KR20040026672A - Ｌ-아미노산의 제조 방법 - Google Patents

Ｌ-아미노산의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20040026672A
KR20040026672A KR10-2003-7016876A KR20037016876A KR20040026672A KR 20040026672 A KR20040026672 A KR 20040026672A KR 20037016876 A KR20037016876 A KR 20037016876A KR 20040026672 A KR20040026672 A KR 20040026672A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
group
producing
formula
acid according
Prior art date
Application number
KR10-2003-7016876A
Other languages
English (en)
Inventor
히로부미 아오끼
하루미 가마찌
Original Assignee
쇼와 덴코 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쇼와 덴코 가부시키가이샤 filed Critical 쇼와 덴코 가부시키가이샤
Priority claimed from PCT/JP2002/006287 external-priority patent/WO2003000915A1/en
Publication of KR20040026672A publication Critical patent/KR20040026672A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

식물 효소의 작용으로 암모니아를 아크릴산 유도체에 첨가하고 해당하는 광학 활성 아미노산을 얻는 것을 포함하는 광학 활성 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 암모니아의 존재 하에서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 다양한 치환체를 가질 수 있고 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기를 가질 수 있는 아크릴산 유도체에 작용하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-아미노산의 제조 방법 {THE METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS}
본 발명은 식물 효소의 작용에 의하여 암모니아를 아크릴산 유도체에 첨가하여 해당하는 광학 활성 아미노산을 얻는 것을 포함하는 광학 활성 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 광학 활성 아미노산은 제약, 농약 및 기타 정밀 화학에 관한 합성 물질로서 유용하다.
비대칭 촉매의 사용과 관련있는 유기 합성 반응 및 미생물의 특이성의 이용과 관련있는 발효 생산 방법과 같은 광학 활성 아미노산을 얻기 위한 다수의 방법이 연구되어 왔다.
미생물로부터 유도된 페닐알라닌 암모니아-리아제 또는 효소 활성을 자체로 갖는 미생물을 신남산에 작용하게끔 하는, 광학적 선택에 의한 광학 활성 페닐알라닌의 제조 방법을 보고하는 많은 문헌들, 예컨대 영국 특허 제 1489468호 및 일본특허 공개 제 53-96388 (1978)이 있었다. 이러한 방법은 고 암모니아 농도에서 효소의 작용으로 신남산의 α-탄소에 아미노기를 첨가하는 반응을 이용하고 이에 따라서 L-페닐알라닌을 높은 광학 순도로 생성할 수 있다.
페닐기에 치환체를 갖는 광학 활성 L-페닐알라닌 유도체를 얻기 위한 방법으로, L-페닐알라닌에 여러 형태의 변경 반응을 적용하여 페닐기에 치환체를 도입하는 방법이 고려된다. 그러나, 이 방법에 의하면, 페닐기 이외의 부분들에 일어나는 부반응에 기인한 수율의 감소 및 매우 혹독한 반응 조건 하에서 라세미화의 진행으로 인한 광학 순도의 저하가 필연적이다. 더구나, 페닐기에 도입하기 위한 치환체의 위치 특이성을 얻기 어렵기 때문에, 낮은 수율 또는 분리 및 정제가 어려운 결과를 낳는다. 따라서, 이 방법은 실용적이지 못하다.
여기서는, 소기의 치환체가 이전에 도입된 치환된 페닐기를 갖는 신남산 유도체에 상기 서술한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 작용하게 하는 다른 방법이 고려된다. 이 방법에서 효소 반응이 온화한 조건 하에서 진행되기 때문에, 페닐기 및 이 기의 치환체에 부반응으로 인한 해로운 효과를 제공하지 않고, 따라서 고순도를 갖는 광학 활성 L-페닐알라닌 유도체가 이 방법에 의해 제공될 것으로 예상된다.
그러나, 미생물로부터 유도된 페닐알라닌 암모니아-리아제의 기질 특이성이 매우 엄격하기 때문에, 대부분의 경우에서 이 효소는 L-페닐알라닌에 대한 신남산으로부터의 원래의 반응성과 비교하여, 치환된 페닐기에 대하여 현저히 낮거나 거의 반응성을 갖지 않는다. 출발 물질로 불소화 페닐기를 갖는 신남산 유도체를 사용하는, 상기 효소의 작용에 의한 광학 활성 불소화 페닐알라닌의 수득 방법(일본 특허 공개 공보 제 63-148992호 (1988)) 또는 특정 미생물 로도토룰라(Rhodotorula)를 사용함으로써 페닐알라닌 유도체를 수득하는 방법 (미국 특허 제 5981239호)과 같은 단지 소수의 사례 만이 개시되어 있다. 적용가능한 화합물은 한정되고 생산성은 산업적으로 충분하지 못하다.
일반적으로, 페닐알라닌 암모니아-리아제는 대체적으로 동물, 식물 및 미생물과 같은 생태계에 널리 분포되어 있음이 알려져 있다. 즉, 이 효소를 포함하는 미생물의 예로 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra)(일본 특허 공개 제 61-043993호 (1986), GB1489468), 로도스포리디움 토루로이데스(Rhodosporidium toruloides)(일본 특허 공개 제 60-227670(1985)), 클라도스포리디움 클라도스포리오이데스(Cladosporidium cladosporioides)(일본 특허 공개 제 62-111687 (1987)), 등을 포함하고, 이들 예를 떠나서도, 다수의 기타 미생물이 보고되었다.
페닐알라닌 암모니아-리아제를 포함하는 식물의 예로 테일-크레스(thale-cress) (Arabidopsis thaliana), 차나무 (Camellia sinensis), 치크-피(chick-pea) (Cicer arietinum), 레몬 (Citrus limonis), 오이 (Cucumis sativusL.), 당근 (Daucus carota), 지치 (Lithospermum erythrorhizon), 토마토(Lycopersicon esculentum), 담배 (Nicotiana tabacum), 쌀 (Oryza sativa), 파슬리 (Petroselinum crispum,Petroselinum hortense), 미송 (Pinus taeda), 포플라 (Populus kitakamiensis, 등.), 체리 (Prunus avium), 가시나무 (Rubus idaeus), 가지 (Solanum tuberosum), 스틸로(stylo) (Stylosanthes humilis), 홉 클로버(hopclover) (Trifolium subterrane), 포도 (Vitis vinifera), 부시 빈(bush bean) (Phaseolus vulgaris) 등을 포함한다.
식물로부터 유도된 페닐알라닌 암모니아-리아제의 구조 유전자, pal(이하, "pal 유전자"로 부른다)에 관한 많은 보고가 있다. 즉, 결정된 pal 유전자의 예로 쌀 (Oryza sativa,Biochim. Biophys. Acta(1993), 1171(3), 321-322,Plant Mol.Biol. (1995), 29(3), 535-550), 차나무 (Camellia sinensis,Theor.Appl.Genet. (1994), 89(6), 671-675), 테일-크레스 (Arabidopsis thaliana,Plant Mol.Biol. (1995), 27, 327-338), 지치 (Lithospermum erythrorhizon, Biosci.Biotech.Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), 토마토(Lycopersicon esculentum,J. Biol. Chem. (1992), 267, 11824-11830), 홉 클로버 (Trifolium subterraneum,Gene(1994), 138(1-2), 87-92), 완두 (Pisum sativum,Plant Mol. Biol. (1992), 20(1), 167-170, 일본 특허 출원 공개 (Kokai) 제 5-153978 (1993)), 포플라 (Populus trichocarpa, Plant Physiol. (1993), 102, 71-83), 담배 (Nicotiana tabacum, Plant Mol. Biol.(1996), 30, 711-722), 대두 (Glycine max,DNA Sequence(1991), 1(5), 335-346), 고구마 (Ipomoea batatas,Plant Physiol. (1989), 90(4), 1403-1407), 밀 (Triticum aestivum), 파슬리 (Petroselinum crispum), 해바라기 (Helianthus annuus), 자주개자리 (Medicago sativa) 등의 것들을 포함하고, 공지된 pal 유전자의 수는 동종의 이성체의 것 또는 부분적인 서열들을 포함하여 40 종류 이상에 달한다.
식물로부터 유도된 페닐알라닌 암모니아-리아제는 상호 간에 다수의보존(conservative) 서열을 갖고; 이들의 아미노산 서열은 최저 정도라도 50% 이상의 상동성을 보인다. 따라서 기능 및 특성 면에서 다수의 공통성이 예측 가능하다.
식물로부터 유도된 페닐알라닌 암모니아-리아제는 식물의 2차 대사에서 페닐프로파노이드 및 이소플라보노이드 합성 경로의 개시 효소 및 페닐알라닌의 속도 결정 단계의 반응, 즉 탈아민화 반응을 촉진하는 효소로도 알려져 있다. 이 효소 및 이의 유전자는 식물의 스트레스 저항과 관련이 있다고 여겨지기 때문에, 이 효소의 기능이 철저히 연구되어졌다. 더구나, 식물체 내에서 pal 유전자를 발현시켜 내질병 식물을 생산하려는 시도가 순수 과학적 및 응용 과학적으로 널리 행해져왔다.
앞서 언급한 바와 같이 많은 연구 기록들이 존재하지만, 미생물로부터 유도한 동일 효소와 달리 물질의 생산의 관점으로 하는 연구에 관해선, 페닐프로파노이드 또는 이소플라보노이드의 몇몇 유용한 물질의 함량을 증가하려는 시도(Planta. (1979), 14(6), 369-376,Biochim. Biophys. Acta. (1979), 563, 278-292)를 제외하고는 통상적인 산업 재료로 사용할 수 있는 유기 화합물을 제조하려는 시도가 없었다. 말할 나위도 없이, 역반응, 즉 아민화 반응을 사용하여 물질을 제조하려는 시도가 기록된 바 없었다. 우선, 낮은 안정성, 높은 기질 특이성 등의 점에서 이들 효소의 실용성이 미생물로부터 유도된 효소의 실용성보다 떨어진다는 일반적으로 채택된 견해가 있기 때문에, 본 효소뿐만 아니라 식물로부터 유도된 다른 효소가 물질의 제조에 거의 사용된 바 없었다. 따라서, 당업자가 본 발명과 유사한 유기 화합물의 하나인 L-페닐알라닌 유도체의 제조 방법을 인지할 때, 동일한 촉매 기능을 갖는 효소가 다른 출처에서 존재하는 한, 식물로부터 유도한 효소는 상기 물질의 제조에 가장 주목되지 않는 재료의 하나였다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §111(b)에 따라 2001년 7월 6일에 출원된 가출원 제 60/303,086호 및 2001년 12월 14일에 출원된 가출원 제 60/339,389호의 출원일의 35 U.S.C. §119(e)(1)에 의거한 권리를 주장하며 35 U.S.C.§111(a)에 따라서 출원된 출원이다.
