有取代苯基的肉桂酸衍生物，所需的取代基此前已引入肉桂酸衍生物。由于此方法在适度条件下进行酶反应，它没有产生对苯基及其上的取代基的副反应引起的不利影响，因此可以预期此方法提供了高纯度的光学活性L-苯丙氨酸衍生物。
然而，由于来自微生物的苯丙氨酸脱氨酶的底物特异性一般是严格的，所以与从肉桂酸到L-苯丙氨酸的原始反应性相比，大多数情况下这个酶对取代苯基有极低的反应性或者几乎没有反应性。只有少数几个公开的例子，例如通过上述酶的作用获得光学活性氟化苯丙氨酸的方法，使用有氟化苯基的肉桂酸衍生物作为起始原料(日本专利申请公开号63-148992(1988))；或者通过使用特定微生物红酵母属(Rhodotorula)获得苯丙氨酸衍生物的方法(美国专利号5981239)。可应用的化合物是有限的而且产量不是工业上足够的。
通常，苯丙氨酸脱氨酶在整个生物界例如动物、植物、微生物中的广泛分布是已知的。就是说，含有这种酶的微生物的例子包括Rhodosporidium rubra(日本专利申请公开号61-043993(1986)，GB1489468)、红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)(日本专利公开号60-227670(1985))、芽枝状枝孢(Cladosporidium cladosporioides)(日本专利申请公开号62-111687(1987))等等；并且除这些例子外，许多其他微生物也有报道。
含有苯丙氨酸脱氨酶的植物例子包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、茶(大叶茶(Camellia sinensis))、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、柠檬(Citruslimonis)、黄瓜(Cucumis sativus L.)、胡萝卜(Daucus carota)、murasaki(紫草(Lithospermum erythrohizon))、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、欧芹(parsley)(Petroselinumcrispum，Petroselinum hortense)、火炬松(Pinus taeda)、白杨(Populuskitakamiensis等)、樱桃(Prunus avium)、树莓(Stylosantheshumilis)、苜蓿(Trifolium subterrane)、葡萄(Vitis vinifera)、bush bean(菜豆(Phaseolus vulgaris))等等。
有许多关于来自植物的苯丙氨酸脱氨酶结构基因pal(此后称为“pal基因”)的报道。已确定的pal基因的例子包括水稻(Oryzasativa，Biochim.Biophys.Acta(1993)，1171(3)，321-322，Plant Mol.Biol.(1995)，29(3)，535-550)、茶(大叶茶(Camellia sinensis)，Theor.Appl.Genet.(1994)，89(6)，671-675)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，Plant Mol.Biol.(1995)，27，327-338)、murasaki(紫草(Lithospermum erythrohizon)，Biosci.Biotech.Biochem.(1997)，61(12)，1995-2003)、番茄(Lycopersicon esculentum，J.Biol.Chem.(1992)，267，11824-11830)、苜蓿(Trifolium subterraneum，Gene(1994)，138(1-2)，87-92)、豌豆(Pisum sativum，Plant Mol.Biol(1992)，20(1)，167-170，日本专利申请公开号(Kokai)5-153978(1993))、白杨(Populus trichocarpa，Plant Physiol.(1993)，102，71-83)、烟草(Nicotianatabacum，Plant Mol.Biol(1996)，30，711-722)、大豆(Glycinemax，DNAsequence(1991)，1(5)，335-346)、甘薯(Ipomoea batatas，，PlantPhysiol.(1989)，90(4)，1403-1407)、小麦(Triticum aestivum)、欧芹(Petroselinum crispum)、向日葵(Helianthus annuus)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等的pal基因；已知pal基因的数目达到40多种，其中包括同一物种内的同分异构体及部分序列。
来自植物的苯丙氨酸脱氨酶相互间有许多保守序列；它们的氨基酸序列在最低程度显示50％或更高的同源性。因此，可以预测它们在功能和特性上有许多共同点。
来自植物的苯丙氨酸脱氨酶已知是植物次生代谢中苯丙素(phenylpropanoid)和异黄酮类化合物合成途径中的初始酶，也是催化反应的限速酶，即苯丙氨酸的脱氨反应。由于此酶及其基因被认为与植物的胁迫抗性有关，此酶的功能已经被完全研究了。而且，使pal基因在植物体内表达以产生疾病抗性植物已经做了广泛的基础和应用尝试。
尽管许多研究报道存在如上述的来自微生物的相同酶的差异，对于从物质产生所做的研究，仍没有进行产生能用作普通工业原料的有机化合物的尝试，除了增加苯丙素或异黄酮类化合物的一些有用物质含量的尝试(Planta.(1979)，14(6)，369-376，Biochim.Biophys.Acta.563，278-292)。不必说，仍然没有关于通过逆反应例如氨基化反应来尝试制造物质的报道。首先，不但本酶而且来自植物的其他酶很少用于制造物质；考虑到这些酶的低稳定性、高底物特异性等，普遍接受的观点是这些酶的可行性比来自微生物的酶的低。因此，当本领域技术人员构思制造与本发明类似的有机化合物L-苯丙氨酸衍生物的方法时，来自植物的酶是他们最不注意的原料，以至于认为有相同催化功能的酶出现在其他来源中。
发明概述
本发明的一个目标是提供方便而高效地获得高光学纯度L-氨基酸的新方法。就是说，本发明的一个目标是提供简单而高效地获得高光学纯度L-氨基酸的新方法，用丙烯酸衍生物例如在苯基上有取代基的肉桂酸作为起始原料。
本发明人集中注意于来自植物的苯丙氨酸脱氨酶的宽底物特异性并研究了酶的活性以产生各种工业上有用的氨基酸。
首先，在整个生物界，例如动物、植物和微生物中，已经搜寻了对在其苯基上有取代基的肉桂酸有高反应性的脱氨酶。
结果是，本发明人发现，对产生苯丙氨酸衍生物来说，来自植物的苯丙氨酸脱氨酶比以前已知的来自微生物的相同酶有更高活性。如上述，与这些酶有关的、植物体内产生苯丙素、异黄酮类化合物等的步骤已充分研究了，但这些研究涉及由苯丙氨酸发生消去反应失去氨基而产生肉桂酸衍生物。逆反应，就是说，由于在来自植物的酶作用下使肉桂酸衍生物添加氨基而产生苯丙氨酸衍生物的可能性还没有研究。
而且，本发明人集中注意于来自植物的苯丙氨酸脱氨酶的宽底物特异性并研究了酶的活性以产生各种类型的工业上有用的氨基酸和苯丙氨酸衍生物。结果是，本发明人发现，有芳环结构的丙烯酸衍生物(其可以有取代基并且可以含有杂原子)用作底物时，这个酶作用以产生相应的L-氨基酸。
进一步深入研究的结果是，本发明人发现通过使用有来自植物的pal基因高表达的微生物可以极高效率地产生氨基酸，因此完成本发明。
用有上面通式[1]描述的结构的丙烯酸衍生物作为底物时，来自植物的苯丙氨酸脱氨酶催化产生氨基酸反应的能力仍然未知，这是本发明人获得的一个新发现。
而且，用有上面通式[3]描述的、其苯基上有各种取代基的肉桂酸衍生物作为底物时，来自植物的苯丙氨酸脱氨酶催化产生苯丙氨酸衍生物反应的能力仍然未知，这是本发明人获得的一个新发现。
另外，用有上面通式[4]或[5]描述的具杂环取代基的丙烯酸衍生物作为底物时，来自植物的苯丙氨酸脱氨酶催化产生L-氨基酸反应的能力仍然未知，这是本发明人获得的一个新发现。
就是说，本发明包括以下[1]到[30]方面：
[1]产生L-氨基酸的方法，它包括在氨存在下，将来自植物的苯丙氨酸脱氨酶作用于以下通式[1]代表的丙烯酸衍生物：
其中
Z代表含有杂原子的芳环基，R代表芳环上的取代基，且n代表0或更大的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的；
由下面通式[2]代表的L-氨基酸：
其中
Z代表含有杂原子的芳环基，R代表芳环上的取代基，n代表0或更大的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
