JP2003024074A - Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法Info
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ５置換ヒダントインをＤ−アミノ酸に変換す
る能力を持つ微生物より、変換能力に関与しているＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子及びＤ−カルバミラーゼ遺伝子
を単離し、遺伝子増幅、転写及び翻訳活性を高めること
によって目的とする酵素の生産量を高めた組換え体を作
製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率良く
製造する方法を提供する。 【解決手段】特定の塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、およ
び、特定の塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
る能力を持つ微生物より、変換能力に関与しているＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子及びＤ−カルバミラーゼ遺伝子
を単離し、遺伝子増幅、転写及び翻訳活性を高めること
によって目的とする酵素の生産量を高めた組換え体を作
製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率良く
製造する方法を提供する。 【解決手段】特定の塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、およ
び、特定の塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−アミノ酸の製
造に好適に利用できるＤ−ヒダントインハイドロラーゼ
（Ｄ−ヒダントイナーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、該遺伝子を
含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換
された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造
方法、およびＤ−アミノ酸の製造方法に関する。
造に好適に利用できるＤ−ヒダントインハイドロラーゼ
（Ｄ−ヒダントイナーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、該遺伝子を
含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換
された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造
方法、およびＤ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素を用いたアミノ酸製法の一つとし
て、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合
物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉
分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン
化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬
品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法で
ある。
て、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合
物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉
分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン
化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬
品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法で
ある。
【０００３】この５置換ヒダントイン化合物から光学活
性アミノ酸を製造する方法では、以下の、の酵素が
必要である。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：ヒダントインハイドロラーゼ（ヒ
ダントイナーゼ）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ（カルバミラーゼ）。
性アミノ酸を製造する方法では、以下の、の酵素が
必要である。 ５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：ヒダントインハイドロラーゼ（ヒ
ダントイナーゼ）。 生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ（カルバミラーゼ）。
【０００４】ここで、５置換ヒダントイン化合物から光
学活性アミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイ
ナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも一方
に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵
素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを
組み合わせた方法が知られている。
学活性アミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイ
ナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも一方
に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵
素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを
組み合わせた方法が知られている。
【０００５】このうち、Ｄ−アミノ酸生産菌または当該
菌が産生する酵素含有物を用いて５置換ヒダントイン化
合物からＤ−アミノ酸を製造する方法として、シュード
モナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特公昭５６
−００３０３４号公報）、アグロバクテリウム(Agrobac
terium)属細菌を用いる方法（特開平０３−０１９６９
６号公報）などが知られている。これらのＤ−アミノ酸
生産菌では、一般的に、そのヒダントイナーゼ活性がＤ
体の５置換ヒダントインに対して特異的であることが多
く、ＤＬ−５置換ヒダントイン（ここでは５−ベンジル
ヒダントイン）を出発物質とした場合、下記反応式に示
すように、Ｄ体のみが加水分解されてＮ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸となり、さらにＤ体のみに作用するＤ−カ
ルバミラーゼによって加水分解されて、最終的にＤ体の
アミノ酸（ここではＤ−フェニルアラニン）のみが得ら
れる。
菌が産生する酵素含有物を用いて５置換ヒダントイン化
合物からＤ−アミノ酸を製造する方法として、シュード
モナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特公昭５６
−００３０３４号公報）、アグロバクテリウム(Agrobac
terium)属細菌を用いる方法（特開平０３−０１９６９
６号公報）などが知られている。これらのＤ−アミノ酸
生産菌では、一般的に、そのヒダントイナーゼ活性がＤ
体の５置換ヒダントインに対して特異的であることが多
く、ＤＬ−５置換ヒダントイン（ここでは５−ベンジル
ヒダントイン）を出発物質とした場合、下記反応式に示
すように、Ｄ体のみが加水分解されてＮ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸となり、さらにＤ体のみに作用するＤ−カ
ルバミラーゼによって加水分解されて、最終的にＤ体の
アミノ酸（ここではＤ−フェニルアラニン）のみが得ら
れる。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ここで、Ｄ−アミノ酸
生産菌の培養菌体を用いて５置換ヒダントイン化合物か
ら光学活性アミノ酸を製造する場合には、反応に必要な
酵素の生産量を増加させるため、ヒダントイン誘導体な
どの誘導物質を使用したり、培養菌体を大量に使用する
必要があるなどの問題点がある。
生産菌の培養菌体を用いて５置換ヒダントイン化合物か
ら光学活性アミノ酸を製造する場合には、反応に必要な
酵素の生産量を増加させるため、ヒダントイン誘導体な
どの誘導物質を使用したり、培養菌体を大量に使用する
必要があるなどの問題点がある。
【０００８】また、光学活性アミノ酸を効率良く製造す
るためには、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カ
ルバミラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子増幅、転写および
翻訳活性を高めることによってこの酵素の生産量を高め
た組み換え体を用いることが好ましい。しかしながら、
従来の方法では反応に多くの時間を要し、反応の中間体
であるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が副生するなどの
問題点があった。
るためには、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カ
ルバミラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子増幅、転写および
翻訳活性を高めることによってこの酵素の生産量を高め
た組み換え体を用いることが好ましい。しかしながら、
従来の方法では反応に多くの時間を要し、反応の中間体
であるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が副生するなどの
問題点があった。
【０００９】本発明は上述の問題点を解決するために成
されたものであり、５置換ヒダントイン化合物をＤ−ア
ミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダントイ
ナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離し
て、そのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列を
解明するとともに、該酵素の生産量を高めた組み換え体
を作製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率
良く製造する方法を提供することを目的とする。
されたものであり、５置換ヒダントイン化合物をＤ−ア
ミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダントイ
ナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離し
て、そのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列を
解明するとともに、該酵素の生産量を高めた組み換え体
を作製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率
良く製造する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記問題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは５置換ヒダントイン化合物をＤ−
アミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダント
イナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離
することに成功し、本発明を完成させた。
の結果、本発明者らは５置換ヒダントイン化合物をＤ−
アミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダント
イナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離
することに成功し、本発明を完成させた。
【００１１】即ち、本発明は以下のとおりである。
【００１２】（請求項１） 下記(a)または(b)の塩基配
列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００１３】（請求項２） 下記(c)または(d)のアミノ
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００１４】（請求項３） 請求項１または２に記載の
ＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換
えＤＮＡ。
ＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換
えＤＮＡ。
【００１５】（請求項４） 前記ベクターＤＮＡは、ｐ
ＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはそ
の誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の
組み換えＤＮＡ。
ＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはそ
の誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の
組み換えＤＮＡ。
【００１６】（請求項５） 請求項３または４に記載の
組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００１７】（請求項６） 前記細胞は、エシェリヒア
・コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細
胞。
・コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細
胞。
【００１８】（請求項７） 請求項５または６に記載の
細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積さ
せることを特徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有す
るタンパク質の製造方法。
細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積さ
せることを特徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有す
るタンパク質の製造方法。
【００１９】（請求項８） 下記(a)または(b)のアミノ
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２０】（請求項９） 請求項７に記載の製造方法
を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイ
ナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに
作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造する
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、を含むこと
を特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方
法。
を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイ
ナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに
作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造する
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、を含むこと
を特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方
法。
【００２１】（請求項１０） 請求項７に記載の製造方
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル
−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有
物を、５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を
製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴と
するＤ−アミノ酸の製造方法。
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル
−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有
物を、５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を
製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴と
するＤ−アミノ酸の製造方法。
【００２２】（請求項１１） 下記(a)または(b)の塩基
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００２３】（請求項１２） 下記(c)または(d)のアミ
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２４】（請求項１３） 請求項１１または１２に
記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる
組み換えＤＮＡ。
記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる
組み換えＤＮＡ。
【００２５】（請求項１４） 前記ベクターＤＮＡは、
ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたは
その誘導体に由来することを特徴とする請求項１３に記
載の組み換えＤＮＡ。
ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたは
その誘導体に由来することを特徴とする請求項１３に記
載の組み換えＤＮＡ。
【００２６】（請求項１５） 請求項１３または１４に
記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００２７】（請求項１６） 前記細胞は、エシェリヒ
ア・コリに由来することを特徴とする請求項１５に記載
の細胞。
ア・コリに由来することを特徴とする請求項１５に記載
の細胞。
【００２８】（請求項１７） 請求項１５または１６に
記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細
胞中にＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄
積させることを特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質の製造方法。
記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細
胞中にＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄
積させることを特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質の製造方法。
【００２９】（請求項１８） 下記(a)または(b)のアミ
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００３０】（請求項１９） 請求項１７に記載の製造
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ
酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製
造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造
方法。
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ
酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製
造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造
方法。
【００３１】（請求項２０） 請求項１７に記載の製造
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントイ
ンを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒ
ダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−ア
ミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ
酸の製造方法。
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントイ
ンを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒ
ダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−ア
ミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ
酸の製造方法。
【００３２】（請求項２１） 請求項７に記載の製造方
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造する第１のタンパク質製造工程と、請求項１７
に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質を製造する第２のタンパク質製造工程
と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
および前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質
を５置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製
造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とす
るＤ−アミノ酸の製造方法。
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造する第１のタンパク質製造工程と、請求項１７
に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質を製造する第２のタンパク質製造工程
と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
および前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質
を５置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製
造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とす
るＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３３】（請求項２２） 請求項９に記載のＮ−カ
ルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含
有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダント
イン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とする
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
ルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含
有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダント
イン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とする
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【００３４】（請求項２３） 請求項１０、１９、２０
または２１に記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、
５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当
該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換
ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特
徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
または２１に記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、
５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当
該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換
ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特
徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【００３５】
【発明の実施の形態】以下、本発明について、
[I]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ [II]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方
法 [III]Ｄ−アミノ酸の製造方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本
明細書においては、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する
タンパク質をＤ−ヒダントイナーゼと呼ぶことがあり、
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＤ−カル
バミラーゼと呼ぶことがある。
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ [II]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方
法 [III]Ｄ−アミノ酸の製造方法 の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本
明細書においては、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する
タンパク質をＤ−ヒダントイナーゼと呼ぶことがあり、
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＤ−カル
バミラーゼと呼ぶことがある。
【００３６】[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼをコードするＤＮＡ 本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラー
ゼをコードするＤＮＡは、特公昭５６−０１５８７８号
に記載のパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella p
neumotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４
８）の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。
なお、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pne
umotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）
はモラキセラ ノンリクエファシエンス(Moraxella non
liquefaciens)として通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結
果、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneum
otropica)に分類されることが判明した。現在では、パ
スツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropi
ca)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）として経
済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。
バミラーゼをコードするＤＮＡ 本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラー
ゼをコードするＤＮＡは、特公昭５６−０１５８７８号
に記載のパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella p
neumotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４
８）の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである。
なお、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pne
umotropica)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）
はモラキセラ ノンリクエファシエンス(Moraxella non
liquefaciens)として通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結
果、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneum
otropica)に分類されることが判明した。現在では、パ
スツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropi
ca)ＡＪ１１２２１（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４８）として経
済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。
【００３７】これらの微生物について、細菌の分類学書
であるバージェーズ マニュアルオブ デターミネイテ
ィブ バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウ
イリアム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわ
せて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
であるバージェーズ マニュアルオブ デターミネイテ
ィブ バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウ
イリアム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわ
せて生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。
【００３８】パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurel
la pneumotropica)ＡＪ１１２２１の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 球状桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 ＋ インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
la pneumotropica)ＡＪ１１２２１の再同定結果 グラム染色 陰性 細胞形態 球状桿菌 運動性 なし 硝酸塩還元 ＋ インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ ＋ エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ 基質資化能 ブドウ糖 − Ｌ−アラビノース − Ｄ−マンノース − Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース ＋ グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −
【００３９】以上の菌学的性質より、ＡＪ１１２２１菌
をパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumot
ropica)と同定した。
をパスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumot
ropica)と同定した。
【００４０】本発明者らは、ＡＪ１１２２１菌の染色体
ＤＮＡを用いて作製した遺伝子ライブラリーより、Ｄ−
ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝
子を単離、取得することに成功した。これらの遺伝子
は、染色体上で離れた位置に存在するものと考えられ
る。
ＤＮＡを用いて作製した遺伝子ライブラリーより、Ｄ−
ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝
子を単離、取得することに成功した。これらの遺伝子
は、染色体上で離れた位置に存在するものと考えられ
る。
【００４１】なお、遺伝子の単離の際に用いたＰＣＲ法
の操作については、White, T.J. etal., Trends Genet.
