JPH07508169A - Ｄ−ｎ−カルバモイル−アミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントイナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｄ−Ｎ−カルバモイルーアミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントイナーゼ本 発明は、ＤＮＡ分子および微生物宿主の形質転換に使用するための組換えベクタ ーに関する。特に、本発明は、カルバモイラーゼ酵素をコードするＤＮＡ。

および上記ＤＮＡよりなる組換えベクターで形質転換された宿主に関する。

ある種のＤ−α−アミノ酸はよ（知られた医薬中間体である。例えば、Ｄ　（− ）ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンは、抗生物質アモキシシリンの出発物質とし て使用される。したがって、Ｄ−α−アミノ酸の製造法は重要であり、ラセミ体 の出発物質からＤ−生成物を生産する幾つかの酵素的方法が報告されている。

例えば、英国特許第１．５３４．４２６号および１□５６４．９８２号は、５− （置換フェニル）ヒダントインを加水分解して中間体Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（ 置換フェニル）グリシンを与えるヒダントイナーゼ生産微生物を開示している。

しかし、対応するＤ−α−アミノ酸を得るためには、生成したＮ−カルバモイル 化合物を引き続き例えば亜硝酸で加水分解することが必要である。

ヒダントイン出発物質からＤ−α−アミノ酸を製造するための第一の酵素的およ び第二の化学的工程を有するという問題を克服するために、微生物（例、英国特 許第２．０２２．５８１号に記載のアグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ）種）により生産されたカルバモイラーゼ酵素で、Ｎ−カルバモイル中間 体を酵素的にα−アミノ酸に変換することが可能である。しかし、英国特許第２ ．０２２．５８１号に記載のアグロバクテリウムＮＲＲＬ　Ｂ１１２９１の欠点 は、カルバモイルーで酵素の生産】が制限されていることである。さらに、該生 物は、ある環境においては望ましくないかもしれない他の酵素活性を示す。

ＰＣＴ出願ｗｏ　９２／　１０５７９　（力＊カッチ）　Ｉ；！、Ｄ−Ｎ−カル ／＜モイル−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸に変換するカルバモイラーゼ酵素 をコードする組換えＤ　Ｎ　Ａで形質転換された細菌を使用するＤαアミノ酸の 製造を開示する。

本発明者らは、驚くべきことに、相同宿主でカルバモイラーゼ遺伝子が発現され る場合に、より高いレベルの酵素活性が得られることを見いだした。「相同宿主 」とは、宿主が、遺伝子が最初に単離された生物と同型であることを意味する。

したがって、本発明は、カルバモイラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡを相 同宿主中で発現させることによる、Ｄ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換され ていてもよいフェニル）グリシンを対応するＤ−（所望により置換されていても よいフェニル）グリノンに変換する能力を有するカルバモイラーゼ酵素の製造法 を提供する。

好ましくは、相同宿主はアグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　 、すなわち、カルバモイラーゼ遺伝子はアグロバクテリウム由来である。

さらに、本発明らは、異種宿主および相同宿主の双方において、特定の構築が高 レベルの発現につながることを見いだした。

したがって、本発明の別の態様においては、Ｄ−Ｎ−カルバモイル（所望により 置換されていてもよいフェニル）グリノンを対応するＤ−（所望により置換され ていてもよいフェニル）グリノンに変換する能力を有するカルバモイラーゼ酵素 をコードする遺伝子よりなる組換えＤＮＡベクターであって、本明細書中に記載 するｐｃＡＲｌ、ｐＣＡＲ６、ｐｃＡＲｌ２、ｐｃＡＲ２１、ｐＣＡＲ２６、ｐ ＣＡＲ２７、ｐＣＡＲ２８、ｐＣＡＲ２９、ｐＧａ　１２７８９Ｒ５３Ｃａｒｂ 、ｐＣＡＲ３１、ｐＣＡＲ３２、ｐＣＡＲ３６、ＤＣＡＲ４４およびｐＣＡＲ４ ６よりなる群から選ばれる組換えＤＮＡベクターを提供する。

本発明の利点は、特に大量のカルバモイラーゼ酵素が製造できることである。

このように、適切な条件下で、活性なカルバモイラーゼ酵素が得られ、使用され 、好ましくは固体担体上に固定化されて選択されたＤ−α−アミノ酸を製造する 。

本明細書中に記載の所望により置換されていてもよいフェニル基の適切な置換基 は、ヒドロキシ、Ｃ（１−６）アルキル、Ｃ（＋−ｓ）アルコキンおよびハロゲ ンを包含する。好ましい（置換フェニル）グリシンは、（ｐ−ヒドロキシフェニ ル）グリノンおよび（３，４−ジヒドロキンフェニル）グリシン、特に（ｐ−ヒ ドロキシフェニル）グリノンを包含する。

以下に記載のように、上記能力を有するカルバモイラーゼ酵素を生産する生物の 全ＤＮ、へまたは染色体ＤＮＡからカルバモイラーゼ遺伝子を単離してもよい。

該カルバモイラーゼ遺伝子は、さらに遺伝子、例えば調節因子、または特別の機 能または公知の機能を有さないフランキングＤＮＡよりなるものであってもよい 。

関連した態様において、本発明は、Ｄ、Ｌ−（所望により置換されていてもよい フェニル）ヒダントインを対応するＤ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換され ていてもよいフェニル）グリシンに変換する能力を有するヒダントイナーゼ酵素 をコードする遺伝子よりなるＤＮＡを提供する。

勿論、本発明のＤＮＡは、かかる染色体ＤＮＡの大部分から分離されており、そ の「自然な」状態、すなわち自然界に存在している状態ではないと理解される。

一つの態様においては、本発明のＤＮＡは、単離されおよび実質的に精製された 形態であり、および／または実質的に、上記ヒダントイナーゼ酵素をコードする ヒダントイナーゼ遺伝子よりなる。

さらに他の態様においては、本発明は、本発明のＤＮＡよりなる組換えＤＮＡを 提供する。

好ましくは、ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡは、組換えベク ター、より好ましくは、高レベルの遺伝子転写物を発現する能力を有する高発現 ベクターよりなる。

さらに、本発明は、通常の形質転換またはエレクトロポレーション条件下で宿主 および組換えベクターを混合することよりなる、本発明によるカルバモイラーセ またはヒダントイナーゼ酵素をコードする宿主細胞を組換えベクターで形質転換 する方法を提供する。

本発明のもう一つの態様においては、本発明による組換えベクターで形質転換さ れた宿主細胞が提供される。適当な宿主は、アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ）およびイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、例えば、イー・コリ ＤＨＩ、イー・コリＪＭＩＯＩおよびイー・コリＨＢＩＯＩを包含する。

本発明はまた、本発明の形質転換された宿主を培養して、カルバモイラーゼまた はヒダントイナーゼ酵素を製造することを包含する。

さらに本発明の他の態様においては、カルバモイラーゼ酵素のための遺伝子およ びヒダントイナーゼ酵素のための遺伝子をコードする単離および組換えＤＮＡが 提供される。そして適切な形質転換宿主の培養により、カルバモイラーゼおよび ヒダントイナーゼ活性を得ることができる。

カルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ活性が、例えばｐｃＡＲｌ、ｐＣＡＲ ６、ｐｃＡＲ３１、ｐＣＡＲ３２およびｐＣＡＲ３６と同じ構築で得られる場合 、有利な結果が得られる。

一つの態様においては、本発明のＤＮＡは、微生物、好ましくは本明細書中に記 載のとおりｒ８０／４４−２ＡＪと称されている土壌単離物から得られる。該単 離物ｒ８０／４４−２ＡＪはアグロバクテリウムであると考えられており、本発 明者らはこの名称に束縛されたくはないが、本明細書中では該株をアグロバクテ リウム８０／４４−２Ａと称する。同様に、これから得られるＤＮＡをアグロバ クテリウムＤＮＡと称する。

本発明をより明確に定義するために、以下の添付図面を参照する。

図１は、プラスミドｐｃＰ１９の制限部位および機能地図を示す。

略語： Ｔｃ”＝テトラサイクリン耐性遺伝子、９狙＝バクテリオフアージ・ラムダから のコス部位、連続線はｐｃＰ１９からのＤＮＡを表す。

図２は、Ｎ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシグリノンからＤ　（−）　ｐ−ヒド ロキシフェニルグリノンへの変換の反応順序を示す。

図３は、プラスミドｐｃＡＲ１の制限部位および機能地図を示す。

略語・ 連続線はｐｃＰ１９からのＤＮＡを表す。

陰影部はアグロバクテリウムＢ○／４４−２ＡからのＤＮＡを表す。

図４は、プラスミドｐＣＡＲ６の制限部位および機能地図を示す。

略語： Ｃ＝Ｃ１ａｌ、　Ｂ＝旦１１１、Ｂａ＝旦ａｍＨＬＨ＝旦１ｎｄＩＩＬ　Ｅ＝旦 ｃｏＲＩ、Ｐ連続線はｐｃＰ１９からのＤＮＡを表す。

陰影部はアグロバクテリウムからのＤＮＡを表す。

図５は、プラスミドｐｌＪ２９２５の制限部位および機能地図を示す。

略語 ｐ、ｐＰ＝アンピンリン耐性 図６は、プラスミドｐｃＡＲ１２の制限部位および機能地図を示す。

「ポリリンカー」と表示した領域には、該ｐｌ　Ｊ２９２ＳＤＮＡ中のすべての 制限部位が示されているわけではない。

略語。

陰影部でない部分はｐｃＰ１９ＤＮＡ　（ｐＣＡＲ６からアグロバクテリウムＤ ＮＡと共にクローニングされたもの）を表す。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

連続線はｐｌ　Ｊ　２９２５ＤＮＡを表す。

図７は、プラスミドｐｃＡＲ２１の制限部位および機能地図を示す。

「ポリリンカー」と表示した領域には、該ｐｉ　Ｊ２９２５ＤＮＡ中のすべての 制限部位が示されているわけてはない。

略語・ 陰影部でない部分はｐｃＰ１９ＤＮＡ　（ｐｃＡＲｌ２からアグロノくクテリウ ムＤＮＡと共にクローニングされたもの）を表す。

Ｖ３影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

連続線はｐｉ　Ｊ　２９２５ＤＮＡを表す。

図８は、プラスミドｐＣＡＲ２７の制限部位および機能地図を示す。

略語・ 連続線はＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡを表す。

陰影部でない部分はｐｌ　３２９２５ＤＮＡを表す。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図９は、プラスミドｐＣＡＲ２８の制限部位および機能地図を示す。

略語： 連続線はＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡを表す。

陰影部でない部分はｐｉ　Ｊ２９２５ＤＮＡを表す。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図１０は、ｐＣＡＲ２７およびｐＣＡＲ２８からのアグロバクテリウムＤＮＡの 配列を示す。該ＤＮＡ分子の「センス」またはコーディング鎖のみを示す。該Ｄ ＮＡ鎖は、５°→３゛で左から右に示す。該ヌクレオチド配列の番号は、該配列 の直下に示す。該ＤＮＡによりコードされるカルバモイラーゼのアミノ酸配列（ 工学コードを使用している）は、ヌクレオチド配列の３線の上に示す。

図１１は、ｐＴＲ５５０の制限部位および機能地図を示す。

略語・ ｒｒｎＢ　ｔｅｒｍはリポソームＲＮＡオペロンからの転写ターミネータ−を表 す。

Ｐ　ｔａｃは転写のｔａｃプロモーターを表す。

図１２は、ｐＣＡＲ２９の制限部位および機能地図を示す。

略語 連続線はｐＴＲ５５０ＤＮＡを表す。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図１３は、ｐＫＴ２１０の制限部位および機能地図を示す。

略語 、へ＝Ａｃｃｌ、Ｅ＝ＥｃｏＲＬ　Ｈ＝１（ｉｎｄＩＩＩ、　Ｐｆ＝Ｐｆ１ＭＩ 　、　Ｐ＝Ｐｓｔｌ、Ｓ−５匣、Ｉ０ 図１４は、ｐＣＡＲ２６の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ａ−Δｃｃ■、Ｂ＝ＢｇｌＩＬ　Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、　Ｅ＝旦ｃｏＲ１，Ｈ＝旦 １ｎｄＩＩＩ、Ｐ＝旦ｓｔｌ、　Ｐｆ＝Ｐｆ１ＭＩ、　５＝Ｓｓｔｌ、Ｓａ＝旦 １■、５ｐ＝Ｓｐｈｌ、Ｓｍ＝Ｓｍａ■、Ｋ＝に四Ｉ０ 陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

矢印はカルバモイラーゼコーディング配列を表す。

該ベクターＤＮＡは、ポリリンカーまたはアグロバクテリウムＤＮＡ中で切断す るすべての酵素についてマツピングされているわけではない。すべてのアグロ図 １５は、ｐＷＯＲ９０１の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ａ＝Δ匹１．　Ｅ＝旦臼ＲＴ、Ｈ＝旦１ｎｄＩＩＩ、Ｐｆ＝旦旦Ｍｌ、Ｐ＝ハリ 、Ｓ＝旦旦Ｉ０ 図１６は、ｐＷＯＲ９０２の制限部位および機能地図を示す。

略語 図１７は、ｐＣＡＲ４４の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ａ＝Ａｃｃｌ、　Ｂ＝ＢｇｌＩＬ　Ｂａ＝ＢａｍＨＴ、Ｅ＝旦ｃｏＲＩ、Ｈ＝旦 １ｎｄＩＩＩ、Ｐ＝ハリ、５＝Ｓｓｔｌ、５ａ＝Ｓａｌｌ、５ｐ＝ＳｐｈｌＳＸ ＝Ｘｂａ＋。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

矢印はカルバモイラーゼコーディング配列を表す。

該ベクターＤＮＡは、ポリリンカーまたはアグロバクテリウムＤＮＡ中で切断す るすべての酵素についてマツピングされているわけではない。

図１８は、ｐＷＯＲ９０３の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ａ＝Δ正ｌ５Ｅ＝旦臼ＲＶ、Ｐ＝旦旦１．Ｓ一旦旦■。

図１９は、ｐＷＯＲ９０４の制限部位および機能地図を示す。

略語、 Ａ＝Ａｃｃｌ、Ｂ＝ＢａｌｌＩ、Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ　、　Ｈ＝ ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ＝ハリ、Ｓｍ＝Ｓｍａ１％５＝Ｓｓｔｌ、　５ａ＝ＳａｌＩ 、　Ｓｐ＝旦ｐｈＬ　Ｘ＝ＸｂａＬＶ＝旦臼ＲＶ、Ｃ＝且１■、Ｋ＝に四Ｉ、Ｘ ｈ＝入肪１．Ｎ＝Ｎ些Ｉ０該ベクターＤＮＡは、ポリリンカー中で切断するすべ ての酵素についてマツピングされているわけではない。

図２０は、ｐＷＯＲ９０５の制限部位および機能地図を示す。

略語。

Ａ＝八へ■、Ｂ＝旦ａＩＩＩ、Ｂａ＝旦ａｍＨＩ、Ｅ＝旦ｃｏＲＩ、Ｈ＝旦１ｎ ｄＩＩＩ、Ｐ＝シリ、Ｓｍ＝Ｓｍａｌ、　５＝Ｓｓｔｌ、５ａ＝Ｓａｌｌ、Ｓｐ ＝シ１、Ｘ＝）（ｂａｌ、Ｖ＝ＥｃｏＲＶ、Ｃ＝Ｃ１ａＬ、　Ｋ＝Ｋｐｎｌ、　 Ｘｈ＝Ｘｈｏｌ、　Ｎ＝Ｎｒｕ１０該ベクターＤＮＡは、ポリリンカー中で切断 するすべての酵素についてマツピングされているわけではない。

図２１は、ｐＣＡＲ４６の制限部位および機能地図を示す。

略語・ Ａ＝Ａｃｃｌ、Ｂ一旦ａｌＩＩＳＢａ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝旦ｃｏＲＩ、Ｈ＝旦１ ｎｄＩＩＩ、Ｐ＝ハリ、Ｓｍ＝Ｓｍａｌ、５＝Ｓｓｔｌ、５ａ＝ＳａｌＩ、　５ ｐ＝Ｓｐｈｌ、　Ｘ＝Ｘｂａｌ、■＝旦臼ＲＶ、Ｃ＝旦虹■、Ｋ＝に凹■。