도 1은 LePAL1 및 LePAL2을 보여주는 지치(Lithospermum erythrorhizon)PAL 발현 플라스미드의 구조물을 나타낸다.
도 2는 CAMPAL을 보여주는 차나무(Camellia sinensis)PAL 발현 플라스미드의 구조물을 나타낸다.
도 3은 PAL 아미노산 서열에서 상동성의 예를 보여준다.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 발명을 아래에서 상세히 설명할 것이다.
본 발명의 L-아미노산의 제조 방법에 의하여, 광학 활성 아미노산을 다양한 치환체를 가질 수 있고 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기를 가질 수 있는 아크릴산 유도체로부터 효소 반응 한 단계로써 간단히 얻을 수 있다.
더구나, 본 발명의 L-아미노산의 제조 방법에 의하여, 광학 활성 아미노산을다양한 치환체를 가질 수 있는 벤젠환 기를 가질 수 있는 아크릴산 유도체로부터 효소 반응 한 단계로써 간단히 얻을 수 있다.
벤젠환에 미리 도입되는 치환체, 예를 들어 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 할로겐 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기는 온화한 반응 조건 하에서 어떤 불리한 영향을 받지 않고 반응의 종결시까지 유지되고, 해당하는 소기의 L-페닐알라닌 유도체를 거의 100%의 전환율로 양호한 수율로 얻을 수 있다.
더구나, 본 발명의 L-아미노산의 제조 방법에 의하여, 측쇄에 헤테로시클릭 환 구조를 갖는 광학 활성 아미노산을 측쇄에 헤테로시클릭환 구조를 갖는 아크릴산 유도체로부터 효소 반응 한 단계로써 간단히 얻을 수 있다.
아크릴산 유도체 내의 헤테로시클릭환 구조 예컨대 푸릴 기, 티에닐 기, 피롤 기 등은 온화한 반응 조건 하에서 어떤 불리한 영향을 받지 않고 반응의 종결시까지 유지되고, 해당하는 소기의 L-아미노산을 거의 100%의 전환율로 양호한 수율로 얻을 수 있다.
본 발명에서 반응 물질로 사용되는 다양한 치환체를 갖는 아크릴산 유도체는 임의의 치환기가 도입된 알데히드 유도체의 알데히드 기를 아세트산 무수물과 반응시키는 소위 퍼킨 반응(Perkin's reaction)(Arch. Pharm. (Weinheim) (1994), 327 (10), 619-625, 등 참조); 피리딘 용매 내에서 피페리딘의 존재 하에서 말론 산의 반응을 포함하는 방법(J. Chem. Soc. (1939), 357-360, 등 참조); 및 다양한 기타 개선된 방법(Synth. Commun. (1999), 29(4), 573-581, 등 참조)에 의하여 쉽게 제조될 수 있다.
본 발명에 적용되는 페닐알라닌 암모니아-리아제 활성을 제공하는 식물은 특별히 제한되지 않는다. 앞서 언급한 바와 같이, 구체적 예로서 테일-크레스(Arabidopsis thaliana), 차나무(Camellia sinensis), 치크-피 (Cicer arietinum), 레몬 (Citrus limonis), 오이 (Cucumis sativusL.), 당근 (Daucus carota), 지치 (Lithospermum erythrorhizon), 토마토(Lycopersicon esculentum), 담배 (Nicotiana tabacum), 쌀 (Oryza sativa), 파슬리 (Petroselinum crispum,Petroselinum hortense), 미송 (Pinus taeda), 포플라 (Populus 키트akamiensis, 등.), 체리 (Prunus avium), 가시나무 (Rubus idaeus), 가지 (Solanum tuberosum), 스틸로 (Stylosanthes humilis), 홉 클로버 (Trifolium subterrane), 포도 (Vitis vinifera), 부시 빈 (Phaseolus vulgaris), 등을 포함하나 이 효소는 거의 전반적으로 식물에서 존재한다.
본 발명의 한 태양으로, 식물로부터 분리한 페닐알라닌 암모니아-리아제를 사용한다. 말하자면, 식물로부터 효소를 분리하고 정제하는 공지된 통상 방법, 예를 들면 육지 식물체로부터의 추출물에 아세톤 침전, 황산암모늄 침전, 다양한 분리 칼럼 등의 적용에 의해 분리 및 정제된 상기 효소가 반응 촉매로서 제공된다. 다양한 유형의 식물체로부터 페닐알라닌 암모니아-리아제를 분리 및 정제하는 구체적 방법에 대하여, J. Koukol 등의 보고서 (J. Biol. Chem. (1961), 236(10), 2692-2698), 및 E. A. Havir 등의 보고서(Biochemistry(1973), 12, 1583-) 등이 알려져 있다.
본 발명의 다른 태양으로, 상기 기술한 식물체의 처리 생성물을 관심있는 반응에 제공한다. 반응에 이용되는 식물체의 처리 생성물의 예로서 분쇄 생성물, 동결건조 생성물 또는 식물체로부터의 추출물; 추출물로부터 관심있는 반응을 촉진시키는 성분을 농축 및 추출시켜 얻은 생성물; 처리된 생성물, 추출물 또는 식물체의 추출된 성분을 거의 녹지않는 담체에 고정하여 얻은 생성물 등을 포함한다.
이러한 고정화 담체의 예로서 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜, 폴리-N-비닐포름아미드, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민, 메틸셀룰로스, 글루코만난, 알기네이트, 카라기난, 및 이들 화합물의 (가교) 코폴리머를 포함한다. 달리 말하면, 식물 추출 성분을 포함하는 수불용성 고체를 형성하는 화합물을 단독으로 또는 혼합된 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 태양으로, 상기 기술한 식물의 배양 세포가 사용된다. 즉 식물 세포가 배양 식물 세포를 수득하는 통상적 방법에 의하여 배양된다. 예를 들면, 식물 세포는 식물 호르몬, 예컨대 인돌 아세트산 또는 키네틴의 존재하에서, 식물의 유형에 따라서 선택되는 다양한 알려진 식물 세포 배양용 배지 예컨대 무라시게 및 스쿠그(Murashige & Skoog) 완전 배지, LS 배지, M9 배지 및 갬보그(Gamborg) B-5 배지에서 배양되고 다음에 얻어진 배양 세포를 반응시킨다. 이 때, 페닐알라닌 암모니아-리아제 활성을 증진하기 위하여 개선된 배지 및 배양 조건을 사용할 수도 있다.
예를 들면, 지치(Lithospermum erythroghizon)의 효소 활성이 유도되는 배양세포를 얻기 위한 배양 조건에 관한 Yazaki 등의 보고서(Biosci. Biotech.Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003); 파슬리(Petroselinum hortense)의 배양 세포에서 상기 효소 활성과 배양 조건의 관계에 관한 Klaus 등의 보고서 (Archiv. Biochem. Biophis. (1975), 66, 54-62); 등과 같은 몇몇 보고서들이 알려져 있다. 더구나, 분쇄 생성물, 동결 건조 생성물 또는 이렇게 얻어진 식물 배양 세포로부터 얻은 추출물; 추출물로부터 관심있는 반응을 촉진시키는 성분을 농축 및 추출하여 얻은 생성물; 식물 배양 세포의 추출물 또는 추출된 성분을 거의 녹지 않는 담체에 고정하여 얻은 생성물 등을 반응을 시킬 수 있다.
본 발명의 다른 태양으로, 식물로부터 유도된 pal 유전자는 유전자가 거기서 발현 가능하도록 미생물 또는 식물에 도입되고, 얻어진 형질전환된 미생물 또는 형질전환된 식물을 또한 사용할 수 있다. 유전자 발현에 사용되는 숙주 유기물은 외부 유전자를 받아들이고 발현할 수 있는 유기체로 알려져 있는 유기체인 한 특별히 제한되지 않는다. 이러한 유기체의 예로서 박테리아 예컨대 에스케리챠(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas)또는 바실러스(Bacillus), 효모 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces)또는 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 및 사상균 예컨대 아스러질러스(Aspergillus)를 포함한다.
본 발명에 사용되는 pal 유전자는 주위에서 자연적으로 생기는 pal 유전자 뿐만 아니라 동일 기능(동일 활성을 갖는 변종 효소의 코딩)을 갖는 유전자일 수 있다 . 이러한 유전자의 예로 지치(Lithospermum erythrorhizon)로부터 유도된 pal2 유전자 (데이타베이스 수탁번호 제 D83076); 지치로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 pal 유전자; 또는 바람직하게는, 지치로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 pal 유전자를 포함한다. 앞서 언급하였듯이, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제는 식물 pal 유전자의 충분히 높은 서열 상동성 및 식물체에서 동일 작용과 같은 기능 및 특성에서 서로 많은 공통성을 갖고 있고, 따라서 본 제조 방법에서 동등한 효과를 예측할 수 있다.
식물로부터 효소 유전자의 cDNA를 단리하고 이 유전자를 사용하여 형질전환된 미생물을 제조하는 방법 또는 형질전환된 미생물로부터 효소를 분리 및 수집하는 방법에 대하여, Yazaki 등의 지치(Lithospermum erythrorhizon)를 사용한 경우에 관한 보고서 (Biosci.Biotech.Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003), W. Schulz 등의 파슬리(Petroselinum crispum)를 사용한 경우에 관한 보고(FEBS Letter(1989), 258(2), 335-338), 등과 같은 많은 보고서가 알려져 있다.
다음에, pal 유전자의 수득 방법, 발현가능한 플라스미드의 제조 방법, 및 이들 플라스미드를 다양한 유형의 유기체 내로 도입하고 이들을 그속에서 발현시키는 방법을 더욱 상세하게 기술할 것이다.