５巻、１８５ページ、１９８９年などに記載されてい
る。また、染色体ＤＮＡを調製する方法や、さらにＤＮ
Ａ分子をプローブとして用いて遺伝子ライブラリーから
目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Mole
cular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor pre
ss（１９８９年）などに記載されている。
の操作については、White, T.J. etal., Trends Genet.
５巻、１８５ページ、１９８９年などに記載されてい
る。また、染色体ＤＮＡを調製する方法や、さらにＤＮ
Ａ分子をプローブとして用いて遺伝子ライブラリーから
目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Mole
cular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor pre
ss（１９８９年）などに記載されている。
【００４２】さらに、単離されたＤ−ヒダントイナーゼ
若しくはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡの塩基
配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecul
ar Cloning, John Wiley & Sons, Inc.（１９８５年）
などに記載されている。また、Applied Biosystems社製
のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定する
ことができる。
若しくはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡの塩基
配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecul
ar Cloning, John Wiley & Sons, Inc.（１９８５年）
などに記載されている。また、Applied Biosystems社製
のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定する
ことができる。
【００４３】なお、添付した本発明の配列表において、
上記方法によって特定されたＡＪ１１２２１菌由来のＤ
−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを配列番号１に
示し、Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡを配列番
号３に示す。
上記方法によって特定されたＡＪ１１２２１菌由来のＤ
−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを配列番号１に
示し、Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡを配列番
号３に示す。
【００４４】これらのＤＮＡは、いずれもＤ−アミノ酸
の製造に係わるタンパク質をコードするものである。
の製造に係わるタンパク質をコードするものである。
【００４５】また、配列表の配列番号２に、配列表の配
列番号１の塩基配列がコードするＤ−ヒダントイナーゼ
活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列表
の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコー
ドするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列を示す。
列番号１の塩基配列がコードするＤ−ヒダントイナーゼ
活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列表
の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコー
ドするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列を示す。
【００４６】配列表の配列番号２に記載のＤ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質、および、配列表の配
列番号４に記載のＤ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質は、下記反応式に示すように、５−ベンジルヒダ
ントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｄ−フ
ェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生成す
る反応を触媒する。
イナーゼ活性を有するタンパク質、および、配列表の配
列番号４に記載のＤ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質は、下記反応式に示すように、５−ベンジルヒダ
ントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｄ−フ
ェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生成す
る反応を触媒する。
【００４７】
【化１】
【００４８】次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼをコ
ードするＤＮＡおよびＤ−カルバミラーゼをコードする
ＤＮＡについて詳細に説明する。
ードするＤＮＡおよびＤ−カルバミラーゼをコードする
ＤＮＡについて詳細に説明する。
【００４９】(1)Ｄ−ヒダントイナーゼをコードするＤ
ＮＡ 配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＤ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子は、前述したようにパスツレラ
ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１
１２２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、
既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来
のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子（ＷＯ９６／２０２７５
号公報）と７７％（アミノ酸配列において７６％）の相
同性を示す。
ＮＡ 配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＤ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子は、前述したようにパスツレラ
ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１
１２２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、
既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来
のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子（ＷＯ９６／２０２７５
号公報）と７７％（アミノ酸配列において７６％）の相
同性を示す。
【００５０】ここで、本発明のＤ−ヒダントイナーゼを
コードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤ
ＮＡだけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の
種や株ごとに塩基配列の違いが観察される。
コードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤ
ＮＡだけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の
種や株ごとに塩基配列の違いが観察される。
【００５１】なお、本発明のＤＮＡは単離されたＤ−ヒ
ダントイナーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然
ながら、単離されたＤ−ヒダントイナーゼをコードする
ＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、
Ｄ−ヒダントイナーゼをコードする場合には本発明のＤ
ＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用
いられるものとして、Method in Enzymol.１５４ペー
ジ、１９８７年などに記載されている部位特異的変異導
入法がある。
ダントイナーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然
ながら、単離されたＤ−ヒダントイナーゼをコードする
ＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、
Ｄ−ヒダントイナーゼをコードする場合には本発明のＤ
ＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用
いられるものとして、Method in Enzymol.１５４ペー
ジ、１９８７年などに記載されている部位特異的変異導
入法がある。
【００５２】また、配列表の配列番号１に記載の塩基配
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここ
で「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的な
ハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形
成されない条件をいう。この条件を明確に数値化するこ
とは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ
同士、例えば、好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダ
イズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズ
する条件が挙げられる。また、「Ｄ−ヒダントイナーゼ
活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解する
ことによってＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する
活性であればよい。
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここ
で「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的な
ハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形
成されない条件をいう。この条件を明確に数値化するこ
とは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ
同士、例えば、好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダ
イズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズ
する条件が挙げられる。また、「Ｄ−ヒダントイナーゼ
活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解する
ことによってＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する
活性であればよい。
【００５３】さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮ
ＡがコードするＤ−ヒダントイナーゼと実質的に同一の
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。即ち、 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも
本発明のＤＮＡである。
ＡがコードするＤ−ヒダントイナーゼと実質的に同一の
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。即ち、 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも
本発明のＤＮＡである。
【００５４】なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」とは、
５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによって
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であれば
よい。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号２に記載
のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵
素活性を保持していることが望ましい。
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」とは、
５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによって
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であれば
よい。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号２に記載
のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵
素活性を保持していることが望ましい。
【００５５】(2)Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮ
Ａ 次に、本発明のＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡ
について説明する。配列表の配列番号３の塩基配列を有
する本発明のＤ−カルバミラーゼは、パスツレラ ニュ
ーモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２
２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知
のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ
−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２号）
と７８％（アミノ酸配列において８１％）の相同性を示
し、既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来
のＤ−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２
号）と６７％（アミノ酸配列において５９％）の相同性
を示す。
Ａ 次に、本発明のＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡ
について説明する。配列表の配列番号３の塩基配列を有
する本発明のＤ−カルバミラーゼは、パスツレラ ニュ
ーモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２
２１株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知
のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ
−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２号）
と７８％（アミノ酸配列において８１％）の相同性を示
し、既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来
のＤ−カルバミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２
号）と６７％（アミノ酸配列において５９％）の相同性
を示す。
【００５６】なお、本発明のＤ−カルバミラーゼをコー
ドするＤＮＡは、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡ
だけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の種お
よび株ごとに塩基配列の違いが観察されるはずだからで
ある。
ドするＤＮＡは、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡ
だけではない。即ち、パスツレラ属に属する細菌の種お
よび株ごとに塩基配列の違いが観察されるはずだからで
ある。
【００５７】また、単離されたＤ−カルバミラーゼをコ
ードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであ
っても、Ｄ−カルバミラーゼをコードする場合には、本
発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として
頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.１５
４ページ、１９８７年などに記載されている部位特異的
変異導入法がある。
ードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであ
っても、Ｄ−カルバミラーゼをコードする場合には、本
発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として
頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.１５
４ページ、１９８７年などに記載されている部位特異的
変異導入法がある。
【００５８】また、配列表の配列番号３に記載の塩基配
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同
士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９
０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。また、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによ
ってＤ−アミノ酸を生成する活性であればよい。
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同
士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９
０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。また、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによ
ってＤ−アミノ酸を生成する活性であればよい。
【００５９】また、上記ＤＮＡがコードするＤ−カルバ
ミラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａも本発明のＤＮＡである。即ち、 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本
発明のＤＮＡである。
ミラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａも本発明のＤＮＡである。即ち、 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本
発明のＤＮＡである。
【００６０】なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、Ｎ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによっ
てＤ−アミノ酸を生成する活性であればいかなるもので
もよい。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸
配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位
を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、Ｎ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによっ
てＤ−アミノ酸を生成する活性であればいかなるもので
もよい。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸
配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位
を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６１】[II]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼの製造方法 次に、組み換えＤＮＡ技術によってＤ−ヒダントイナー
ゼおよびＤ−カルバミラーゼを製造する方法について説
明する。なお、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生
理活性物質などの有用タンパク質を製造する例は数多く
知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天
然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
バミラーゼの製造方法 次に、組み換えＤＮＡ技術によってＤ−ヒダントイナー
ゼおよびＤ−カルバミラーゼを製造する方法について説
明する。なお、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生
理活性物質などの有用タンパク質を製造する例は数多く
知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天
然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００６２】図２は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼお
よびＤ−カルバミラーゼの製造工程のフローチャートで
ある。まず、本発明のＤ−ヒダントイナーゼＤＮＡおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼＤＮＡを調製する(ステ
ップＳ１)。次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと
接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組
み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を
作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地
中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダン
トイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを生成蓄