[2]根据上面[1]的用于产生L-氨基酸的方法，其中用下面通式[3]代表Rn-Z-：
其中
R是苯环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到5的整数，且优选1到5的整数。当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
[3]根据上面[1]的用于产生L-氨基酸的方法，其中用下面通式[4]描述Rn-Z-：
其中
X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
[4]根据上面[1]的用于产生L-氨基酸的方法，其中用下面通式[5]代表Rn-Z-：
其中
X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
[5]根据上面[1]到[4]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，包括使用通过处理含有苯丙氨酸脱氨酶的植物组织而获得的组分。
[6]根据上面[1]到[4]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，包括使用含有苯丙氨酸脱氨酶的植物培养细胞和/或其处理组分。
[7]根据上面[1]到[4]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，包括使来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因可在植物中表达，并使用转化的植物培养物或该植物培养物的处理产物。
[8]根据上面[1]到[4]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，包括使来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因可在微生物中表达，并使用转化的微生物培养物、其处理产物或来自培养物的酶。
[9]根据上面[7]或[8]的用于产生L-氨基酸的方法，其中来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因是编码与来自紫草pal2基因核苷酸序列推导出的氨基酸序列有70％或更高同源性的氨基酸序列的基因。
[10]根据上面[7]或[8]的用于产生L-氨基酸的方法，其中来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因是编码与来自紫草pal2基因核苷酸序列推导出的氨基酸序列有80％或更高同源性的氨基酸序列的基因。
[11]根据上面[1]到[8]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中苯丙氨酸脱氨酶基因来源的植物是紫草属(Lithospermum)和/或山茶属(Camellia)。
[12]根据上面[1]到[8]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中微生物是细菌、酵母和/或丝状真菌。
[13]根据上面[12]的用于产生L-氨基酸的方法，其中细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。
[14]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是羟基。
[15]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是氰基。
[16]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是羧基。
[17]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是酰胺基。
[18]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是卤素基团。
[19]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是氨基。
[20]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是硝基。
[21]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是羟甲基。
[22]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(3)中至少一个取代基R是含有1到6个碳原子的烷基。
[23]根据上面[1]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中R是氰基、羟基、硝基和羧基中的任一个且n是1。
[24]根据上面[2]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
[25]根据上面[3]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(4)中X是O。
[26]根据上面[3]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(4)中X是S。
[27]根据上面[3]和[5]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(4)中X是NH。
[28]根据上面[4]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(5)中X是O。
[29]根据上面[4]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(5)中X是S。
[30]根据上面[4]到[13]中任一项的用于产生L-氨基酸的方法，其中在上面通式(5)中X是NH。
附图简述
图1表示了表达LePAL1和LePAL2的紫草PAL表达质粒的构建；
图2表示了表达CAMPAL的大叶茶PAL表达质粒的构建；和
图3显示PAL氨基酸序列同源性的例子。
优选实施方案详述
本发明详述如下。
通过本发明制造L-氨基酸的方法，可以简单地通过一步酶反应从丙烯酸衍生物获得光学活性氨基酸，其中所述衍生物具有含不同取代基及杂原子的芳环基。
而且，通过本发明制造L-氨基酸的方法，可以简单地通过一步酶反应从丙烯酸衍生物获得光学活性氨基酸，其中所述衍生物具有含不同取代基的苯环基团。
直到反应完成时仍保留事先引入苯环的取代基，例如氰基、羟基、羧基、酰胺基、卤原子、氨基、硝基、羟甲基或有1到6个碳原子的烷基，在反应的适度条件下不受任何不利影响，可以获得高产量的相应所需的L-苯丙氨酸衍生物，转化率几乎是100％。
另外，通过本发明制造L-氨基酸的方法，可以简单地通过一步酶反应从在其侧链上有杂环结构的丙烯酸衍生物获得在其侧链上有杂环结构的光学活性氨基酸。
杂环结构如上面丙烯酸衍生物中的呋喃基、噻吩基、吡咯基等，在反应的适度条件下不受任何不利影响，直到反应完成时仍保留，可以获得高产量的相应所需的L-氨基酸，转化率几乎是100％。
可以通过被称为Perkin反应的方法易于制备本发明中用作反应物的有不同取代基的丙烯酸衍生物，它使其中引入给定取代基的醛衍生物的醛基与乙酐反应(参考Arch.Pharm.(Weinheim).(1994)，327(10)，619-625，等等)；可以通过在吡啶溶液中哌啶存在下有关丙二酸反应的方法(参考J.Chem.Soc.(1939)，357-360，等等)；以及各种其他改进方法(参考Synth.Commun.(1999)，29(4)，573-581，等等)。
本发明中应用的、提供苯丙氨酸脱氨酶活性的植物没有特殊限定。如前面提到的特定的例子包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、茶(大叶茶(Camellia sinensis))、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、柠檬(Citrus limonis)、黄瓜(Cucumis sativus L.)、胡萝卜(Daucus carota)、murasaki(紫草(Lithospermum erythrohizon))、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、欧芹(Petroselinum crispum，Petroselinum hortense)、火炬松(Pinus taeda)、白杨(Populuskitakamiensis，等)、樱桃(Prunus avium)、树莓(Rubus idaeus)、茄子(Solanumtuberosum)、stylo(Stylosanthes humilis)、苜蓿(Trifolium subterrane)、葡萄(Vitis vinifera)、bush bean(菜豆(Phaseolus vulgaris))等等，但此酶在植物中几乎是普遍存在的。
