DE69333528T2

DE69333528T2 - D-n-carbamoylaminosäureamidohydrolase und hydantoinase

Info

Publication number: DE69333528T2
Application number: DE69333528T
Authority: DE
Inventors: Robert John Worthing NEAL; Alison Michelle Worthing GRIFFIN; Miller O'neill Scott; Allan Richard Shatzman; Hazel Claire Gorham
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1992-06-30
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: DE69333528D1; WO1994000577A1; EP0650525A1; EP1568778A1; US5858759A; EP0650525B1; JPH07508169A; JP3510625B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle und rekombinante Vektoren für die Verwendung in der Transformation eines bakteriellen Wirts. Im Besonderen betrifft die Erfindung eine DNA, die ein Carbamoylase-Enzym codiert, und mit rekombinanten Vektoren transformierte Wirte, die diese DNA enthalten.
Bestimmte D-α-Aminosäuren sind wohl bekannte Arzneimittel-Zwischenstufen. Zum Beispiel wird D(-)-p-Hydroxyphenylglycin als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Antibiotikums Amoxycillin verwendet. Verfahren zür Herstellung von D-α-Aminosäuren sind daher von Bedeutung und verschiedene enzymatische Verfahren, die die Herstellung eines D-Produkts aus racemischem Ausgangsmaterial ermöglichen, wurden veröffentlicht.
Die U.K.-Patente 1,534,426 und 1,564,982, zum Beispiel, offenbaren Hydantoinase produzierende Organismen, die 5-(substituiertes Phenyl)-hydantoine hydrolysieren, um interme-diäre D-N-Carbamoyl-(substituiertes Phenyl)-glycine zu liefern. Um jedoch die entsprechende D-α-Aminosäure zu erhalten, ist es erforderlich, daraufhin die gebildeten N-Carbamoyl-Verbindungen zu hydrolysieren, zum Beispiel mit salpetriger Säure.
Um das Problem zu überwinden, einen ersten enzymatischen und einen zweiten chemischen Schritt zur Herstellung von D-α-Aminosäuren aus Hydantoin-Ausgangsmaterial zu benötigen; ist es möglich, die N-Carbamoyl-Zwischenstufe enzymatisch in die α-Aminosäure mit einem Carbamoylase-Enzym umzuwandeln, das von einem Mikroorganismus, z.B. einer Agrobakterium-Spezies, wie im U.K.-Patent Nr. 2,022,581 beschrieben, produziert wird. Ein Nachteil des im U.K.-Patent Nr. 2,022,581 beschriebenen Agrobakterium NRRL B11291 besteht jedoch darin, daß nur begrenzte Mengen an Carbamoylase-Enzym produziert werden. Darüberhinaus weist der Organismus andere Enzymaktivitäten auf, die unter bestimmten Umständen unerwünscht sein können.
Die PCT-Anmeldung WO 92/10579 (Kanegafuchi) offenbart die Produktion von D-α-Aminosäuren durch Bakterien, die mit rekombinanter, ein Carbamoylase-Enzym codierender DNA transformiert wurden, das die D-N-Carbamoyl-α-Aminosäure in eine D-α-Aminosäure umwandelt.
Wir haben entdeckt, daß überraschenderweise höhere Mengen Enzymaktivität erhalten werden können, wenn ein Carbamoylase-Gen in einem homologen Wirt exprimiert wird. Mit "homologem Wirt" meinen wir, daß der Wirt die gleiche An Organismus ist, aus dem das Gen ursprünglich isoliert wurde.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Carbamoylase-Enzyms, das die Fähigkeit besitzt, ein D-N-Carbamoyl-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin in das entsprechende D-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin umzuwandeln, durch die Expression rekombinanter, ein Carbamoylase-Gen codierender DNA in einem homologen Wirt bereit.
Bevorzugterweise ist der homologe Wirt ein Agrobakterium, d.h. das Carbamoylase-Gen wurde aus Agrobakterium erhalten.
Wir haben darüberhinaus entdeckt, daß bestimmte Konstrukte sowohl in heterologen wie auch in homologen Wirten zu hohen Expressionsmengen führen.
Dementsprechend wird in einer weiteren Anwendung der vorliegenden Erfindung ein rekombinanter DNA-Vektor bereitgestellt, der ein ein Carbamoylase-Enzym codierendes Gen enthält, das die Fähigkeit besitzt, ein D-N-Carbamoyl-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)glycin in das entsprechende D-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin umzuwandeln, wobei der DNA-Vektor aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus pCAR1, pCAR6, pCAR12, pCAR21, pCAR26, pCAR27, pCAR28, pCAR29, pGal2789RS3Carb, pCAR31, pCAR32, pCAR36, pCAR44 und pCAR46, wie hier beschrieben, besteht.