陰影部はアグロバクテリウムＢＯ／４４−２ＡからのＤＮＡを表す。

矢印はカルバモイラーゼコーディング配列を表す。

該ベクターＤＮＡは、ポリリンカーまたはアグロバクテリウムＤＮＡ中で切断す るすべての酵素についてマツピングされているわけではない。

図２２は、ｐｃＡＲ３１の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ｂ＝ＢｇｌＩ１．　Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、Ｂｓ＝ＢｓｐＨＩ、　Ｃ＝Ｃ１ａｌ、Ｅ ＝ＥｃｏＲＩ、■＝ＥｃｏＲＶ、Ｈ＝旦１ｎｄＩＩＩ、Ｎ＝Ｎｒｕｌ、　Ｐ＝Ｐ ｓす、Ｓ＝旦ｓｔｌ、　５ａ＝ＳａｌＩ％Ｓｐ＝旦吐１、Ｓｃ＝旦ｃａｒ、Ｔｃ ’＝テトラサイク１ル耐性遺伝子。

Ｃ０５＝バクテリオフアージλからのコス（＝）部位。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図２３は、ｐＣＡＲ３２の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ｂ＝ＢｇｌＩＬ　Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、Ｂｓ＝ＢｓｐＨＩＳＣ＝Ｃ１す、Ｅ＝Ｅｃ ｏＲＩ、　Ｖす翔ＲＶ、　Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、　Ｎ＝ＮｒｕＩ、　Ｐ＝Ｐｓす 、５＝Ｓｓｔｌ、　５ａ＝Ｓａｌ＋、ｓｐ＝旦帥１．Ｓｃ＝旦９■、Ｔｃ’＝テ トラサイクリン耐性遺伝子。

＝＝バクテリオファージλからのコス（臼９部位。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図２４は、ｐＣＡＲ３６の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ａ＝Ａｃｃｌ、Ｂ＝ＢｇｌＩＩ、Ｂａ＝＝ＢａｍＨＩ、Ｂｓ＝ＢｓｐＨＩ、　Ｃ ＝Ｃ１ａＬ　Ｅ＝堕Ｒ１，Ｖ＝肘ＲＶ、Ｈ＝堕ｄＩＩＩ、Ｎ＝セ１．　Ｐ＝シリ 、Ｐｆ＝江ＭＩＳＳ＝Ｓｓｔｌ、５ａ＝Ｓａｌｌ、５ｐ＝ｓｐｈ＋、５ｃ＝Ｓｃ ａｌ、Ｃｍ”＝クロラムフェニコール耐性遺伝子。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図２５は、ｐＤＡＮ３の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ｂ＝塩↓工１、Ｂａ＝ＢａｍＨｌ　、　Ｅ＝ＥｃｏＲｌ５Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、 Ｐ＝Ｐｓす、５＝Ｓｓｔｌ、　５ａ＝Ｓａｌｌ、５ｐ＝Ｓ陣ＬＸ＝ＸｂａＩ。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

図２６は、ｐ　Ｄ　Ａ　Ｎ　４の制限部位および機能地図を示す。

略語 Ｂ＝ＢｇユＩＩ、Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、　Ｅ＝ＥｃｏＲＬ　Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、 　Ｐ＝Ｐｓｔｌ、　５＝Ｓｓｔ１．５ａ＝Ｓａｌｌ、　５ｐ＝Ｓｐｈｌ、Ｘ＝Ｘ ｂａ＋。

陰影部はアグロバクテリウムＤＮＡを表す。

本発明のＤＮＡは、いずれかの適切なベクターに連結されてもよ（１゜通常、該 ベクターはプラスミド、例えばイー・コリ由来のプラスミド、またはテンペレー トまたはビルレントバクテリオファーンである。

特別なベクターは、例えばｐｃＰ１９またはｐＫＴ２１０またはその誘導体のよ うな広宿主域ベクターを包含する。本明細書中に詳細に記載されているベクタ＝ ｐｌＪ２９２５およびｐＴＲ５５０が有利に使用され得る。

特に有用なベクターは、ｐＫＴ２１０の誘導体である動態化欠陥（Ｍｏｂつベク ターｐＷＯＲ９０２である。ｐＷＯＲ９０２は、Ｍｏｂ−不安定ベクターｐＷＯ Ｒ９０１からのＤＮＡの自発的欠失により得られ、ｐＫＴ２１０はど乱交性では ない。このようにｐＷＯＲ９０２の利点は、ｐＷＯＲ９０２により形質転換され る場合、例えばｐＫＴ２１０による場合に比べて組換え株がより安全であること である。イー・コリＨＢ１０１　（ｐＷＯＲ９０２）は、ナンヨナノいコレク／ ヨン・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　１ｌａｒｉ ｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）　（アバディーン、スコツトランド）に１９９１年１ １月４日に、受託番号Ｎ（ｊＭＢ４０４５１で寄託された。該寄託は、特許手続 のための微生物の寄託に関するブダペスト条約に基づき行われた。

ｐＷＯＲ９０２、その誘導体およびそれにより形質転換された宿主は、さらに本 発明の他の態様を形成する。

ｐＷＯＲ９０２の特に有用な誘導体は、以下に記載するプラスミドｐＷＯＲ９０ ３、ｐＷＯＲ９０４およびｐＷＯＲ９０５である。これらは、ｐＷＯＲ９０２か ら標準的方法により得てもよい。

本発明による組換えベクターは、標準的な技術、例えば、付着末端のダイレクト ・コンビ不−ンヨン、ホモポリマー・テーリングにより、またはリンカ−または アダプター分子により、カルバモイラーゼ遺伝子よりなるＤＮＡを選択されたベ クターに連結することにより調製してもよい。

上記方法により調製される組換えベクターは、可能な２つの配向の内の１つによ り挿入ＤＮＡを含有してもよいと理解される。挿入ＤＮＡを各配向で有する組換 えベクターが本発明の範囲に含まれる。

特別の組換えベクターは、ｐ　Ｃ、Ａ　Ｒｌ、ｐＣＡＲ６、ｐｃＡＲ１２、ｐ　 ＣＡＲ２１、ｐＣＡＲ２６、ｐＣΔＲ２７、ｐＣＡＲ２８、ｐＣＡＲ２９、ｐＧ ａ１２７８９Ｒ５３Ｃａｒｂ、ｐｃＡＲ３１、ｐＣＡＲ３２、ｐＣＡＲ３６、ｐ ＣＡＲ４４およびｐＣＡＲ４６と称するもの（これらの調製および性状は以下に 詳細に記載する）を包含する。

本発明の特に好ましい態様においては、プラスミドｐＣＡＲ２６、ｐＣＡＲ４４ およびｐＣＡＲ４６が提供される。ｐＣＡＲ２６、および特に、ｐＣＡＲ４４お よびｐＣＡＲ４６は、宿主細胞（特にアグロバクテリウム）がそれにより形質転 換され、適切な条件下で培養された場合、大量のカルバモイラーゼ活性を与える 。

カルバモイラーゼタンパク質コーディング配列は、例えばｔａｃプロモーターの ような異種プロモーターから発現されてもよいと理解される。かかる発現は本発 明の範囲内に含まれる。

特定の態様において、本発明は、ｐＣＡＲ４６で形質転換された宿主、特にアグ ロバクテリウムを提供する。特定の態様において、本発明は、ブタペスト条約に 基づき１９９２年２月１４日に寄託されたＮＣＩＭＢ４０４７８を提供する。

カルバモイラーゼ酵素をコードするＤＮＡを得る方法は、ａ）カルバモイラーゼ 生成微生物から得られる染色体ＤＮＡ断片から遺伝子ライブラリーを構築するこ と、 ｂ）上記ライブラリーから本発明のＤＮＡを含有するクローンを選択するために 、１以上のハイブリッド形成実験を行うこと、およびＣ）本発明のＤＮＡを単離 すること よりなる。

遺伝子ライブラリーは、 （ａ）カルハモイラーゼ生成微生物の染色体ＤＮＡを１以上の適切な制限エンド ヌクレアーゼ、例えばＨｊｎｄｌＩＩて部分的消化し、（ｂ）サイズ分画により 適当な長さの断片を得、（Ｃ）該断片をベクターに連結して組換えベクターを得 、および（ｄ）ａ切な宿主を組換えベクターで形質転換またはトランスフェクシ ョンすることによる通常の「ノヨットガン」法により調製してもよい。

本明細書中に記載のとおり、形質転換またはトランスフェクションは、当該分野 でよ（知られた通常の方法により行ってもよい。

適切には、サイズ分画をショ糖密度勾配上で行い、選ばれたサイズ範囲の断片を 選択してもよい。

好ましい態様においては、「遺伝子ライブラリー」は、約１５〜３Ｑｋｂの長さ の断片を選択し、上記断片をプラスミドベクター、例えばベクターｐｃＰ１９に 連結することにより調製してもよい。適切な宿主はイー・コリ、例えばイー・コ リＤＨＩである。

カルバモイラーゼ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリー中のクローンを識別する ためには、Ｎ−カルバモイル−４−ヒドロキシフェニルグリシンをＤ　（−）　 ４−ヒドロキシフェニルグリノンに変換する能力についてコロニーをスクリーニ ングする必要がある。「陽性」コロニーは、標準的な方法で、例えばフェノール レッドのような指示薬を使用してアンモニア（上記反応で生成したもの）の生産 を調べることにより、簡便に識別および単離され得る。

当業者が本発明を容易に実施できるようにするために、この試験で陽性のコロニ ー、特に、ｐｃＡＲｌで形質転換されたイー・コリＡＧＩ微生物を、ナショナル ・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　 Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）　（アバディーン、スコc トランド）に１９８９年４月２６日に、受託番号ＮＣＩＭＢ４０１３３で寄託し た。イー・コリＮＣＩＭＢ４０１３３は、本発明のさらに別の態様を形成する。

陽性コロニー、例えばイー・コリＮＣｌＢ４Ｏ１３３中に存在するプラスミドＤ ＮＡは、それによりコードされているカルバモイラーゼ酵素の配列を決定するた めに、以下の実施例に記載のとおりさらに処理してもよい［以下の図１０（ｂ） 参昭］。

この人件に存在する酵素のアミノ酸配列は、い（らか変化させてもよいと理解さ れる。以下の［Ｚｌｏ（ｂ）に示すように、これらは、実質的には同一のアミノ 酸配列を有し、カルバモイラーゼ活性を有する。

本発明の特定の具体例においては、以下の図１０（ｂ）に示すヌクレオチド８９ １からヌクレオチド１８０２までのコーディング配列よりなるＤＮＡまたは組換 えＤＮＡが提供される。該Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、推定分子量約３４．１００のカル ノくモイラーゼ酵素をコードする。

工発明のさらに別の態様においては、図１０（ｂ）に示すＮ−からＣ−末端まで のアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたカルバモイラーゼ酵素が提供され る。

さらに本発明の別の態様においては、本明細書中で上記するような、固体担体、 例えばフェノール−ホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂ドウオライド（Ｄｕｏ１ ４ｔｅ）Ａ５６８（ｏ−ム・アンドＨハース（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ）　 ）のような陰イオン交換樹脂上に固定化したカルバモイラーゼ酵素が提供される 。

所望により、図１０（ｂ）に示す該ＤＮＡコーディング配列またはアミノ酸配列 は、通常手段、例えば自動合成機により合成することができる。

遺伝コードの縮重性により、カルバモイラーゼ酵素のアミノ酸配列は、多数の代 替ＤＮＡ配列によりコードされ得る。本発明のＤＮＡは、さらにかかる代替配列 よりなると理解される。

さらにもう１つの態様においては、本発明は、ａ）ｐｃＡＲｌのＤＮＡ挿入の１ 部分（上記部分は９８６塩基対のＰ３ＨＩ−ＲｉｎｄＩＩＩ断片である）、 ｂ）緊縮条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で上記部分に対 してハイブリッド形成し、Ｄ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換されていても よいフェニル）グリノンを対応するＤ−（所望により置換されていてもよいフェ ニル）グリシンに変換する能力を有するカルバモイラーゼ酵素をコードするＤＮ Ａ配列から選択されるＤＮＡ化合物を提供する。

本発明の特定の管種において、標準的な方法を用いては可溶性活性酵素の生成を 得ることが最初は困難であるにもかかわらず、イー・コリ中ではカルバモイラー ゼ酵素が簡便に製造され得ることが見いだされた。本発明のこの態様では、適切 なプロモーターの制御下イー・コリ中で遺伝子が発現されるために処理される、 または既に処理されたいずれかの適切なベクター中にカルバモイラーゼ遺伝子よ りなるＤＮＡをまずクローニングする。

好ましくは、該ベクターは高コピー数プラスミド、例えばｐＵｃ１８または天然 に存在するイー・コリ・プラスミドＮＲＩの誘導体である（フォスター、ティー ・ジエイ（Ｆｏｓｔｅｒ、丁ｊ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔ、、１９７５，１２４．１１ ５３）。

カルバモイラーゼ酵素の効果的発現を達成するために、好ましくは、該プロモー ターは非誘導（ｎｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）である。すなわち、その抑制解除 または誘導のために化学物質を加えたり温度を上げたりする必要がない。驚くべ きことに、これらの条件下、増殖周期の間じゅう、可溶性かつ活性であるカルバ モイラーゼ酵素をイー・コリ細胞が生産することを見いだした。

イー・コリ中でのカルバモイラーゼ酵素の発現のための一つの好ましいプロモー ターは、以下に記載のとおり、ガラクトースプロモーターである。

イー・コリＮＣＩＭＢ４０１３３中に存在するプラスミドＤＮＡまたはその誘導 体もまた、本明細書中に記載のヒダントイナーゼの高レベル発現を得るために処 理されてもよい。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例１ アグロバクテリウム８０／４４−２Ａの培養および染色体ＤＮＡの単離５０１ｍ １のＡＪ−１ブロス（１リツトル当たり酵母エキス２０ｇ、ＫＨｘＰｏ。

１ｇＳＫ２ＨＰＯ４１ｇ、ＭｇＳ○５７Ｈｚ○０．５　ｇ、　ＣａＣｌ２・２Ｈ ｚＯ０，１ｇ、Ｍｎ５Ｏ４Ｈ４Ｈ２０１５ｍｇ５＃ｅＳＯ４・７ＨｔＯ２０＋＋ ｇ、グルコース５ｇ。

５Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ７，０に調整）にアグロバクテリウム８０／４４−２Ａ　 （土壌から単離）の培養を接種し、２５℃で２４時間、旋回インキュベーター中 でインキュベートした。該培養液を約１５００ｘｇ、１０℃で７分間遠心分離し た。得られた上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍ１の食塩水リン酸緩衝液（１リ ツトル当たりＮａＣ１８，５ｇ５ＫＨ２ＰＯ４７，２ｇ、ＫｔＨＰＣＬ　７．Ｏ ｇ）で洗浄し、再度ペレット化した。上清を捨て、３％ＳＤＳ　（ドデンル硫酸 ナトリウム）および５部ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）の溶菌溶液（８１ １１）に細胞ペレットを再懸濁し、水浴中６５°Ｃで１５分間インキュベートし た。溶菌細胞溶液を室温に冷却し、５ｍｌの緩衝化フェノール／クロロホルム（ トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）でｐＨ約７に緩衝化されたフェノールおよびク ロロホルムの５０　：　５０混合物）で２回抽出した。回収された水層を５ｍｌ のクロロホルムで抽出した。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を 加え、混合し、２５容量の冷（−２０℃）エタノールを該溶液に重層し、ぐるぐ る回して混合することにより、回収された水層を沈殿させた。沈殿したＤＮＡの 凝固をガラス棒に巻き、４０μｇ／ｍｌリポヌクレアーゼＡを含有する３ＩＩ＋ １のＴＥ（１０ｗＭトリス−ＨＣＬ　ｐＨ８，Ｏ；　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８ ，０）に再溶解した。該溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、緩衝化フェ ノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、ついでＮａ０Ａｃおよ びエタノールで沈殿させた。該ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、３ｍｌのＴＥに再 溶解した。