<pal 유전자의 수득 방법>
식물로부터 유도한 pal 유전자는 페닐알라닌 암모니아-리아제의 보존 서열에 해당하는 부분 단편을 탐침으로 사용하여 공지된 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 통상적인 mRNA의 단리 및 정제 후에, 이렇게 얻은 mRNA를 주형(template)으로 사용하여 필요한 cDNA를 역전사 효소로, 얻을 수 있다. 최근에는, 그러나, 완전 RNA 또는 mRNA를 주형으로 사용하여 내열 역전사 효소 PCR 방법에 의하여 충분한 양의 cDNA를 쉽게 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 cDNA는 적합한 플라스미드 벡터 예컨대 pBR322 또는 pUC18에 연결되어 숙주로서 사용되는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)를 형질전환한다.
상기와 같이 생성한 cDNA 라이브러리로부터 관심있는 pal 유전자를 제조하기 위하여, 페닐알라닌 암모니아-리아제의 보존 서열을 코딩하는 올리고 DNA를 탐침으로 사용하는 콜로니 혼성화 방법(Colony hybridization Method)을 사용할 수 있다. 앞서 언급하였듯이, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제는 전체 서열을 통해, 보존 서열로 추정되는 매우 상동한 서열을 갖기 때문에, 탐침으로 사용되는 올리고 DNA를 목적에 따라 위치를 선택함으로써 생산할 수 있고, 사용할 수 있다.
플라스미드는 콜로니 혼성화에 의하여 얻어진 양성 후보 형질전환체로부터 제조된다. 다음에, 플라스미드를 적합한 프라이머와 함께 PCR 반응시켜 플라스미드에 삽입되는 pal 유전자의 위치 및 방향을 확인한다. 식물로부터 유도된 pal 유전자의 다수의 기본 서열은 데이타베이스 예컨대 GenBank 또는 EMBL에 개시되어 있다. 따라서, 서열 정보를 갖는 유전자에 대하여, 제한 지도를 만듬으로써 제조 및 방향을 확인하는 것이 또한 가능하다.
<발현 플라스미드의 제조 방법 및 생성에 사용되는 재조합 미생물의 제조 방법>
적합한 벡터 (이의 구체예를 후에 기술할 것임)를 사용하여, pal 유전자를 박테리아 예컨대 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 또는 미생물 예컨대 사카로미세스 세레비시애(Saccaromyces cerevisiae)를 포함하는 효모에 도입하고 거기에서 발현하여, 흥미있는 페닐알라닌 유도체를 생성하는 활성을 갖는 재조합체를 얻을 수 있다. 여기에서, 바람직한 숙주는 박테리아 예컨대 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)이다. 후에 기술하듯이, 생성된 페닐알라닌 유도체를 반응 혼합물로부터 미생물의 반응 생성물을 분리하는 통상의 방법에 의하여 단리 및 정제할 수 있다.
외부 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조 방법, 및 플라스미드를 미생물 예컨대 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)와 같은 미생물에 도입하고 그것을 발현하는 절차 또는 방법이 유전 공학 분야에서 통상 사용하는 수단 또는 방법에 의하여 수행될 수 있다 (예를 들어 "Vectors for cloning Genes"Methods in Enzymology, 216, pp.469-631, 1992, Academic Press, 및 "Other bacterial systems"Methods in Enzymology, 204, pp.305-636, 1991, Academic Press 참조).
외부 유전자를 (pal 유전자 군) 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에 도입하는 방법으로서, 하나한법(Hanahan Method) 또는 루비듐법(rubidium Method)과 같은 몇몇 효과적인 방법이 이미 정립되어 있고, 따라서 이들 방법을 유전자의 도입에 사용할 수 있다 (예를 들면 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning-A laboratory manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조). 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에서 외부 유전자의 발현은 통상적인 방법에 의하여 수행될 수 있고(예를 들면 상기 언급한 "Molecular cloning-A laboratory manual" 참조), 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에 대한, lac프로모터, 예컨대 pUC, pBluescript 등을 갖는 벡터를 사용할 수 있다. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에 대한 벡터,lac 프로모터를 갖는 pBluescript II SK-를 사용하여, 본 발명자는 lac 프로모터의 다운스트림에 pal 유전자를 삽입하고, 다음에 이 유전자가 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)내에서 발현되게 하였다.
pal 유전자를 효모 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에 도입하는 방법으로서, 리튬법과 같은 방법이 이미 정립되어 있고, 이 같은 방법을 사용하여 유전자의 도입을 수행할 수 있다 (예를 들어 "New Biotechnology of Yeast" Yuichi Akiyama 편집 하에서, Bioindustry Association 편찬, Igaku Syuppan Center 출판). PGK 또는 GPD (GAP)와 같은 프로모터 및 종결자를 사용하여, 외부 유전자가 프로모터와 종결자 사이에 삽입된 발현 카세트를 구축하여 전사 제어를 하는 단계 및; 이 발현 카세트를 벡터 에스. 세레비시애(S. cerevisiae), 예를 들면 YRp (복제 기원으로서, 효모 염색체의 ARS 서열을 갖는 효모를 위한 복수-카피 벡터), YEp (효모의 2 μm DNA의 복제 기원을 갖는 효모를 위한 복수-카피 벡터), YIp (효모의 복제 기원을 가지지 않는 효모 염색체의 혼입을 위한 벡터), 등에 삽입하는 단계에 의하여 효모 내에서 외부 유전자의 발현을 수행할 수 있다 (앞서 언급한 "New Biotechnology of Yeast" Igaku Syuppan Center, 및 Asakura Shoten에서 출판된 "Genetic Engineering for Production of Substances", Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, ABC Series, 참조).
<재조합 미생물의 배양 방법>
본 발명의 형질전환체의 배양은 숙주 미생물의 통상적인 배양 방법에 의하여 수행될 수 있다.
형질전환된 미생물을 배양하기 위한 탄소원은 숙주 미생물이 탄소원으로 사용할 수 있는 물질일 수 있고, 이러한 탄소원의 예로서 당류 예컨대 글루코스, 슈크로스, 프럭토스 및 블랙스트랩 당밀; 유기 물질 예컨대 에탄올, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 락트산, 벤조산 및 지방산, 또는 이들의 알칼리 금속 염 ; 지방족 탄화수소 예컨대 n-파라핀; 및 천연 유기 물질 예컨대 펩톤, 육류 추출물, 어류 추출물, 식용 대두, 밀 겨, 맥아 추출물 및 감자 추출물을 포함한다. 이들 물질들은 대개 약 0.01% 내지 30%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 10%의 농도로 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)가 형질전환체로 사용되는 경우, 글루코스, 펩톤, 육류 추출물, 맥아 추출물 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
형질전환된 미생물을 배양하기 위한 질소원은 숙주 미생물이 질소원으로 사용할 수 있는 물질일 수 있고, 이러한 질소원의 예로서 무기 질소 화합물 예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산나트륨 및 질산칼륨; 질소 함유 유기 물질 예컨대 우레아 및 요산; 및 천연 유기 물질 예컨대 펩톤, 육류 추출물, 어류 추출물, 식용 대두, 맥아 추출물 및 감자 추출물을 포함한다. 이들 물질은 대개 약 0.01% 내지 30%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 10%의 농도로 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)가 형질전환체로 사용되는 경우, 황산암모늄, 펩톤, 육류 추출물, 맥아 추출물 등이 바람직하게는 사용될 수 있다.
또한, 필요하다면, 포스페이트 예컨대 인산 이수소 칼륨 또는 금속 염 예컨대 황산마그네슘, 황산철, 아세트산칼슘, 염화망간, 황산구리, 황산아연, 황산코발트 또는 황산니켈을 박테리아 세포의 성장을 촉진하기 위해 첨가한다. 첨가 농도는 배양 조건에 의존하는데, 일반적으로 농도는 포스페이트에 대해 약 0.01% 내지 5%, 마그네슘염에 대해 약 10ppm 내지 1%, 기타 화합물에 대해서는 0.1ppm 내지 1000ppm이다. 더구나, 선택되는 배지에 따라서, 박테리아 세포의 성장을 촉진하기 위하여 약 1 ppm 내지 100 ppm의 효모 추출물, 카사미노산, 효모 핵산 등을 비타민, 아미노산 또는 핵산의 공급원으로 첨가할 수 있다.
또한, 필요한 경우, 벡터의 발현 프로모터에 해당하는 유도 물질(inducer)을 배양 중에 첨가할 수 있어 형질전환에 제공되는 효소 유전자가 숙주 미생물 내에서 그 자체가 많이 발현되게 한다. lac 프로모터가 사용되는 경우, 약 0.01 mM 내지 10 mM의 IPTG (이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드)를 첨가하고, 암피실린 또는 카나마이신 같은 약에 대한 내성을 위한 프로모터를 사용하는 경우, 약 0.1 ppm 내지 1,000 ppm의 해당하는 약을 첨가한다.
임의의 조성물이 사용되는 모든 경우에서, 배양을 위해 pH를 5 내지 9로, 바람직하게는 5.5 내지 8로 유지한다. 더구나, 앞서 기술한 배지에서 미리 배양된 미생물 세포가 원심 분리 또는 막 여과와 같은 방법에 의하여 분리 및 수집되고 반응을 행하는 과정이 배양액으로부터 나온 불순물을 감소시키고 후속되는 생성물의 분리 및 수집을 용이하게 하는데 유용하다.
배양에 의해 얻어진 형질전환된 미생물을 공지된 방법 예컨대 원심분리 또는막 여과에 의하여 수집하여 관심있는 반응에 사용할 수 있거나, 다르게는, 배양액을 직접 흥미있는 반응을 시킬 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물의 분쇄 또는 동결 건조 생성물; 미생물 세포로부터의 무세포 추출물; 무세포 추출물로부터의 관심있는 반응을 촉진시키는 성분을 농축 및 추출하여 얻은 생성물; 이들 형질전환된 미생물 세포, 및 처리된 생성물, 이들의 추출물 및 추출된 성분을 거의 불용성의 담체에 고정하여 얻은 생성물; 등도 관심있는 반응을 시킬 수 있다.
위의 목적을 위한 고정화 담체의 예로 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜, 폴리-N-비닐포름아미드, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민, 메틸셀룰로스, 글루코만난, 알기네이트, 카라기난, 등 및 이들 화합물의 (가교) 코폴리머를 포함한다. 달리 말하면, 미생물 또는 이의 추출 성분을 포함하는 수불용성 고체를 형성하는 화합물은 단독으로 또는 혼합된 형태로 사용할 수 있다. 더구나, 형질전환된 미생물, 추출물 또는 이의 추출된 성분은 사용 전에 고체 물질 예컨대 활성탄, 다공성 세라믹, 유리 섬유, 다공성 폴리머 성형물 또는 니트로셀룰로오스 막 위에 보유될 수 있다.