在本发明的一个实施方案中，使用分离自植物的苯丙氨酸脱氨酶。就是说，提供上面的酶作为反应催化剂，使用分离和纯化方法已知传统从植物中分离和纯化酶，例如，对地面植物体提取物使用丙酮沉淀、硫酸铵沉淀、及各种分离柱等。至于从不同类型植物体分离和纯化苯丙氨酸脱氨酶的特定方法，已知有J.Koukol等的报道(J.Biol.Chem.(1961)，236(10)，2692-2698)，和E.A.Harin等的报道(Biochemistry(1973)，12，1583-)，等等。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于目的反应的上述植物体的处理产物。用于反应的植物体处理产物的例子包括地面产物、冷冻干燥产物或植物体提取物；从提取物中通过浓缩和提取催化目的反应的成分获得的产物；通过固定处理产物而获得的产物，在几乎不溶载体上的植物体提取物或提取组分；等等。
此固定载体的例子包括聚乙烯酸、聚异丁烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡甘露聚糖、藻酸盐、角叉菜聚糖、及这些化合物的(交联)共聚物。换句话说，可以以单独或混合的形式使用形成水不溶固体且含有植物提取组分的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，使用上述植物的培养细胞。即用获得培养植物细胞的常见方法培养植物细胞。例如，植物细胞在植物细胞培养的不同已知培养基上培养，例如Murashige和Skoog完全培养基、LS培养基、M9培养基及Gamborg B-5培养基，依据植物的类型选择培养基在有植物激素例如吲哚乙酸或细胞分裂素存在下培养，然后对获得的培养细胞进行反应。此时，为了增加苯丙氨酸脱氨酶活性也可以使用改进的培养基和培养条件。
例如，关于获得培养细胞的培养条件已知有一些报道如Yazaki等的报道，其中紫草的酶活性被诱(Biosci.Biotech.Biochem.(1997)，61(12)，1995-2003)；Klaus等报道了关于在欧芹培养细胞中上述酶活性与培养条件之间的关系(Archiv.Biochem.Biophis.(1975)，66，54-62)；等等。而且，也可以对地面产物、冷冻干燥产物或由此获得的植物培养细胞的提取物；从提取物中通过浓缩和提取催化目的反应的组分获得的产物；通过在几乎不溶载体上固定植物培养细胞的提取物或提取组分获得的产物；等进行反应。
在本发明的另一个实施方案中，将来自植物的pal基因导入微生物或植物以至在其中基因是可表达的，也可以使用由此产生的转化微生物或转化植物。用于基因表达的宿主生物体没有特别限定，以至于此生物体可以是已知能摄入并表达外源基因的生物体。此生物体的例子包括细菌例如埃希氏菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属，酵母例如酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，和丝状真菌例如曲霉菌。
本发明中使用的pal基因可以不仅仅是环境中天然存在的pal基因，也可以是有相同功能的基因(编码有相同活性的酶突变体)。此基因的例子包括来自紫草的pal2基因(数据库登记号D83076)；其编码的氨基酸序列与来自紫草pal2基因核酸序列推导出的氨基酸序列有70％或更高同源性的pal基因；或者优选地，其编码的氨基酸序列与来自紫草pal2基因核酸序列推导出的氨基酸序列有80％或更高同源性的pal基因。如上面提到的，来自植物的苯丙氨酸脱氨酶相互间在其功能及特性上有许多共同点，例如植物pal基因具有足够高的序列同源性及在植物体内具有相同的功能，因此可以预期在本生产方法中有同等的作用。
至于从植物分离酶基因cDNA及用此基因制备转化微生物的方法或从转化微生物分离并收集酶的方法，已知有许多报道例如Yazaki等的报道关于使用紫草的例子(Biosci.Biotech.Biochem.(1997)，61(12)，1995-2003)，W.Schulz等的报道关于使用欧芹的例子(FEBS letter(1989)，258(2)，335-338)，等等。
接下来，获得pal基因的方法，制备表达质粒的方法，及将这些质粒导入不同类型生物体并在其中表达的方法将进一步具体描述。
<获得pal基因的方法>
可以用由已知方法产生的cDNA文库中获得来自植物的pal基因，用与苯丙氨酸脱氨酶的保守序列相应的部分片断作为探针。常规mRNA分离和纯化之后，使用由此获得的mRNA作为模板用反转录酶可以获得所需的cDNA。然而，近年来，用总RNA或mRNA为模板在耐热的反转录酶作用下通过PCR的方法易于获得足够量的cDNA。由此获得的cDNA与合适的质粒载体例如pBR322或pUC18连接以转化用作宿主的大肠杆菌。
为了从如上产生的cDNA文库中获得目的pal基因，可以使用菌落杂交法，其中编码苯丙氨酸脱氨酶的保守序列的寡DNA用作探针。如上面提到的，由于来自植物的苯丙氨酸脱氨酶在全长序列上与被认为的保守序列有高度同源序列，可以根据目的通过选择位置来制备用作探针的寡DNA并可以使用。
质粒制备自通过菌落杂交获得的阳性候选转化子。然后，质粒与合适的引物进行PCR以确认插入质粒的pal基因的位置和方向。来自植物的许多pal基因的原始序列在数据库如GeneBank或EMBL中公开。因此，对于有序列信息的基因，通过绘制限制图来确认制备和方向也是可能的。
<制备表达质粒的方法及制备用作生产的重组微生物的方法>
用合适载体(其特定例子在以后将描述)将pal基因导入细菌例如大肠杆菌或微生物例如酵母(包括酿酒酵母)，并在其中表达，由此可以获得有产生目的苯丙氨酸衍生物活性的重组体。此处，优选宿主为细菌例如大肠杆菌。如后面所述，用从反应混合物中分离微生物反应产物的常规方法可以分离和纯化产生的苯丙氨酸衍生物。
制备含有外源基因的质粒的方法，及将质粒导入微生物例如大肠杆菌并表达的步骤或方法，可以根据在基因工程领域常用的手段或方法来进行(参见，例如，“用于克隆基因的载体(Vectors for cloning genes)”，酶学方法(Methods in Enzymology)，216，第469-631页，1992，Academic Press，和“其它细菌系统(Other bacterial systems)”，酶学方法(Methods inEnzymology)，204，第305-636页，1991，Academic Press)。
作为将外源基因(一组pal基因)导入大肠杆菌的方法，已经建立了几种有效的方法例如Hanahan法或铷法，因此这些方法可用于导入基因(参见如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，“分子克隆实验手册(Molecular cloning-A laboratory manual).”Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。可以用常规方法进行在大肠杆菌中外源基因的表达(参见例如上面提到的“分子克隆实验手册”)，可以使用用于大肠杆菌的具有Lac启动子等的载体如pUC、pBluescript等。使用用于大肠杆菌的载体，有Lac启动子的pBluescript II sk-，本发明人在Lac启动子的下游插入pal基因，并因此允许在大肠杆菌中进行基因表达。
作为将pal基因导入酵母-酿酒酵母的方法，有已经建立的方法例如锂法，可以使用此方法将基因导入(参见例如，“酵母的新生物技术”(“New Biotechnology of yeast”)，在Yuichi Akiyama的领导下由生物工业协会编辑，由Igaku Syuppan中心出版)。使用启动子例如PGK或GPD(GAP)及终止子，可如下进行酵母中外源基因的表达：构建表达盒，其中外源基因插入启动子和终止子之间以处于转录控制下；将此表达盒插入酿酒酵母载体中，例如YRp(用于酵母的多拷贝载体，有酵母染色体的ARS序列作为复制起点)、YEp(用于酵母的多拷贝载体，有酵母的2μm DNA复制起点)、YIp(用于整合入酵母染色体的载体，没有酵母的任一复制起点)等等(参见上面提到的“酵母的新生物技术”Igaku Syuppan中心、和“制造物质的基因工程”(“Genetic Engineering for Productionof Substances”)日本生物科学、生物技术和农业化学协会，ABC系列，由Asakura Shoten出版)。