実施例２ アグロバクテリウム８０／４４−２Ａのゲノムライブラリーの作成プラスミドベ クターｐｃＰ１９（図１）は、広い宿主域のプラスミドｐ　ＬＡＦ２９６コの誘 導体であり、ｐｃＰ１３　［ダーノンズ（Ｄａｒｚｉｎｓ）およびチャクラパテ ィ（Ｃｈａｋｒａｂａｔｙ）　、ジャーナル・オブ・バクテリオロン−（Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ存在するカナマイノン耐性遺伝子を欠く。２μｇのプラ スミドｐｃＰ１９を、ＩｄＩＩＩ消化緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ ，Ｏ；　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ；　１１００ｎ　ＮａＣ１）中、２０単位の制限酵 素ＨｉｎｄＩＩＩ　［ギブ：ｌ　（Ｇｉｂｃｏ）　ＢＲＬ、ペイズリ−（Ｐａｉ ｓｌｅｙ）　、ＰＡ３　４ＥＦ、スコツトランド］により３７℃で３時間消化し た。

該混合物を緩衝化フェノール／クロロホルムで抽出し、ついでクロロホルムで抽 出し、回収した水層を１１容量の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよび２５容量のエタノール で処理した。該混合物を一２０℃で１時間インキュベートして該ＤＮＡを沈殿さ せた。マイクロセントリフユーノ試験管中、１２０００ｘｇで５分間遠心分離し た後、該ＤＮＡペレットを５０μｍの５部ｍＭｌ−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０ ）　、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）に再溶解した。１単位の牛腸アル カリホスファターゼ（ＣＩＡＰ：ＢＣＬから、ベーリンガー・ランハイム・ハウ ７、　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ｌ１ｏｕｓｅ）　、レウェ ス（Ｌｅｗｅｓ）　、イースト・サセックス（Ｅａｓｔ　５ｕｓｓｅｘ）、ＢＮ ７　１ＬＧ）を加え、該混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。４５μ ｍの水および５μｍの１０％ＳＤＳ溶液を加え、該混合物を６８℃で１５分間イ ンキュベートした。ついで該混合物を室温に冷却し、緩衝化フェノール／クロロ ホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールを加える ことにより沈殿させた。該ＤＮＡペレットを４０μｍのＴＥに再溶解した。

アグロバクテリウム８０／４４−２Ａ　（実施例１）からのＤＮＡ２５μｇを、 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，Ｏ；　１０ａ ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ；　１０Ｑｍ）Ｉ　ＮａＣ１）　１５０　μｍ中、１２単位の Ｈｉｎｄ　ＩＩＩにより３７℃で１０〜３０分間消化して制限酵素のいくつかの （すべてではない）認識部位にて切断した。消化の進行は、アリコートを取り出 し、フェノール／クロロホルム抽出により反応を停止することにより監視した。

０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有するＴＨＥ緩衝液（３９ｍＭ）リス塩基 、８９ｍＭホウ酸、２μＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）中の０６％アガロース（ウ ルトラピュア（ｌｌｌｔｒａｐｕｒｅ）　、ギブコＢＲＬから）ゲル上の電気泳 動により、回収したＤＮＡサンプルの１部を分画し、紫外線を用いてＤＮＡ帯を 可視化した。部分的に消化したＤＮＡ断片の必要な大きさは約１５〜約３０ｋｂ ｐである。部分消化物から適当なアリコートを選択し、それらを合わせ、臭化エ チジウムを含有するＴＢＥ緩衝液中の０８％低融点アガロース（ウルトラピュア 、ギブコＢＲＬから）ゲル上での電気泳動によりそれらを分画することにより、 これらの断片を得た。ＤＮＡ帯を紫外線で可視化した後、約１５ｋｂｐ〜約３０ ｋｂｐの大きさの断片に相当するゲルの１部分を切り出し、６５℃で１５分間融 解した。該混合物を約３７℃に冷却し、トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）で中性 ｐＨに緩衝化したフェノールの溶液で２回抽出した。回収した水層を、緩衝化し たフェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、Ｎａ０Ａｃおよ びエタノールを加えることによりＤＮＡを沈殿させた。１００μｌのＴＥにＤＮ Ａを再溶解した。

μｇを、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールを加えることにより共沈させ、１２μｍの ＤＮＡリガーゼ緩衝液（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，Ｏ：　４ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１１；　１０ｍＭノチオトレイトール；５０μｇ／ｍｌウノ血清アルブミン、 および０．５ｍＭ　ＡＴＰ）に再溶解させた。１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ギ ブコＢＲＬ）を加え、該混合物を１２℃で約１６時間インキュベートした。スト ラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊｏ１１ａＸカルフ ォルニア州９２０３７）からのギガパック・ゴールド・パスケージング・キット （Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｗｉｔ）を使用して、３ μｍの連結ＤＮＡをラムダバクテリオファージ粒子にパッケージングした［エン クイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）およびスターンバーブ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）　、 メリンス・イン・エンザイモロノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ）Ｓ１（１９７９）２８１−２９８も参詔せよコ。これによりバクテリオフ ァージ粒子の懸濁ａｓｏｏμｌを得た。

ストラタノーンから得た工／エリキア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）　ＡＧ　１　［イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＨ１の誘導体　ハナハン（ Ｈａｎａｈａｎ）　、ジャーナル・オブ・３）５５７−５８０］の培！ｊｌｏｍ ｌを、０．４％マルトースおよび１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含有するし一ブロス（ １リツトル当たりバクトートリブトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ５ＮａＣ１５ｇお よびグルコースＩｇ）中、旋回インキュベーター上、３７℃で約１６時間増殖さ せた。約１５００ｘｇでの７分間の遠心分離により該細胞を集め、６００ｎｆｆ ｉでの最終光学濃度が０．５になるまで１０　＋＊Ｍ　Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４中に再懸 濁させた。イー・コリ培養の細胞４００μｍの１１個のアリコートをそれぞれ４ ０μｌのバクテリオファージ粒子と混合し、３７℃で１５分間インキユベートシ た。各混合物を８００μｌのＬ−ブロスに加え、振とう器上３７℃で１時間イン キュベートし、１２０００Ｘｇで２分間遠心分離して該細胞をペレット化した。

各細胞ベレットを１００μｍのＬ−ブロス中に再懸濁し、１０Ｍｇ／ｍｌテトラ サイクリンで補足された１個のし一寒天（Ｌ−ブロスについてであるが１．５％ 寒天を含有する）平板上に広げた。該平板を３７℃で約１６時間インキュベート した。テトラサイクリン（１０Ｍｇ／ｍｌ）を含有するし一寒天平板に８００コ ロニーを取り、各平板が５０コロニーを有するようにした。これらの平板を３７ ℃で約１６時間インキュベートし、ついで各平板をテトラサイクリンを含有する ２Ｌ−寒天平板へのレプリカ平板法に付し、３７℃で約１６時間インキュベート した。１６個の平板の２組からの結果によると、これらの組は、イー・コリにお けるアグロバクテリウム８０／４４−２Ａ　ＤＮＡのゲノムライブラリーのコピ ーであった。

実施例３ カルバモイラーゼ活性を特徴づけるクローンの単離イー・コリＡＧＩにおけるプ ラスミドｐｃＰ１９中のアグロバクテリウム８０／４４−２Ａ　ＤＮＡのゲノム ライブラリーを表す８００コロニー（実施例２）の１組を、Ｎ−カルバモイル− ｐ−ヒドロキシフェニルグリジン（Ｎ−ｃａｒｂ、）をＤ（−）ｐ−ヒドロキシ フェニルグリジン（Ｄ（−）ＨＰＧ）に変換する能力についてスクリーニングし た。該ライブラリーの１個の平板の半分（すなわち２５個の異なるコロニー）か らの細胞を、８００μｍの検定緩衝液を含有するミクロセントリヒュージ試験管 中にこすり落とした。該検定緩衝液は、１％Ｎ−ｃａｒｂ、、１０１１Ｍリン酸 緩衝液、０．００１２％フェノールレッド（Ｎ−ｃａｒｂ、溶液１００−１当た り２％溶液０．６ＩＩｌ）の、ＮａＯＨでｐＨ６，７に調整された溶液であった 。この溶液は黄色であった。チューブの内容物を混合し、チューブを水浴中４２ ℃で２４時間インキュベートした。Ｎ　−ｃａｒｂ、からＤ（−）ＨＰＧへの変 換により、アンモニアが発生しく図２）、これはｐＨを上昇させ、該変換はフェ ノール・レッドが黄色から挑赤色へ変色することにより感知できた。３２本の試 験管のうちの１本が桃赤色に変色した。この試験管に対応する２５個のコロニー を、重複ライブラリーの対応する平板から、テトラサイクリンを含有するし一寒 天平板上に再度線状に塗り、３７℃で約１６時間インキュベートした。各再スト リークからの１白金耳の細胞を、上記フェノール・レッド試験を用いてカルバモ イラーゼ活性について試験した。２５コロニーのうちの１つが桃赤色を生じた。

該反応試験管を１２０００Ｘｇで２分間遠心分離して該細胞をぺ１ノット化し、 上清をＨＰＬＣにより検定してＤＣ−）ＨＰＧが存在することを確認した。カル バモイラーゼ活性をコードするクローンは、ナショナル・コレクシタン・オブ・ インダストリアル・アンド−マリーン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃ ｔｅｒｉａ）（スコツトランド、アバディーン）に１９８９年４月２６日に受託 託に関するブタベスト条約に基づき行った。

実施例４ エンエリキア・コリＮＣＩＭＢ４０１３３からのｐｃＡＲｌの単離および同定１ ０μｇ／ｍｌテトラサイクｌルを含有するし一ブロス４００１１１にイー・コＩ ＪＮｃＩＭＢ４０１３３の培養（実施例３）を接種し、旋回インキュベーター中 、３７℃で約２０時間インキュベートした。該培養を約６０００Ｘｇ、４℃で１ ０分間遠心分離し、生じた細胞ペレットを２．５＋ａｌの２５％ンヨ糖、５０ｍ Ｍト１ノスーＨＣ１（ｐＨ８，０）に再懸濁した。１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶 液０．５＋ａｌを加え、該混合物を氷上で１０分間インキュベートした。０．２ ５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）１ｍ１をリゾチーム処理細胞に加え、ついで溶 菌溶液（０，２５％ト１ノトンＸ−１００；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８， ｏ；および６２．５■ｌＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）を加えた。これら溶液を混 合し、氷上でさらに５〜１０分間インキュベートして細胞を溶菌した。溶菌細胞 を約３８０００ｘｇ、４℃で３０分間遠ＩＣ１分離し、８゜Ｑｍｌの上清を８． ４ｇのＣｓＣ１に加えた。ＣｓＣ１が溶解したら、１．Ｑｍｌの５　ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウム溶液を加え、該混合物を１６Ｘ７６ｍｏのボＩＪアロマ−チュー ブ［ベンクマン・インスツルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）’、ノ（口・アルド（Ｐａｌ。

＾１ｔＯ）、カリフォルニア州９４３０４］に移した。該試験管を封管し、約１ ８５０００ｘｇで６０時間遠心分離した。生じたプラスミド帯を紫外線で可視イ ヒし、２１番径の針のついたンリンノを用いて該ＤＮＡを取り出しｔこ。５ＭＮ ａＣ１で飽和させたイソプロパツールで数回抽出することにより、該ＤＮＡ溶液 力１ら臭イヒエチ功ムを除去した。回収した水層をＴＥ緩衝液の３回の変化１こ 対してそれぞれ１時間透析し、緩衝化フェノール／クロロホルムで抽出し、タロ ロホルムで抽出し、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールを加えることによりＤＮＡを沈 殿させた。該プラスミドＤＮＡ（約５０μｇ）を、５００μｍのＴＥＩ＝再懸濁 しｌ二。このプラスミドをｐＣＡＲｌと称した。制限部位地図を図３に示す。

実施例５ プラスミドｐＣＡＲ６の作製 約４μｇのプラスミドｐＣＡＲ１（実施例４）を３７°Ｃで３時間、世ｄ　ＩＩ Ｉ消泳動することにより１９％低融点アガロースゲル（ギブコＢＲＬ）上で分画 した。約１２ｋｂｐのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片を含有するゲルの１部を切り出し、 １０分間６５℃に加熱することにより融解し、約３７℃に冷却し、緩衝化フェノ ール（トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）でｐＨ約７に緩衝化されたフェノール） で２回抽出した。

回収した水層を緩衝化フェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出 し、０．１容量の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよび２．５容量のエタノールで処理した。

該混合物を一２０℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを沈殿させ、ミクロセン トリヒュージ試験管中、１２０００ｘｇで５分間遠心分離することによりペレッ ト化し、２０μｌのＴＥに再溶解した。

ｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ消化、ＣＩＡＰ処理ｐｃＰ１９ＤＮＡ　（実施例２）約１６ μｇおよびｐｃＡＲｌ　（上記参照）からの約１２ｋｂｐの町ｄ　ＩＩＩ断片０ ．６μｇを、全容量２０μ１（７）ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で合わせた。１単位 のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、該混合物を１２℃で約１６時間インキュベート した。

イー・コリＨＢＩＯＩ　［エイチ・ボイヤー（Ｈ，Ｂｏｙｅｒ）およびディー・ ローランドードゥソイクス（Ｄ、　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ）　、ジ ャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー０ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　４１　（１９６９）　４５９］を、ｓｏｏｎｍ のＯ，Ｄが釣鉤５になるまで、５０＋ａｌのＬ−ブロス中３７℃で旋回インキュ ベーター上で増殖させた。１５００Ｘｇ、４℃で７分間遠心分離することにより 該細胞をペレット化し、４ｍｌ　１００ｍＭ　ＭｇＣ１□中に再懸濁し、再度ペ レット化し、２ｍｌの１００ｍＭ　ＣａＣｌ２中に再懸濁し、再度ペレット化し 、２■ｌの１００ｍＭ　ＣａＣ１，中に再懸濁した。これらの細胞を氷上で１時 間保った。イー・コリ細胞の形質転換は以下のとおり行った。１０μｍの連結反 応混合物を２００μｌの細胞に加えた。該混合物を氷上で３０分間インキュベー トし、４２℃で２分間インキュベートし、８００μｍのＬ−ブロスを加え、３７ ℃で３０分間インキュベートした。この混合物の希釈物を、１０Ｍｇｍｌ−’テ トラサイクリンで補足されたし一寒天平板上に広げ、該平板を３７℃で１６時間 インキュベートした。２０個のテトラサイクリン耐性コロニーを、１０Ｍｇｍｌ 　−’のテトラサイクリンで補足されたし一寒天平板上に再度線状に塗り、３７ ℃で−夜インキュベートした。１白金耳の細胞を各平板からこすり落とし、実施 例３に記載の「フェノール・レッド試験」によりカルバモイラーゼ活性について 試験した。２０個の単離物のうちの１５個がカルバモイラーゼ活性について陽性 であった。

２０個の単離物のそれぞれから、以下のとおりプラスミドＤＮＡを単離（小規模 で）した。ミクロセントリヒュージ試験管中の５０■Ｍグルコース、２５ｍＭ１ −リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１０＋ａＭ　ＥＤＴＡの１００μｌ中へ平 板から細胞をこすり落とし、渦を起こして混合し、室温で５分間インキュベート した。０．２ＭＮａＯＨと１％ドデシル硫酸ナトリウムとの新鮮な混合物２００ μｍを加え、該チューブをひっ（つかえして内容物を混合し、氷上で５分間イン キュベートした。酢酸でｐＨ４，８に調整した３Ｍ酢酸カリウム１５０μｍを試 験管に加え、試験管をひつくりかえすことにより内容物を混合し、試験管を氷上 で５分間インキュベートした。試験管を１２００Ｘｇで２分間遠心分離し、回収 した上清を緩衝化フェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、 回収した水層を８００μｌの冷（−２０℃）エタノールで処理した。試験管の内 容物を混合し、室温で２分間インキュベートし、試験管を１２０００Ｘｇで２分 間遠心分離して核酸をペレット化した。該ペレットをＴＨに溶解し、１部をプラ スミドＤＮＡの制限地図を確認するための制限酵素消化に使用した。該プラスミ ドＤＮＡの制限酵素消化から判断すると、試験した２０個の単離物のうち、カル バモイラーゼ酵素を全く生成しなかった５個の単離物はｐｃＰ１９　ＤＮＡを含 有していた。カルバモイラーゼ酵素を与えた全１５個は、ｐｃＡＲｌからの１２ ｋｂｐ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を有するプラスミドを含有していた。該プラスミ ドＤＮＡは２個の型のうちの１個であり、該プラスミドベクターの残りの部分と 比較して、１２ｋｂｐのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片の配向のみが相違していた。カル バモイラーゼ活性を有するイー・コリの単離物のうちの１つを、１０μｇｍｌ− ’テトラサイクリンで補足されたＬ−ブロス４ＱＱａ＋１中、３７℃で旋回イン キュベーター上で一夜インキュベートした。実施例４に記載の方法を用いて、プ ラスミドＤＮＡをこの培養から単離した。このプラスミドをｐＣＡＲ６と称した 。制限部位地図を図４に示す。