<제조에 사용되는 재조합 식물의 제조 및 배양 방법>
앞서 언급하였듯이, pal 유전자를 식물 세포에 도입하여 페닐알라닌 유도체를 생성하는 식물을 제조할 수 있다. 바람직한 예로서, pal 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하고, 다음에 플라스미드를 적합한 식물 예컨대 담배(Nicotiana tabacum)의 세포에 도입하고 발현시켜 관심있는 페닐알라닌 유도체를 생성하는 식물을 얻는다. 식물에서 다양한 유형의 유전자를 도입 및 발현하는 기술에 대해서많은 연구가 진행되어 있고, 관심있는 증대된 활성을 갖는 식물을 이들 공지된 방법에 의하여 얻을 수 있다 (Plant Mol. Biol. (1999), 39(4), 683-693,Plant Biotechnol. (Tokyo) (1998), 15(4), 189-193,Plant Physiol. (1996), 112(4), 1617-1624).
외부 유전자를 식물 세포로 도입하는 공지된 방법의 예로서 식물 병리학적 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 포함하는 방법, 전기영동 방법, 입자총을 포함하는 방법, 등을 포함하고 유전자를 도입하고자 하는 식물의 유형에 따라서 이들 방법으로부터 적합한 방법을 선택할 수 있다. 프로모터로서, 전신적 고발현에 대한 프로모터인 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터 뿐만 아니라 다양한 기관에서 특이적으로 발현되는 다른 프로모터도 사용할 수 있다. CaMV로부터 35S 프로모터를 포함하는 이성분 벡터 pBI121을 클론테크(Clontech)로부터 얻을 수 있고, 이 벡터는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 매개하는 벡터로 널리 사용된다. pal 유전자가 식물 예컨대 담배(Nicotiana tabacum)에 입자총을 사용하여 도입될 수 있고 다음에 도입된 pal 유전자가 거기서 발현되고 기능한다는 것은 이미 알려져 있다 (Shokubutsu Soshiki Baiyo(1995), 12(2), 165-171).
외부 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조 방법 및 식물(잎, 줄기, 뿌리 세포 등) 에서 플라스미드를 도입 및 발현하는 방법의 예는 본 발명에서 보여진 방법을 포함할 뿐 아니라, 유전 공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 포함하고, 따라서 플라스미드의 제조, 도입 및 발현을 이들 기술 또는 방법에 의하여 수행할수 있다 (예를 들어 Isao Ishida, Norihiko Misawa,Saibo Kogaku Jikken Sosa Nyumon(An Introduction to Experiments of Cell Technology), Kodansha, 1992 참조). 상기와 같이 제조한 재조합 식물을 앞서 언급한 식물 세포 배양의 통상 방법에 의하여 식물 세포 배양에 사용할 수 있다.
앞서 기술한 다양한 공지된 방법에 의하여 제조된 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제, 식물 처리 생성물 또는 효소의 활성을 갖는 배양된 세포, 식물로부터 단리한 효소 유전자로 형질전환된 미생물에 의하여 제조된 동일 유전자, 형질전환된 미생물 세포 및 이들의 처리한 생성물, 효소 유전자로 형질전환된 식물로부터 제조한 동일 효소 또는 형질전환된 식물 및 이의 처리 생성물의 존재 하에서; 반응 물질로, 1 ppm 내지 20%, 바람직하게는 10 ppm 내지 10%의 아크릴산 유도체, 및 2M 내지 12M의 최종 농도로 암모니아를 첨가하고; pH를 8.5 내지 11, 바람직하게는 9 내지 10.5로 조절하고; 및 약 1 내지 200시간 동안 반응을 수행함으로써 본 발명의 L-아미노산의 생성 반응이 수행된다.
pH를 조절하는데 사용되는 산의 예로서 무기산 예컨대 황산, 염산, 인산, 붕산 또는 탄산, 유기산 예컨대 포름산, 아세트산 또는 프로피온산, 이의 염을 포함한다. 본원에서 휘발성산의 사용은 결과적으로 세포를 반응 용액으로부터 분리 및 제거하는 것만을 요구하고, 탈염 단계를 빼는 것을 가능하게 하고 생성물을 용이하게 분리 및 수집하는 것이 가능하게 한다. 탄산이 이렇게 이용되는 바람직한 산이다. 이 경우에 사용되는 탄산의 예로서 버블링 등에 의하여 이산화탄소로서 수용액에서 용해되고 다음에 해리되어 발생되는 탄산을 포함한다. 또한, 이들 산 및암모늄 염은 반응 용액에 대한 암모늄원으로 사용된다. 상기 진술한 이유 때문에, 탄산암모늄 또는 탄산수소 암모늄을 암모늄원의 일부 또는 전부로서 사용하는 것이 바람직하다.
첨가되는 아크릴산 유도체의 전량의 용해가 반드시 필요하지는 않고 반응 용액에서 유도체의 용해도 또는 분산성을 개선하는 용매, 계면활성제 등을 첨가하는 것이 또한 가능하다는 것을 유의한다. 반응의 진행에 기인한 화합물의 소비에 따라서, 화합물을 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가할 수 있다. 이 경우 반응 용액에서 화합물의 농도는 앞서 진술한 범위 안에 항상 들지는 않는다.
반응 용액에서 유도체의 성질에 따라 반응 용액에서 발생되는 L-아미노산을 공지의 방법 예컨대 원심분리, 막 여과, 진공 건조, 증류, 용매 추출, 염석, 이온 교환 또는 다양한 유형의 크로마토그래피에 의하여 분리 및 수집한다. 이로부터 L-아미노산을 간단하게 분리 및 수집하는 예로서 다음과 같다. 효소, 효소 처리된 생성물, 형질전환된 미생물 또는 이의 처리된 생성물 등을 여과, 원심분리, 투석 등에 의하여 반응 용액으로부터 제거하고, 그후 용매 추출을 수행하거나, 반응 용액을 산성화하여 반응하지 않은 출발 물질인, 아크릴산 유도체를 침전시키고 침전을 제거한다.
얻어진 상징액의 pH를 L-아미노산의 등전점 근처로 다시 조절하고, 침전된 유도체를 앞선 방법과 동일하게 수집한다. 따라서, 생성물을 고순도로 반응 용액으로부터 효과적으로 수집할 수 있다. 또한, 증류 등에 의하여 미리 잔류 암모니아를 반응 용액으로부터 제거하고, 물을 제거하여 농도를 높여서 등전점에서 생성물의 수율을 향상시키는 것이 또한 유용하다.
더 편리하게, 휘발성 산으로써 반응 용액의 pH 조절을 수행한다. 전환율이 비교적 높은 경우, 생성물을 반응용액으로부터 세포의 분리 후에 L-페닐알라닌 유도체의 암모늄염으로서 직접 단리할 수 있다. 다량의 출발 물질이 여전히 남아 있는 경우, 미생물의 분리 후 반응 용액을 용매 추출 전에 산성화시켜, 물 및 산 기재를 제거하고, 생성물을 L-아미노산의 암모늄염으로서 단리한다. 이러한 방법에 적합한 바람직한 휘발성 산으로 탄산 및 이의 암모늄 염을 포함한다.
어떤 경우에는, 반응 생성물의 성질에 따라서, 생성물이 반응 용액에 축적되고 반응 속도가 감소된다. 이 경우, 생성물의 농도에 따라서, 연속적으로 반응 용액을 희석하기 위하여 수성 암모니아, 암모니아-함유 생리 식염수 및 암모니아를 포함하는 반응 완충액을 반응 용액에 첨가하는 방법을 채택하는 것이 바람직하다. 더구나, 반응 속도가 감소될 때 세포가 분리 및 수집되고, 상징액이 생성물을 포함하는 용액으로서 수집되고, 수집된 세포가 반응 물질 또는 현탁액을 포함하는 용액으로 대체되는 반응 속도를 증가하는 다른 방법이 있다. 이들 방법은 미생물의 암모니아-리아제 활성이 유지되는 한 반복적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 출발 물질로서 사용되는 화합물은 하기 화학식 (1)로 표현되는 아크릴산 유도체이다:
<화학식 1>
상기 화학식에서,
Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고, 및
n은 0 이상의 정수이고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
수득한 화합물은 앞서 언급한 화학식 (2)로 표현되는 화합물이다:
<화학식 2>
상기 화학식에서
Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고,
n은 0 이상의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 화학식에서, Z의 예로 하기 화학식 (6) 내지 (10)으로 표현되는 기
하기 화학식 (11) 내지 (15)로 표현되는 기:
하기 화학식 (16) 내지 (20)으로 표현되는 기:
하기 화학식 (21) 내지 (25)로 표현되는 기:
하기 화학식 (26) 내지 (30)으로 표현되는 기:
하기 화학식 (31) 내지 (35)로 표현되는 기:
하기 화학식 (36) 내지 (40)으로 표현되는 기:
하기 화학식 (41) 내지 (45)로 표현되는 기:
하기 화학식 (46) 내지 (50)으로 표현되는 기:
및
하기 화학식 (51) 내지 (55)로 표현되는 기:
를 포함한다.
상기 화학식에서 R의 예로 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 포함한다.
상기 화학식에서, n은 방향족환이 치환될 수 있는 위치의 수로부터 1을 제한 수 또는 그보다 작은 0 이상의 정수일 수 있다. n이 2 이상의 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 화학식 (1)로 표현되는 본 발명에서 출발 물질로 사용되는 화합물에서, Rn-Z-은 하기 화학식 (3)으로 표현되는 화합물이다.
<화학식 3>
상기 화학식에서,
R은 벤젠환에 있는 치환체이고, 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타낸다. n은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 5의 정수를 나타낸다. n이 2 이상의 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
얻어진 화합물은 상기 화학식 (2)에서, Rn-Z-이 화학식 (4)로 표현되는 화합물이다.