<培养重组微生物的方法>
根据培养宿主微生物的通用方法进行本发明转化子的培养。
培养转化微生物的碳源可以是宿主微生物用作碳源的原料，此碳源的例子包括糖类例如葡萄糖、蔗糖、果糖和赤糖糊；有机物质例如乙醇、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、苯甲酸和脂肪酸，或它们的碱金属盐；脂族烃例如n-石蜡；天然有机物质例如蛋白胨、肉膏、鱼膏、大豆粉、麸皮、麦芽汁、马铃薯汁。这些物质可单独或组合使用，浓度通常约0.01％到30％，优选地约0.1％到10％。当大肠杆菌用作转化子时，优选使用葡萄糖、蛋白胨、肉膏、麦芽汁等。
培养转化微生物的氮源可以是宿主微生物用作氮源的原料，此氮源的例子包括无机氮化合物例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾；含氮有机原料例如尿素和尿酸；天然有机原料例如蛋白胨、肉膏、鱼膏、大豆粉、麦芽汁、和马铃薯汁。这些原料可以单独或组合使用，浓度通常约0.01％到30％，优选地约0.1％到10％。当使用大肠杆菌作为转化子时，可优选使用硫酸铵、蛋白胨、肉膏、麦芽汁等。
进一步地，根据需要，加入磷酸盐例如磷酸二氢钾或金属盐例如硫酸镁、硫酸亚铁、乙酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钴或硫酸镍以促进细菌细胞的生长。添加剂浓度取决于培养条件，但通常，磷酸盐浓度约0.01％到5％、镁盐约10ppm到1％、其他化合物约0.1ppm到1,000ppm。而且，依赖于所选择的培养基，可添加约1ppm到100ppm的酵母提取物、酪蛋白氨基酸、酵母核酸等作为供应维生素、氨基酸或核酸的来源，以促进细菌细胞的生长。
进一步地，根据需要，在培养过程中可添加与载体的表达启动子相应的诱导物，以允许转化的酶基因在宿主微生物中大量表达。当使用lac启动子时，加入约0.01mM到10mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，当使用的启动子对药物例如氨苄青霉素或卡那霉素有抗性时，加入约0.1ppm到1,000ppm的相应药物。
使用任一组分的所有情况下，pH维持在5到9，培养优选5.5到8。而且，用例如离心或膜过滤的方法从培养液中分离和收集在上述培养基中事先培养的微生物细胞的步骤对减少来自培养液的杂质及利于产物后续分离和收集有用。
用已知的方法例如离心或膜过滤收集通过培养获得的转化微生物并用于目的反应，另外培养液可直接用于目的反应。而且，转化微生物的地面产物或冷冻干燥产物；来自微生物细胞的无细胞提取物；从无细胞提取物中通过浓缩和提取催化目的反应组分获得产物；通过在几乎不溶载体上固定化这些微生物细胞、处理产物、其提取物和提取组分获得的产物等也可用于进行目的反应。
用作上面目的的固定载体的例子包括聚乙烯酸、聚异丁烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡甘露聚糖、藻酸盐、角叉菜聚糖等等、及这些化合物的(交联)共聚物。换句话说，可以以单独或混合的形式使用形成含有微生物或其提取组分的水不溶固体的化合物。而且，在使用之前可以把微生物、提取物或其提取组分保留在固态基质上例如活性炭、多孔陶瓷、玻璃纤维、多孔聚合物造型或硝酸纤维素膜。
<制备及培养用作生产的重组植物的方法>
如上面提到的，通过将pal基因导入植物细胞可以制备产生苯丙氨酸衍生物的植物。作为优选实例，制备含有pal基因的质粒，质粒然后导入合适植物细胞例如烟草的细胞并允许表达以获得产生目的苯丙氨酸衍生物的植物。已经公开了许多关于把不同类型的基因导入植物并表达的技术的研究，可以由这些公知方法得到有增强目的活性的基因(Plant Mol.Biol.(1999)，39(4)，683-693，Plant Biotechnol.(Tokyo)(1998)，15(4)，189-193，Plant Physiol.(1996)，112(4)，1617-1624)。
把外源基因导入植物细胞的已知方法的例子包括涉及到致植物病细菌根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的方法、电穿孔法、涉及基因枪的方法等等，依据打算导入基因的植物的类型可以从这些方法中选择出合适的方法。作为启动子，不但可以使用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，它是系统高表达的启动子；还可以使用在不同器官中特异表达的其他启动子。可以从Clontech得到含有来自CaMV的35S启动子的双元载体pBI121，此载体作为介导根癌农杆菌的载体广泛使用。已经有人发现，可以用基因枪将pal基因导入植物例如烟草，然后导入的pal基因表达并在其中起作用。(ShokubutsuSoshiki Baiyo(1995)，12(2)，165-171)。
制备含有外源基因的质粒的方法，以及将质粒导入植物(叶细胞、茎细胞、根细胞，等等)并表达的方法或步骤的例子，不但包括本发明中出现的方法，而且包括在基因工程领域常规使用的方法，因此可以根据这些技术或方法进行制备、导入和表达质粒(参见，例如Isao Ishida，NorihikoMisawa，Saibo Kogaku Jikken Sosa Nyumon(细胞技术实验入门)，Kodansha，1992)。如上面所制备的重组植物可用于根据如上述植物细胞培养的常规法进行植物细胞培养。
产生本发明L-氨基酸的反应如下实施：1ppm到20％，优选地10ppm到10％的丙烯酸衍生物，终浓度为2M到12M的氨作为反应原料；控制pH在8.5-11之间，优选9到11.5；于存在如上述各种已知方法制备的来自植物的苯丙氨酸脱氨酶、具有酶活性的植物处理产物或培养细胞、由分离自植物的酶基因转化的微生物产生的相同酶、转化的微生物细胞及其处理产物、由酶基因转化的植物产生的相同酶或者转化的植物及其处理产物时，进行反应约1到200小时。
用于调节pH的酸的例子包括无机酸例如硫酸、盐酸、磷酸、硼酸或碳酸，有机酸例如甲酸、乙酸或丙酸及它们的盐。使用挥发酸导致只需要从反应溶液中分离和去除细胞，且使得省去脱盐步骤并易于分离和收集产物成为可能。因此优选使用的酸是碳酸。在这情况下碳酸的例子也包括通过起泡等的把二氧化碳溶于水溶液中然后由解离产生的碳酸。而且，这些酸及氨盐也可用作反应溶液的氨源。基于上述原因，优选使用碳酸铵或碳酸氢铵作为部分或全部氨源。
要指出的是，溶解所有量的添加的丙烯酸衍生物不是必需的，但也可以在反应液中加入提高衍生物溶解度或分散性的溶剂、表面活性物质等。依据反应进程的化合物的消耗，可以连续或间断地添加化合物。在这种情况下反应溶液中的化合物浓度不是总在上述范围之内。
依据反应液中衍生物的特性，用已知的方法分离和收集反应液中产生的L-氨基酸，例如离心、膜过滤、真空干燥、蒸馏、溶剂提取、盐析、离子交换或各种类型的层析。简单地分离和收集由此产生的L-氨基酸的实例如下：用过滤、离心、透析等方法从反应液中去除酶、酶处理产物、转化的微生物或其处理产物等等，之后进行溶剂提取，或酸化反应液，以使未反应的起始原料丙烯酸衍生物沉淀并去除沉淀。
再次调节所获得上清液的pH值达到L-氨基酸的等电点附近，用如上同样的方法收集沉淀的衍生物。因此，可以从反应液中有效地高纯度地收集产物。另外，通过蒸馏等事先从反应液中去除残留的氨，并通过去除水增加浓度以增加在等电点的产物产量也是有用的。
更简单地，用挥发酸进行反应液pH的控制。转化率相对高时，从反应液分离细胞后，产物可以以L-苯丙氨酸衍生物的铵盐形式直接分离。当分离微生物之后有大量起始原料仍然存留时，在溶剂提取之前酸化反应液，由此去除水和酸碱并以L-氨基酸的铵盐形式分离产物。适合于此方法的挥发酸的优选例子包括碳酸及其铵盐。
在某些情况下，依据反应产物的特性，产物在反应液中聚集并因此降低了反应速率。在这种情况下，依据产物浓度，优选使用向反应液中加入氨水、含氨的生理盐水和含氨的反应缓冲液的方法，以连续稀释反应液。另外，有另一个增加反应速率的方法，其中当反应速率降低时分离和收集细胞，收集上清液作为含有产物的溶液，并将收集的细胞放回含有反应原料的溶液或悬液中。可以重复使用此方法，只要来自微生物的脱氨酶还有活性。
本发明中作为起始原料使用的化合物是由下述通式(1)代表的丙烯酸衍生物：
其中Z代表含有杂原子的芳环基，R代表芳环上的取代基，且n代表0或更大的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
获得的化合物是下述通式(2)代表的化合物：