積させる(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進
み、該酵素を回収・精製することによってＤ−ヒダント
イナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを大量生産
する。また、ステップＳ５で生産した酵素またはステッ
プＳ４の酵素が蓄積された培地を用いてアミノ酸を合成
することで、目的とするアミノ酸を大量に製造すること
ができる(ステップＳ６)。
よびＤ−カルバミラーゼの製造工程のフローチャートで
ある。まず、本発明のＤ−ヒダントイナーゼＤＮＡおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼＤＮＡを調製する(ステ
ップＳ１)。次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと
接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組
み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を
作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地
中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダン
トイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを生成蓄
積させる(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進
み、該酵素を回収・精製することによってＤ−ヒダント
イナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを大量生産
する。また、ステップＳ５で生産した酵素またはステッ
プＳ４の酵素が蓄積された培地を用いてアミノ酸を合成
することで、目的とするアミノ酸を大量に製造すること
ができる(ステップＳ６)。
【００６３】なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡ
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼが発現可能であればよい。
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼが発現可能であればよい。
【００６４】ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有す
るＤＮＡ、(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、(d)配列表の配列番号２に記載
のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配
列をコードするＤＮＡなどを使用できる。
ヒダントイナーゼ遺伝子としては、上述の (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有す
るＤＮＡ、(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、(d)配列表の配列番号２に記載
のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配
列をコードするＤＮＡなどを使用できる。
【００６５】また、ベクターＤＮＡと接続されるＤ−カ
ルバミラーゼ遺伝子としては、(a)配列表の配列番号３
に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)配列表の配列番
号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列表の
配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡな
どを使用できる。
ルバミラーゼ遺伝子としては、(a)配列表の配列番号３
に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)配列表の配列番
号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列表の
配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡな
どを使用できる。
【００６６】さらに、これらのＤＮＡの他、上記Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子とＤ−カルバミラーゼ遺伝子を連
結したＤＮＡなどを用いることもできる。この場合に
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび本発明のＤ−
カルバミラーゼが同時に発現することになる。
ダントイナーゼ遺伝子とＤ−カルバミラーゼ遺伝子を連
結したＤＮＡなどを用いることもできる。この場合に
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび本発明のＤ−
カルバミラーゼが同時に発現することになる。
【００６７】ところで、組み換えＤＮＡ技術を用いてタ
ンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞
としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細
胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一
般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術
について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくは
エシェリヒア・コリが用いられる。以下、形質転換され
た大腸菌を用いてＤ−ヒダントイナーゼおよび／または
Ｄ−カルバミラーゼを製造する方法を説明する。
ンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞
としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細
胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一
般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術
について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくは
エシェリヒア・コリが用いられる。以下、形質転換され
た大腸菌を用いてＤ−ヒダントイナーゼおよび／または
Ｄ−カルバミラーゼを製造する方法を説明する。
【００６８】Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモ
ーターとしては、通常大腸菌においてタンパク質生産に
用いられるプロモーターを使用することができ、例え
ば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーターな
どの強力なプロモーターが挙げられる。
カルバミラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモ
ーターとしては、通常大腸菌においてタンパク質生産に
用いられるプロモーターを使用することができ、例え
ば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーターな
どの強力なプロモーターが挙げられる。
【００６９】また、生産量を増大させるためには、タン
パク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータ
ーを連結することが好ましい。このターミネーターとし
ては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネータ
ー、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネー
ターなどが挙げられる。
パク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータ
ーを連結することが好ましい。このターミネーターとし
ては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネータ
ー、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネー
ターなどが挙げられる。
【００７０】Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞に導入す
るためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型の
ものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有す
るプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３
２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加、または逆位などによってプラスミドに改変を
施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変
異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異
などによる改変をも含む。
カルバミラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞に導入す
るためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型の
ものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有す
るプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３
２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加、または逆位などによってプラスミドに改変を
施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変
異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異
などによる改変をも含む。
【００７１】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有す
ることが好ましく、このようなプラスミドとして、例え
ば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クロ
ーンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック
製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクタ
ーが市販されている。
クターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有す
ることが好ましく、このようなプラスミドとして、例え
ば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クロ
ーンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック
製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクタ
ーが市販されている。
【００７２】プロモーター、Ｄ−ヒダントイナーゼおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子、タ
ーミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤ
ＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得ることができる。
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子、タ
ーミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤ
ＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得ることができる。
【００７３】該組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質
転換し、この細胞を培養すると、Ｄ−ヒダントイナーゼ
および／またはＤ−カルバミラーゼが発現生産される。
なお、形質転換を行う方法および形質転換体を選別する
方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring
Harbor press （１９８９年)などに記載されている方法
を適用することができる。
転換し、この細胞を培養すると、Ｄ−ヒダントイナーゼ
および／またはＤ−カルバミラーゼが発現生産される。
なお、形質転換を行う方法および形質転換体を選別する
方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring
Harbor press （１９８９年)などに記載されている方法
を適用することができる。
【００７４】また、生産培地としては、Ｍ９−カザミノ
酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用
いる培地を用いてもよい。さらに、培養条件、生産誘導
条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿
主菌などの種類に応じて適宜選択する。酵素生産量を高
めるため、培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加したり、温度上昇な
どの酵素誘導処理を行うことも好ましい。
酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用
いる培地を用いてもよい。さらに、培養条件、生産誘導
条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿
主菌などの種類に応じて適宜選択する。酵素生産量を高
めるため、培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加したり、温度上昇な
どの酵素誘導処理を行うことも好ましい。
【００７５】培養菌体を遠心分離操作などにより回収し
た後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用することができる。菌体破砕には超音波
破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リ
ゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜
組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じ
て、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなど
の手法により、これらの酵素を精製して用いることも可
能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精
製法も利用できる。
た後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用することができる。菌体破砕には超音波
破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リ
ゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜
組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じ
て、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなど
の手法により、これらの酵素を精製して用いることも可
能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精
製法も利用できる。
【００７６】上述の組み換え体を用いる方法によって得
られる本発明のＤ−ヒダントイナーゼは、下記(a)また
は(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有するタンパク質である。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
られる本発明のＤ−ヒダントイナーゼは、下記(a)また
は(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有するタンパク質である。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００７７】また、上述の組み換え体を用いる方法によ
って得られる本発明のＤ−カルバミラーゼは、下記(c)
または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ
活性を有するタンパク質である。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
って得られる本発明のＤ−カルバミラーゼは、下記(c)
または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ
活性を有するタンパク質である。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００７８】なお、ここで、「数個」および「Ｄ−ヒダ
ントイナーゼ活性」、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」の定
義は、[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラ
ーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
ントイナーゼ活性」、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」の定
義は、[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラ
ーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
【００７９】[III]Ｄ−アミノ酸の製造方法
次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ
−カルバミラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法につ
いて述べる。
−カルバミラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法につ
いて述べる。
【００８０】本発明のＤ−アミノ酸の製造方法は、ヒダ
ントイナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも
一方に本発明の酵素を用いるものであり、ヒダントイナ
ーゼおよびカルバミラーゼの組み合わせとしては下記の
３通りが考えられる。 (i)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋カルバミラーゼ (ii)ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−カルバミラーゼ (iii)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−
カルバミラーゼ
ントイナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも
一方に本発明の酵素を用いるものであり、ヒダントイナ
ーゼおよびカルバミラーゼの組み合わせとしては下記の
３通りが考えられる。 (i)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋カルバミラーゼ (ii)ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−カルバミラーゼ (iii)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＤ−
カルバミラーゼ
【００８１】(i)の場合、本発明のＤ−ヒダントイナー
ゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質が挙げら
れる。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
ゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質が挙げら
れる。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００８２】また、このようなＤ−ヒダントイナーゼを
コードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み
換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養すること
によって得られたＤ−ヒダントイナーゼを用いることも
できる。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−ヒダントイ
ナーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接
基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、
洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破
砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよ
いし、当該菌体処理物からＤ−ヒダントイナーゼを回収
し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を
精製して用いてもよい。即ち、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有する画分であれば、全てを使用することが可能で
ある。
コードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み
換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養すること
によって得られたＤ−ヒダントイナーゼを用いることも
できる。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−ヒダントイ
ナーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接
基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、
洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破
砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよ
いし、当該菌体処理物からＤ−ヒダントイナーゼを回収