상기 화학식에서, R은 벤젠환의 치환체이고, 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타낸다. n은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 5의 정수를 나타낸다. n이 2이상의 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
이러한 출발 물질의 구체적 예로서 2-시아노신남산, 3-시아노신남산, 4-시아노신남산, 2-히드록시신남산, 3-히드록시신남산, 4-히드록시신남산, 3,4-디히드록시신남산, 2-니트로신남산, 3-니트로신남산, 4-니트로신남산, 2-카르복시신남산, 3-카르복시신남산, 4-카르복시신남산, 2-아미노신남산, 3-아미노신남산, 4-아미노신남산, 2-클로로신남산, 3-클로로신남산, 4-클로로신남산, 2-플루오로신남산, 3-플루오로신남산, 4-플루오로신남산, 2-브로모신남산, 3-브로모신남산, 4-브로모신남산, 2-요오도신남산, 3-요오도신남산, 4-요오도신남산, 2-메틸신남산, 3-메틸신남산, 4-메틸신남산, 2-메톡시신남산, 3-메톡시신남산, 4-메톡시신남산, 4-이소프로필신남산, 4-t-부틸 신남산, 4-메톡시-3-메틸신남산, 등을 포함한다.
지치(Lithospermum erythrorhizon)로부터 유도한 효소가 사용될 때, 사용되는 바람직한 출발 물질은 2-시아노신남산, 4-시아노신남산, 3-히드록시신남산, 4-히드록시신남산 및 3,4-디히드록시신남산이다. 이들 출발 물질을 사용하는 경우, 2-시아노-L-페닐알라닌, 4-시아노-L-페닐알라닌, 3-히드록시-L-페닐알라닌 (메타티로신), 4-히드록시-L-페닐알라닌 (티로신) 및 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌 (DOPA)을 각각 얻을 수 있다. 본 발명에서, 신남산 유도체는 또한 신남산을 포함하고, 따라서 해당하는 페닐알라닌 유도체는 또한 페닐알라닌을 포함한다.
특히, 본 발명에서 출발 물질로 사용되는 화합물은 상기 화학식 (1)에서, Rn-Z-가 하기 화학식 (4)로 표현되는 화합물이다:
<화학식 4>
상기 화학식에서,
X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
R은 헤테로환에서의 치환체이고, 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기이고,
n은 0 내지 3의 정수이고, n이 2 이상의 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
얻어진 화합물은 상기 화학식 (2)에서, Rn-Z-이 상기 화학식 (4)로 표현되는 화합물이다.
여기서,
X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
R은 헤테로환에서의 치환체이고, 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시기이고,
n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상의 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에서 출발 물질로 사용되는 상기 화학식 (1)로 표현되는 화합물에서, Rn-Z-는 하기 화학식 (5)로 표현된다:
<화학식 5>
상기 화학식에서,
X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
R1는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
R은 헤테로환에서의 치환체이고, 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시기를 나타내고,
n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상의 경우, 각 R은 상이하거나 동일할 수 있고, 얻어진 화합물은 상기 화학식 (2)에서 Rn-Z-이 상기 화학식 (5)로 표현되는 화합물이다.
이러한 출발 물질의 구체적 예로서 2-푸란아크릴산, 3-푸란아크릴산, 2-티에닐 아크릴산, 3-티에닐 아크릴산, 2-피롤릴 아크릴산, 3-피롤릴 아크릴산 등을 포함한다.
지치(Lithospermum erythrorhizon)로부터 유도된 효소가 사용될 경우, 사용되는 바람직한 출발 물질은 2-푸란아크릴산, 3-푸란아크릴산, 2-티에닐 아크릴산, 3-티에닐 아크릴산, 2-피롤릴 아크릴산 및 3-피롤릴 아크릴산이다. 이들 출발 물질을 사용할 경우, 알파-아미노-2-푸란프로피온산, 알파-아미노-3-푸란프로피온산, 알파-아미노-2-티에닐 프로피온산, 알파-아미노-3-티에닐-프로피온산, 알파-아미노-2-피롤-프로피온산, 및 알파-아미노-3-피롤-프로피온산을 각각 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서, 고광학 순도를 갖는 L-아미노산을 유기 합성에 의하여 편리하게 얻어지는 아크릴산 유도체를 기질로 사용하여 단일 반응 단계에 의하여 효과적으로 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 L-아미노산은 고광학 순도를 필요로 하는 정밀 화학제품 예컨대 제약 및 농약 분야에서 합성 중간체로서 유용하다.
본 발명의 요약
본 발명의 목적의 하나는 높은 광학 순도의 L-아미노산을 편리하게 및 효과적으로 얻는 신규의 방법을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 목적 중의 하나는 페닐기에 치환체를 갖는 신남산 유도체와 같은 아크릴산 유도체를 출발 물질로 사용하여 높은 광학 순도의 L-아미노산을 간단하게 및 효과적으로 수득하는 신규 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제의 넓은 기질 특이성에 주목하고, 그 효소의 활성을 연구하여 산업적으로 유용한 다양한 아미노산을 생성하였다.
먼저, 페닐기에 치환체를 갖는 신남산 유도체와 높은 반응성을 갖는 암모니아-리아제를 동물, 식물 및 미생물과 같은 생태계 전체에 걸쳐 조사하였다.
그 결과, 본 발명자들은 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 기존에 알려져 있는 미생물로부터 유도된 동일 효소보다 페닐알라닌 유도체를 생성하는 훨씬 더 높은 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 앞서 언급하였듯이, 이들 효소가 관련된, 식물체 내에서 페닐프로파노이드, 이소플라보노이드 등을 생성하는 단계는 철저히 연구하였지만, 이들 연구는 페닐알라닌이 아미노기를 이탈시키는 제거 반응에 기인한 신남산 유도체의 생성에 관한 것이다. 역반응, 즉 식물로부터 유도한 효소에 의하여 아미노기를 신남산 유도체에 첨가하는 것에 기인한 페닐알라닌 유도체의 생성에 관한 가능성은 연구된 바 없다.
또한, 본 발명자는 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제의 넓은 기질 특이성에 주목하고, 페닐알라닌 유도체 뿐만 아니라 다양한 유형의 산업적으로 유용한 아미노산을 생성하기 위하여 그 효소의 활성에 대하여 연구하였다. 그 결과, 본 발명자는 이 효소가, 치환체를 가질 수 있고 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족 환구조를 갖는 아크릴산 유도체를 기질로 사용하여 작용시켜 해당하는 L-아미노산을 생성시키는 작용을 발견하였다.
더욱 집중적인 연구 결과, 본 발명자들은 아미노산을 식물로부터 유도한 pal 유전자의 높은 발현을 보여주는 미생물을 사용함으로써 매우 높은 효율로 아미노산을 제조할 수 있고 따라서 본 발명을 수행할 수 있음을 발견하였다.
식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 화학식 (1)로 표현되는 구조를 갖는 아크릴산 유도체를 기질로 사용하여 아미노산을 생성하는 반응을 촉진시키는 능력은 알려진 바가 없고, 본 발명자들에 의하여 얻어진 새로운 발견이다.
더구나, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 앞선 화학식 (3)으로 표현되는 페닐기에 다양한 치환체를 갖는 신남산 유도체를 기질로 사용하여 페닐알라닌 유도체를 생성하는 반응을 촉진시키는 능력은 공지된 바가 없고, 본 발명자들에 의하여 얻어진 새로운 발견이다.
또한, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 화학식 (4) 또는(5)로 표현되는 헤테로시클릭 치환체를 갖는 아크릴산 유도체를 기질로 사용하여 L-아미노산을 생성하는 반응을 촉진시키는 능력은 알려진 바가 없고, 본 발명자들에 의하여 얻어진 새로운 발견이다.
말하자면, 본 발명은 다음의 양태 [1] 내지 [30]를 포함한다:
[1] 암모니아의 존재 하에서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 하기 화학식 (1)로 표현되는 아크릴산 유도체에 작용하는 단계를 포함하는 하기 화학식 (2)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법:
<화학식 1>
(상기 화학식에서,
Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고, 및
n은 0 이상의 정수이고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다);
<화학식 2>
(상기 화학식에서,
Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고,
n은 0 이상의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다).
[2] 상기 [1]에 있어서, Rn-Z-가 하기 화학식 (3)으로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법:
<화학식 3>
상기 화학식에서
R은 벤젠환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기이고, 및
n은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 5의 정수를 나타낸다. n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
[3] 상기 [1]에 있어서, 상기 Rn-Z-이 하기 화학식 (4)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법:
<화학식 4>
상기 화학식에서,
X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
R은 헤테로환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타내고, 및
n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
[4] 상기 [1]에 있어서, 상기 Rn-Z-이 하기 화학식 (5)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법:
<화학식 5>
상기 화학식에서
X는 S, O, NH 또는 NR1을 나타내고,
R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
R은 헤테로환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기,또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타내고, 및
n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
[5] 상기 [1] 내지 [4]의 어느 하나에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제를 함유하는 식물 조직을 처리하여 얻어지는 조성물을 사용하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [4]의 어느 하나에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제를 포함하는 식물 배양 세포 및(또는) 이의 처리한 조성물을 사용하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [4]의 어느 하나에 있어서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 식물 내에서 발현될 수 있게 하는 단계 및 형질전환된 식물 배양물 또는 식물 배양물의 처리 생성물을 사용하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
[8] 상기 [1] 내지 [4]의 어느 하나에 있어서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 미생물 내에서 발현될 수 있게 하는 단계 및 형질전환된 미생물 배양물, 이의 처리 생성물 또는 배양물에서 얻은 효소를 사용하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
[9] 상기 [7] 또는 [8]에 있어서, 상기 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 지치(Lithospermum erythrorhizon)으로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역한 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 L-아미노산의 제조 방법.
[10] 상기 [7] 또는 [8]에 있어서, 상기 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 지치(Lithospermum erythrorhizon)으로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 L-아미노산의 제조 방법.
[11] 상기 [1] 내지 [8] 중 하나에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 유도되는 식물이 지치(Lithospermum)및(또는) 차나무(Camellia)인 L-아미노산의 제조 방법.
[12] 상기 [8] 내지 [11] 중 하나에 있어서, 상기 미생물이 박테리아, 효모 및(또는) 사상균인 L-아미노산의 제조 방법.
[13] 상기 [12]에 있어서, 상기 박테리아가 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)인 L-아미노산의 제조 방법.
[14] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 히드록실 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[15] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 시아노 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[16] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 카르복실 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[17] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 아미드 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[18] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 할로겐 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[19] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 아미노 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[20] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 니트로 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[21] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 히드록시메틸 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[22] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기인 L-아미노산의 제조 방법.
[23] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 R이 시아노 기, 히드록실 기, 니트로 기 및 카르복실 기 중 어느 하나이고, n이 1인 L-아미노산의 제조 방법.
[24] 상기 [2] 및 [5] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-페닐알라닌인 L-아미노산의 제조 방법.
[25] 상기 [3], [5] 및 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 0인 L-아미노산의 제조 방법.