実施例６ プラスミドｐｃＡＲ１２の作製 プラスミドベクターｐｌＪ２９２５　（図５）はｐＵｃ１８［フーチング−（Ｎ 。

ｒｒａｎｄｅｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）λ旦（１９８３）１０１−１０６コに 類似しているが、それはｌａｃ　Ｚ　’遺伝子の５°末端付近の複数のクローニ ング部位に異なるポリリンカーを有している。ｐＨ２９２５ＤＮＡ２μｇを、１ ００μｍのジッロエ消化緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ５ｐＨ８，ｏ　：　１ ０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ；　１００ｍＭ　ＮａＣ１）中、１０単位のＢａｍＨＩ　（ ギブコーＢＲＬ）で３７℃で３時間消化した。１単位のＣＩＡＰを加え、３０分 間インキュベートを続けた。５μｌの１０％ＳＤＳを加え、該混合物を約６８℃ で１５分間インキュベートした。ついで該混合物を室温に冷却し、緩衝化フェノ ール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、０．１容の３Ｍ　Ｎａ０ Ａｃおよび２．５容のエタノールを加えることにより沈殿させた。−２０°Ｃで １時間インキュベートした後、該試験管を１２０００ｘｇで５分間遠心分離し、 該ＤＮＡベレットを１０μｌのＴＥに再溶解した。

触３人工消化緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ７，４；　５１１１Ｍ　Ｍｇ Ｃ１１，５０ｍＭＫＣＩ）中、約２０μｇのｐＣＡＲ６ＤＮＡを１ｚ単位のジ卑 ３ＡＩ　（ギブコーＢＲＬ）で３７℃にて１〜３０分間消化して、制限酵素の認 識部位の幾つかの（すべてではない）位置で切断した。アリコートを取り出し、 フェノール／クロロホルム抽出により反応を停止することにより、消化の進行を 監視した。臭化エチジウムを含有するＴＨＥ緩衝液中０．８％アガロースゲル上 で電気泳動することにより、回収したＤＮＡサンプルの１部を分画し、紫外線を 用いてＤＮＡ帯を可視化した。ＤＮＡ断片のほとんどが１〜５ｋｂｐの範囲のサ イズである１つのアリコートからのＤＮＡを、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールを用 いて沈殿させ、２０μＩＴＥに再溶解した。

響［ＩＩ消化、ＣＩΔＰ処理ｐＩＪ２９２５　ＤＮＡ約０５μｇφ恕３＾工で部 分消化したｐＣＡＲ６のＤＮＡ　１μｇとをＤＮＡリガーゼ緩衝液１２μｌ中で 混合した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの１単位を加え、該混合物を１２℃で１６時間 インキュベートした。

実施例５のイー・コリＨＢＩＯＩについて記載したと同様の方法で、イー・コリ ＤＨ５α（ギブコーＢＲＬから得た）の培養を増殖させた。この培養からの細胞 をＭｇＣ１，およびＣａ　ＣＬ　！で処理し、ついで連結ＤＮＡで形質転換した 。５０μ１（ＩＰＴＧ、ギブコーＢＲＬから）および４０μｇｍド１５−ブロモ ー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトピラノシド［Ｘ−ガル（ｇａｌ ）　、ギブコーＢＲＬから］を含有するし一寒天平板上で形質転換株を選択した 。Ｘ−ガルを青色化合物に変換せず、したがって恐らく、プラスミド上の１ａｃ Ｚ’遺伝子を崩壊させるｐＨ２９２５のポリリンカー中に挿入を含有する約３０ ０の「白い」コロニーが、５０μｇｍｌ−’アンピシリンを含有するし一寒天平 板上に斑点となり、これを３７℃で一夜増殖させた。１平板当たり２５個の斑点 があり、重複平板を作った。平板の１組を用いて、実施例３記載の方法によりカ ルバモイラーゼ酵素活性を試験した。２５個の斑点からの細胞を各試験管中で試 験した。１２本の試験管のうちの１本が陽性であった。問題の平板からのコロニ ーを再度線状に塗り、−夜増殖させ、カルバモイラーゼ活性についてそれぞれ試 験した。２５コロニーのうちの１つが陽性であった。５０μｇｍｌ−’アンピシ リンで補足したＬ−ブロス４００ｍ１にこのクローンの培養を接種し、ついで旋 回インキュベーター中３７℃で約２０時間増殖させた。実施例４に記載の方法を 用いて、プラスミドＤＮＡをこの培養から単離した。このプラスミドをｐＣＡＲ １２と称した。図６に制限地図を示す。

実施例７ プラスミドｐｃＡＲ２１の作製 プラスミドｐｃＡＲ１２（実施例６）約２μｇを、星ＩＩ消化緩衝液（５０１１ ＭトリスＨＣＩ、ｐＨ８゜Ｏ；　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ４；　１００ｍＭ　ＮａＣ １）中、５単位の賄ＩＩＩ　（ギブコＢＲＬ）で３７℃で３時間消化した。ＴＨ Ｅ緩衝液中で電気泳動することにより、消化されたＤＮＡを０，９％低融点アガ ロースゲル上で分画した。

約１．９　ｋ　ｂ　ｐＢｇｌＩＩ断片を含有するゲルの１部を切り、実施例５に 記載の方法を用いて該Ｄ　Ｎ　Ａを回収した。

このＤＮＡ断片約０５μｇを、全容量１２μｍのＤＮＡリガーゼ緩衝液中、胎Ｈ Ｉ消化、ＣＩＡＰ処理ｐ　Ｉ　Ｊ２９２５ＤＮＡ　（実施例６）約０，５μｇと 混合した。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１単位を加え、該混合物を１２℃で約１６時間インキユベ ートシ、ついでイー・コリＤＨ５αを形質転換するために使用した。該細胞をア ンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ガル（実施例６）で補足されたＬ−寒天平板上 に広げ、３７℃で一夜インキユベートした。４個の「白色の」コロニー（実施例 ６参照）を、アンピンリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ガルを含有するし一寒天平板上 に再度線状に塗り、３７℃で一夜増殖させ、実施例５記載の方法を用いていくつ かの細胞について小規模プラスミドＤＮＡ調製を行った。ＤＮＡの１部を制限酵 素で消化して、プラスミドの制限地図を確認した。ｐｃＡＲｌ２からの約１．９ ｋｂｐ断片およびｐＨ２９２５からのポリリンカー配列から予想されるとおり、 試験した４個のコロニーのうちの３個は約２ｋｂｐの当σＩＩ断片を含有してい た。

「フェノール・レッド試験」　（実施例３）を用いてこれらの３コロニーからの 細胞をカルバモイラーゼ活性について試験した。試験はすべて陽性であった。５ ０μｇｍｌ”アンピンリンを含有するし一ブロス４００ｍ１に、３個の「陽性」 クローンの１つの培養を接種し、旋回インキュベーター中３７℃で約２０時間増 殖させた。実施例４に記載の方法を用いて、この培養からプラスミドＤＮＡを単 離した。

このプラスミドはｐｃＡＲ２１と称した。図７に制限地図を示す。

実施例８ ｐＣＡＲ２７およびｐＣＡＲ２８の作製プラスミドｐｃＡＲ２１約２μｇを、腹 ｄｌＩＩ消化緩衝液中、５単位の抛ｄＩＩＩで３７℃で３時間消化した。ＴＢＥ 緩衝液中で電気泳動することにより、０．９を抽出し、該ＤＮＡを２０μＴＥに 溶解した。

Ｍ１３ｍｐ１９［フーチング−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）　、ケンペ（Ｋｅｍｐｅ ）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６　（１９８ ３）１０１　１０６］複製型（ＲＦ）ＤＮＡ約１μｇを、防ｄＩＩＩ制限緩衝液 中、５単位の町ｄＩＩＩで３７℃で３時間消化した。該混合物を緩衝化フェノー ル／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、３Ｍ　Ｎａ０Ａｃおよびエ タノールを用いて、回収された水層からＤＮＡを沈殿させた。遠心分離によりＤ ＮＡを集め、２０μＩＴＥに再溶解させた。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、該混合物を１２℃で１６時間インキュベート した。

イー・コリＤＨ５αＦ’　（ギブコーＢＲＬから得た）の培養を、実施例５でイ ー・コリＨＢＩＯＩについて記載したと同様の方法で増殖させた。この培養から の細胞をＭｇＣｌ２およびＣａＣ１＋で処理しく実施例５に記載と同様）、氷上 で２時間インキュベートした。イー・コリ細胞のトランスフェクションを以下の ようにして行った。２００μｍの細胞に０．５μｍまたは４μｌの連結反応混合 物を加え、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で２分間インキュベートし 、室温で１５分間インキュベートした。イー・コリＤＨ５α゛の一夜培養物１０ ０μｍ、２％Ｘ−ガル３０μｍおよび２．５％ＩＰＴ０３０μｍを、細胞および ＤＮＡの混合物に加えた。Ｌ−ブロスおよびＬ−寒天（４８〜５０℃で溶融状態 に保つ）の１：１混合物２．５ｍｌにこの混合物を加え、素早く混合し、ついで Ｌ−寒天平板上に注いで、全平板を横切る薄層を得た。該平板を３７℃で一夜イ ンキユベートした。

青色（Ｘ−ガル上β−ガラクトシダーゼ活性により生じた）および「白色」　（ すなわち青でない）のプラークの混合物は、ＤＨ５ａＦ’細胞の菌叢上で見るこ とができた。該ＨｉｎｄＩ１１部位はＭ１３ｍｐ１９の１ａｃＺ’遺伝子内にあ った。したがって、この部位におけるＤＮＡの挿入は胆り゛遺伝子を不活性化し 、したがってかかるＭ１３ｍｐ１９誘導体で感染したＤＨ５αＦ′約５αＦ′る β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化するであろう。イー・コリＤＨ５αＦ′を Ｌ−ブロス中３７°Ｃで約１６時間増殖させた。得られた培養をＬ−ブロスで１ ・１００に希釈し、「白色」プラークをこの希釈培養ｌ１１１に接種し、旋回イ ンキュベーター（約３０Ｏｒｐｍ）上で約５時間インキュベートした。該培養を ミクロセントリヒュージ試験管に移し、１２０００ｘｇで３分間遠心分離して該 細胞をペレット化した。該上清を４℃で保存した。実施例５に記載のプラスミド 単離のための小規模方法を用いて、細胞の各サンプルからＲＦ　ＤＮＡを単離し た。これらのプラスミドの制限酵素消化により、Ｍ１３ｍｐ１９にいずれかの配 向で挿入された。ｐＣＡＲ２１からの約１．９ｋｂｐの断片を含有する２個の単 離物が同定された。これらのプラスミドが単離されたそれぞれの培養からの上清 ８００μｍを、イー・コリＤＨ５αＦ′の一夜培養物４ｍｌを含有するＬ−ブロ ス４００＋＊１に別々に接種した。

該上清はバクテリオファージ粒子を含有する。これらをＤＨ５αＦ′約５αＦ′ させ、該細胞の内部に二本鎖のＲＦ　ＤＮＡを得てもよい。該４００ｍ１培養の それぞれを３７℃で２０時間増殖させ、実施例４に記載のとおり処理してプラス ミド（ＲＦ）ＤＮＡを精製した。該プラスミドの制限酵素消化により、該プラス ミドの構造が確認された。一方の培養からのプラスミドをｐＣＡＲ２７（図８） と称し、他方の培養からのプラスミドをｐＣＡＲ２８（図９）と称した。

実施例９ ｐＣＡＲ２７およびｐＣＡＲ２８におけるアグロバクテリウムＤＮＡのヌクレオ チド配列の決定 プラスミドｐＣＡＲ２７およびｐＣＡＲ２８を同様に処理して、欠失クローンお よび配列決定のための鋳型を得た。

ＲＦ　ＤＮＡ約８μｇを、２０１１Ｍ）リスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、５＊Ｍ 　ＭｇＣ１＊、５０ｍＭＫＣｌの１００１１１中、１０単位のＫｐｎｉおよび１ ０単位のＢａｙａＨｌで消化した。フェノール／クロロホルム抽出により該ＤＮ Ａを精製し、０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃの存在下、エタノールを用いて沈殿させた。

ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）　［ジーン（Ｇｅｎｅ）２８　（１９８４）３５ １　３５９］により記載されている方法を用いて、回収されたＤＮＡをエキソヌ クレアーゼＩＩＩで処理して該プラスミド中のアグロバクテリウムＤＮＡ中に欠 失させた。連結生成物を用いて、実施例８に記載の方法を用いてイー・コリＤＨ ５αＦ°の細胞をトランスフェクトした。配列決定反応に用いる鋳型ＤＮＡは以 下のようにして調製した。

「白色」のプラークをそれぞれ、イー・コリＤＨ５αＦ’　（実施例８参照）の 培養１ｍｌに接種し、激しく振とうしながら（３００ｒｐ＋＊）　３７℃で５〜 ６時間増殖させ、ついで遠心分離により該細胞をペレット化した。上清８００μ ｍを、２Ｏ％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）　、２．５Ｍ　ＮａＣ １（７）１５Ｃ１μｍを含有する新鮮な試験管に移し、混合し、室温で１２分間 インキュベートした。

該試験管を１２０００Ｘｇで５分間遠心分離してバクテリオファージ粒子をペレ ット化し、上清を捨てた。該試験管を再度平炉に遠心分離し、残りすべての上清 を取り出し、１０１１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、０．１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　（ｐＨ８，０）の１００μｍにペレットを再懸濁した。フェノール（１０ ０１１Ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０でｐＨ７に緩衝化されている）５０μｌ を加え、混合し、該試験管を室温で５分間インキュベートした。該試験管を１２ ０００ｘｇで３分間遠心分離し、水層を新鮮な試験管に移し、クロロホルムで抽 出し、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールで処理してＤＮＡを沈殿させた。遠心分離に よりＤＮＡを回収し、１６μｍの水に溶解した。このＤＮＡはＭ１３バクテリオ ファージ粒子からの一本鎖ＤＮＡであり、配列決定反応の「鋳型」として使用し た。ンークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）酵素［ユナイティノド・スティン・ バイオケミカル・コーポレーション（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　、クリーブランド、オハイオ州４４１ ２２、ＵＳＡ］により、該酵素を含有するキットで供給される方法を用いて配列 決定を行った。いくつかの鋳型を配列決定してｐＣＡＲ２７挿入の完全な配列を 得た。

ｐＣＡＲ２８の欠失からの鋳型を用いて、反対方向の断片の配列を決定した。Ｄ ＮＡ　Ｓ　ＴＡ　Ｒインク［マジラン（Ｍａｄｉｓｏｎ）　、ウィスコノンン州 ５３７１５、米国コからのソフトウェア−を用いて、両方向からの配列を比較し 、アグロバクテリウムＤＮＡ　１８８０ｂｐについての共通性を得た。この共通 性を、推定されるカルバモイラーゼ酵素のアミノ酸配列と共に図１０に示す。