し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を
精製して用いてもよい。即ち、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有する画分であれば、全てを使用することが可能で
ある。
【００８３】本発明のＤ−ヒダントイナーゼの基質とし
ては、当該酵素の基質特異性において加水分解できる５
置換ヒダントイン化合物であればいかなるものも使用で
きる。例えば、ヒダントイン、５−メチルヒダントイ
ン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシ
ベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダン
トイン、５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダン
トイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソ
プロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、
５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチ
ルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、
５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキ
シメチルヒダントインなどに代表されるような天然型ア
ミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−
フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニ
ル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、
５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３,４−
メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウ
ラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若し
くはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙
げられる。
ては、当該酵素の基質特異性において加水分解できる５
置換ヒダントイン化合物であればいかなるものも使用で
きる。例えば、ヒダントイン、５−メチルヒダントイ
ン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシ
ベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダン
トイン、５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダン
トイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソ
プロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、
５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチ
ルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、
５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキ
シメチルヒダントインなどに代表されるような天然型ア
ミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−
フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニ
ル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、
５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３,４−
メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウ
ラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若し
くはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙
げられる。
【００８４】本発明のＤ−ヒダントイナーゼと組み合わ
せて用いるカルバミラーゼとしては、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することに
よりＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または
当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用
いることができる。すなわち、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ア
ミノ酸のみに特異的に作用するカルバミラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼ）であっても、光学選択性を有しないカル
バミラーゼであってもよい。ここで、「酵素含有物」と
は、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養
物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げられる。
せて用いるカルバミラーゼとしては、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することに
よりＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または
当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用
いることができる。すなわち、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ア
ミノ酸のみに特異的に作用するカルバミラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼ）であっても、光学選択性を有しないカル
バミラーゼであってもよい。ここで、「酵素含有物」と
は、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養
物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げられる。
【００８５】Ｄ−カルバミラーゼとしては、例えばシュ
ードモナス（Pseudomonas）や、アグロバクテリウム（A
grobacterium）にその存在が知られている（特許２９０
２１１２号公報）。
ードモナス（Pseudomonas）や、アグロバクテリウム（A
grobacterium）にその存在が知られている（特許２９０
２１１２号公報）。
【００８６】次に(ii)の場合について説明する。本発明
のＤ−カルバミラーゼとしては、下記(a)または(b)のア
ミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタ
ンパク質が挙げられる。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
のＤ−カルバミラーゼとしては、下記(a)または(b)のア
ミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタ
ンパク質が挙げられる。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【００８７】また、このようなＤ−カルバミラーゼをコ
ードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することに
よって得られたＤ−カルバミラーゼを用いることもでき
る。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−カルバミラーゼ
を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を
添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌
体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕ある
いは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、
当該菌体処理物からＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して
用いてもよい。即ち、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有する
画分であれば、全てを使用することが可能である。
ードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することに
よって得られたＤ−カルバミラーゼを用いることもでき
る。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−カルバミラーゼ
を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を
添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌
体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕ある
いは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、
当該菌体処理物からＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して
用いてもよい。即ち、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有する
画分であれば、全てを使用することが可能である。
【００８８】また、本発明のＤ−カルバミラーゼの基質
としては、当該酵素の基質特異性において加水分解でき
るＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であればいかなるもの
も使用できる。即ち、上述した５置換ヒダントイン化合
物より得られるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸以外のＮ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であっても基質として使用
することができる。
としては、当該酵素の基質特異性において加水分解でき
るＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であればいかなるもの
も使用できる。即ち、上述した５置換ヒダントイン化合
物より得られるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸以外のＮ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であっても基質として使用
することができる。
【００８９】さらに、本発明のＤ−カルバミラーゼと組
み合わせて用いるヒダントイナーゼとしては、５置換ヒ
ダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解するこ
とによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒
する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく
公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有
物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的に
は培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌
体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げら
れる。ただし、本発明のＤ−カルバミラーゼは、Ｄ体特
異的であるので、光学特異性のないヒダントイナーゼま
たはＤ体に特異的に作用するＤ−ヒダントイナーゼを用
いる必要がある。光学特異性のないヒダントイナーゼ
は、例えばマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株にそ
の存在が知られている（特願２００１−０６５８１４
号）。また、Ｄ体ヒダントイン化合物に特異的に作用す
るＤ−ヒダントイナーゼは、例えばアグロバクテリウム
エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０株に
その存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号
公報）。なお、マイクロバクテリウム リクエファシエ
ンスＡＪ３９１２株は、１９７５年６月２７日に通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与された微生物であ
る。また、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacter
ium sp.）ＡＪ１１２２０株（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）
はシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）とし
て１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同
定の結果、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacter
ium sp.）に分類されることが判明した。現在では、ア
グロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp.）Ａ
Ｊ１１２２０（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）として独立行政
法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託
されている。
み合わせて用いるヒダントイナーゼとしては、５置換ヒ
ダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解するこ
とによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒
する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく
公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有
物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的に
は培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌
体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げら
れる。ただし、本発明のＤ−カルバミラーゼは、Ｄ体特
異的であるので、光学特異性のないヒダントイナーゼま
たはＤ体に特異的に作用するＤ−ヒダントイナーゼを用
いる必要がある。光学特異性のないヒダントイナーゼ
は、例えばマイクロバクテリウム リクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株にそ
の存在が知られている（特願２００１−０６５８１４
号）。また、Ｄ体ヒダントイン化合物に特異的に作用す
るＤ−ヒダントイナーゼは、例えばアグロバクテリウム
エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０株に
その存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号
公報）。なお、マイクロバクテリウム リクエファシエ
ンスＡＪ３９１２株は、１９７５年６月２７日に通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与された微生物であ
る。また、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacter
ium sp.）ＡＪ１１２２０株（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）
はシュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）とし
て１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同
定の結果、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacter
ium sp.）に分類されることが判明した。現在では、ア
グロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp.）Ａ
Ｊ１１２２０（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）として独立行政
法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託
されている。
【００９０】次に、(iii)の場合について説明する。(ii
i)では、(i)で説明した本発明のＤ−ヒダントイナーゼ
および(ii)で説明した本発明のＤ−カルバミラーゼを組
み合わせて用いる。(i)〜(iii)のうち最も好ましい組み
合わせは(iii)である。
i)では、(i)で説明した本発明のＤ−ヒダントイナーゼ
および(ii)で説明した本発明のＤ−カルバミラーゼを組
み合わせて用いる。(i)〜(iii)のうち最も好ましい組み
合わせは(iii)である。
【００９１】ここで、反応工程としては、Ｄ−ヒダント
イナーゼとＤ−カルバミラーゼの混合物を５置換ヒダン
トイン化合物に作用させてもよいし、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼを５置換ヒダントイン化合物に作用させた後、Ｄ−
カルバミラーゼを作用させてもよい。反応工程の簡素化
の観点からは前者の方法が好ましい。
イナーゼとＤ−カルバミラーゼの混合物を５置換ヒダン
トイン化合物に作用させてもよいし、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼを５置換ヒダントイン化合物に作用させた後、Ｄ−
カルバミラーゼを作用させてもよい。反応工程の簡素化
の観点からは前者の方法が好ましい。
【００９２】なお、上記(i)〜(iii)の方法によってＤ−
アミノ酸を製造する際に、Ｌ体のＮ−カルバミルアミノ
酸やアミノ酸を製造することも可能である。例えば、本
発明のＤ−ヒダントイナーゼを用いて、ＤＬ−５置換ヒ
ダントインからＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造し
たあと、残存するＬ−５置換ヒダントインとＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸とを分離して、Ｌ−５置換ヒダント
インを回収し、これを加水分解させることによりＮ−カ
ルバミル−Ｌ−アミノ酸を、さらに加水分解反応を進行
させることによりＬ−アミノ酸を製造できる。当該加水
分解反応には、Ｌ体に作用する加水分解酵素を用いても
よいが、亜硝酸等による化学的な加水分解処理を施すこ
とによっても、光学活性を維持したまま、高収率でＬ−
アミノ酸を製造することが可能である。
アミノ酸を製造する際に、Ｌ体のＮ−カルバミルアミノ
酸やアミノ酸を製造することも可能である。例えば、本
発明のＤ−ヒダントイナーゼを用いて、ＤＬ−５置換ヒ
ダントインからＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造し
たあと、残存するＬ−５置換ヒダントインとＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸とを分離して、Ｌ−５置換ヒダント
インを回収し、これを加水分解させることによりＮ−カ
ルバミル−Ｌ−アミノ酸を、さらに加水分解反応を進行
させることによりＬ−アミノ酸を製造できる。当該加水
分解反応には、Ｌ体に作用する加水分解酵素を用いても
よいが、亜硝酸等による化学的な加水分解処理を施すこ
とによっても、光学活性を維持したまま、高収率でＬ−
アミノ酸を製造することが可能である。
【００９３】また、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物
をＤ−アミノ酸へと変換させる際には、５置換ヒダント
イン化合物の自発的ラセミ化若しくは化学的なラセミ化
若しくはヒダントインラセマーゼを用いるラセミ化反応
などを組み合わせることにより、ＤＬ体の５置換ヒダン
トイン化合物からモル収率５０％以上でＤ−アミノ酸を
製造することが可能となる。
をＤ−アミノ酸へと変換させる際には、５置換ヒダント
イン化合物の自発的ラセミ化若しくは化学的なラセミ化
若しくはヒダントインラセマーゼを用いるラセミ化反応
などを組み合わせることにより、ＤＬ体の５置換ヒダン
トイン化合物からモル収率５０％以上でＤ−アミノ酸を
製造することが可能となる。
【００９４】換言すれば、Ｄ−ヒダントイナーゼおよび
Ｄ−カルバミラーゼの他、さらにヒダントインラセマー
ゼを用いることが好ましい。ヒダントインラセマーゼと
しては、例えば、特願２００１−０６５８１５号に記載
のマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ
３１３３）由来のヒダントインラセマーゼを好ましく用
いることができる。この場合、下記反応式に示すよう
に、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、
ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル
収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能とな
る。
Ｄ−カルバミラーゼの他、さらにヒダントインラセマー
ゼを用いることが好ましい。ヒダントインラセマーゼと
しては、例えば、特願２００１−０６５８１５号に記載
のマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ
３１３３）由来のヒダントインラセマーゼを好ましく用
いることができる。この場合、下記反応式に示すよう
に、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、
ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル
収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能とな
る。
【００９５】
【化２】
【００９６】なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カ
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパクにＤ−カルバミラーゼの阻害剤な