[26] 상기 [3], [5] 및 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 S인 L-아미노산의 제조 방법.
[27] 상기 [3], [5] 및 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 NH인 L-아미노산의 제조 방법.
[28] 상기 [4] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 O인 L-아미노산의 제조 방법.
[29] 상기 [4] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 S인 L-아미노산의 제조 방법.
[30] 상기 [4] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 NH인 L-아미노산의 제조 방법.
또한 본 발명을 하기의 실시예에서 구체적으로 기술할 것이다. 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니다.
하기의 실시예 및 비교예에서 유리 산 대신에 이들의 염 또는 에스테르도 출발 물질로 사용될 수 있음을 유의해야 한다. 또한 "1 단위"는 30℃에서 기질로 0.1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 및 10 mM L-페닐알라닌의 존재 하에서 1 분당 1 μmole의 신남산을 방출하는 효소의 양으로 정의된다.
뷰렛 방법에 의하여 표준 예컨대 송아지 혈청 알부민을 사용하여 효소 단백질 양을 결정하고, 효소의 특이 활성을 "단위/mg 단백질"로 표현한다. 아크릴산유도체 및 아미노산의 동정을1H-NMR 및13C-NMR로 및 반응 용액을 HPLC로 측정하여 UV 흡수도 세기를 표준과 비교함으로써 수행하였다.
얻어진 아크릴산 유도체의 분리 및 측정을 다음의 분석 조건 하에서 수행한다.
역상 HPLC 분석 조건
칼럼: 쇼덱스(Shodex) (쇼와 덴코(Showa Denko K.K.)에 의해 등록된 상표), RSpak NN-614 (쇼와 덴코에 의해 제조)
칼럼 온도: 40℃
용출액: 아세토니트릴/물/50 mM H3PO4-KH2PO4용액 (pH 3) = 20/70/10
유속: 1.0 ml분
검출: 210 nm에서 UV 흡수도에 의하여
다음의 조건 하에서 광학 분리 HPLC에 의하여 얻어진 아미노산의 광학 순도를 분석하였다.
광학 분리 HPLC 분석 조건
칼럼: 쇼덱스 (쇼와 덴코에 의하여 등록된 상표), ORpak CRX-853 (쇼와 덴코에 의하여 제조)
칼럼 온도: 실온 (22℃)
용출액: 아세토니트릴/물 = 15/85 2.5 mM CuSO4
유속: 1.0 ml/분
검출: 256 nm에서 UV 흡수도에 의하여
실시예 1: 배양 세포 (파슬리(Petroselinum hortense))에 의한 반응
표 1에서 나타낸 배지의 조성
[표 1]
상기 기술된 조성을 갖는 배지 A 10 L를 엘렌마이어 플라스크에 나누어 붓고, 다음에 이전에 27℃에서 동일 배지에서 어두운 곳에서 통풍 하에서 계대배양한(5th계대배양의 세대) 파슬리 (Petroselinum hortense) 세포 배양 현탁액을 각 배지에 접종시키고 다음에 배양을 27℃에서 어두운 곳에서 통풍시키면서 10일 동안 200 rpm으로 진탕하였다. 다음에, 추가로 형광 램프의 광을 거기에 비추면서 배양을 24 시간 계속하였다. 얻어진 배양 용액을 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과시키고 페닐알라닌 암모니아-리아제를 포함하는 약 1.6 kg의 배양 세포를 얻었다. 활성은 후레쉬 세포 중량당 0.0051 u/g이었다.
얻어진 배양 세포 2 g을 다양한 아크릴산 유도체 0.1%를 포함하는 10 mL의 2M 암모니아/탄산암모늄 용액 (pH 10) (이는 2M 암모니아수와 2M 탄산암모늄 용액을 혼합함으로써 pH를 조절함으로써 얻음)에 현탁시키고, 30℃에서 24시간 동안 교반함으로써 반응을 수행하였다. 표 2는 각 반응에 의하여 얻은 생성물 및 이의 농도 및 광학 순도를 보여준다.
비교예 1: 미생물로부터 유도된 효소에 의한 반응
0.44 단위/mg의 특이 활성을 갖는 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis)(시그마(Sigma))로부터 유도된 시판되는 페닐알라닌 암모니아-리아제 0.025 mg을 실시예 1의 배양 세포 대신에 첨가하였다는 것만을 예외로 하고는 실시예 1에서와 동일한 조건으로 반응을 수행하였다. 얻어진 생성물, 이의 농도 및 광학 순도를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
실시예 2: 배양 세포 (파슬리(Petroselinum hortense))의 처리된 생성물에 의한 반응
실시예 1에서와 동일한 방식으로 배양하여 얻은 파슬리(Petroselinum hortense)배양 세포 (1.5 kg)를 3 L의 0.1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.8)에 현탁시키고, 현탁액을 얼음 위에서 20분간 초음파 균질화(homogenization)시켰다. 불용성 분획물을 10,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하여 얻어진 처리된 생성물로부터 정치하고, 상징액을 수집하였다.
파쇄한 황산암모늄을 점차로 30분 동안 얼음 위에서 얻어진 추출물에 교반하면서 첨가하여, 농도가 40% 포화가 되게 한 다음에 용액을 15분 동안 10000rpm으로 원심분리시켜 침전물을 제거하였다. 마찬가지로, 황산암모늄을 얻어진 상징액에 첨가하여, 농도가 55% 포화가 되게 한 다음에, 용액을 15 분 동안 10000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 얻어진 침전물을 150 ml의 0.05M Tris-HCl 완충액에 용해시키고, 다음에 동일 완충액의 100배 부피에 대하여 4℃에서 24 시간 동안 투석하였다. 투석 후에, 170 ml의 용액을 페닐알라닌 암모니아-리아제의 조 효소 추출물 용액으로서 얻었다. 단백질의 총량은 620 mg이고, 특이 활성은 0.0205 U/mg이었다.
얻어진 조 추출물 용액 1ml 및 9 ml의 2M 암모니아/탄산암모늄 용액 (pH 10) (2M 수성 암모니아와 2M 탄산암모늄 용액을 혼합하여 pH를 조절하여 얻음)의 혼합한 용액에, 다양한 신남산 유도체를 첨가하여, 혼합 용액이 0.5%의 유도체를 함유하도록 하고, 다음에 30℃에서 24 시간 동안 교반시켜 반응을 수행하였다. 표 3은 각 반응에 의하여 얻은 생성물, 이의 농도 및 광학 순도를 보여준다.
비교예 2: 미생물로부터 유도한 효소에 의한 반응
0.44 단위/mg의 특이 활성을 갖는 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis)(시그마(Sigma))로부터 유도된 시판되는 페닐알라닌 암모니아-리아제 0.175 mg을 실시예 1의 배양 세포 대신에 첨가하였다는 것만을 예외로 하고는 실시예 1에서와 동일한 조건으로 반응을 수행하였다. 얻어진 생성물, 이의 농도 및 광학 순도를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
실시예 3: 식물 조직 (Cucumis sativusL.; 오이)의 처리된 생성물에 의한 반응
오이 (Cucumis sativusL.) 씨를 물-습윤 필터가 놓인 페트리 접시에서 25℃ 72 시간 동안 발아를 위해 배양하였다. 다음에 형광 램프의 광을 거기에 4 시간 조사하였고, 그 후 약 50 g의 배축(hypocotyl)을 수집하였다.
얻어진 배축 조직을 얼음 위에서 모르타르 내에서 균질화하고, 다음에 균질화 생성물의 총량을 1 mM 글루타티온을 포함하는 0.1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.8) 100 ml에 현탁시키고, 20분간 초음파 균질화시켰다. 불용성 분획물을 얻어진 처리된 생성물을 10,000 rpm에 15 분 동안 원심분리하여 침강시키고, 상징액을 수집하였다.
파쇄한 황산암모늄을 점차로 30분 동안 얼음 위에서 얻어진 추출물에 교반하면서 첨가하여, 농도가 30% 포화가 되게 한 다음에, 용액을 15분 동안 10000rpm으로 원심분리시켜 침전물을 제거하였다. 마찬가지로, 황산암모늄을 얻어진 상징액에 첨가하여, 농도가 70% 포화가 되게 한 다음에 용액을 15분 동안 10000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 얻어진 침전을 20 ml의 0.05M Tris-HCl 완충액에 용해시키고, 다음에 동일 완충액의 100배 부피에 대하여 4℃에서 24 시간 동안 투석하였다. 투석 후에, 2.2 ml의 용액을 페닐알라닌 암모니아-리아제의 조 효소 추출물 용액으로서 얻었다. 단백질의 총량은 50.7 mg이고, 특이 활성은 0.0307 U/mg이었다.
얻어진 조 추출물 용액 0.1ml 및 9.9 ml의 2M 암모니아/탄산암모늄 용액 (pH 10) (2M 수성 암모니아와 2M 탄산암모늄 용액을 혼합하여 pH를 조절하여 얻음)의 혼합한 용액에, 다양한 신남산 유도체를 첨가하여, 혼합 용액이 0.5%의 유도체를 함유하도록 하고, 다음에 30℃에서 24 시간 동안 교반시켜 반응을 수행하였다. 표 4은 각 반응에 의하여 얻은 생성물, 이의 농도 및 광학 순도를 보여준다.
비교예 3: 미생물로부터 유도한 효소에 의한 반응
비교예로서, 0.44 단위/mg의 특이 활성을 갖는 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis)(시그마(Sigma))로부터 유도된 시판되는 페닐알라닌 암모니아-리아제 0.16 mg을 실시예 3의 조 효소 추출물 용액 대신에 첨가하였다는 것만을 예외로 하고는 실시예 3에서와 동일한 조건으로 반응을 수행하였다. 얻어진 생성물, 이의 농도 및 광학 순도를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
실시예 4: 형질전환체의 배양 및 형질전환체와의 반응
2% 아가를 L 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% NaCl, 0.5% 효모 추출물, pH 7.0)에 혼합하고 혼합물을 편평하게 하여 얻은 아가 플레이트에서 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포의 접종 루프 양을 추가로 5 ml 내지 100 ml 의 L 배지로 30℃에서 16 시간 동안 배양하여 반응에 사용되는 형질전환체를 얻었다. 배양 후에, 세포를 수집하고, 동일 부피의 생리 염 용액을 배양액으로 사용하여 세척하였다. 다음에, 세포체를 배양액 (4M 암모니아/탄산암모늄 (pH 10.3))의 절반 부피의 반응 용액에서 현탁시키고, 기질을 추가로 첨가하여 최종 농도가 0.2% (2,000 mg/L)가 되게 하고, 30℃에서 교반하면서 반응시켰다. 이 반응 용액의 분취량을 매 일정 시간마다 취하고, 세포를 원심분리로 제거하였고, 상징액을 HPLC 분석하여 생성물의 양을 측정하였다.