実施例１０ ｐＣＡＲ２９の作製 ｐＣＡＲ２８（実施例８、図９）のＲＦ　ＤＮＡ約２μｇを、２０ｍＭ）リスＨ Ｃ１（ｐＨ７，４）　、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭＫＣｌの５０μｍ中、５ 単位のＢｓｐＨＩ［ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、米国マサチューセノノ州０１９１５ビバリー］で消 化した。フェノール／クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出により該ＤＮＡ を精製し、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールを用いて沈殿させ、遠心分離により回収 し、ＩＱ＠ＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、１０＠Ｍ　ＭｇＣｌ２．５０ｍ ＭＮａＣ１，５０μｇｌｌｌ−’ウン血清アルブミン、１０ｍＭ２−メルカプト エタノールの４０μｌに再溶解した。２５０μＭデオキシグアノシン三リン酸、 ２５０μＭデオキシーチミジン三リン酸および２５０μＭデオキシシチジン三リ ン酸の混合物１μｌを加え、ついでイー・コリＤＮＡポリメラーゼ（ギブコーＢ ＲＬ）の「フレノウフラグメント」２単位を加えた。該試験管を３７℃で１０分 間インキユベートシ、フェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出 した。回収した水層をＮａ０Ａｃおよびエタノールで処理してＤＮＡを沈殿させ 、遠心分離により回収し、５０μｍＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１０ ■Ｍ験管を３７℃で３時間インキュベートした。ＴＨＥ緩衝液中で電気泳動する ことにより、消化されたＤＮＡを０．９％低融点アガロースゲル上で分画した。

９９０ｂｐ断片を含有するゲルの部分を切り、実施例５に記載の方法を用いてア ガロースセグメントからＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを２０μｍの水に再溶解し た。

ｐＴＲ５５０（図１１）は、ジー・エム・ビーーｏ−レシス（Ｇ、　Ｍ、　Ｐ、 　Ｌａｗｒｅｎｃｅ）博士［スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティ カルズ、グレート・バーブ（Ｇｒｅａｔ　Ｂｕｒｇｈ）　、ニブツム、サリー、 英国コにより作製されたプラスミドベクターであり、それはｐＫＫ２２３−３　 ［ファルランアＬＫＢバイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ）　、Ｓ　−７５１８２ウプサラ、スウェーデン］の誘 導体である。ｐＴＲ５５０においては、ｐＢＲ３２２由来のｐＫＫ２２３−３の ほとんどがｐＡＴ１５３からのＤＮＡで置換されている。ｐＴＲ５５０約１μｍ を、２０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５Ｑ＋ｏ ＭＫＣ１の３０μｍ中、５単位の制限酵素ＳｍａＩ　（ギブコーＢＲＬ）により ３７℃で３時間消化した。消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルムおよびク ロロホルム抽出により精製し、Ｎ　ａ　ＯＡ　ｃおよびエタノールを用いて沈殿 させ、遠心分離により回収し、５単位のＨｉｎｄＩＩＩを含有する５ＱｍＭトリ スーＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍＭ　ＮａＣ１の ３０μｍに再溶解した。該混合物を３７℃で３時間インキュベートし、フェノー ル／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、回収された水層をＮａ０Ａ ｃおよびエタノールで処理してＤＮＡを沈殿させた。

遠心分離によりＤＮＡを集め、２０μｌの水に再溶解した。

ジ甲工およびＨｉｎｄＩＩＩの両方で消化されたｐＴＲ５５０ＤＮＡ約０．５μ ｇをｐｃＡＲ２８からの９９０ｂｐ断片（カルボキシラーゼ遺伝子の始めのＢｓ ｐｔｌＩ部位から配列決定されたＤＮＡの末端の）ｌｉｎｄＩＩｒ部位まで）約 ０．２μｇと、ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｍ中で混合した。Ｔ４ＤＮＡリガー ゼの１単位を加え、該混合物を１２℃で約１６時間インキュベートした。

イー・コリＪＭ１０１　［メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、リコンビナントＤ ＮＡ　・テクニカル・ブレティン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈ ｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）（Ｎ　Ｉ　Ｈ）　２、Ｎｏ、２．４３〜４８頁 （１９７９）］の培養を増殖させ、実施例５におけるイー・コリＨＢＩＯＩにつ いて記載と同様の方法により、該細胞をＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２で処理した 。実施例５に記載のとおり、連結混合物ＤＮＡで該細胞を形質転換した。該細胞 の希釈物を、５０μｇｏｌ−’アンピンリンを含有するし一寒天平板上に広げ、 ３７℃で一夜インキユベートした。２２個のアンピシリン耐性コロニーを、５０ μｇｍｌ　−’アンピノリンを含有するし一寒天平板上に再度線状に塗り、３７ ℃で一夜インキユベートし、ついで実施例５に記載の方法を用いて、これらの単 離物のそれぞれの細胞について小規模のプラスミドＤＮＡの調製を行った。ＤＮ Ａ調製物の制限酵素消化により、所望の作製物である１個のプラスミドが示され た。このプラスミドを含有する単離物を、５０μｇｍド１アンピンリンを含有す るし一ブロス４００ｍ１に接種し、旋回インキュベーター上３７℃で一夜増殖さ せ、実施例４に記載の方法を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。制限酵素消化 により、このプラスミドの正確な構造が確認された。該プラスミドをｐＣＡＲ２ ９と称した（図１２）。

実施例１１ ｐＣＡＲ２９を含有するイー・コリＪＭＩＯＩにおけるカルボキシラーゼの発現 ｐＣＡＲ２９（実施例１０）を含有するイー・コリＪＭＩＯＩを、５０μｇ＋ｍ ｌ−’のアンピシリンを含有するし一ブロス１０ｍ１に接種し、旋回インキュベ ーター上３７℃で一夜増殖させた。２５０＋ｅｌの円錐フラスコ中、この培養の ６００μｍを、５０μｇｍｌ　−’のアンピノリンを含有するし一ブロス６ｏ■ ｌに接種し、旋回インキュベーター上３７℃でインキュベートした。２時間後（ ６００ｎ−の光学温度約０．３）、最終濃度１ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、 さらに３時間増殖を継続した。培養中のイー・コリ細胞はカルボキシラーゼ活性 を有していた。上記の方法により増殖させた、１）ＴＲ５５０を含有するイー・ コリＪＭＩＯＩの細胞は、カルボキシラーゼ活性を全く有さながった。

実施例１２ イー・コリからアグロバクテリウムへのｐｃＡＲｌの転移プラスミド転移に必要 な機能を付与する「ヘルパー株」としてのイー・コリ（ｐＲＫ２０１３）との細 菌の接合を含む三親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　＋ｍａｔｉｎｇ）により、 プラスミドｐＣＡＲ１をイー・コリからアグロバクテリウムに転移させた。アグ ロバクテリウム１５−１０は、紫外線を用いた突然変異誘発によるアグロバクテ リウム８０／４４−２Ａ由来の株である。アグロバクテリウム１５−１０の培養 １０ｍ１をＬ−ブロス中、旋回インキュベーター上３０’Ｃで約２０時間増殖さ せた。

イーーコ１ＪＡＧ１　（ｐｃＡＲＩＸ実施例３参照）　（Ｄ培１１１０　ｍｌを 、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するし一グロス中、旋回インキュベー ター上３７℃で約１６時間増殖させた。イー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＲＫ２０１ ３）［フィブルスキー（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ）およびヘリンスキー（ｌｌｅｌｉｎ ｓｋｉ）　、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンスＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ ＾ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　ＵＳＡ）７６　（１９７９）１６４ ８−１６５２１を、５０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンを含有するＬ−ブロス中、 旋回インキュベーター上３７℃で約１６時間増殖させた。各培養８００μｍを細 孔径ｏ、４５μ−の１個の無菌ＨＡフィルター［ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）　、ブラックモア・レイン（Ｂｌａｃｋｍｏｏｒ　Ｌａｎｅ）　、ワットフォ ード（Ｗａｔｆｏｒｄ）　、ＷＤ　１８　ＹＷ、英国］で濾過した。ついで、培 養からの細胞を保持するフィルターをＬ−寒天平板の表面に載せ、３０℃で２４ 時間インキュベートした。フィルターを平板の表面から除いてｌ１１１の無菌食 塩水リン酸ＩＩ衝液を含有するねじ歪式容器に移し、該容器を振とうしてフィル ターからの細胞を再懸濁した。１００μｌのこの溶液、および食塩水リン酸緩衝 液中の希釈液を、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍ ｌテトラサイ’）’）　ンを含有する最少培地［ＭＭ：　１ｇ　ＫＨ２ＰＯ４， １ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４，０゜５ｇ　Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７ＨｚＯ，０，１ｇ　ＣａＣ１１ Ｈ２Ｈ！０．１５ｍｇ　ＭｎＳＯ４・４ＨａＯ，２０μ１ｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ ｚ０．５ｇグルコース、２ｇ　（ＮＨ４）！Ｓ！１４および１５ｇ寒天、５Ｍ　 ＮａＯＨでｐＨ７，０に調整］に入れた。イー・コリの親株は１００μｇ／ｅｌ ストレプトマイシンを含有するＭＭ上で増殖できないはずである。

アグロバクテリウム１５−１０は１０μｇ／＋ｉｌテトラサイクリンの存在下で 増殖しないはずである。したがって、ｐＣΔＲ１含有アグロバクテリウム１５− １０細胞のみがこの培地上で増殖するはずである。３０℃で５日間増殖させた後 、２５μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンおよび１０μｍ／ｍ１テトラサイクリ ンを含有するし一寒天平板上にコロニーを再度線状に塗り、３０℃でさらに３日 間インキュベートした。実施例５に記載の方法を用いて、４個の単離物からプラ スミドＤＮＡを調製した。該プラスミドＤＮＡの１部の制限酵素消化を用いて、 テトラサイクリン耐性のエクスコンジュガンツ（ａｘ−ｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ） （すなわち接合からの子孫）がｐｃＡＲｌを含有することを確認した。

実施例１３ イー・コリからアグロバクテリウムへのｐＣＡＲ６の転移この転移に用いた方法 は、実施例１２においてｐｃＡＲｌに関して記載したのと非常に類似したもので ある。交配の親はイー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＣＡＲ６）（実施例５参照）、イ ー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＲＫ２０１３）（実施例１２参照）およびアグロバク テリウム１５−１０　（実施例１２参照）であった。両方のイー・コリの親株は 栄養要求性突然変異体であるため、アグロバクテリウム１５−１０（ｐＣＡＲ６ ）コロニーについて選択するために、交配からの子孫は、１０μｇ／ｍｌテトラ サイクリン（ストレプトマイシンは全く含有しない）を含有するｋｉＭ上で平板 培養した。エクスコンジュガンツから単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素消 化の分析により、ｐＣＡＲ６の存在が確認された。

実施例１４ イー・コリからアグロバクテリウムへのｐｃＰ１９の転移この転移に用いた方法 は、イー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＣＡＲ６）でなくイー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐ ｃＰ１９）が交配における親株である以外、実施例１３においてｐＣＡＲ６に関 して記載したのと同じ方法である。エクスコンジュガンッから単離されたプラス ミドＤＮＡの制限酵素消化の分析により、エクスコンジュガンツ中のｐｃＰ１９ の存在が確認された。

実施例１５ ｐｃＡＲｌおよびｐＣＡＲ６に関連する特別の（ｅｘｔｒａ）ヒダントイナーゼ 活性の証明 アグロバクテリウム１５−１０　（ｐｃＡＲｌ）　、アグロバクテリウム１５− １０　（ｐＣＡＲ６）　およＵ７’ｆｏバ’）ｆ’）’ｙム１５−１０　（ｐｃ Ｐ１９）をそれぞれ、０１％アラニンヒダントインおよび１０μｇ／ｍｌクロラ ムフェニコールを含有するＡＪ−１ブロス５０Ｉ＋１１に接種し、旋回インキュ ベーク−中３０℃で２４時間増殖させた。ついで、培養のそれぞれを以下のとお り処理した。培１１５ｍ１がらの細胞を遠心分離により集め、細胞の湿！ｉ量を 測定した。５０＋１のねじ蓋式円錐フラスコ中、０２Ｍトリス中の１％Ｄ、Ｌ− ５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインの２０ｍ１に細胞を再懸濁し、水 浴中４２℃で振とうした。１０分間のインキュベートの後および３０分後、サン プルを取り出した。該細胞を遠心分離により回転させ、Ｄ−Ｎ−カルバモイルー ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの存在に関してＨＰＬＣにより上清を検定した 。３０分および１部分におけるＤ−Ｎ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニル グリノン生成物の量の差を用いて、細胞（湿重量）１ｇ当たり１時間当たりの生 成物μモルとしてヒダントイナーゼ活性を算出した。ｐｃＡＲｌまたはｐＣＡＲ ６を含有するアグロバクテリウム１５−１０についてのヒダントイナーゼ活性は 、ｐｃＰ１９を含有するアグロバクテリウム１５−１０についての活性より５〜 ６倍高く、これはｐｃＡＲｌおよびｐＣＡＲ６がヒダントイナーゼ活性コードす る遺伝子を含有することを示す。

実施例１６ プラスミドｐＣＡＲ２６の作製 プラスミドベクターｐＫＴ２１０　［バグダサリアン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）１旦（１９８１）２３７−２４７頁１図１３の地図］ は、広宿主域プラスミドＲ３ＦＩＯＩＯのクロラムフェニコール耐性誘導体であ る。ｐＫＴ２１０ＤＮＡ約２μｇを、ゆＲＩ消化緩衝液（５０℃Ｍ）リス−ＨＣ １，ｐＨ８，Ｏ：　１０謬Ｍ　ＭｇＣｈ；　１００ｍＭ　ＮａＣ１）中、５単位 のＥｃｏＲＩ　（ギブ：＋−ＢＲＬ）により３７℃で３時間消化した。消化混合 物の１部を電気泳動により分析した。消化は完全でなかったようであるが、１単 位のＣＩＡＰを加え、インキュベ−１・を３０分間続けた。消化混合物を０９％ 低融点アガロースゲル上に載せ、ＴＢＥ緩衝液中電気亦動することにより該ＤＮ Ａを分画した。線状化プラスミドＤＮＡに相当する約１１．４ｋｂｐのＥｃｏＲ Ｉ断片を含有するゲル部分を切り、実施例５に記載の方法を用いて該ＤＮＡを回 収した。

ゲル上、ＴＢＥ緩衝液中の電気泳動により、消化されたＤＮＡを分画した。約２ ６７ｋｂｐのＥｃｏＲＴ断片を含有するゲル部分を切り、実施例５に記載の方法 を用いて該ＤＮＡを回収した。

この約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片約０５μｇを、全量１２μｍのＤＮＡリガーゼ 緩衝液中、すＲＩ消化、ＣＩＡＰ処理ｐＫＴ２１０　ＤＮＡ約０５μｇと混合し た。

Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ１単位を加え、該混合物を１２°Ｃで約１６時間インキュ ベートした。

実施例５においてイー・コリＨＢＩＯＩについて記載したのと同様にして、イー ・コリＡＧＥ、（実施例２参照）の培養を増殖させた。実施例５と同様にして、 この培養からの細胞をＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２、ついで連結ＤＮＡで処理し た。細胞−ＤＮＡ混合物を、２５μｇｍｌ−’クロラムフェニコールで補足した し一寒天平板上に広げ、該平板を３７℃で１６時間インキュベートした。１７個 のクロラムフェニコール耐性形質転換体を、２５μｇ／［１１−ｌクロラムフェ ニコールを含有するし一寒天平板上に再度線状に塗り、３７°Ｃて一夜インキユ ベートした。各形質転換体の細胞１白金耳を該平板からこすり取り、「フェノー ル・レッド」検定緩衝液（実施例３）６００μｍに再懸濁した。４２℃で５時間 インキュベートした後、反応液のうちの３つが桃色を呈した。実施例５の小規模 方法を用いて、該試験において桃色に対応する培養からプラスミドＤＮＡを単離 した。該ＤＮＡ！Ｉｆｆ製物の制限酵素消化により、ｐｃＡＲｌ２からの約２． ７ｋｂｐの断片の存在が示された。該プラスミド調製物のうちの１つは、ｐｃＡ Ｒｌ２からの断片の２個の複製を有していた。このプラスミドをｐＣＡＲ２６と 称しな。さらに制限酵素消化は、ｐＣＡＲ２６がｐ　ＣＡＲ１２からのアグロバ クテリウムＤＮＡのすべてを含有する、すなわち、ｐｃＡＲｌ２からの断片はカ ルバモイラーゼ遺伝子（図６および１０参照）中のＥｃｏＲ工部位を越えてポリ リンカーのＥｃｏＲＩ部位へ伸びていることを示した。したがって、単離された 断片（約２．７ｋｂｐ）は部分消化ｐｃＡＲ１２由来であるにちがいない。ｐＣ ＡＲ２６の地図を図１４に示す。プラスミドｐＣＡＲ２６は完全なカルバモイラ ーゼ遺伝子の２個の複製を含有する。