どを添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で
止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造でき
る。
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパクにＤ−カルバミラーゼの阻害剤な
どを添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で
止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造でき
る。
【００９７】本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／ま
たはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクター
が接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換
された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理
物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵
素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５
置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌
体、菌体処理物、粗酵素液、または、精製酵素を含む反
応液を２５〜６０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９
に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
たはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクター
が接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換
された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理
物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵
素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５
置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌
体、菌体処理物、粗酵素液、または、精製酵素を含む反
応液を２５〜６０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９
に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
【００９８】また、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベ
クターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形
質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミ
ノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイ
ン化合物を含み、かつ、形質転換された細胞の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水
溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸など
の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる
場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加して
もよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃
の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日間培養するこ
とが好ましい。
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベ
クターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形
質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミ
ノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイ
ン化合物を含み、かつ、形質転換された細胞の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水
溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸など
の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる
場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加して
もよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃
の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日間培養するこ
とが好ましい。
【００９９】培養液あるいは反応液中のＤ−アミノ酸の
定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができ
る。即ち、簡便にはMerck製のHPTLC CHIRなどを利用し
た薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より
分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のCHIRALPA
K WHなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。
定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができ
る。即ち、簡便にはMerck製のHPTLC CHIRなどを利用し
た薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より
分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のCHIRALPA
K WHなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。
【０１００】培養液あるいは反応液中に蓄積されたＤ−
アミノ酸は、定法により培養液あるいは反応液中より採
取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃
縮、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、結晶化
などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いること
ができる。特に、高濃度の５置換ヒダントイン化合物か
らの変換を行った際には、培養液あるいは反応液を冷却
し、ｐＨを調整するなどによってＤ−アミノ酸を容易に
結晶として得ることができる。
アミノ酸は、定法により培養液あるいは反応液中より採
取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃
縮、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、結晶化
などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いること
ができる。特に、高濃度の５置換ヒダントイン化合物か
らの変換を行った際には、培養液あるいは反応液を冷却
し、ｐＨを調整するなどによってＤ−アミノ酸を容易に
結晶として得ることができる。
【０１０１】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。 カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ 移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4 カラム温度：５０℃ 流速：１．５ ｍｌ/分 検出：ＵＶ210
【０１０２】（実施例１）ＡＪ１１２２１菌由来のＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝
子の単離
ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝
子の単離
【０１０３】１．菌体の取得
パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pneumotro
pica)ＡＪ１１２２１株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコー
ス０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、
ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０
℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍ
ｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂
口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的
に振とう培養した。
pica)ＡＪ１１２２１株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコー
ス０．５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、
ＮａＣｌ ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０
℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍ
ｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ ｍｌ容の坂
口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的
に振とう培養した。
【０１０４】２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１０５】３．遺伝子ライブラリーからのＤ−カルバ
ミラーゼ遺伝子の単離 まず、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pne
umotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡ２００μ
ｇに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１Ｕ添加し、３７℃にて１
５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡから
アガロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収し
た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ切断物と
ライゲーションさせ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して
遺伝子ライブラリーを作製した。これをアンピシリンを
含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム１％、アンピシリン０．０１％、寒天２
％、ｐＨ７．０）にプレーティングした後、コロニーを
Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源と
する液体培地（グルコース０．２％、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−フェニルアラニン０．２％、Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．６
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、ＮａＣｌ ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．０１２％、ＣａＣｌ2 ０．１ｍＭ、アン
ピシリン０．０１％、チアミン０．０００１％、ｐＨ
７．０）に植菌し、集積培養することによってＮ−カル
バミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源として生育
可能な株を選抜した。こうして得られた形質転換体を単
離し、アンピシリンとイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地にて
培養後、遠心・集菌した菌体を０．５％のＮ−カルバミ
ル−Ｄ−フェニルアラニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
に１％添加し、３７℃にて５時間反応させた。反応液を
解析したところ、Ｄ−フェニルアラニンの生成が確認で
きたことから、この形質転換体が目的とする遺伝子を含
むプラスミドを保持していると確認した。この形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ４１３−１と
命名した。
ミラーゼ遺伝子の単離 まず、パスツレラ ニューモトロピカ(Pasteurella pne
umotropica)ＡＪ１１２２１株の染色体ＤＮＡ２００μ
ｇに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１Ｕ添加し、３７℃にて１
５分間反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡから
アガロース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収し
た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ切断物と
ライゲーションさせ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して
遺伝子ライブラリーを作製した。これをアンピシリンを
含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム１％、アンピシリン０．０１％、寒天２
％、ｐＨ７．０）にプレーティングした後、コロニーを
Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源と
する液体培地（グルコース０．２％、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−フェニルアラニン０．２％、Ｎａ2ＨＰＯ4 ０．６
％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、ＮａＣｌ ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4 ０．０１２％、ＣａＣｌ2 ０．１ｍＭ、アン
ピシリン０．０１％、チアミン０．０００１％、ｐＨ
７．０）に植菌し、集積培養することによってＮ−カル
バミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源として生育
可能な株を選抜した。こうして得られた形質転換体を単
離し、アンピシリンとイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地にて
培養後、遠心・集菌した菌体を０．５％のＮ−カルバミ
ル−Ｄ−フェニルアラニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
に１％添加し、３７℃にて５時間反応させた。反応液を
解析したところ、Ｄ−フェニルアラニンの生成が確認で
きたことから、この形質転換体が目的とする遺伝子を含
むプラスミドを保持していると確認した。この形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ４１３−１と
命名した。
【０１０６】４．挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣ４１３−１の挿入断片の塩基配列をジ
デオキシ法によって決定し、配列表の配列番号５に示し
た。その結果、挿入断片の長さは約２．８ｋｂｐであ
り、約０．９ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ１；塩基番号１１４
１〜２０６４）を含むことが明らかとなった（図１）。
デオキシ法によって決定し、配列表の配列番号５に示し
た。その結果、挿入断片の長さは約２．８ｋｂｐであ
り、約０．９ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ１；塩基番号１１４
１〜２０６４）を含むことが明らかとなった（図１）。
【０１０７】５．ＯＲＦ１と既知配列との相同性
ＯＲＦ１について、既知配列との相同性検索を行ったと
ころ、既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細
菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と７８％（アミノ酸
配列において８１％）、シュードモナス（Pseudomona
s）属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と６７％
（アミノ酸配列において５９％）の相同性を示した。こ
の結果より、ＯＲＦ１はＤ−カルバミラーゼ遺伝子を含
んでいることが予想された。しかし、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼと相同性を示す配列は確認されなかった。Ｄ−カル
バミラーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号３
に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示し
た。
ころ、既知のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属細
菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と７８％（アミノ酸
配列において８１％）、シュードモナス（Pseudomona
s）属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ遺伝子と６７％
（アミノ酸配列において５９％）の相同性を示した。こ
の結果より、ＯＲＦ１はＤ−カルバミラーゼ遺伝子を含
んでいることが予想された。しかし、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼと相同性を示す配列は確認されなかった。Ｄ−カル
バミラーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号３
に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示し
た。
【０１０８】６．遺伝子ライブラリーからのＤ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子の単離 そこで、上記３において作製したパスツレラ ニューモ
トロピカ(Pasteurellapneumotropica)ＡＪ１１２２１株
の遺伝子ライブラリーを用いて、Ｄ−ヒダントイナーゼ
遺伝子の単離を行った。選抜の際には、形質転換体をア
ンピシリンを含むＬＢプレートにて生育させた後、ｐＨ
指示薬を含む選抜プレート（Ｄ−５−ベンジルヒダント
イン０．５％、クレゾールレッド０．００５％、ＭｎＣ
ｌ2１ｍＭ、寒天２％、ｐＨ８．５）に写し取り、Ｎ−
カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンの生成に伴うｐＨ指
示薬の変色が見られた株を選抜した。この形質転換体よ
りＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製
し、ｐＵＣ４１３−２と命名した。
トイナーゼ遺伝子の単離 そこで、上記３において作製したパスツレラ ニューモ
トロピカ(Pasteurellapneumotropica)ＡＪ１１２２１株
の遺伝子ライブラリーを用いて、Ｄ−ヒダントイナーゼ
遺伝子の単離を行った。選抜の際には、形質転換体をア
ンピシリンを含むＬＢプレートにて生育させた後、ｐＨ
指示薬を含む選抜プレート（Ｄ−５−ベンジルヒダント
イン０．５％、クレゾールレッド０．００５％、ＭｎＣ
ｌ2１ｍＭ、寒天２％、ｐＨ８．５）に写し取り、Ｎ−
カルバミル−Ｄ−フェニルアラニンの生成に伴うｐＨ指
示薬の変色が見られた株を選抜した。この形質転換体よ
りＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製
し、ｐＵＣ４１３−２と命名した。
【０１０９】７．挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣ４１３−２の挿入断片の塩基配列をジ
デオキシ法によって決定し、配列表の配列番号６に示し
た。その結果、挿入断片の長さは約２．３ｋｂｐであ
り、約１．４ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ２；塩基番号１８４
〜１５７２）を含むことが明らかとなった（図１）。
デオキシ法によって決定し、配列表の配列番号６に示し
た。その結果、挿入断片の長さは約２．３ｋｂｐであ
り、約１．４ｋｂのＯＲＦ（ＯＲＦ２；塩基番号１８４
〜１５７２）を含むことが明らかとなった（図１）。
【０１１０】６．ＯＲＦ２と既知配列との相同性
ＯＲＦ２について、既知配列との相同性検索を行ったと
ころ、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来
のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子と７７％（アミノ酸配列
において７６％）の相同性を示した。この結果より、Ｏ
ＲＦ２はＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含んでいること
が予想された。Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子全長の塩基
配列を配列表の配列番号１に、対応するアミノ酸配列を
配列表の配列番号２に示した。
ころ、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来
のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子と７７％（アミノ酸配列
において７６％）の相同性を示した。この結果より、Ｏ
ＲＦ２はＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含んでいること
が予想された。Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子全長の塩基