其中Z代表含有杂原子的芳环基，R代表芳环上的取代基，n代表0或更大的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
在上述通式中，Z的例子包括：
由下述通式(6)到(10)代表的一组：
由下述通式(11)到(15)代表的一组：
由下述通式(16)到(20)代表的一组：
由下述通式(21)到(25)代表的一组：
由下述通式(26)到(30)代表的一组：
由下述通式(31)到(35)代表的一组：
由下述通式(36)到(40)代表的一组：
由下述通式(41)到(45)代表的一组：
由下述通式(46)到(50)代表的一组：
以及由下述通式(51)到(55)代表的一组：
在上面通式中R的例子包括氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基。
在上面通式中，n可以是0或更大的整数，它是从可以被取代的芳环的位置数减去1得到的数字，或更小。当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
由上面通式(1)代表的在本发明中用作起始原料的化合物中，Rn-Z-是由下面通式(3)代表的化合物：
其中R是苯环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基。n代表0到5的整数，优选1到5的整数。如果n是2或大于2，每个R可以是相同的或不同的。
所获得的化合物是这样的化合物，其中，在上面通式(2)中，Rn-Z-用上述通式(4)描述，其中R是苯环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基。n代表0到5的整数，优选1到5的整数。如果n是2或大于2，每个R可以是相同的或不同的。
此起始原料的具体例子包括：2-氰基肉桂酸、3-氰基肉桂酸、4-氰基肉桂酸、2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3，4-二羟基肉桂酸、2-硝基肉桂酸、3-硝基肉桂酸、4-硝基肉桂酸、2-羧基肉桂酸、3-羧基肉桂酸、4-羧基肉桂酸、2-氨基肉桂酸、3-氨基肉桂酸、4-氨基肉桂酸、2-氯代肉桂酸、3-氯代肉桂酸、4-氯代肉桂酸、2-氟代肉桂酸、3-氟代肉桂酸、4-氟代肉桂酸、2-溴代肉桂酸、3-溴代肉桂酸、4-溴代肉桂酸、2-碘代肉桂酸、3-碘代肉桂酸、4-碘代肉桂酸、2-甲基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、4-甲基肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、4-异丙基肉桂酸、4-叔丁基肉桂酸、4-甲氧基-3-甲基肉桂酸，等等。
当使用来自紫草的酶时，所使用的起始原料优选是2-氰基肉桂酸、4-氰基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、4-羟基肉桂酸和3，4-二羟基肉桂酸。当使用这些起始原料时，将分别得到2-氰基-L-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、3-羟基-L-苯丙氨酸(偏酪氨酸(metatyrosine))、4-羟基-L-苯丙氨酸(酪氨酸)、和3，4-二羟基-L-苯丙氨酸(DOPA)。在本发明中，肉桂酸衍生物也包括肉桂酸，因此相应的苯丙氨酸衍生物也包括苯丙氨酸。
具体地，用作本发明中起始原料的化合物是这样的化合物，其中，在上面通式(1)中，Rn-Z-是由下面通式(4)代表的：
其中X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
获得的化合物是这样的化合物，其中，在上面通式(2)中，Rn-Z-是由上面通式(4)代表的，
其中X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
在由上面通式(1)描述的、本发明中用作起始原料的化合物中，Rn-Z-是由下面通式(5)代表的：
其中X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的，且得到的化合物是这样的化合物，其中，在上面通式(2)中，Rn-Z-是由上面通式(5)代表的：
其中X代表S、O、NH或NR1，R1代表有1到6个碳原子的烷基，R是杂环上的取代基并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且n代表0到3的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
此起始原料的具体例子包括：2-呋喃丙烯酸、3-呋喃丙烯酸、2-噻吩丙烯酸、3-噻吩丙烯酸、2-吡咯丙烯酸、3-吡咯丙烯酸，等等。
当使用来自紫草的酶时，优选使用的起始原料是2-呋喃丙烯酸和3-呋喃丙烯酸、2-噻吩丙烯酸、3-噻吩丙烯酸、2-吡咯丙烯酸、3-吡咯丙烯酸。当使用这些起始原料时，能分别得到α-氨基-2-呋喃丙酸、α-氨基-3-呋喃丙酸、α-氨基-2-噻吩丙酸、α-氨基-3-噻吩丙酸、α-氨基-2-吡咯丙酸、和α-氨基-3-吡咯丙酸。
根据本发明的方法，使用便于通过有机合成得到的丙烯酸衍生物作为底物，经一步反应，可高效地得到有高光学活性的L-氨基酸。由此得到的L-氨基酸作为合成中间体在需要高光学纯度的精细化学品领域是有用的，其中所述精细化学品例如药品和农用化学品。
实施例：
本发明将在以下实施例中进一步具体描述。实施例只用于阐述目的，无意于限定本发明的范围。
需要提到的是，在下列实施例及比较实施例中，游离酸的盐或酯可代替其用作起始原料。“1个单位”定义为在0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.5)和10mM用作底物的L-苯丙氨酸存在下，30℃时每分钟释放1μmol肉桂酸所需的酶量。
用缩二脲法，使用牛血清白蛋白作为标准测定酶蛋白量，用“单位/mg蛋白”表示酶的特异活性。通过1H-NMR和13C-NMR以及通过将反应液进行HPLC并与标准比较UV吸收强度来进行丙烯酸衍生物及氨基酸的鉴定。
在以下分析条件下对获得的丙烯酸衍生物进行分离和鉴定。
反相HPLC分析条件
柱：Shodex(Showa Denko K.K.注册商标)
RSpak NN-614(Showa Denko K.K.生产)
柱温度：40℃
洗脱液：乙腈/水/50mM H3PO4-KH2PO4溶液(pH3)＝20/70/10
流速：1.0ml/分钟
检测：210nm的UV吸收
通过在下列条件下的光学分辨HPLC进行获得的氨基酸光学纯度分析。
光学分辨HPLC分析条件：
柱：Shodex(Showa Denko K.K.注册商标)
ORpak CRX-853(Showa Denko K.K.生产)
柱温度：室温(22℃)
洗脱液：乙腈/水＝15/85 2.5mMCuSO4
流速：1.0ml/分钟
检测：256nm的UV吸收
实施例1：培养细胞(Petroselinum hortense)的反应
表1显示培养基A的组分
[表1]
| 组分 | mg/L |
| 磷酸氢二钠 | 150 |
| 硝酸钾 | 3000 |
| 硫酸铵 | 134 |
| 七水硫酸镁 | 500 |
| 二水氯化钙 | 150 |
| 七水硫酸亚铁 | 15 |
| 乙二铵四乙酸 | 15 |
| 尼克酸 | 1 |
| 盐酸硫胺素 | 10 |
| 维生素B6盐酸盐 | 1 |
| m-环己六醇 | 100 |
| 水合硫酸锰 | 10 |
| 硼酸 | 3 |
| 七水硫酸锌 | 2 |
| 二水钼酸钠 | 0.25 |
| 硫酸铜 | 0.025 |
| 六水氯化钴 | 0.025 |
| 碘化钾 | 0.75 |
| 蔗糖 | 20000 |
| 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D) | 2 |
pH＝5.5
将含有上述组分的十升培养基A等分地倒入锥形瓶中，然后将之前已经在27℃暗处通风条件下在相同培养基中传代培养的欧芹(Petroselinumhortense)细胞培养悬浮液(传代培养第5代)接种入每个培养基，之后以200转/分钟27℃暗处通风条件下摇动培养10天。然后，在荧光灯的光下进一步培养24小时。获得的培养液用玻璃纤维过滤器进行真空过滤以得到1.6kg含有苯丙氨酸脱氨酶的培养细胞。活性是0.0051单位/每克鲜细胞重。
两克获得的培养细胞在含有0.1％的不同丙烯酸衍生物的10mL 2M氨/碳酸铵溶液(pH10)(通过混合2M氨水及2M碳酸铵溶液调pH获得)中重悬，30℃搅动24小时进行反应，表2显示每个反应获得的产物、其浓度及光学纯度。