실시예 5: cDNA 라이브러리의 제조 및 pal 유전자 획득
지치 (Lithospermum erythrorhizon)의 세포 배양, cDNA 라이브러리의 제조및 pal 유전자의 획득이 Yazaki 등의 보고서 (Plaint Cell Physiol.(1995), 36, 1319-1329; Biosci.Biotech. Biochem. (1997), 61(12), 1995-2003)에 상세히 기술되어 있고, 차나무(Camellia sinensis)의 cDNA 라이브러리의 제조 및 pal 유전자의 획득이 Matsumoto 등의 보고서 (Theor. Appl. Genet.(1994), 89(6), 671-675)에 상세히 기술되어 있다. 존재하는 이들 정보를 참고하여, 본 발명자는 여기에 약간의 변형을 하여 각 식물로부터 pal 유전자를 얻었다. 일련의 접근법들을 모든 식물로부터의 pal 유전자에 적용할 수 있으며, 이들의 뉴클레오티드 서열은 밝혀져 있다. 배양 세포 이외에, pal 유전자가 발현되는 조건 하에서의 식물 조직들이 mRNA를 얻기 위한 물질로서 또한 이용될 수 있다.
(지치(Lithospermum erythrorhizon)의 cDNA 라이브러리의 제조)
지치(Lithospermum erythrorhizon)의 조직으로부터 제조한 세포를 LS 배지 (10 μM 인돌아세트산 및 0.1 μM 키네틴을 포함하는 통상적인 성장 배지)에서 25℃에서 1주 동안 배양하였다. 다음에 얻어진 배양 세포를 M9 배지 (10 μM 인돌아세트산 및 0.1 μM 키네틴을 포함하는 시코닌(shikonin) 성장 배지)로 옮기고 추가로 2일 동안 배양하였다. 퀵프렙 마이크로(QuickPrep Micro) mRNA 정제 키트 (아멀샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))를 사용하여, 키트 설명서의 표준 방법에 의하여 mRNA를 얻어진 배양 세포로부터 얻었다. 이어서, 퍼스트-스트랜드(First-Strand) cDNA 신테시스(Synthesis) 키트 (아멀샴 파마시아 바이오테크) 및 올리고 (dT) 12-18 프라이머를 사용하여, 얻어진 mRNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. 생성된 DNA 단편의 혼합물을 유전자 증폭 PCR에 대한 주형으로 사용된 cDNA 라이브러리로서 제공하였다.
(차나무(Camellia sinensis)의 cDNA 라이브러리의 제조)
냉동된 젊은 차 잎(햇살 좋은 오후에 수집함)으로부터, 지치(Lithospermum erythrorhizon)의 방법과 동일한 방법으로 RT-PCR에 의하여 DNA 단편을 얻었고, 얻어진 DNA 단편의 혼합물을 유전자 증폭 PCR에 대한 주형으로 사용된 cDNA 라이브러리로서 사용하였다.
(pal 유전자의 획득)
지치에 두가지 유형의 유전자가 존재한다 (이후, "LePAL1" 및 "LePAL2"로 언급합). 이들 두 유형의 유전자는 이미 Yazaki 등에 의해 데이타베이스 예컨대 GenBank 및 EMBL에 SEQ ID 번호: D83075 및 D83076으로 각각 공개되었다. 차나무(Camellia sinensis)에 존재하는 pal 유전자 (이후, "CAMPAL"로 언급함)는 이미 Matsumoto 등에 의해 상기 데이타베이스에 SEQ ID 번호: D26596로 공개되었다. 이의 서열 5'-말단 및 3'-말단을 사용하여, pal 유전자에 특이한 프라이머를 제조하였다. 여기서, 적합한 제한 부위를 양 말단에 갖도록 프라이머를 고안하여, 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 벡터와 연결할 수 있다.
다양한 유형의 플라스미드 벡터의 복수 클로닝 부위에 종종 사용되는 제한 효소들 사이에서부터 적합한 제한 효소(pal 유전자의 서열에 절단 부위를 가지지 않음)를 조사한 결과 , LePAL2에 대해서는, EcoRI 부위가 이의 5'-말단 쪽에 사용되고, SalI 부위가 이의 3'-말단 쪽에 사용되고, CAMPAL에 대해서, SmaI 부위가 이의 5'-말단 쪽에 사용되고, HindIII 부위가 이의 3'-말단 쪽에 사용되었다.LePAL1의 5'-말단 쪽에 적합한 부위를 발견하지 못하였기에, EcoRV 부위를 5'-말단에 사용하고, 절단 후에 발생되는 평활 말단을 벡터의 SmaI 부위의 평활 말단과 연결되도록 디자인하였다. LePAL1의 3'-말단 쪽에는, LePAL2에서처럼 SalI 부위가 사용되었다.
프라이머의 서열:
(LePAL1)
[서열 1]
5'-말단 (EcoRV 부위가 있는): 서열 목록 1로 나타낸 서열을 갖는 23mer 올리고뉴클레오티드
[서열 2]
3'-말단 (SalI 부위가 있는): 서열 목록 2로 나타낸 서열을 갖는 23mer 올리고뉴클레오티드
(LePAL2)
[서열 3]
5'-말단 (EcoRI 부위가 있는): 서열 목록 3으로 나타낸 서열을 갖는 25mer 올리고뉴클레오티드
[서열 4]
3'-말단 (SalI 부위가 있는): 서열 목록 4로 나타낸 서열을 갖는 23mer 올리고뉴클레오티드
(CAMPAL)
[서열 5]
5'-말단 (SmaI 부위가 있는): 서열 목록 5로 나타낸 서열을 갖는 23mer 올리고뉴클레오티드
[서열 6]
3'-말단 (HindIII 부위가 있는): 서열 목록 6으로 나타낸 서열을 갖는 23mer 올리고뉴클레오티드
반응 용액의 조성:
주형 cDNA0.5 내지 2 ㎍
프라이머각 100 pmol
dNTPs 용액각 1 mM
10 x 반응 완충액10 ㎕
ExTaq DNA 폴리머라제 (다카라 슈조 코. 엘티디(TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)) 2.5 U
총: 50 ㎕
반응 조건:
열 변성94℃, 30 초
어닐링55℃, 60 초
연장(elongation)72℃, 120 초
사이클 수24 사이클
상기 조건하에서 유전자 단편의 증폭을 시도하고자 할 때, 주형 cDNA의 양을여러번 변화시키면서, 이론적으로 계산하여 LePAL1, LePAL2 및 CAMPAL 각각의 약 2.1kb의 길이를 갖는 단편을 거의 특이적으로 증폭시켰다. LePAL1, LePAL2 및 CAMPAL 각각의 상기 증폭된 단편을 아가로스 젤 전기영동을 행하고, 다음에 추출, 수집, 및 정제하였다. 이어서, 뉴클레오티드 서열의 분석을 증폭에 사용된 프라이머로 수행할 경우, 뉴클레오티드 서열의 얻어진 정보가 LePAL1, LePAL2 및 CAMPAL의 것과 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 6: PAL 활성을 보여주는 형질전환체의 제조
얻어진 유전자 단편을 아가로스 젤 전기영동을 하고, 추출하고 수집하였다. 이렇게 하여 얻어진 제한 부위가 있는 단편 LePAL1, LePAL2 및 CAMPAL을 제한 효소, EcoRV 및 SalI, EcoRI 및 SalI, 및 SmaI 및 HindIII으로 각각 절단하였다. 그렇게 한 후, 아가로스 젤 전기영동, 추출 및 수집과 같은 조작을 다시 수행하였다. 이들 단편을 EcoRV 및 SalI, EcoRI 및 SalI, 및 SmaI 및 HindIII로 절단하여 얻은 pUC18에 연결하고, 다음에 아가로스 젤 전기영동, 추출 및 수집을 행하였다 (도 1 및 2).
에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)JM109를 이들 플라스미드로 형질전환하여 얻은 형질전환체를 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 및 0.1% X-Gal을 포함하는 L 아가 플레이트에 가하고, 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 생성된 콜로니로부터, 백색을 나타내는 일부 콜로니를 선택하고, 이의 플라스미드를 제조하여, 제한 효소 절단 패턴을 조사하였다. 그 결과, 관심있는 플라스미드, pULePAL1, pULePAL2 및 pUCAMPAL를 갖는 다수의 형질전환체를 얻었다.
3개의 균주를 이들 계통을 얻어진 형질전환체의 각 유형으로부터 임의로 선택하였다. 실시예 4에서 기술된 방법에 따라서, 각 균주의 복제물 (2 종 x 3 균주 x 2 라인)를 5 ml의 L 배지에서 배양하였다. 배양의 개시 후 12 시간 동안, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 2 라인의 어느 하나에 첨가하여, IPTG 농도가 배양액에서 0.1 mM로 되게 하고, 추가로 4시간 동안 배양하였다. 얻어진 배양 용액을 따로 원심분리하여 세포를 수집하고, 얻어진 세포를 실시예 4에서 기술된 방법에 따라 반응시켰다. 반응 10 시간 후, 얻어진 생성물을 HPLC로 결정하였다. 표 5에서 보여지듯이, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 존재 또는 부재에 관계없이, 각 형질전환체는 페닐알라닌 암모니아-리아제 활성을 보여 주었다.
[표 5]
실시예 7: 형질전환체를 사용하여 페닐알라닌 유도체의 제조
실시예 6에서 얻은 pULePAL1, pULePAL2 및 pUCAMPAL을 갖는 각 유형의 형질전환체로부터의 한 균주를 실시예 4에서 기술된 방법에 의하여 100 ppm 암피실린을 포함하는 100 ml의 L 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 용액을 100 ppm 암피실린을 포함하는 2 L의 L 배지를 포함하는 5 L 자(jar) 발효기로 옮기고, 다음에 30℃에서 800 rpm로 통풍을 1 ml/분으로 하여 10 내지 12 시간 동안 배양물의 교반을 수행하였다.