配列を配列表の配列番号１に、対応するアミノ酸配列を
配列表の配列番号２に示した。
【０１１１】（実施例２）ＡＪ１１２２１株由来Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子
のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
ダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子
のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
【０１１２】１．発現プラスミドの構築
両遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１
８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプ
ラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃを以下の
ようにして構築した。まず、パスツレラ ニューモトロ
ピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の
染色体ＤＮＡを鋳型とし、表１に示すオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅し
た。これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸ
ｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物
とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に
導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミ
ドを持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プ
ラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃと命名し
た。
８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプ
ラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃを以下の
ようにして構築した。まず、パスツレラ ニューモトロ
ピカ(Pasteurella pneumotropica)ＡＪ１１２２１株の
染色体ＤＮＡを鋳型とし、表１に示すオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅し
た。これらの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸ
ｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物
とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に
導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミ
ドを持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プ
ラスミドｐＵＣ４１３ＨおよびｐＵＣ４１３Ｃと命名し
た。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】２．Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼ活性測定 得られた発現株を実施例１と同様にして培養し、無細胞
抽出液を調製してＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。ｐ
ＵＣ４１３Ｈを用いて形質転換した株ではＤ−ヒダント
イナーゼ活性が検出され、ｐＵＣ４１３Ｃを用いて形質
転換した株にはＤ−カルバミラーゼ活性が検出されたこ
とから、両遺伝子がパスツレラ ニューモトロピカ(Pas
teurellapneumotropica)ＡＪ１１２２１株由来Ｄ−ヒダ
ントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子で
あり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で発現されていることを確
認した。
バミラーゼ活性測定 得られた発現株を実施例１と同様にして培養し、無細胞
抽出液を調製してＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。ｐ
ＵＣ４１３Ｈを用いて形質転換した株ではＤ−ヒダント
イナーゼ活性が検出され、ｐＵＣ４１３Ｃを用いて形質
転換した株にはＤ−カルバミラーゼ活性が検出されたこ
とから、両遺伝子がパスツレラ ニューモトロピカ(Pas
teurellapneumotropica)ＡＪ１１２２１株由来Ｄ−ヒダ
ントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子で
あり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で発現されていることを確
認した。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】（実施例３）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たＤ−フェニルアラニンの生産 実施例２と同様にして培養したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１
３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗
浄菌体を調製し、１ｇ／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダン
トインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれ
ぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させ
た。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰ
ＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラ
ニンを定量した。
たＤ−フェニルアラニンの生産 実施例２と同様にして培養したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１
３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗
浄菌体を調製し、１ｇ／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダン
トインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれ
ぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させ
た。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰ
ＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラ
ニンを定量した。
【０１１７】その結果を表３に示した。この表に示され
るように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カル
バミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を
用いることにより、ベンジルヒダントインから効率良く
Ｄ−フェニルアラニンを生成させることができた。
るように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カル
バミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を
用いることにより、ベンジルヒダントインから効率良く
Ｄ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たＤ−アミノ酸の生産 実施例３と同様にして調製したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１
３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗
浄菌体を、１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントイン化合物
を含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１
ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反
応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで
解析することにより生成したＤ−アミノ酸を定量した。
たＤ−アミノ酸の生産 実施例３と同様にして調製したＪＭ１０９／ｐＵＣ４１
３Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４１３Ｃの洗
浄菌体を、１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントイン化合物
を含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１
ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反
応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで
解析することにより生成したＤ−アミノ酸を定量した。
【０１２０】その結果を表４に示した。この表に示され
るように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カル
バミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を
用いることにより、各種５置換ヒダントイン化合物から
効率良くＤ−アミノ酸を生成させることができた。
るように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カル
バミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を
用いることにより、各種５置換ヒダントイン化合物から
効率良くＤ−アミノ酸を生成させることができた。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】（実施例５）ヒダントインラセマーゼによ
るラセミ化との組み合わせによるＤ−フェニルアラニン
の生産 特願２００１−０６５８１５号に記載のマイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来の
ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣＦ
ＨＲを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード
培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容
坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７
℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃
度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間
培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌
体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０９
／ｐＵＣ４１３Ｈ洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４
１３Ｃ洗浄菌体を調製し、上記ヒダントインラセマーゼ
発現株の洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベン
ジルヒダントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．
５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃
で反応させた。反応２４、４８、７２時間後にサンプリ
ングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生
成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
るラセミ化との組み合わせによるＤ−フェニルアラニン
の生産 特願２００１−０６５８１５号に記載のマイクロバクテ
リウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来の
ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣＦ
ＨＲを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード
培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容
坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７
℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃
度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間
培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌
体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０９
／ｐＵＣ４１３Ｈ洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ４
１３Ｃ洗浄菌体を調製し、上記ヒダントインラセマーゼ
発現株の洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−ベン
ジルヒダントインを含む０．１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．
５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃
で反応させた。反応２４、４８、７２時間後にサンプリ
ングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生
成したＤ−フェニルアラニンを定量した。
【０１２３】その結果を表５に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発
現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、Ｄ
Ｌ体のベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニル
アラニンを生成させることができた。
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発
現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、Ｄ
Ｌ体のベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニル
アラニンを生成させることができた。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】（実施例６）実施例５と同様にして反応を
行い、Ｄ−フェニルアラニンを含む反応液５００ｍｌを
得た。この反応液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０
分）して菌体を分離し、遠心上清を減圧濃縮操作により
２０ｍｌまで濃縮することによって、Ｄ−フェニルアラ
ニンの結晶を析出させた。析出結晶は、濾紙を用いて濾
過により回収し、粗結晶とした。粗結晶（２．４g）に
水１０ｍｌ、濃硫酸１ｍｌを加えて溶解させ、これに１
００mgの活性炭を加え、溶液の脱色を行わせた。次に、
濾過により活性炭を除いた後、濾液に２８％アンモニア
水を５ｍｌ加えてｐＨ３．５とし、Ｄ−フェニルアラニ
ンを再結晶させた。その後、濾紙を用いて濾過により回
収した析出結晶を乾燥させ、１．８ｇのＤ−フェニルア
ラニンを得た。ＨＰＬＣ分析に供したところ、物質純度
９９%、光学純度は９９%e.e.以上であった。
行い、Ｄ−フェニルアラニンを含む反応液５００ｍｌを
得た。この反応液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０
分）して菌体を分離し、遠心上清を減圧濃縮操作により
２０ｍｌまで濃縮することによって、Ｄ−フェニルアラ
ニンの結晶を析出させた。析出結晶は、濾紙を用いて濾
過により回収し、粗結晶とした。粗結晶（２．４g）に
水１０ｍｌ、濃硫酸１ｍｌを加えて溶解させ、これに１
００mgの活性炭を加え、溶液の脱色を行わせた。次に、
濾過により活性炭を除いた後、濾液に２８％アンモニア
水を５ｍｌ加えてｐＨ３．５とし、Ｄ−フェニルアラニ
ンを再結晶させた。その後、濾紙を用いて濾過により回
収した析出結晶を乾燥させ、１．８ｇのＤ−フェニルア
ラニンを得た。ＨＰＬＣ分析に供したところ、物質純度
９９%、光学純度は９９%e.e.以上であった。
【０１２６】
【発明の効果】本発明によって、Ｄ−ヒダントイナーゼ
およびＤ−カルバミラーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主
において安定に大量に発現させることが可能となった。
この結果、このような形質転換体から該酵素を容易に調
製することができるようになり、該形質転換体やその抽
出液、精製酵素等を用いることによって医薬品、化学工
業品、食品添加物等の製造に有用なＤ−アミノ酸を効率
良く生産できるようになった。
およびＤ−カルバミラーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主
において安定に大量に発現させることが可能となった。
この結果、このような形質転換体から該酵素を容易に調
製することができるようになり、該形質転換体やその抽
出液、精製酵素等を用いることによって医薬品、化学工
業品、食品添加物等の製造に有用なＤ−アミノ酸を効率
良く生産できるようになった。
【０１２７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> AJINOMOTO Co,LTD
<120> AJINOMOTO
<130> PAMA-13173
<140>
<141>
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1386)
<400> 1
atg gat ctc atc gtc aag aac gga acg atc gtc acc gcc gcc ggc att 48
Met Asp Leu Ile Val Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
tcg cgc gcg gat ctc ggc gtc agg gac ggc aag atc gtc cag atc ggc 96
Ser Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Asp Gly Lys Ile Val Gln Ile Gly
20 25 30
ggc gat ctc ggc gag gcg gcg cgc acg atc gac gcg acc ggc cgc tat 144
Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
gtc atg ccg ggc ggc gtc gac gtc cac acc cat atc gac tcc aac aac 192
Val Met Pro Gly Gly Val Asp Val His Thr His Ile Asp Ser Asn Asn
50 55 60
atg gag acg aag tcg gcg gac gat ttc cgg acc ggc acg atc gcg gcg 240
Met Glu Thr Lys Ser Ala Asp Asp Phe Arg Thr Gly Thr Ile Ala Ala
65 70 75 80
gcc tgt ggc ggc acg acg acg atc gtc gat ttc tgc gcc cag gac cgg 288
Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Cys Ala Gln Asp Arg
85 90 95
ggc ggc acg ctc gcc gag gcg atc gcc aaa tgg gac ggg cgg gcg gcc 336
Gly Gly Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala Lys Trp Asp Gly Arg Ala Ala
100 105 110
ggc aag gcg gcg atc gac tac ggc tac cat gtc atc gtg ctc gac atg 384
Gly Lys Ala Ala Ile Asp Tyr Gly Tyr His Val Ile Val Leu Asp Met
115 120 125
aat ccc ggc gtg ttc gag gag ttg ctg acg ctg ccg gag cgt ggc att 432
Asn Pro Gly Val Phe Glu Glu Leu Leu Thr Leu Pro Glu Arg Gly Ile
130 135 140
ccc tcc ttc aag gtg ttc atg gcc tat cgc ggc atg aac atg atc gac 480
Pro Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp
145 150 155 160
gac gtc acc ctg ctg aag acg ctg gag cag gcc aag cgc tcg ggg gcg 528
Asp Val Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gln Ala Lys Arg Ser Gly Ala
165 170 175
ctg gtc atg gtc cat gcc gag aac ggt gat gcg gcg gat ttc ctg cgc 576
Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Phe Leu Arg
180 185 190
gac aag ttc gtc gcc gag ggc aag acc tcg ccg aaa tac cac gcg ctc 624
Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Lys Thr Ser Pro Lys Tyr His Ala Leu
195 200 205