実施例１フ イー・コリからアグロバクテリウムへのｐＣＡＲ２６の転移ｐｃＰ１９−誘導体 と同様、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を用いる接合により、ｐＫＴ２１０ に基づくプラスミドを転移させることができる。ｐＣＡＲ２６の転移に用いる方 法は実施例１２におけるｐｃＡＲｌについて記載したのと同様の方法であったが 、下記の修飾を施した。２５μｇｍｌ”クロラムフェニコールを含有するＬ−ブ ロス中、イー・コリＡＧＩ　（ｐＣＡＲ２６）を３７℃で１６時間増殖させ、イ ー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＲＫ２０１３）およびアグロバクテリウム１５−１０ を実施例１２に記載のとおり増殖させた。これら３個の培養からの細胞をフィル ターメート化（ｆｉｌｔｅｒ−ｍａｔｅｄ）　シ、ついで１０μｇｍド１クロラ ムフェニコールを含有するＭＭ上で平板培養した。５日後、増殖したコロニーを ２５μｇｍｌ　−’ストレブトマイノンおよび１０μｇｍｌ−’クロラムフェニ コールを含有するし一寒天上に再度線状に塗り、３０℃で３日間インキュベート した。実施例５に記載の方法を用いて１個の単離物からプラスミドＤＮＡを調製 した。このＤＮＡの制限酵素消化によりｐＣＡＲ２６の存在が確認された。

実施例１８ ｐＫＴ２１０の動繋化−欠陥誘導体の作製Ｐｆ１ＭＩ緩衝液（１００ｍＭ　Ｎａ Ｃ］　：　５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，９；　Ｉｆ）ｍＭ％ｑｇｃ１２ ；　１ｍＭジチオスレイ）・−ル、１００μｇｍｌ−’ウノ血清アルブミン）中 、約２μｇのｐＫＴ２１０を、３７℃で１６時間、５単位のＰｆｌＭＩ　にュー イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、 ｃ１０ン−−ビー・ラボラトリーズ私書箱２２号ビンヨノブス・ストートフォー ド、ハートＣＭ２３３ＤＨ（ｃｌｏｃＰＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｐ、　ｏ、 　Ｂｏｘ２２　Ｂ１５ｈｏｐ’　Ｓ　５ｔｏｒｔｆｏｒｄ、　Ｈｅｒｔｓ　ＣＭ ２３３ＤＨ）　）で■■■■B 消化されたＤＮＡを、０．７部％アガロースゲル上、ＴＢＥ緩衝液中電気泳動に より分画した。１０ｋｂ断片に相当するゲル部分を切り、モデルＵＥＡエレクト ロエリューター（Ｍｏｄｅｌ　ＵＥＡ　ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ）　［イン ターナ／ヨナル・バイオチクノロノーズ・インク（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　、私書箱９５５８号、ニュー ・＼ブノ、コネティカソト、ＣＴＯ６５３５］を用いて、機器マニュアルに記載 の条件によりＤＮＡを電気溶出により回収し、ついでイソプロパツールで、を殿 させ、ついで遠心分離してＤＮＡを集めた。ＤＮＡを３２μｌのＴＥに再溶解し 、１５０＋ｎＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）　、２５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍ Ｍ酢酸船、２５％グリセロールの混合物８μｍを加え、ついで２０単位のマング ビーン（ＩＩｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼにューイングランド・バイオラブ ズ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）　）を加えた。この混合物を３７ °Ｃで３０分間インキュベートした。これはＤ　Ｎ　Ａ断片上平滑末端を与える はずである。上記のとおり、消化されたＤＮＡを分画し該１０．５ｋｂｐ断片を 単離した。５μｍの５×連結緩衝液（ギブコーＢＲＬ）および１単位のＴ　４　 Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを加えた２　０７１１のＴＥ中に該ＤＮＡを再溶解した。連 結混合物を１２°Ｃでコロ時間インキュベートした。

実施例５に記載のとおり、イー・コＩＪＨＢＩＯＩを１０１ｚｌの連結混合物で 形質転換した。この混合物の希釈物を、２５μｇｍｌ”のクロラムフェニコール を含有するＬ−寒天平板上に広げた。この平板を３７°Ｃで４８時間インキュベ ートした。わずかの形質転換体しか得られず、これらは最初の選択平板上でゆっ くりと増殖した。２５μｇｍｌ”クロラムフェニコールを含有するし一寒天平板 上に１６個のコロニーを再度線状に塗り、３７℃で１６時間インキュベートし、 ついで該細胞をこすり落とし、迅速沸騰法（ｒａｐｉｄ　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｍｅ ｔｈｏｄＸホルメス、ディー・ニス（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、　Ｓ、　）およびク イグレイ、エム（Ｑｕｉｇｌｅｙ　Ｍ、　）　１９８１、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍｌ　１４　＋　ｐ１９３）の変法を用いて小規模調製を行った 。各形質転換体について、細胞をマイクロセントリヒュージ試験管中３００μｍ の５ＴＥＴ　［８％）−３糖ｗ／ｖ：０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ− １００ｗ／ｖ　；　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　５部ｍＭｈリスーＨＣ１，ｐＨ８ ，０］に再￥濁し、５ＴＥＴ中の３３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム］Ｏμｍを加えた 。該懸濁液を水上で３０分間インキユベートシ、ついで沸騰水浴中に３分間入れ た。該試験管を１５分間遠心分離し、平らの側面のつまようじでペレットを除い た。容量を５ＴＥＴで３３０μｍに調整し、さらに３３０μｌのイソプロパツー ルを加えた。該試験管を振とうして内容物を混合し、１０分間遠心分離し、上清 を捨てた。ペレットを乾燥し、ついで３０μｌのＴＥに再懸濁した。２μｍ分を 制限酵素で消化して各プラスミドの制限地図を決定した。５単位の供１を含有す る制限緩衝液リアクト（Ｒｅａｃｔ）　３　（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８、Ｏ：　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２；　１００１Ｍ　ＮａＣ１）の全量１０μｍ中 、３７℃で２時間、ら単離された断片が、ｐＫＴ２１０（図１３）の部分消化物 からの約１０．９ｋｂｐの断片を含むにちがいないことを示唆した。三親交配（ 実施例１７に記載と同様の方法を用いて行った）におけるｐＷＯＲ９０１の転移 頻度は、ｐＫＴ２１０の転移頻度に比べて約１０４〜１０５だけ減少したことが 判明した。２５μ四１−１のクロラムフェニコールで補足した５００ｏ１のＬ− ブロスにｐＷＯＲ９０１を含有するイー・コリＨＢＩＯＩの単離物を接種し、旋 回インキュベーター上３７℃で一夜インキ、ベートした。実施例４の方法により プラスミドＤＮＡを単離した。

実施例１９ ｐＷＯＲ９０１のアグロバクテリウム１５−１０へのエレクトロポレーションお よびｐＷＯＲ９０２の単離 約２００ｎｇのｐＷＯＲ９０１ＤＮＡ　（実施例１８）を用いて、高電圧エレク トロポレーション（ウエンージュン　ニス（Ｔｅｎ−ｊｕｎ、　Ｓ、　）および フォーデ、ビー・ジー（Ｆｏｒｄｅ　Ｂ、Ｇ、）１９８９．ニュークリーク・ア ノッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１７　 ：　Ｉ）　８３８５）によりアグロバクテリウム１５−１０を形質転換した。６ ００オームの抵抗を用いた場合に最大効率が得られた。１０μｇｍｌ−’のクロ ラムフェニコールを含有するＬ−寒天平板上で形質転換体を選択し、３０℃で４ 日間増殖させた。実施例１８に記載の迅速沸騰法を用いて、再度線状に塗られた 形質転換体コロニーの細胞から２２個の小規模プラスミドを調製した。

リアクト２制限緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，Ｏ；　１０ｍＭ　Ｍ ｇＣｌ、：５０ｍＭ　ＮａＣ１）中、プラスミドＤＮＡ上、３７℃で２時間、５ 単位のＰｓｔｌにより制限消化した。これらの結果から、種々の制限パターンが 認められた。異なる型のプラスミドの具体例を使用してイー・コリＨＢＩＯＩを 形質転換した（実施例５の方法を使用）。イー・コリの形質転換に使用した場合 、１個のプラスミドのみが安定なりロラムフェニコール耐性コロニーを与えた。

これらのクロラムフェニコール耐性コロニーから調製されたプラスミドＤＮＡの 消化により、さらに約５００ｂｐの欠失が生じたことが示された。この欠失によ り、ｐＷＯＲ９０１の町ＬＭＩ小断片が完全に除かれた。この新しいプラスミド をｐＷＯＲ９０２と称した。

イー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＷＯＲ９０２，）４００ｍｌの培養上、ＤＮＡの大 規模調製を行った。このＤＮＡはＰｆｌＭＩについての部位を有していなかった （図１６に示す地図）。エレクトロポレーションによる導入後、ｐＷＯＲ９０２ は、アグロバクテリウム１５−１０中に安定に維持されているようであった。し たがって、ｐＷＯＲ９０２は、安定で、ｐＫＴ２１０の動態化欠損（Ｍｏｂつ誘 導体であり、イー・コリおよびアグロバクテリウムにおける使用に適切である。

イー・コリＨＢ１０１　（ｐＷＯＲ９０２）は、ナショナル・コレクション・オ ブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄｌｉａｒｉｎｅ　Ｂ ａｃｔｅｒｉａ）　、アバディーン（＾ｂｅｒｄｅｅｎ）　、スコツトランド（ Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に、１９９１年１１月４日、受託番号ＮＣＩＭＢ４０４５１ にて寄託されている。

この寄託は、特許手続のための微生物の寄託に関するブタベスト条約に基づいて 行った。

実施例２０ ｐＣＡＲ４４の構築およびアグロバクテリウムの転移た後、アガロースゲル薄片 から１．９ｋｂの断片を電気溶出により単離した（実施例１８）。回収したＤＮ Ａを１０μｍのＴＥに再溶解した。

約０．５μｇのｐＷＯＲ９０２（実施例１９）を町ｄｌＩＩで消化し、ＣＩＡＰ 処理し、１０μｌのＴＥに再溶解した。多数の挿入を得るために、ベクターへの 過剰な断片（ｐｃＡＲ２１からの）を連結した。１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを 含有する全量１５μの連結緩衝液（ギブコーＢＲＬ）中、１２℃で約１６時間、 ０゜１μｌのカットｐＷＯＲ９０２および１０μｍの１．９ｋｂ断片を混合した 。５μｍの連結混合物を用いてイー・コリＨＢ１０１を形質転換しく実施例５に 記載と同様の方法を用いた）、２５μｇｍｌ−’のクロラムフェニコールを含有 するＬ−寒天平板上に細胞を広げ、３７℃で２日間インキュベートした。２４個 の形質転換体を２５μｇｍド１クロラムフェニコールを含有するし一寒天上に再 度線状に塗り、３７℃で一夜増殖させ、ついで平板から細胞をこすり落とし、小 規模なプラスミド調製に用いた（実施例１８）。挿入の数およびそれらの配向を 決定するために、各調製物からのＤＮＡのアリコート上でＥｃｏＲＩ消化を行っ た。消化ＤＮＡの分析により、５個のクローンがｐｃＡＲ２１からの断片の二重 の挿入を含有していることが示された。これらのプラスミドはすべて同一の挿入 配向を示し、この型のプラスミドをｐＣＡＲ４４（図１７の地図）と称した。１ ６個のクローンが、ｐＷＯＲ９０２中のｐｃＡＲ２１断片の１個の挿入を含有し ていた。イー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＣＡＲ４４）単離物（実施例４の方法）の うちの１個の５００加１の培養上、大規模なプラスミド調製を行い、このＤＮＡ の２００ｎｇを用いて、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム１５ −１０を形質転換した（実施例１９）。形質転換体を小規模なプラスミド調製に 付した。制限酵素消化によりｐ　ＣＡ　Ｒ４４の存在が確認された。

実施例２１ アグロバクテリウムにおけるｐＣＡＲ２６およびｐＣＡＲ４４に関連した余分の カルバモイラーゼ活性の証明 アグロバクテリウム１５−１０を５０ｍ１のＡＪ−１グロスに接種し、アグロバ クテリウム１５−１０　（＋）ＣＡＲ２６）およびアグロバクテリウム１５−１ ０（ｐＣＡＲ４４）をそれぞれ、１０μｇｍｌ−’クロラムフェニコールを含有 する５ＱｍｌのＡＪ−１１０スに接種した。全３個の培養を旋回インキュベータ ー中、３０℃で２４時間増殖させ、ついで各培養を以下のとおり処理した。１． ３６１１１の培養ブロスを、ミクロセントリヒュージ試験管中、１４０１．ｔｌ の１％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロミド（６５＋＋Ｍ　Ｎａ２ＨＰ ○４．３５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ２゜ｐＨ７，０中）と混合し、室温で１０分間イ ンキュベートした。この混合物５０μｍを、６５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ○４．３５ｍ Ｍ　ＮａＨｚＰ０４　（＋）Ｈ７，Ｏ；反応基貿を溶解後、ｐＨ７，０に再調整 ）中１．５％（Ｗ／Ｖ）Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリジ ン１．４５ｍ１を含有するマイクロセントリヒューン試験管に移した。試験管の 内容物を混合し、４８℃で２０分間インキュベートした。遠心分離により細胞を 集め、カルバモイラーゼ酵素により生産されたＤ　（−）　ｐ−ヒドロキシフェ ニルグリジンの存在につき、上清をＨＰＬＣにより分析した。ｐＣＡＲ２６また はｐＣＡＲ４４を含有するアグロバクテリウム１５−１０についてのカルバモイ ラーゼ活性は、培養ブロス１ｍｌあたり、アグロバクテリウム１５−１０につい ての活性より１０〜３０倍高かった。これはおそらく、組換え株中のカルバモイ ラーゼ遺伝子の余分の複製により、より多くのカルバモイラーゼ酵素が生産され たからであろう。

実施例２２ ｐＷＯＲ９０３の構築 およびクロロホルム抽出により該ＤＮＡを精製し、Ｎａ０Ａｃおよびエタノール を用いて沈殿させ、遠心分離により回収し、４０μｍの１０ｍＭｈリスーＨＣｌ 　（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ□、５ＱｍＭ　ＮａＣＬ　５０μｇｍ ド１ウン血清アルブミン、１０＋＊Ｍ２−メルカプトエタノールに再溶解した。

２５０μＭデオキシグアノシンー三リン酸、２５０μＭデオキシチミジン三リン 酸および２５０μＭデオキソンチジン三リン酸の混合物１μｌを加え、イー・コ リＤＮＡポリメラーゼＩ　（ギブコーＢＲＬ）の「フレノウフラグメント」２単 位を加えた。室温で１時間、試験管をインキュベートし、フェノール／クロロホ ルムで抽出し、クロロホルムで抽出した。回収した水層をＮａ０Ａｃおよびエタ ノールで処理してＤＮＡを沈殿させ、これを遠心分離により回収し、１５μｍの ＤＮＡリガーゼ緩衝液に再溶解した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、該混合 物を１２℃で約１６時間インキュベートした。

連結混合物５μｍを用いてイー・コリＨＢＩＯＩを形質転換しく実施例５に記載 と同様の方法を使用した）、２５μｇｅｌ−’クロラムフェニコールを含有する Ｌ−寒天平板上に細胞を広げ、３７℃で２日間インキュベートした。１６個の形 質転換体を、２５μｇＩＩド１クロラムフェニコールを含有するし一寒天上に再 度線状に塗り、３７°Ｃで一夜増殖させ、ついで細胞を該平板からこすり落とし 、小規模のプラスミド調製に使用した（実施例１８）。