对比实施例1：用来自微生物的酶的反应
在与实施例1相同条件下进行反应，例外的是加入具有0.44单位/mg比活性的来自红酵母(Rhodotorula glutinis)(Sigma)的0.025mg市售苯丙氨酸脱氨酶，而不是实施例1中的培养细胞。表2显示得到的产物、其浓度及光学纯度。
[表2]
| 底物 | 肉桂酸 | 3-羟基肉桂酸 | 3，4-二羟基肉桂酸 | 2-氰基肉桂酸 | 4-氰基肉桂酸 | |
| 产物 | L-苯丙氨酸 | 偏酪氨酸 | L-DOPA | L-2-氰基苯丙氨酸 | L-4-氰基苯丙氨酸 | |
| 产物浓度(mg/L) | 实施例1 | 210 | 180 | 170 | 240 | 250 |
| 对比实施例1 | 190 | 50 | 30 | 5 | 没检测 | |
| 产物光学纯度(％) | 实施例1 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 |
| 对比实施例1 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | - | |
实施例2：用培养细胞(Petroselinum hortense)处理产物的反应
与实施例1相同的方法通过培养获得的欧芹培养细胞(1.5kg)在3L0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.8)中重悬，重悬液在冰上进行超声匀浆20分钟。通过10,000转/分钟离心15分钟从获得的处理产物中沉淀出不溶级分并收集上清液。在超过30分钟的时间，将压碎的硫酸铵搅拌下逐渐加至冰上的所获提取物中，使浓度为40％饱和，然后将溶液于10,000转/分钟离心15分钟，移出沉淀。同样将硫酸铵加至所获上清液中，使浓度为5％饱和，然后将溶液于10,000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。将获得的沉淀溶解在150ml 0.05Mtris-Hcl缓冲液中，然后用100倍体积相同缓冲溶液4℃进行透析24小时。透析之后，得到的170ml溶液作为苯丙氨酸脱氨酶的粗酶提取液。蛋白质总量是620mg，比活性是0.0205U/mg。
向1ml获得的粗提取液及9ml 2M氨/碳酸铵溶液(pH10)(通过混合2M氨水及2M碳酸铵溶液调pH获得)的混合溶液中加入不同的桂酸衍生物，以使混合液含有0.5％衍生物，然后30℃搅拌下24小时进行反应。表3显示从每个反应中得到的产物、其浓度及光学纯度。
对比实施例2：用来自微生物的酶的反应
在与实施例2相同条件下进行反应，例外的加入具是有0.44单位/mg比活性的来自Rhodotorula graminis(Sigma)的0.175mg市售苯丙氨酸脱氨酶，而不是实施例2中的粗酶提取液。
表3显示得到的产物、其浓度及光学纯度。
[表3]
| 底物 | 肉桂酸 | 3-羟基肉桂酸 | 3，4-二羟基肉桂酸 | 2-氰基肉桂酸 | 4-氰基肉桂酸 | |
| 产物 | L-苯丙氨酸 | 偏酪氨酸 | L-DOPA | L-2-氰基苯丙氨酸 | L-4-氰基苯丙氨酸 | |
| 产物浓度(mg/L) | 实施例2 | 1920 | 1600 | 1500 | 2010 | 2040 |
| 对比实施例2 | 1680 | 470 | 200 | 40 | 没检测 | |
| 产物光学纯度(％) | 实施例2 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 |
| 对比实施例2 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | - | |
实施例3：用植物组织处理产物的反应(Cucumis sativus L.；黄瓜)
黄瓜(Cucumis sativus L.)种子种入培养皿，其上放置水润湿的滤纸，25℃发芽72小时。然后，在荧光灯的光下4小时，之后收集约50g下胚轴。
获得的下胚轴组织在冰上于研钵中匀浆，然后在含有1mM谷胱甘肽的100ml 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.8)中重悬匀浆产物的总量，之后超声匀浆碎20分钟。通过10,000转/分钟离心15分钟从获得的处理产物中沉淀出不溶组分，并收集上清液。
在冰上边搅动边向得到的提取物中加磨碎的硫酸铵超过30分钟，以使浓度变成30％饱和，然后10,000转/分钟离心溶液15，移出沉淀。同样地，向得到的上清液中加入硫酸铵以使浓度变成70％饱和，然后溶液10,000转/分钟离心15分钟以收集沉淀。获得的沉淀溶解在20ml 0.05M Tris-Hcl缓冲液中，然后用100倍体积相同缓冲液4℃进行透析24小时。透析之后，得到2.2ml溶液为粗酶提取液。蛋白质总量是50.7mg，比活性是0.0307U/mg。
向0.1ml获得的粗提取液及9.9ml 2M氨/碳酸铵溶液(pH10)(通过混合2M氨水及2M碳酸铵溶液调pH获得)的混合溶液中加入不同的肉桂酸衍生物，以使混合溶液含有0.5％衍生物，30℃搅拌24小时进行反应。表4显示从每个反应中得到的产物、其浓度及光学纯度。
对比实施例3：用来自微生物的酶的反应
作为对比实施例，在与实施例3相同条件下进行反应，例外的只是加入具用有0.44单位/mg比活性的来自Rhodotorula graminis(Sigma)0.16mg市售苯丙氨酸脱氨酶，而不是实施例3中的粗酶提取液。
表4显示得到的产物、其浓度及光学纯度。
[表4]
| 底物 | 肉桂酸 | 3-羟基肉桂酸 | 3，4-二羟基肉桂酸 | 2-氰基肉桂酸 | 4-氰基肉桂酸 | |
| 产物 | L-苯丙氨酸 | 偏酪氨酸 | L-DOPA | L-2-氰基苯丙氨酸 | L-4-氰基苯丙氨酸 | |
| 产物浓度(mg/L) | 实施例3 | 1480 | 1300 | 1280 | 1940 | 2040 |
| 对比实施例3 | 1500 | 400 | 180 | 40 | 没检测 | |
| 产物光学纯度(％) | 实施例3 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 |
| 对比实施例3 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | - | |
实施例4：转化子的培养以及与转化子的反应
细胞在琼脂平板上培养24小时，琼脂平板是通过混合2％琼脂到L液体培养基(1％聚胨、0.5％Nacl、0.5％酵母提取物，pH7.0)并铺平混合物得到的。之后，一接种环量的细胞在5ml到10omlL液体培养基中30℃进一步培养16小时，以获得用于反应的转化子。培养之后，收集细胞并用与培养液相同体积的生理盐水洗涤。然后，细胞体在有一半体积培养液的反应液(4M氨/碳酸铵(pH10.3))中重悬，向其中再加入底物至终浓度为0.2％(2,000mg/L)之后搅拌下于30℃反应。每隔一定时间从此反应液中取等分试样，离心去除细胞，上清液进行HPLC分析以测定产物的量。
实施例5：cDNA文库的制备及pal基因的获得
紫草的细胞培养、cDNA文库的制备及pal基因的获得在Yazaki等的报道(PlantCell Physiol(1995)，36，1319-1329；Biosci.Biotech.Biochem.(1997)，61(12)，1995-2003)中有详细描述，大叶茶(Camellia sinensis)cDNA文库的制备及pal基因的获得在Matsumoto等的报道(Theor.Appl.Genet.(1994)，89(6)，671-675)中有详细描述。根据已有的信息，本发明人在此处增加了一些改进并从每种植物中得到pal基因。一系列的方法都可应用于来自所有植物的pal基因，其核酸序列已经清楚了。除了培养细胞，在一定条件下pal基因在其中表达的植物组织也是可用于获得mRNA的原料。
<紫草cDNA文库的制备>
制备自紫草组织的细胞在LS培养基(含有10μM吲哚乙酸及0.1μM细胞分裂素的常规生长培养基)中25℃培养一个星期。然后得到的培养细胞转移至M9培养基(含有10μM吲哚乙酸及0.1μM细胞分裂素的紫草宁生长培养基)进一步培养2天。用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)，根据试剂盒说明书中的标准方法从得到的培养细胞制备mRNA。随后，用第一链cDNA合成试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)及Oligo(dT)12-18引物，以得到的mRNA为模板进行RT-PCR。产生的DNA片段的混合物用作cDNA文库，用作基因扩增PCR的模板。