agc cgg ccg ccg cgg gtc gag gcc gag gcg acc gcg cgc gcc atc gcg 672
Ser Arg Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ile Ala
210 215 220
atg gcc gag atc gtc ggc acc tcg atc tac atc gtg cac ctg acc tgc 720
Met Ala Glu Ile Val Gly Thr Ser Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys
225 230 235 240
gag gag gcg ctg gag gaa ctg atg cgc gcc aag gcg cgc ggc gtc gac 768
Glu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val Asp
245 250 255
gcg ctg gcc gag acc tgc acg cag tat ctc tac ctg acc aag gac gac 816
Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Asp Asp
260 265 270
ctc gac cgg ccg ggc ttc gag ggg gcg aag ttc gtc ttc acg ccg ccg 864
Leu Asp Arg Pro Gly Phe Glu Gly Ala Lys Phe Val Phe Thr Pro Pro
275 280 285
ccg cgc gag gtc aag gac cag gaa atc ctc tgg gag gcg ctg gcc aac 912
Pro Arg Glu Val Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Glu Ala Leu Ala Asn
290 295 300
cgc gtg ttc gag acg gtg tcg tcc gat cac tgc tcc tgg ctc tac aag 960
Arg Val Phe Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys Ser Trp Leu Tyr Lys
305 310 315 320
ggc cac aag gat gag ggc ctg cac gat ttc cgg ctg atc ccg aac ggg 1008
Gly His Lys Asp Glu Gly Leu His Asp Phe Arg Leu Ile Pro Asn Gly
325 330 335
gcg ccc ggc gtc gag gag cgg atg atg atg gtc tac cag ggc gtc aac 1056
Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Met Met Met Val Tyr Gln Gly Val Asn
340 345 350
cag ggc cgc atc tcg ctg acc cag ttc gtc gac ctg gtg gcg acg cgg 1104
Gln Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln Phe Val Asp Leu Val Ala Thr Arg
355 360 365
ccg gcg cag gtg ttc ggc atg ttc ccg cag aag ggc acc atc gcc gtc 1152
Pro Ala Gln Val Phe Gly Met Phe Pro Gln Lys Gly Thr Ile Ala Val
370 375 380
ggc tcc gac gcc gac ctc gtc atc tgg gac ccg gag gcg acg atg acg 1200
Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Trp Asp Pro Glu Ala Thr Met Thr
385 390 395 400
atc acc cag tcg gcg atg aac aac gcg atg gac tac tcg acc tat gag 1248
Ile Thr Gln Ser Ala Met Asn Asn Ala Met Asp Tyr Ser Thr Tyr Glu
405 410 415
ggc cag gcc gtc aag gga atg ccc acg acg gtg gtg ctg cgc ggc aag 1296
Gly Gln Ala Val Lys Gly Met Pro Thr Thr Val Val Leu Arg Gly Lys
420 425 430
gtc atc gtc gag gat cgc aac tat gtc ggc acg ccc ggc gaa ggg cgt 1344
Val Ile Val Glu Asp Arg Asn Tyr Val Gly Thr Pro Gly Glu Gly Arg
435 440 445
ttc ctg cgg cgc gag cgc tac gcg cgt tcc ccg aag ctc gcc tga 1389
Phe Leu Arg Arg Glu Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Lys Leu Ala
450 455 460
<210> 2
<211> 462
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 2
Met Asp Leu Ile Val Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10 15
Ser Arg Ala Asp Leu Gly Val Arg Asp Gly Lys Ile Val Gln Ile Gly
20 25 30
Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ala Arg Thr Ile Asp Ala Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Val Met Pro Gly Gly Val Asp Val His Thr His Ile Asp Ser Asn Asn
50 55 60
Met Glu Thr Lys Ser Ala Asp Asp Phe Arg Thr Gly Thr Ile Ala Ala
65 70 75 80
Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Cys Ala Gln Asp Arg
85 90 95
Gly Gly Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala Lys Trp Asp Gly Arg Ala Ala
100 105 110
Gly Lys Ala Ala Ile Asp Tyr Gly Tyr His Val Ile Val Leu Asp Met
115 120 125
Asn Pro Gly Val Phe Glu Glu Leu Leu Thr Leu Pro Glu Arg Gly Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg Gly Met Asn Met Ile Asp
145 150 155 160
Asp Val Thr Leu Leu Lys Thr Leu Glu Gln Ala Lys Arg Ser Gly Ala
165 170 175
Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Phe Leu Arg
180 185 190
Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Lys Thr Ser Pro Lys Tyr His Ala Leu
195 200 205
Ser Arg Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Ile Ala
210 215 220
Met Ala Glu Ile Val Gly Thr Ser Ile Tyr Ile Val His Leu Thr Cys
225 230 235 240
Glu Glu Ala Leu Glu Glu Leu Met Arg Ala Lys Ala Arg Gly Val Asp
245 250 255
Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr Gln Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Asp Asp
260 265 270
Leu Asp Arg Pro Gly Phe Glu Gly Ala Lys Phe Val Phe Thr Pro Pro
275 280 285
Pro Arg Glu Val Lys Asp Gln Glu Ile Leu Trp Glu Ala Leu Ala Asn
290 295 300
Arg Val Phe Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys Ser Trp Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Gly His Lys Asp Glu Gly Leu His Asp Phe Arg Leu Ile Pro Asn Gly
325 330 335
Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Met Met Met Val Tyr Gln Gly Val Asn
340 345 350
Gln Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln Phe Val Asp Leu Val Ala Thr Arg
355 360 365
Pro Ala Gln Val Phe Gly Met Phe Pro Gln Lys Gly Thr Ile Ala Val
370 375 380
Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Trp Asp Pro Glu Ala Thr Met Thr
385 390 395 400
Ile Thr Gln Ser Ala Met Asn Asn Ala Met Asp Tyr Ser Thr Tyr Glu
405 410 415
Gly Gln Ala Val Lys Gly Met Pro Thr Thr Val Val Leu Arg Gly Lys
420 425 430
Val Ile Val Glu Asp Arg Asn Tyr Val Gly Thr Pro Gly Glu Gly Arg
435 440 445
Phe Leu Arg Arg Glu Arg Tyr Ala Arg Ser Pro Lys Leu Ala
450 455 460
<210> 3
<211> 924
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(921)
<400> 3
atg agc agg aag atg att ctc gcc gtt ggc cag cag ggg ccg atc cag 48
Met Ser Arg Lys Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Gln
1 5 10 15
cgc gcc gat acg cgc gag cag gtc gtc gcg cgg ctg atc gag atg ctg 96
Arg Ala Asp Thr Arg Glu Gln Val Val Ala Arg Leu Ile Glu Met Leu
20 25 30
aag gaa gcg aag gcg cgc aac gcc gat ttc gtc gtc ttc ccc gag ctc 144
Lys Glu Ala Lys Ala Arg Asn Ala Asp Phe Val Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
gcc ctg acc acc ttc ttc ccg cgc tgg tac ttc acc gac gag gcg gag 192
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
ctc gac ttc ttc tac gaa acg gag atg ccg ggg ccg gca acg cgc ccg 240
Leu Asp Phe Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Ala Thr Arg Pro
65 70 75 80
ctg ttc gag aag gcg acc gag ctc ggc atc ggc ttc acc atc tcc ttc 288
Leu Phe Glu Lys Ala Thr Glu Leu Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ser Phe
85 90 95
gcc gag ctg gtg atg gag ggg acg acc aag cgg cgc ttc aac acc tcg 336
Ala Glu Leu Val Met Glu Gly Thr Thr Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
ctg gcg atc gac aag tcc ggc cgg gtc gcc ggc aag tac cgc aag atc 384
Leu Ala Ile Asp Lys Ser Gly Arg Val Ala Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
cat ctc ccc ggc cac aag gaa tac gag gcc tac cgg ccg ttc cag cac 432
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
ctc gag aag cgc tat ttc gag agc ggc gac ctc ggc ttc cag gtc aac 480
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Ser Gly Asp Leu Gly Phe Gln Val Asn
145 150 155 160
gac gtc gac ggc gcc aag ctc ggc atg ttc atc tgc aac gac cgc cgc 528
Asp Val Asp Gly Ala Lys Leu Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
tgg ccg gag acc tgg cgc gtc atg ggc ctc aag ggc gcc gag atc atc 576
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile
180 185 190
tgc ggc ggc tac aac acg ccg ctg cac aac ccg ccc gtg ccg cag cat 624
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
gac cag ctg agc tcg ttc cac cac ctg ctg tcg atg cag gcc ggg gcg 672
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
tac cag aac ggc gcc tgg gcg gcg gct gcc ggc aag gtc ggc atc gag 720
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ala Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Ile Glu
225 230 235 240
gaa ggc tgc atg ctg ctc ggc cat tcc tgc atc gtg gcg ccg aca ggc 768
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
gag ctc gtc gcc atg acc aac acg ctc gag gac gag gtg atc acc gcc 816
Glu Leu Val Ala Met Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
gcc gtc gac ctc gat cgc tgc cgc gag atc cgc gag aac atc ttc aac 864
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
ttc gcc ctg cac cgc gaa ccg aag aac tac gcg atc atc gcg gaa gaa 912
Phe Ala Leu His Arg Glu Pro Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Ala Glu Glu
290 295 300
cag gtc cgc tag 924
Gln Val Arg
305
<210> 4
<211> 307
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 4
Met Ser Arg Lys Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Gln
1 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Arg Glu Gln Val Val Ala Arg Leu Ile Glu Met Leu
20 25 30
Lys Glu Ala Lys Ala Arg Asn Ala Asp Phe Val Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
Leu Asp Phe Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Ala Thr Arg Pro
65 70 75 80
Leu Phe Glu Lys Ala Thr Glu Leu Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ser Phe
85 90 95
Ala Glu Leu Val Met Glu Gly Thr Thr Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
Leu Ala Ile Asp Lys Ser Gly Arg Val Ala Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Ser Gly Asp Leu Gly Phe Gln Val Asn
145 150 155 160
Asp Val Asp Gly Ala Lys Leu Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile
180 185 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala
210 215 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ala Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Ile Glu
225 230 235 240
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
Glu Leu Val Ala Met Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn
275 280 285
Phe Ala Leu His Arg Glu Pro Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Ala Glu Glu
290 295 300
Gln Val Arg
305
<210> 5
<211> 2833
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<400> 5
gatcctcgcc tatctcggcc tcggccatgt cggaaacgaa ctggcccgca acctgccgca 60
cggctatctg cgcacgctcg gcatcgccat cgccatggcg gcgaacccgc gcatcctgct 120
gctcgacgaa cccttcgccg gcatgaaccc ggaagagacg gaccgcgccg tcgaaatggt 180
ggagggaatc cgccgccgcg gcatcaccgt cctgctcgtc gagcacgaca tgcgcgccgt 240
gatgcggatc agcgaccgga tcgtcgtcat cagcttcggc tcgaagattg cagagggaac 300
cccggcggag atccgggaca acccaaccgt catcgaggcc tatctcggcc aggacgacga 360
gacgatcgga cactgacatg gcgggaagca gcatgcgata tttcgaggca cgcggcctga 420
ccgtcaacta taaccgcgtc cgcgccatcg ccgatgtcgg cctcgccttc gacgagggca 480
aggttgcctc gctgatcggc gccaatggcg cgggaaagag cacgacgctg cgggcgatca 540
ccggcctcgt cccgctcgcc ggcggcgaaa tctggttcga cggcgcccgc atcgaccgcc 600
tcccggcgcc gcgccgggtc gagatcggcg tcgccatggt gccggagggc cggcgcgtct 660
tcccgcagat gagcgtgcgc gacaacctgc tgatgggcgc ctatgcgcgc aaggatcgcg 720
gcgccatcgc cagcgacctc gaacggatcc tgacccgctt cccccgcctc aaggaacgcc 780
tgcgccaggg cgccggcacg ctgtcgggcg gcgagcagga gatgctcgtc atcggccgcg 840
ccctgatgtc gaagccgaag ctgctgctgc tcgacgaacc ctcgctcggc ctggcgccgc 900
tggtcgtgcg cgacatcgcg aggctgatca tcgaggtcaa tcgcgacgag ggcatgagca 960
tcgtgctcgt cgaacagaac tcgcggatgg cgctgcgcgt cagccagtac ggctacgtgc 1020
tggagaccgg ccgcatcgcg ctcgaaggcc cttcggacgc actgctgaac gaccccaagg 1080
tcaaggaact ctatctcggc ggctaaggcc gccctccatc gaaccatcga ggattttgga 1140
atgagcagga agatgattct cgccgttggc cagcaggggc cgatccagcg cgccgatacg 1200
cgcgagcagg tcgtcgcgcg gctgatcgag atgctgaagg aagcgaaggc gcgcaacgcc 1260