列を除去するであろう。これが生じたかどうかを決めるために、プラスミド調製 物からのＤＮＡのアリコートをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。さらに、ＥｃｏＲＶ でアリコートを消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を持たないがｐＷＯＲ９０２と同 様のＥｃｏＲ１１消化パターンを有するプラスミドを、形質転換体のほとんどが 含有しているようであった。

これらの単離物の１つの培養５００ｍ１上、大規模なプラスミド調製を行った（ 実施例４の方法）。このプラスミド、ｐＷＯＲ９０３（図１８に示す図）は、ｐ ＷＯＲ９０２（図１６）と同様の制限地図を有するが、１ＩｉｎｄＩＩＩ部位を 欠いている。

実施例２３ ｐＷＯＲ９０４およびｐＷＯＲ９０５の作製ｐＷＯＲ９０３ＤＮＡ　（実施例２ ２）約１μｇを、甲Ｒ１緩衝液中、３７℃で３し、クロロホルムで抽出し、Ｎａ ０Ａｃおよびエタノールで沈殿させることによりＤＮＡを回収した。回収したＤ ＮＡを、１単位のＣＩＡＰを含有する５０μｍの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐ Ｈ８，０）　、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）に溶解した。このホスフ ァターゼ処理およびＤＮＡの回収は、実施例２に記載のとおりに行った。該ＤＮ Ａを１０μｍの水に再溶解した。

プラスミドｐｌｃ２ＯＲ［ｖ−ン＋Ｌ　（Ｍａｒｓｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ） 　３２　（１９８４）ｐｐ４８１−４８５１はｐＵＣプラスミド［ビニリア（Ｖ ｉｅｒｉａ）およびメッノング（ｌｌｅｓｓｉｎｇ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）１ ９　（１９８２）ｐｐ２５９−２６８１　と類似しているが、修飾されたポリリ ンカーを有している。約２μｇのｐｌｃ２０ＲＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ緩衝液中、 ３７℃で約１５時間、５単位のＥｃｏＲＩで消化した。ＴＢＥ緩衝液中での電気 泳動による分画後、アガロースゲル薄片から電気溶出により、ｐＴｃ２０Ｒのポ リリンカーセグメントに相当する８４ｂｐ断片を回収した（実施例１８）。回収 したＤＮＡを１０μｍの水に再溶解した。

１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する連結緩衝液の全量１２μｌ中、ｐｌｃ２ ＯＲの８４ｂｐの独ＲＩ断片８μｍを、１２℃で約１６時間、０．５μｍのＥｃ ｏＲＩカフト、ＣＩＡＰ処理ｐＷＯＲ９０３と混合した。該連結混合物５μｍを 用いてイー・コリＪＭＩＯＩを形質転換しく実施例５に記載と同様の方法を使用 ）、２５μｇ山ド１クロラムフェニコールを含有するＬ−寒天平板上に該細胞を 広げ、３７℃で２日間インキュベートした。２５μｇＩＩ１１−’クロラムフェ ニコールを含有するＬ−寒天上に、６４個の形質転換体を再度線状に塗り、３７ ℃で一夜増殖させ、ついで細胞を平板からこすり落とし、小規模なプラスミド調 製に使用した（実施例１８）。

カーの配向を決定した。いずれか一方の配向のポリリンカーを含有する単離物を 得た。各型の単離物の１つの培養５００ｍ１上、大規模なプラスミド調製を行っ た（実施例４の方法を使用）。ｐＷＯＲ９０４およびｐＷＯＲ９０５と称するプ ラスミドの制限地図を図１９および２０に示す。

実施例２４ ｐＣＡＲ４６の作製およびアグロバクテリウムへの転移的２μｇのｐＣＡＲ２９ ＤＮＡ　Ｃ実施例１０）を、５ＱｍＭトリスー塩酸（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ 　ＭｇＣｈ、５０ｍＭ　ＮａＣ１の合計５０μｍ中、３７℃で３時間、５単位の ＢａｍＨＩおよび５単位のＨｉｎｄＩＩＩで消化した。電気泳動による分画の後 、アガロースゲル薄片から電気溶出により１．３５ｋｂ断片を単離した（実施例 １８）。

回収したＤＮＡを１０μｍのＴＨに再溶解した。

約２μｇのｐＷＯＲ９０４ＤＮＡ　（実施例２３）を膓ｄＩＩＩで消化し、つい で勝ｇ１．ＩＩで消化した。ついで該ＤＮＡをＣＩＡＰで処理しく実施例２）、 最後に１０μｍのＴＥに再溶解した。

１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する連結緩衝液全量１２μｍ中、１μｍのカ ットｐＷＯＲ９０４をｐＣＡＲ２９の１．３５ｋｂ断片４μｍと混合し、１２℃ で約１６時間インキュベートした。

５μｍの連結混合物を用いてイー・コリＤＨ５αを形質転換しく実施例５に記載 と同様の方法を使用）、該細胞を、２５μｇｍｌ−’クロラムフェニコールを含 有するし一寒天平板上に広げ、３７°Ｃで２日間インキュベートした。１５個の 形質転換体を、２５μｇｍｌ−’クロラムフェニコールを含有するし一寒天上に 再度線状に塗り、３７°Ｃて一夜増殖させ、ついで細胞を該平板からこすり落と し、小規模のプラスミド調製に用いた（実施例１８）。

ＤＮＡのアリコートをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化して、ｐＣＡＲ２９由来 の挿入物の存在を確認した。単離物のうちの１つの５００ｍ１の培養上、大規模 なプラスミド調製を行った（実施例４の方法を使用）。ｐＣＡＲ４６と称する該 プラスミドの制限地図を図２１に示す。このＤＮＡ２００ｎｇを用いてアグロバ クテリウム１５−１０をエレクトロポレーノヨンにより形質転換した（実施例１ ９）。形質転換体を小規模なプラスミド調製に付し、制限酵素ｌ角化によりｐＣ ＡＲ４６の存在を確認レニ。アグロバクテリウム１５−１０　（ｐＣ，ＡＲ４６ ）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・ バクテリア（アノくディージ、スコツトランド）ｌ：１９９２年２月１４日に、 受託番号ＮＣＩＭＢ４０４７８にて寄託した。この寄託は、特許手続きのための 微生物の寄託に関するブタペスト条約に基づいて行った。

実施例２５ アグロバクテリウムにおけるｐＣＡＲ４６に関連する余分のカルバモイラーゼ活 性の証明 アグロバクテリウム１５−１０をＡＪ−１ブロス５Ｑｍｌに接種した。アグロバ クテリウム１５−１０　（ｐＣＡＲ４６）　を、１０μｇｌＩｌ−’りｏ５ム７ ｚ二：＋−／Ｌｌを含有するＡＪ−１ブロス５０ＩＩｌに接種した。該培養を旋 回インキュベーター中３０’Ｃで２４時間増殖させ、ついで各培養を以下のとお り処理した。１．３６１１１の培養ブロスをミクロセントリヒュージ試験管中、 １４０μｍの１％へキサデンルトリメチルアンモニウムブロミド（６５ｍＭ　Ｎ ａ２ＨＰＯ４，３５ｍＭ　ＮａＨｔＰ○４、ｐＨ７，０）と混合し、室温で１０ 分間インキュベートした。５０μｍのこのａ合物を、６５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４ ，３５ｏＭ　ＮａＨｚＰ０４（ｐＨ７，ｏ　；反応基質を溶解後、ｐＨ７，０に 再調整）中の１５％（ｗ／ｖ）Ｄ−Σ−カルバモイルーｐ−ヒドロキシフェニル グリシン１．４５ｍ１を含有するミクロセントリヒュージ試験管に移した。試験 管の内容物を混合し、４８℃で２０分間インキュベートした。遠心分離により細 胞を集め、カルバモイラーゼ酵素により生成したＤ（−）ｐ−ヒドロキシフェニ ルグリノンの存在について上清をＨＰＬＣにより分析した。

ｐＣＡＲ４６を含有するアグロバクテリウム１５−１０についてのカルバモイラ ーゼ活性は、培養ブロス１ｍｌ当たり、アグロバクテリウム１５−１０について の活性より２０〜３０倍高かった。

実施例２６ ｐｃＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２の作製的２μｇのｐＣＡＲ６（実施例５）ＤＮ Ａを、５ＱｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８゜０）　、１０ｍＭ　Ｍｇｃｈの合計５ ０ｍ１中、３７°Ｃで３時間、５単位のＣ１ａＩで消化した。消化しｆ：　Ｄ　 Ｎ　Ａを、０８％低融点アガロースゲル上、ＴＢＥ中電焦電気泳動り分画した。

約４．７ｋｂ　Ｃ１ａＩ断片を含有するゲル部分を切り、実施例５に記載の方法 を用いてＤＮＡを回収した。

ＤＮＡリガーゼ緩衝液の合計２０μｍ中、Ｃ１ａｌ消化、ＣＩＡＰ処理ｐｃＰ１ ９ＤＮＡ　（実施例２）約０．６μｇおよびｐＣＡＲ６から（Ｄ　４　、７　ｋ ｂ＋７１Ｃ１ａＩ断片約０６μｇを合わせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１単位を加 え、該混合物を４℃で約１６時間インキュベートした。

連結混合物１０μｌを用いてイー・コリＤＨ５αを形質転換しく実施例５に記載 と同様の方法を使用）、該細胞を、１０μｇｍド１テトラサイクリンで補足され たし一寒天平板上に広げ、３７℃で一夜インキユベートした。１８個のテトラサ イクリン耐性コロニーを、１０μｇｍｌ−１テトラサイクリンを含有するし一寒 天平板上に再度線状に塗り、３７℃で一夜インキユベートし、ついでこれらの各 単離物の細胞上で、小規模なプラスミドＤＮＡ調製（実施例５に記載の方法を使 用）を行った。ＤＮＡ調製物の制限酵素消化により、ベクター中Ｃ１ａＩ断片の 両方の配向を有するクローンが得られたことが示された。これらのベクターはｐ ＣＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２と称した（図２２および２３）。

１０７１１０７ｌ’テトラサイクリンを含有するＬ−ブロス中、イー・コリＤＨ ５α（ｐｃＡＲ３１）およびイー・コリＤＨ５α（ｐＣＡＲ３２）の培養５００ ｍ１を７ＡＩした。両方の培養物を以下のとおり処理した。

該培養を約６０００Ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを １０ｍ１の５ＱｏＭグルコース、２５ｍＭｈリスー塩酸（ｐＨ８，０）　、１０ ＋ｏＭ　ＥＤＴＡ、５１１ｇｍ１−　’のりゾチームに再せ濁した。該混合物を 室温で１５分間インキュベートした。１０ｍ１の０．２Ｍ　ＮａＯＨ１１％ＳＤ Ｓ溶液をリゾチーム処理細胞に加え、溶液を混合し、水上２０分間インキュベー トした。水Ａ３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５，８）　１５ｍｌを反応混合物に加え、 溶液を混合し、水上さらに６０分間インキュベートした。約３８０００ｘｇ、４ ℃で約３０分間、溶解細胞を遠心分離した。上清を集め、０６容量のイソプロパ ツールを加え、室温で１５分間ＤＮＡを沈殿さゼた。反応混合物を約６０００Ｘ ｇ、室温で約３０分間遠心分離し、沈殿したＤＮＡをＴＥ４．０ｍｌに再Ｉ９！ 濁した。ついでＣｓＣ１勾配を調製しく実施例４のとおり）、プラスミドＤＮＡ を５００μＩＴＥに再懸濁した。さらにこのＤＮＡの制限酵素消化により、ｐｃ ＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２の正確な構造が確認された。

実施例２７ ｐｃＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２のイー・コリからアグロバクテリウムへの転移 ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を用いる接合（実施例１２でｐｃＡＲｌにつ いて記載したとおり）により、ｐｃＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２をアグロバクテ リウム１５−１０に転移した。実施例５に記載の方法を用いて、単離物からプラ スミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡの１部分の制限酵素消化を用いて、 テトラザイクリン耐性エクスコンツユガントがｐｃＡＲ３１またはｐＣＡＲ３２ を含有することを確認した。

実施例２８ ｐｃＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２に関連した余分のヒダントイナーゼ活性の証明 アグロバクテリウム１５−１０　（ｐｃＡＲｌ）　、アグロバクテリウム１５− １０　（ｐＣＡＲ６）　、アグロバクテリウム１５−１０　（ｐＣＡＲ２６）　 、アグロバクテリウム１５−１０　（ｐｃＡＲ３１）　、アグロバクテリウム１ ５−１０　（ｐＣＡＲ３２）およびアグロバクテリウム１５−１０をそれぞれ、 ０１％アラニンヒダントインおよび適当な抗生物質を含有するＡＪ−１ブロス５ ０ｍ１を含有する別々のフラスコに接種した。該培養を旋回インキュベーター中 ３０℃で２４時間増殖させた。得られた培養をヒンダトイナーゼ活性について検 定した（実施例１５のとおり）。ｐｃＡＲｌおよびｐＣＡＲ６はアグロバクテリ ウム１５−１０において上昇したヒダントイナーゼ活性を与えるが、ｐＣＡＲ２ ６は与えないことが確認された。ｐｃＡＲ３１またはｐＣＡＲ３２を含有する株 は、アグロバクテリウム１５−１０についての活性より約２０倍高いピンダトイ ナーゼ活性を与えた。これはｐｃＡＲ３１およびｐＣＡＲ３２が、ヒダントイナ ーゼ活性をコードする遺伝子を含有することを示す。

実施例２９ ｐＣＡＲ３６の作製 約２μｇのｐｃＡＲ３１（実施例２６）ＤＮＡを、５ＱｍＭｈリスー塩酸（ｐＨ ８，０）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ＱｍＭ　ＮａＣ］の合計５０μｌ中、３ ７℃で３時間、るゲル部分を切り、実施例５に記載の方法を用いてＤＮＡを回収 した。

ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｍ中、ＨｉｎｄＩＩＩ消化、ＣＩＡＰ処理ｐＫＴ２ １０ＤＮＡ（実施例１６）約０．６μｇおよびｐｃＡＲ，３１からの４．７ｋｂ の）ＩｉｎｄＩＩＩ断片約０６μｇを合わせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの］単位を 加え、該混合物を４℃で１６時間インキュベートした。

連結混合物１０１１１を用いてイー・コリＨＢＩＱｌコンピテント細胞を形質転 換しく実施例５に記載と同様の方法を使用）、該細胞を、２５μｇｍｌ−’クロ ラムフェニコールで補足されたし一寒天平板上に広げた。１７個のクロラムフェ ニコール耐性コロニーを、２５μｇｍｌ　−’クロラムフェニコールを含有する し一寒天平板上に再度線状に塗り、３７℃で一夜インキュベー＋−Ｌ、ついでこ れらの各単離物の細胞上、小規模なプラスミドＤＮＡ調製を行った（実施例５に 記載と同様の方法を使用）。制限酵素消化により、ｐＣＡＲ３６の存在が確認さ れた。制限消化地図を図２４に示す。

２５μｇｍｌ−’クロラムフェニコールで補足されたＬ−ブロス５００ｍ１にイ ー・コリＨＢ１０Ｆ、（ｐＣ，へＲ３６）を接種し、旋回インキュベーター上３ ７℃で一夜インキユベートした。実施例２６の方法を用いてプラスミドＤＮＡを 単離した。

実施例３０ イー・コリ力１らアグロバクテリウムへのｐＣＡＲ３６の転移ヘルパープラスミ ドｐＲＫ２０１３を用いる接合により、ｐＣＡＲ３６をアグロバクテリウムへ転 移させた（実施例１２にｐｃＡＲｌについて記載したとおり）。実施例５記載の 方法を用いて単離物からプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡの１部 分の制限酵素消化を用いて、タロラムフェニコール耐性エクス＝ン／ユガントが ｐＣＡＲ３６を含有することが確認された。