<大叶茶cDNA文库的制备>
用与上面紫草相同的方法通过RT-PCR从大叶茶冷冻幼叶(阳光好的下午收集)中得到DNA片段，得到的DNA片段的混合物用作cDNA文库，用作基因扩增PCR的模板。
<pal基因的获得>
在紫草中存在两类pal基因(此后称为“LePAL1”和“LePAL2”)。两类基因已经被Yazaki等公布。在数据库例如GenBank和EMBL中分别是SEQ ID NOS：D83075和D83076。大叶茶中存在的pal基因(此后称为“CAMPAL”)已经被Matsumoto等公布，在上面数据库中是SEQ IDNO：D26596。用其5`端和3`端的序列，制备pal基因的特异引物。此处，设计引物以使在两端有合适的酶切位点，以使得到的DNA片段能连入质粒载体。
从常用于各种类型质粒载体多克隆位点的限制性酶搜索合适的限制性酶(其在pal基因序列中无切割位点)的结果是，对于LePAL2，在其5`末端使用EcoR I位点且在其3`末端使用Sal I位点，对于CAMPAL，在其5`末端使用Sma I位点且在其3`末端使用Hind III位点一侧。由于没有发现LePAL1 5`末端合适的位点，在其5`末端使用EcoRV位点，设计切割之后产生的钝末端与载体的Sma I位点钝末端连接。至于LePAL1的3`末端，与LePAL2一样用Sal I位点。
引物序列：
<LePAL1>
[序列1]
5`末端(有EcoRV位点)：为序列列表1中所示的23mer寡核苷酸序列
[序列2]
3`末端(有Sal I位点)：为序列列表2中所示的23mer寡核苷酸序列
<LePAL2>
[序列3]
5`末端(有EcoR I位点)：为序列列表3中所示的25mer寡核苷酸序列
[序列4]
3`末端(有Sal I位点)：为序列列表4中所示的23mer寡核苷酸序列
<CAMPAL>
[序列5]
5`末端(有Sma I位点)：为序列列表5中所示的23mer寡核苷酸序列
[序列6]
3`末端(有Hind III位点)：为序列列表6中所示的23mer寡核苷酸序列
反应液组分：
cDNA模板 0.5到2μg
引物 每种引物100pmol
dNTP溶液 每种1mM
10×反应缓冲液 10μL
ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Shuzo有限公司) 2.5U
总体积： 50μL
反应条件：
热变性 94℃ 30秒
退火 55℃ 60秒
延伸 72℃ 120秒
循环数 24个循环
当在上面条件下尝试基因片段扩增时，虽然几次变化了模板cDNA的量，但理论上计算的LePAL1、LePAL2和CAMPAL的长度约2.1Kb的片段，几乎被特异扩增。由此扩增的第一LePAL1、LePAL2和CAMPAL片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后提取、收集并纯化。随后，用用于扩增的引物进行核酸序列分析，确认得到的核苷酸序列信息与LePAL1、LePAL2和CAMPAL的序列信息匹配。
实施例6：制备显示pal活性的转化子
获得的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳之后提取并收集。由此获得的有限制性位点的LePAL1、LePAL2和CAMPAL片段分别用限制性酶EcoRV和Sal I，EcoR I和Sal I，Sma I和Hind III切割。之后再次进行例如琼脂糖凝胶电泳、提取和收集的操作。这些片段与已用EcoRV和Sal I，EcoR I和Sal I，Sma I和Hind III切割然后进行琼脂糖凝胶电泳、提取和收集获得的pUC18连接(图1和图2)。
用这些质粒转化大肠杆菌JM109得到的转化子铺于含有0.1mM异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)和0.1％X-Gal的L琼脂平板上，在37℃培养24小时。在产生的菌落中选择呈白色的一些菌落，制备其质粒以检查其限制性酶切模式。结果是，得到含有目的质粒pULePAL1、pULePAL2和pUCAMPAL的大量转化子。
从每种得到的转化子中任意挑选3个菌株。按照实施例4中描述的方法，每一菌株(2个种×3菌株×2品系)取双份在5ml L液体培养基中培养。初始培养12小时后，异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)加入到2个品系中的任一个，以使培养液中IPTG浓度变为0.1mM，之后再培养4小时。获得的培养液分别进行离心以收集细胞，得到的细胞按照实施例4中描述进行方法的反应。反应10小时后，得到的产物通过HPLC测定。如表5所示，不管异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)存在与否，每个转化子都显示苯丙氨酸脱氨酶的活性。
[表5]
| 缺乏诱导物IPTG时的活性(mg/L) | 存在诱导物IPTG时的活性(mg/L) | |
| 大肠杆菌JM109 | - | - |
| pULePAL1转化子 | 1960 | 1470 |
| pULePAL2转化子 | 1990 | 1830 |
| pUCAMPAL转化子 | 1860 | 1520 |
实施例7：用转化子产生苯丙氨酸衍生物
根据实施例4中描述的方法，实施例6中得到的有pULePAL1、pULePAL2和pUCAMPAL的每类转化子的每一菌株在有100ppm氨苄青霉素的100ml L液体培养基中培养。得到的培养液转移到有含有100ppm氨苄青霉素的2L L液体培养基的5L小型发酵罐中，然后在30℃800转/分钟通气1ml/每分钟下进行搅拌培养10到12小时。
离心晚对数生长期到早稳定期的培养液获得细胞，在1L 4M氨/碳酸铵溶液(pH10.3)中重悬，向其中加入20g底物(见表6)，之后30℃反应，同时以800转/分钟搅拌。收集每1小时的反应液等分试样，用HPLC测定在反应液中产生的产物(见表6)。当连续加入底物以使底物浓度保持在2％左右时，反应继续进行。约10小时后，反应液中聚集的产物浓度为1％到3％(表6)。
反应结束后，用旋转蒸发器对反应液进行真空浓缩以去除过量的氨，向其中加入浓盐酸调节pH到1以沉淀残留的底物。用过滤器过滤溶液，然后用旋转蒸发器浓缩上清液。通过过滤收集结晶的产物并用稀盐酸(0.1N)洗涤，之后真空干燥。此干燥样品纯度为99％或更高。检测到的杂质是任何系统中用作底物的肉桂酸衍生物或丙烯酸衍生物。当用上述方法测定这些衍生物的光学纯度时，在这两种衍生物中只检测到L型，D型在检测底线以下。
[表6]
| 底物 | 肉桂酸 | 3-羟基肉桂酸 | 3，4-二羟基肉桂酸 | 2-氰基肉桂酸 | 4-氰基肉桂酸 | 2-呋喃丙烯酸 | |
| 产物 | L-苯丙氨酸 | 偏酪氨酸 | L-DOPA | L-2-氰基苯丙氨酸 | L-4-氰基苯丙氨酸 | α-氨基-2-呋喃丙酸 | |
| 产物浓度 | pULePAL1转化子 | 19200 | 12100 | 12000 | 20100 | 20400 | 11300 |
| (mg/L) | pULePAL2转化子 | 16800 | 13000 | 9800 | 21700 | 24900 | 11000 |
| pUCAMPAL转化子 | 15800 | 14700 | 10500 | 18600 | 22600 | 12500 | |
| 产物光学纯度(％) | pULePAL1转化子 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 |
| pULePAL2转化子 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | |
| pUCAMPAL转化子 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 | ＞99.9 |
本实施例中，使用了多个有不同氨基酸序列的苯丙氨酸脱氨酶用于显示来自植物的苯丙氨酸脱氨酶在本发明中通常是有效的(黄瓜的氨基酸序列未确定)。图3显示氨基酸序列同源性。发现尽管这些酶在氨基酸序列上相互间有10％到20％的差异，这些酶中的任一种酶在本发明中都是足够有效的，就是说，这些酶转换底物以产生苯丙氨酸衍生物的能力远远高于来自微生物的相同酶。
根据本发明，通过使用来自植物的苯丙氨酸脱氨酶，以丙烯酸衍生物作为起始原料，可以方便且有效地得到相应的氨基酸。尤其是，可以简单且有效地得到在其苯基上有不同取代基的L-苯丙氨酸衍生物。
概括地说根据本发明的用于产生L-氨基酸的方法得到的L-氨基酸用作生物活性有机化合物例如药物中间体或农业中间体的手性构件，且它主要用作药物中间体。