후반 로그형 성장 상(phase)으로부터 초반 정지 상(phase)에 이르기까지 배양액을 원심분리하여 얻은 세포를 1 L의 4M 암모니아/탄산암모늄 용액 (pH 10.3)에 재현탁하였고, 20 g의 기질 (표 6 참조)을 거기에 첨가하고, 30℃에서 800 rpm로 교반하면서 반응시켰다. 반응 용액의 분취량을 매 1시간 마다 수집하고, 반응 용액 (표 6 참조) 중의 생성된 생성물을 HPLC에 의해 측정하였다. 기질을 연속적으로 첨가하여 기질의 농도를 약 2%로 유지하고, 반응을 계속하였다. 약 10 시간 후에, 생성물이 반응 용액 내에서 1% 내지 3%의 농도로 축적되었다 (표 6).
반응의 종결 후에, 반응 용액을 회전 증발기를 사용하여 진공 농축을 하여 과량의 암모니아를 제거하고, 다음에 진한 염산을 거기에 첨가하여 pH를 1로 조절하여 남아있는 기질을 침전시켰다. 용액을 필터로 여과하고, 다음에 상징액을 회전 증발기로 농축하였다. 결정화된 생성물을 여과하여 수집하고, 묽은 염산 (0.1 N)으로 세척하고, 진공 건조하였다. 이 건조 샘플의 순도는 99% 이상이었다. 검출된 불순물은 모든 시스템에서 기질인 신남산 유도체 또는 아크릴산 유도체였다. 이들 유도체의 광학 순도가 상기 기술한 방법에 의하여 측정되는 경우, 단지 L 형태만이 두 유도체 모두에서 검출되고 D 형태는 검출 한계량 미만이었다.
[표 6]
본 실시예에서, 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 페닐알라닌 암모니아-리아제를 채택하여, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 본 발명에서 일반적으로 효과적임을 보여주었다 (오이(Cucumis sativusL.)의 아미노산 서열은 동정되지 않음). 아미노산 서열에서의 서열 상동성을 도 3에서 나타내었다. 이들 효소가 상호 간에 아미노산 서열에서 10% 내지 20% 상이하여도 이들 효소의 어느 것도 본 발명에서 충분히 효과적임을, 즉 이들 효소가 미생물로부터 유도된 동일 효소보다 기질을 전환하여 페닐알라닌 유도체를 생성시키는 능력이 훨씬 뛰어남을 발견하였다.
본 발명에 의하면, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제를 사용하여, 출발 물질인 아크릴산 유도체로부터, 해당하는 아미노산을 편리하게 그리고 효과적으로 얻을 수 있다. 특히, 이의 페닐기에 다양한 체환체를 갖는 L-페닐알라닌 유도체를 간단하게 그리고 효과적으로 얻을 수 있다.
본 발명의 L-아미노산의 제조 방법에 의하여 얻은 L-아미노산은 넓은 분야에서 생물학적 활성 유기 화합물 예컨대 제약학적 중간체 또는 농약 중간체의 키랄 구성 블록으로서 유용하고, 주로 제약학적 중간체로 유용하다.

Claims (30)

  1. 암모니아의 존재 하에서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제가 하기 화학식 (1)로 표현되는 아크릴산 유도체에 작용하는 단계를 포함하는 하기 화학식 (2)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법.
    <화학식 1>
    (상기 화학식에서,
    Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
    R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고, 및
    n은 0 이상의 정수이고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다);
    <화학식 2>
    (상기 화학식에서,
    Z는 헤테로 원자를 포함할 수 있는 방향족환 기이고,
    R은 방향족환에서의 치환체를 나타내고,
    n은 0 이상의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Rn-Z-이 하기 화학식 (3)으로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법.
    <화학식 3>
    상기 화학식에서
    R은 벤젠환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기이고, 및
    n은 0 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 5의 정수를 나타낸다. n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 Rn-Z-이 하기 화학식 (4)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법.
    <화학식 4>
    상기 화학식에서,
    X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
    R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
    R은 헤테로환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타내고, 및
    n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 Rn-Z-이 하기 화학식 (5)로 표현되는 L-아미노산의 제조 방법:
    <화학식 5>
    상기 화학식에서,
    X는 S, O, NH 또는 NR1를 나타내고,
    R1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타내고,
    R은 헤테로환에서의 치환체이고 시아노 기, 히드록실 기, 카르복실 기, 아미드 기, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 아미노기, 니트로 기, 히드록시메틸 기,또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알콕시 기를 나타내고, 및
    n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, n이 2 이상인 경우, 각 R은 동일하거나 상이할 수 있다.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제를 포함하는 식물 조직을 처리함으로써 얻어진 조성물을 사용하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제를 포함하는 식물 배양 세포 및(또는) 이의 처리된 조성물을 사용하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 식물 내에서 발현될 수 있게 하는 단계 및 형질전환된 식물 배양물 또는 식물 배양물의 처리된 생성물을 사용하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 미생물 내에서 발현될 수 있게 하는 단계 및 형질전환된 미생물 배양물, 이의 처리 생성물 또는 배양물에서 얻은 효소를 사용하는 단계를포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 지치(Lithospermum erythrorhizon)으로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역된 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 L-아미노산의 제조 방법.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 식물로부터 유도한 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 지치(Lithospermum erythrorhizon)으로부터 유도한 pal2 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 연역된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자인 L-아미노산의 제조 방법.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자가 유도되는 식물이 지치(Lithospermum)및(또는) 차나무(Camellia)인 L-아미노산의 제조 방법.
  12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 박테리아, 효모 및(또는) 사상균인 L-아미노산의 제조 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 박테리아가 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)인L-아미노산의 제조 방법.
  14. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 히드록실 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  15. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 시아노 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  16. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 카르복실 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  17. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 아미드 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  18. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 할로겐 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  19. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 아미노 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  20. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 니트로 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  21. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 히드록시메틸 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  22. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (3)에서, 치환체 R 중 하나 이상이 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기인 L-아미노산의 제조 방법.
  23. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R이 시아노 기, 히드록실 기, 니트로 기 및 카르복실 기 중 어느 하나이고, n이 1인 L-아미노산의 제조 방법.
  24. 제 2항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-페닐알라닌인 L-아미노산의 제조 방법.
  25. 제 3항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 0인 L-아미노산의 제조 방법.
  26. 제 3항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 S인 L-아미노산의 제조 방법.
  27. 제 3항 및 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (4)에서 X가 NH인 L-아미노산의 제조 방법.
  28. 제 4항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 O인 L-아미노산의 제조 방법.
  29. 제 4항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 S인 L-아미노산의 제조 방법.
  30. 제 4항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (5)에서 X가 NH인 L-아미노산의 제조 방법.
KR10-2003-7016876A 2001-06-25 2002-06-24 Ｌ-아미노산의 제조 방법 KR20040026672A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2001-00190867 2001-06-25
JP2001190867 2001-06-25
JPJP-P-2001-00367780 2001-11-30
JP2001367780 2001-11-30
PCT/JP2002/006287 WO2003000915A1 (en) 2001-06-25 2002-06-24 Method for producing l-amino acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040026672A true KR20040026672A (ko) 2004-03-31

Family

ID=34525230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7016876A KR20040026672A (ko) 2001-06-25 2002-06-24 Ｌ-아미노산의 제조 방법

Country Status (4)

Country Link
KR (1) KR20040026672A (ko)
CN (1) CN100457918C (ko)
AT (1) ATE353371T1 (ko)
DE (1) DE60218033T2 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1309702C (zh) * 2005-10-28 2007-04-11 中国科学院上海有机化学研究所 犬尿氨酸酶的特异性抑制剂l－邻甲氧基苯甲酰基丙氨酸的合成方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1145484A (zh) * 1995-02-21 1997-03-19 申炳章 中文电脑
US5981239A (en) * 1997-09-24 1999-11-09 Great Lakes Chemical Corp. Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis

Also Published As

Publication number Publication date
ATE353371T1 (de) 2007-02-15
CN100457918C (zh) 2009-02-04
CN1568368A (zh) 2005-01-19
DE60218033D1 (de) 2007-03-22
DE60218033T2 (de) 2007-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5962281A (en) Process for preparing L-tertiary-leucine and L-phosphinothricine by transamination
US20050009153A1 (en) Process of producing glutamate derivatives
US7354746B1 (en) Method for producing optically active IHOG and monatin
US10221435B2 (en) DNA encoding novel enzyme having D-serine synthase activity, method of producing the enzyme and method of producing D-serine by using the same
US20220220516A1 (en) Method for asymmetrically preparing l-phosphinothricin by oxidation-reduction reaction through biological multi-enzyme coupling
EA009284B1 (ru) Полипептиды и пути биосинтеза
JP2003024074A (ja) Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法
Kim et al. Optimization of the enzymatic synthesis of dp-hydroxyphenylglycine from dl-5-substituted hydantoin using d-hydantoinase and N-carbamoylase
FR2804971A1 (fr) Adn codant une acetohydroxyacide synthase, bacterie le contenant et procede de production de l-valine par culture de cette bacterie
RU2287015C2 (ru) Способ получения l-аминокислот
EP1479762A1 (en) Novel dehydrogenase and gene encoding the same
KR20040026672A (ko) Ｌ-아미노산의 제조 방법
JP4590981B2 (ja) 光学活性環状アミノ酸の製造方法
JP2003024073A (ja) Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法
JP2003225092A (ja) Ｌ−アミノ酸の製法
JP4118687B2 (ja) Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ（アリスロバクテリア クリスタロポイテス）ＤＳＭ２０１１７株由来のＤ−カルバモイラーゼ
US8940516B2 (en) Method for the synthesis of chiral cyanohydrins via a hydroxynitrile lyase from brassicaceae
US8895270B2 (en) Method for producing β-Phenylalanine
KR0185578B1 (ko) 유전자 재조합 플라스미드, 미생물 및 이를 이용한 글루타민산의 제조방법
JP2004041107A (ja) Ｌ−アミノ酸の製造方法
JPH04271783A (ja) 新規インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびその製造法
JP2003319788A (ja) 新規デヒドロゲナーゼ及びそれをコードする遺伝子
WO2004090124A2 (en) Sequences encoding s-hydroxynitril lyases and their use in methods for the production of cyanohydrins
KR20060113697A (ko) 신규 아세토아세틸-ＣｏＡ 환원 효소 및 광학 활성알코올의 제조 방법
JP2004262819A (ja) 複素環カルボン酸誘導体の製造方法および複素環カルボン酸誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application