gatttcgtcg tcttccccga gctcgccctg accaccttct tcccgcgctg gtacttcacc 1320
gacgaggcgg agctcgactt cttctacgaa acggagatgc cggggccggc aacgcgcccg 1380
ctgttcgaga aggcgaccga gctcggcatc ggcttcacca tctccttcgc cgagctggtg 1440
atggagggga cgaccaagcg gcgcttcaac acctcgctgg cgatcgacaa gtccggccgg 1500
gtcgccggca agtaccgcaa gatccatctc cccggccaca aggaatacga ggcctaccgg 1560
ccgttccagc acctcgagaa gcgctatttc gagagcggcg acctcggctt ccaggtcaac 1620
gacgtcgacg gcgccaagct cggcatgttc atctgcaacg accgccgctg gccggagacc 1680
tggcgcgtca tgggcctcaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgctg 1740
cacaacccgc ccgtgccgca gcatgaccag ctgagctcgt tccaccacct gctgtcgatg 1800
caggccgggg cgtaccagaa cggcgcctgg gcggcggctg ccggcaaggt cggcatcgag 1860
gaaggctgca tgctgctcgg ccattcctgc atcgtggcgc cgacaggcga gctcgtcgcc 1920
atgaccaaca cgctcgagga cgaggtgatc accgccgccg tcgacctcga tcgctgccgc 1980
gagatccgcg agaacatctt caacttcgcc ctgcaccgcg aaccgaagaa ctacgcgatc 2040
atcgcggaag aacaggtccg ctagcgggcg tcgccgggct cggcggccgg ggtgatcggc 2100
gtgaccaccg cctggcatct ggccgaagcc ggccgccagg taacgatttt cgtcccccgc 2160
cgccgggcgc ggatctcgcc gacgtcgacc tcgccccctt tgcgccccgt tagatcgaac 2220
ccgaggaacc ccgatgaaga tcaaggtgat caacccgaac accacctggt ccatgaccga 2280
gaagatcggc gaggcggcgc gacgcgtggc ggcgcccggc accgagatcg tcgccgtgtc 2340
gccggcaatg ggcccggtct cgatcgaggg cttctatgac gaggccttcg ccgccatcgg 2400
cgtcatcgac gaagtgcgga agggcgagga agagggctgc gacggctatg tcatcgcctg 2460
cttcggcgat ccgggcctgc tggcggcgcg cgagatcgcg cgcggaccgg tcgtcggcat 2520
cgccgaggcg gccatgcatg cggcgagcct gatcggcaac ggcttcacca tcgtctcgat 2580
gctggagcgg acgcgggcga cgatggaaca cctcgtgcac gcctatggca tgagccacaa 2640
gtgccgcaac atccgcatga ccgacctgcc ggtgctggaa ctggaaaagg aaggctcgaa 2700
cgcgcaggcg atcatcatcg aggaatgccg ccgcgcgctg gaagaggacc attccgacgc 2760
ggtgctgctc ggctgcggcg gcatgtcgga cctgatggcg ctcatcaccc gcgagatcgg 2820
cgcgccggcg atc 2833
<210> 6
<211> 2263
<212> DNA
<213> pasteurella pneumotropica
<400> 6
gatcctgtcg tgggaagggg gaaggaagcg ggcctggccc gcgacgtcct gcgccgcctt 60
cccgcgctcc gggttgggcc tgcgccctgt cctctcgtcc gaagtcggcc cggcatggac 120
cgattcctgc atcccggccc gcgcggggcc ggcccgcctg tgaaacccta ttggagactg 180
tcgatggatc tcatcgtcaa gaacggaacg atcgtcaccg ccgccggcat ttcgcgcgcg 240
gatctcggcg tcagggacgg caagatcgtc cagatcggcg gcgatctcgg cgaggcggcg 300
cgcacgatcg acgcgaccgg ccgctatgtc atgccgggcg gcgtcgacgt ccacacccat 360
atcgactcca acaacatgga gacgaagtcg gcggacgatt tccggaccgg cacgatcgcg 420
gcggcctgtg gcggcacgac gacgatcgtc gatttctgcg cccaggaccg gggcggcacg 480
ctcgccgagg cgatcgccaa atgggacggg cgggcggccg gcaaggcggc gatcgactac 540
ggctaccatg tcatcgtgct cgacatgaat cccggcgtgt tcgaggagtt gctgacgctg 600
ccggagcgtg gcattccctc cttcaaggtg ttcatggcct atcgcggcat gaacatgatc 660
gacgacgtca ccctgctgaa gacgctggag caggccaagc gctcgggggc gctggtcatg 720
gtccatgccg agaacggtga tgcggcggat ttcctgcgcg acaagttcgt cgccgagggc 780
aagacctcgc cgaaatacca cgcgctcagc cggccgccgc gggtcgaggc cgaggcgacc 840
gcgcgcgcca tcgcgatggc cgagatcgtc ggcacctcga tctacatcgt gcacctgacc 900
tgcgaggagg cgctggagga actgatgcgc gccaaggcgc gcggcgtcga cgcgctggcc 960
gagacctgca cgcagtatct ctacctgacc aaggacgacc tcgaccggcc gggcttcgag 1020
ggggcgaagt tcgtcttcac gccgccgccg cgcgaggtca aggaccagga aatcctctgg 1080
gaggcgctgg ccaaccgcgt gttcgagacg gtgtcgtccg atcactgctc ctggctctac 1140
aagggccaca aggatgaggg cctgcacgat ttccggctga tcccgaacgg ggcgcccggc 1200
gtcgaggagc ggatgatgat ggtctaccag ggcgtcaacc agggccgcat ctcgctgacc 1260
cagttcgtcg acctggtggc gacgcggccg gcgcaggtgt tcggcatgtt cccgcagaag 1320
ggcaccatcg ccgtcggctc cgacgccgac ctcgtcatct gggacccgga ggcgacgatg 1380
acgatcaccc agtcggcgat gaacaacgcg atggactact cgacctatga gggccaggcc 1440
gtcaagggaa tgcccacgac ggtggtgctg cgcggcaagg tcatcgtcga ggatcgcaac 1500
tatgtcggca cgcccggcga agggcgtttc ctgcggcgcg agcgctacgc gcgttccccg 1560
aagctcgcct gaggcagcgg cgccccctgg aatcgtagag gcgcccgccc cgatcgaatc 1620
gtggcgggcg cggcattcgc cgcgtcagag gatggcgtcc gggccggcgc cgcagacgat 1680
cgcgcagacc ttctctgccg gcccgatcac gacccgttgc ttcatcaaag cggcgatcga 1740
ggcggcgccg ctcaggtcgg cggccaggcc catctcgaac cagagccatt tcgcggcttc 1800
ggccatttcg tcgtcgtcga ccagcacgat ctcgtcgaca ttctgccgga cgatctcgaa 1860
gatcctcgga tcggtatgcg agcacgacat cgtcgcgacc tttgtcgtcg acacgccgat 1920
gtcgacattc cggcccgctt cgagcgagcg caacagggtc ggagagcccg tcgccgcgat 1980
gccgacgacg cgcacatgcg gcgccagcgc cttgatcgcc gtcgacacgc cgctgatcag 2040
tccgccgccg ccgatggcga cgagcaccgt gtcgagatcg gcgaattgct cgaggatctc 2100
gagcccgacg gtgccctgtc cggcgacgac ataggggtcg gcgaaggggt ggaaataggc 2160
ggcgcctgtt tcggcgacga aggccatcgc ggctgcgttc gcctcctgcc aggcatcgcc 2220
gatgatcacc gtttcggcgc cccattcctg gagcttgctg atc 2263
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer7
<400> 7
cgctctagag ggagactgac gatggatctc atcgt 35
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer 8
<400> 8
cgcaagcttc ctctgacgcg gcgaatg 27
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer9
<400> 9
cgcgaattcc atcgaaccag ggaggatttt gga 33
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer 10
<400> 10
cgctctagac gcccgctagc ggacctgtt 29
【図１】ＡＪ１１２２１株のＤ−ヒダントイナーゼおよ
びＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子の配置を示す
図である。
びＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子の配置を示す
図である。
【図２】本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
バミラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１４年９月１２日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所
学工業技術研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ −Ｐ ４３４８
【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター
究所 特許生物寄託センター
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ− ８０６４
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 横関 健三
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の
素株式会社アミノサイエンス研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 BA71 CA01
DA06 EA04 GA11 HA20
4B050 CC03 DD02 EE10 LL05
4B064 AE03 CA19 CB05 CC24 CD12
DA02
4B065 AA26X AA27Y AB01 AC14
BA02 CA17 CA44
(54)【発明の名称】 Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロ
ラーゼをコードするＤＮＡ、該遺伝子を含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換
された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、Ｄ−アミノ酸の製造方法
Claims (23)
- 【請求項１】 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ
−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列 - 【請求項２】 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項３】 請求項１または２に記載のＤＮＡとベク
ターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラス
ミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由
来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 請求項３または４に記載の組み換えＤＮ
Ａによって形質転換された細胞。 - 【請求項６】 前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来
することを特徴とする請求項５に記載の細胞。 - 【請求項７】 請求項５または６に記載の細胞を培地中
で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特
徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
の製造方法。 - 【請求項８】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項９】 請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−
ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタ
ンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を
有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造するＮ−カルバミ
ル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とする
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１０】 請求項７に記載の製造方法を用いてＤ
−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性
を有するタンパク質およびＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ
酸を加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換
ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−
アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミ
ノ酸の製造方法。 - 【請求項１１】 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列 - 【請求項１２】 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載のＤＮＡ
とベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項１４】 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラ
スミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に
由来することを特徴とする請求項１３に記載の組み換え
ＤＮＡ。 - 【請求項１５】 請求項１３または１４に記載の組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞。 - 【請求項１６】 前記細胞は、エシェリヒア・コリに由
来することを特徴とする請求項１５に記載の細胞。 - 【請求項１７】 請求項１５または１６に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−カ
ルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させること
を特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質の製造方法。 - 【請求項１８】 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列 - 【請求項１９】 請求項１７に記載の製造方法を用いて
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、 前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−
カルバミルアミノ酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造す
るＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ
−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２０】 請求項１７に記載の製造方法を用いて
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、 前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質および
５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素
含有物を５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸
を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴
とするＤ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２１】 請求項７に記載の製造方法を用いてＤ
−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する
第１のタンパク質製造工程と、 請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラー
ゼ活性を有するタンパク質を製造する第２のタンパク質
製造工程と、 前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
び前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を５
置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製造す
るＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ
−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２２】 請求項９に記載のＮ−カルバミル−Ｄ
−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化
合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換
ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する工程を含むことを特徴とするＮ−カルバミ
ル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２３】 請求項１０、１９、２０または２１に
記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダン
トイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物
を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン
化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＤ−
アミノ酸の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP2001209713A JP4561010B2 (ja) | 2001-07-10 | 2001-07-10 | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 |
| US10/190,471 US7098019B2 (en) | 2001-07-10 | 2002-07-09 | DNA for encoding D-hydantoin hydrolases, DNA for encoding N-carbamyl-D-amino acid hydrolases, recombinant DNA containing the genes, cells transformed with the recombinant DNA, methods for producing proteins utilizing the transformed cells and methods for producing D-amino acids |
| US11/433,467 US7316916B2 (en) | 2001-07-10 | 2006-05-15 | DNA for encoding D-hydantoin hydrolases, DNA for encoding N-carbamyl-D-amino acid hydrolases, recombinant DNA containing the genes, cells transformed with the recombinant DNA, methods for producing proteins utilizing the transformed cells and methods for producing D-amino acids |
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