序列表
<110>昭和电工株式会社
<120>产生L-氨基酸的方法
<130>用于PAL的引物
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn版本2.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>紫草(Lithospermum erythrorhizon)
<400>1
aagatatcat ggaaaccata gtg 23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>紫草
<400>2
ttgtcgactt aacagattgg aag 23
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>紫草
<400>3
aagaattcat ggaaaatgga aatgg 25
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>紫草
<400>4
ttgtcgacta acatattgga aga 23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>大叶茶(Camellia sinensis)
<400>5
aacccgggat ggatagtacc acc 23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>大叶茶
<400>6
ttaagcttct aacagatagg aag 23
Claims (30)
1.用于产生L-氨基酸的方法，它包括在氨存在下，使来自植物的苯丙氨酸脱氨酶作用于由以下通式(1)代表的丙烯酸衍生物：
其中
Z代表可以含有杂原子的芳环基，
R代表所述芳环上的取代基，且
n代表0或更大的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的；
所述L-氨基酸用下列通式(2)代表：
其中
Z代表可以含有杂原子的芳环基，
R代表所述芳环上的取代基，
n代表0或更大的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
2.根据权利要求1的用于产生L-氨基酸的方法，其中Rn-Z-用下列通式(3)代表：
其中
R是苯环上的取代基，并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且
n代表0到5的整数，并优选1到5的整数，当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
3.根据权利要求1的用于产生L-氨基酸的方法，其中Rn-Z-用下列通式(4)代表：
其中
X代表S、O、NH或NR1，
R1代表有1到6个碳原子的烷基，
R是杂环上的取代基，并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且
n代表0到3的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
4.根据权利要求1的用于产生L-氨基酸的方法，其中Rn-Z-用下列通式(5)代表：
其中
X代表S、O、NH或NR1，
R1代表有1到6个碳原子的烷基，
R是杂环上的取代基，并代表氰基、羟基、羧基、酰胺基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、硝基、羟甲基、或有1到6个碳原子的烷基或烷氧基，且
n代表0到3的整数，且当n是2或大于2时，每个R可以是相同的或不同的。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其包括使用通过处理含有苯丙氨酸脱氨酶的植物组织而获得的组分。
6.根据权利要求1至4中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其包括使用含有苯丙氨酸脱氨酶的植物培养细胞和/或其处理组分。
7.根据权利要求1至4中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其包括使来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因可在植物中表达，并使用转化的植物培养物或植物培养物的处理产物。
8.根据权利要求1至4中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其包括使来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因可在微生物中表达，并使用转化的微生物培养物、其处理产物或由培养物获得的酶。
9.根据权利要求7或8的用于产生L-氨基酸的方法，其中来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因为这样的基因，其编码的氨基酸序列与来自紫草pal2基因的核苷酸序列推导出的氨基酸序列有70％或更高的同源性。
10.根据权利要求7或8的用于产生L-氨基酸的方法，其中来自植物的苯丙氨酸脱氨酶基因为这样的基因，其编码的氨基酸序列与来自紫草pal2基因的核苷酸序列推导出的氨基酸序列有80％或更高的同源性。
11.根据权利要求1至8中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中苯丙氨酸脱氨酶基因来源的植物是紫草属和/或山茶属。
12.根据权利要求8至11中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中微生物为细菌、酵母和/或丝状真菌。
13.根据权利要求12的用于产生L-氨基酸的方法，其中细菌是大肠杆菌。
14.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中所述通式(3)中至少一个取代基R是羟基。
15.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是氰基。
16.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是羧基。
17.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是酰胺基。
18.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是卤素基团。
19.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是氨基。
20.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是硝基。
21.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是羟甲基。
22.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(3)中至少一个取代基R是含有1到6个碳原子的烷基。
23.根据权利要求1至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中R是氰基、羟基、硝基和羧基中的任一个且n为1。
24.根据权利要求2和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中L-氨基酸为L-苯丙氨酸。
25.根据3和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(4)中X是O。
26.根据权利要求3和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(4)中X是S。
27.根据权利要求3和5至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(4)中X是NH。
28.根据权利要求4至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(5)中X是O。
29.根据权利要求4至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(5)中X是S。
30.根据权利要求4至13中任意一项所述的用于产生L-氨基酸的方法，其中在所述通式(5)中X是NH。
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