実施例３】 ｐＣＡＲ３６に関連した余分のヒンダトイナーゼ活性の訂明アグロバタテリウム １５−１０およびアグロバクテリウム１５−１０　（ｐＣＡＲ６）をそれぞれ、 ０１％アラニンヒダントイン（およびアグロバクテリウム１５−１０　（ｐＣＡ Ｒ３６）培養のための１０　μｇｍｌ−’タロラムフェニコール）を含有するＡ Ｊ−１グロス５０ｍ１を含有する別々のフラスコに接種し、旋回インキュベータ ー中３００Ｃで２４時間増殖させた。得られた培養をヒンダトイナーゼ活性につ いて検定した（実施例１５のとおり）。ｐＣＡＲ３６を含有するアグロバクテリ ウム１５−１０についてのピンダトイナーゼ活性は、アグロバクテリウム１５− １０についての活性より６〜７倍高かった。これにより、ｐＣＡＲ３６がヒンダ トイナーゼ活性をコードする遺伝子を含有することが確認された。

実施例３２ ｐ　Ｄ　Ａ　Ｎ　３およびｐＤＡＮ４の作製約２／１ｇのｐＣＡＲ３６（実施例 ２９）ＤＮＡを、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８、０）　、１０℃１Ｍ　ＭｇＣ １，，５ＱｍＭＮａＣ１の合計５０μｍ中、３７℃で３時間、５単位のＳｓｔ　 Ｉ　（ＳａｃＩ）で消化した。消化したＤＮＡを、０．８％低融点アガロースゲ ル上、ＴＢＩＪｉｉｉｉ液中電気泳動により分画した。約３．３ｋｂの５ｓｔＩ 断片を含有するゲル部分を切り、実施例５に記載の方法を用いてＤＮＡを回収し た。

ＤＮＡ’）ｆｆ−ゼ’ｆＭ？Ｆｅ全Ｎ２０ｕｌ中、５ｓｔＩ消化、ＣＩＡＰ処理 ｐＷＯＲ９０２ＤＮＡ　（実施例１つ）約０．５　μｇおよびｐＣＡＲ３６がら の３．３ｋｂの５ｓｔＩ断片約Ｑ、５／１ｇを合わせた。Ｔ４］）ＮＡリガーゼ の１単位を加え、該混合物を４℃で１６時間インキュベートした。

反応混合物１０μｍを用いてイー・２１月（ＢＩＯＩコンピテント細胞を形質転 換しく実施例５に記載と同様の方法を使用）、該細胞を、２５μｇｍｌ−’クロ ラムフェニコールで補足されたＬ−寒天平板上に広げた。４個のクロラムフェニ コール耐性コロニーを、２５μｇｍｌ−’クロラムフェニコールを含有するＬ− 寒天平板上に再度線状に塗り、３７°Ｃで一夜インキユベートし、ついでこれら の各単離物のＢｆｌａ上、・１＼規模プ：プラスミドＤＮＡ調製を行った（実施 例５に記載と同様の方法を使用）。ＤＮＡ調製物の制限酵素消化により、ベクタ ー中５ｓｔＩ断片のいずれか一方の配向を有するクローンが得られたことが示さ れた。これらをｐＤＡＮ３およびｐＤＡＮ４と称し、制限地図を図２５および２ ６に示す。

２５μｇｍｌ　−’クロラムフェニコールで補足されたＬ−グロス５００ｍ１に イー・コリＨＢＩＯＩ　（ｐＤＡＮ３）を接種し、さらに、２５μｇＩｌｌ利ク ロラムフェニコールで補足されたし一ブロス５００ｍ１にイー・コリＨＢＩＯＩ 　（ｐＤＡＮ４）を接種し、旋回インキュベーター上３７℃で一夜インキユベー トした。実施例２６記載の方法を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。

実施例３３ ｐＤＡＮ３およびｐＤＡＮ４のアグロバクテリウムへのエレクトロポレーション ｐＤＡＮまたはｐＤＡＮ４約２００ｎｇを用いて、エレクトロポレーションによ りアグロバクテリウム１５−１０を形質転換した（実施例１９）。形質転換体を 小規横なプラスミド調製に付した。制限酵素消化によりｐＤＡＮ３およびｐＤＡ Ｎ４の存在が確認された。

実施例３４ ｐＤＡＮ３およびｐＤＡＮ４に関連した余分のヒダントイナーゼ活性の証明アグ ロバクテリウム１５−１０　（ｐＣＡＲ３６）　、アグロバクテリウム１５−１ ０　（ｐＷＯＲ９０２）　、アグロバクテリウム１５−１０　（ｐＤＡＮ３）お よびアグロバクテリウム１５−１０　（ｐＤＡＮ４）をそれぞれ、５ｇド’　（ ＮＨＩ）２ＳＯ１および１０μｇ［Ｉｌ−’クロラムフェニコールで補足された ＡＪ−１培地（実施例１）５０＋ｎｌを含有する別々のフラスコに接種し、３０ ℃で２４時間増殖させた。

ついで得られた培養のそれぞれを以下のとおり処理した。Ｉ　Ｍ　Ｍｎ　Ｓ　Ｏ ４溶液５００μｍを培養に加え、ついで３０６Ｃでさらに３５分間振とうした。

該ブロスを以下のとおり検定した。原液または希釈したブロス１３６０μｍを、 エッペンドルフ・チューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ）中の１％セチルト リメチルアンモニウムプロミド溶液１４０μｍに加え、混合し、室温で５分間イ ンキュベートした。この溶液１ｍｌを、５０ｍ１のねじ蓋式円錐フラスコ中の０ ．２Ｍ　トリス中の１％Ｄ、Ｌ−５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン １９ｍ１に加え、４２℃で水浴中振とうした。１０分間および３０分間インキュ ベートした後サンプルを取り出し、ＨＰＬＣを用いて検定した（実施例１５）。

１時間当たり細胞１＋＋１当たりの生成物μモルで、ヒダントイナーゼ活性を算 出した。

ｐＣＡＲ３６、ｐＤＡＮ３およびｐＤＡＮ４はアグロバクテリウム１５−１０中 上昇したヒダントイナーゼ活性を与えることが証明された。ｐＤＡＮ４を含有す る株は、ｐＷＯＲ９０２を含有するアグロバクテリウム１５−１０についての活 性より約２３０倍高いヒダントイナーゼ活性を与えた。

実施例３５ ｐＧａ１２７８９Ｒ３３Ｃａｒｂの作製天然に存在するイー・コリプラスミドＮ ＲＩのコピー数突然変異体を、自然突然変異により得た。ついで、不必要な領域 を欠失させることによりこのプラスミド（ｐＢＲ２１）のサイズを減少させ、ｐ ＤＰＴ２７８９を得た。これはセ脛Ｆｉｌ領域およびクロラムフェニコールおよ びストレブトマイノン耐性マーカーを含有する１２５コピープラスミドである。

ついでｐＤＰＴ２７８９をＮｄｅｌで切断し、フィルイン（ｆｉｌｌｅｄ　ｉｎ ）　Ｌ、再度連結してｐＤＴＰ　２７８９　（Ｎｄｅつを作製した。ついでｐＤ 　Ｐ７２７８９　（Ｎｄｅ−）を５ｔｕｌおよびＥｓｐｌで消化し、合成リボゾ ーム結合部位を下流に有するＰｇａｌプロモーターを含有する５ｔｕ−Ｅｓｐｌ 断片を挿入した。

このベクターをｐＧａ　１２７８９Ｒ３３ＶＩＶ２と称した。

ｐＧａ　］　２７８９Ｒ３３ＶＩＶ２をＮｄｅｌで消化し、フレノウでフィルイ ンしくｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）　Ｌ、ついでＢａｍＨｌで消化した。ｐｃＡＲ２１ （実施例７）をＢｓｐＨ１で消化し、フレノウで補充（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）　 Ｌ／、ついでＢａｍＨｌで消化した。これらの消化により、カルバモイラーゼ遺 伝子をコードする配列を含有する〜９００ｂｐの断片を遊離し、Ｇａｌプロモー ターのカルバモイラーゼ遺伝子を発現するプラスミドｐＧａ１２７８９Ｒ３ｃａ ｒｂが生じた。

ついで、標準的なＣａ　Ｃ１２法により、このプラスミドを幾つかのイー・コリ に１２宿主株中に形質転換し、細胞抽出物が移動する５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのク ーマノ−ブルー染色により、細胞増殖中、カルバモイラーゼの生成を監視した。

ポリリッカー領域 Ｆｉｇ、９ １’＋（−、、０１（、＋１ ＮＧＧＴＣ’＋ＧＣＣＣＴ＾ＱＴＣＣＡＴｃＧｃｃＧＡｃ丁Ｔ（、ＣＣＧＣＣＣ ；ＧＣＣ＾ＴＧＣＣＧＴＣＣＣ＾ＴＴ工ＧＧＣＣ＾ｃｃｃｃ■ −７０００〜９０　〜ｔｏｏ　１１０　−１２０ＴＴＴＧＴＣＣＧＧＣＣＧＧＣ ＣＧＧＧＣＣＧＡＡＣＧＴＴＣＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣ ＾ＴＣＣ工丁ＧＡＴＴ””！１０　−３２０　’３３０　＋３４０　−ＸＳＯ− ３６０ＴＣＣＡＴＡＡＡにＣＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＧＴＴＧ＾丁ＧＧＡＴＡ＾Ａ ＴＴＣ工＾ＴＡＴＧＣＧＧＴＡＴＧ＾ＴＧＴτＣτＴＴ＾■」−４３０−ａａＯ −４５０−４６０−４７０−４ＢＯ＾丁＾＾ｔ−ＩＧＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣ ＣＴＴＣＴ＾ｒ（丁ＧＴＣ＾＾ＧＣＧＧＧ＾＾ＧＧＧ＾＾ＧＴ丁ＣＴＣＣＧＧ＾ ＾丁ＣＧＧＣ″’４’？Ｏ−５００”’５１０　−５２０　−５３０　”’５４ ０ＧＣＴＧＣＧＱＧＧＧＡ＾ＣＧＴＡＴＣＧＡＧＴＴＴＣＧ＾ＴＴ＾Ｇ＾ＣＧＣ ＧＧ丁ＴＧ＾＾＾ＧＣＧ＾ＧＣＧＧＴＣ＾Ｔ丁Ｃ＾＾Ｔ−５５０〜５６０　へ５ ７０　−５ｎｏ　”５９０　−６ａＯＴＡＡ＾ＡＣＧＣ；ＣＧＣＣＧＴＴＣ＾Ａ ＴＣＣにＧＧＴＧＡＡＩ！１＾＾にＴＴＣ八＾Ｃへ＾ＴＣＣＧ＾＾＾ττττＣ へＣＣＣＴＧＧＩ−６７０−６８０−６９０−７００’７１０　−７２０ＣＣ丁 ＴＧＩ＋１（ｆｉＧ／ＩＴＣ／Ｉｎ＾＾ＣＪＴＴＴ八ＣＧＣＣＴＧｒ＾ＧＴ／） ｒＧ＾へ■＾ＣＴＧＣ＾ＴＣＴＧＧＣ＾ＴＴＩ＾ＴＣbＴＴ −７３０−７４０−７５０−フ／＋Ｏ−７７０−７００７ＴＴＣ；Ｔ＾ＣＱＡＣ ／’ｌ＾Ｔ（ＡＴ丁ＧＧＣＧＴにＣＣ／１＾ＧＣＴＧ八Ｇ＾ＣＧｒＧＴＧＴＴＣ ＣＴＧ＾＾＾ＴＧＴＧＣ八■＾ＧＣ−７９０ＡＢＯ３−８１０−ｅ２ｏ　Ｐ８５ Ｇ嬰−５−一叫」υ ｐＴＲ５５０ 一３９６０ｂｐ ＩＳｍａｌ／ＢｓｐＨＩ］ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　９／８ ０ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　９／８０ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９／８６ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　９／８６ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、　ＳＥ ）、ＪＰ、　ＵＳ（７２）発明者　ニール、ロバート・ジョンイギリス国ウェス ト・サセックス・ビーエン１４・８キユーエイチ、ワージング、クラレンドン・ ロード（番地の表示なし）　スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティ カルズ Ｉ （７２）発明者　グリフイン、アリラン・ミツシェルイギリス国ウェスト・サセ ックス・ビーエン１４・８キユーエイチ、ワージング、クラレンドン・ロード（ 番地の表示なし）　スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ （７２）発明者　スコツト、ミラー・オニールアメリカ合衆国ペンシルベニア州 １９４０６、キング・オブ・プルシア、スウエードランド・泊−ド７０９番　ス ミスクライン・ビーチャム （７２）発明者　シャツマン、アラン・リチャードアメリカ合衆国ペンシルベニ ア州１９４０６、キング・オブ・プルシア、スウエードランド・ロード７０９番 　スミスクライン・ビーチャム （７２）発明者　ゴーラム、ベーゼル・フレアイギリス国オックスフォード・オ ーエックスト３ニスアール、マンスフイールド・ロード（番地の表示なし）　イ ンスティテユート・オブ・パイロロジー・アンド・エンバイロンメンタル・ミク ロバイオ口ジー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．カルバモイラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡを相同宿主中で発現させ ることによる、Ｄ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換されていてもよいフェニ ル）グリシンを対応するＤ−（所望により置換されていてもよいフェニル）グリ シンに変換する能力を有するカルバモイラーゼ酵素の製造法。 ２．相同宿主がアグロバクテリウムである請求項１記載の製造法。 ３．請求項１または２記載の製造法により得られるカルバモイラーゼ酵素。 ４．Ｄ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換されていてもよいフェニル）グリシ ンを対応するＤ−（所望により置換されていてもよいフェニル）グリシンに変換 する能力を有するカルバモイラーゼ酵素をコードする遺伝子よりなる組換えＤＮ Ａベクターであって、ｐＣＡＲ１、ｐＣＡＲ６、ＰＣＡＲ１２、ｐＣＡＲ２１、 ｐＣＡＲ２６、ｐＣＡＲ２７、ｐＣＡＲ２８、ｐＣＡＲ２９、ｐＧａｌ２７８９ ＲＳ３Ｃａｒｂ、ｐＣＡＲ３１、ｐＣＡＲ３２、ｐＣＡＲ３６、ｐＣＡＲ４４お よびｐＣＡＲ４６から選ばれる組換えＤＮＡベクター。 ５．請求項１で定義されるカルバモイラーゼ酵素の遺伝子およびＤ．Ｌ−（所望 により置換されていてもよいフェニル）ヒダントインを対応するＤ−Ｎ−カルバ モイル（所望により置換されていてもよい）フェニルグリシンに変換する能力を 有するヒダントイナーゼ酵素の遺伝子をコードする単離されたＤＮＡ。 ６．請求項５記載のＤＮＡよりなる組換えＤＮＡ。 ７．ｐＣＡＲＩ、ｐＣＡＲ６、ｐＣＡＲ３１、ｐＣＡＲ３２またはｐＣＡＲ３６ である請求項６記載の組換えＤＮＡベクター。 ８．Ｄ．Ｌ−（所望により置換されていてもよいフェニル）ヒダントインを対応 するＤ−Ｎ−カルバモイル（所望により置換されていてもよいフェニル）グリシ ンに変換する能力を有するヒダントイナーゼ酵素の遺伝子をコードする単離され たＤＮＡ。 ９．請求項８記載のＤＮＡよりなる組換えＤＮＡ。 １１．通常の形質転換またはエレクトロポレーション条件下で宿主および組換え ＤＮＡを混合することよりなる、請求項４、６、７、９または１０のいずれか１ 項に記載の組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換する方法。 １２．請求項４、６、７、９または１０のいずれか１項記載の組換えベクターで 形質転換された宿主細胞。 １３．アグロバクテリウムまたはイー・コリである請求項１２記載の宿主細胞。 １４．（ａ）請求項４〜１０のいずれか１項で定義される上記宿主細胞ＤＮＡに 、上記宿主細胞中で機能する転写または翻訳活性化配列からの発現のために位置 する上記ＤＮＡを導入すること、および（ｂ）上記ＤＮＡの発現を許容する条件 下で、工程（ａ）で形質転換された上記宿主細胞を培養することよりなるカルバ モイラーゼおよび／またはヒダントイナーゼ活性を生成させる方法。 １５．ＤＮＡが、ｐＷＯＲ９０２またはその誘導体に基づくベクターである請求 項１４記載の方法。