Der Vorteil der Erfindung liegt darin, daß besonders große Mengen des Carbamoylase-Enzyms hergestellt werden können. Unter geeigneten Bedingungen aktives Carbamoylase-Enzym kann somit erhalten, und, bevorzugt an einem festen Träger immobilisiert, verwendet werden, um eine ausgewählte D-α-Aminosäure herzustellen.
Geeignete Substituenten für gegebenenfalls substituierte Phenylgruppen, wie hier beschrieben, schließen Hydroxy-, C_(1-6)-Alkyl-, C_(1-6)-Alkoxyreste und Halogenatome ein. Bevorzugte (substituiertes Phenyl)-glycine schließen (p-Hydroxyphenyl)-glycin und (3,4-Dihydroxyphenyl)-glycin, insbesondere (p-Hydroxyphenyl)-glycin, ein.
Das Carbamoylase-Gen kann, wie hier nachstehend beschrieben, aus vollständiger oder chromosomaler DNA von Organismen isoliert werden, die ein Carbamoylase-Enzym mit der entsprechenden Fähigkeit produzieren.
Das Carbamoylase-Gen kann weitere Gene enthalten, zum Beispiel regulatorische Elemente, oder flankierende DNA, die keine bestimmte oder bekannte Funktion besitzt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle mit einem rekombinanten, das Carbamoylase-Enzym codierenden, erfindungsgemäßen Vektor bereit, das die Mischung des Wirts zusammen mit dem rekombinanten Vektor unter herkömmlichen Transformations- oder Elektroporationsbedingungen umfaßt.
In einer anderen Anwendung der Erfindung wird eine, mit dem rekombinanten, erfindungsgemäßen Vektor transformierte Wirtszelle bereitgestellt. Geeignete Wirte schließen Agrobakterium und E. coll, zum Beispiel E. coll DH1, E. coli JM 101 und E. coll HB101 ein.
Die Erfindung schließt auch die Züchtung des transformierten, erfindungsgemäßen Wirts ein, so daß die Produktion des Carbamoylase-Gens erfolgt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls eine DNA, die ein ein Hydantoinase-Enzym codierendes Gen enthält, das die Fähigkeit besitzt, ein D,L-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-hydantoin in das entsprechende D-N-Carbamoyl-(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin umzuwandeln.
Es sollte natürlich selbstverständlich sein, daß die in dieser Anwendung beschriebene DNA von der Hauptmenge einer solchen chromosomalen DNA abgetrennt wurde und nicht in ihrem "natürlichen" Zustand vorliegt, d.h. in der Form, in der sie in der Natur vorkommt. Daher kann die DNA in isolierter und im Wesentlichen gereinigter Form vorliegen und/oder im Wesentlichen aus einem Hydantoinase-Gen bestehen, das das Hydantoinase-Enzym codiert.
Eine rekombinante DNA, die die DNA enthält, wird ebenfalls beschrieben. Bevorzugterweise enthält die das Hydantoinase-Gen codierende DNA einen rekombinanten Vektor, noch bevorzugter einen Hochexpressionsvektor, der in der Lage ist, hohe Mengen des Gentranskripts zu exprimieren.
Dementsprechend wird in einer weiteren Anwendung der Erfindung isolierte und rekombinante DNA bereitgestellt, die ein Gen für ein Carbamoylase-Enzym und ein Gen für ein Hydantoinase-Enzym codiert. Die Züchtung eines geeigneten, transformierten Wirts kann dann sowohl Carbamoylase- als auch Hydantoinase-Aktivität erzeugen.
Vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn die Carbamoylase- und Hydantoinase-Aktivität im selben Konstrukt bereitgestellt werden, wie zum Beispiel in pCAR1, pCAR6, pCAR31, pCAR32 und pCAR36.
In einer Anwendung wird die erfindungsgemäße DNA aus einem Mikroorganismus, bevorzugt aus einem Boden-Isolat, bezeichnet als "80/44-2A", wie hier beschrieben, erhalten. Von Isolat "80/44-2A" wird angenommen, daß es ein Agrobakterium ist und da wir nicht durch diese Bezeichnung gebunden sein wollen, wird der Stamm hier als Agrobakterium 80/44-2A bezeichnet. Die daraus erhaltene DNA wird in ähnlicher Weise als Agrobakterium-DNA bezeichnet.
Um die Erfindung deutlicher zu beschreiben, wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, in denen:
1 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCP19 zeigt;
Abk.:
B = BglII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, C = ClaI, S = SalI,
Tc^R = Tetracyclin-Resistenzgen,
cos = cos-Stelle des Bakteriophagen lambda,
Die Linie repräsentiert die DNA von pCP19;
2 die Reäktionsfolge für die Umwandlung von N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin in D-(-)p-Hydroxyphenylglycin zeigt;
3 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR1 zeigt;
Abk.:
C = ClaI, B = BglI, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII,
P = PstI, (nur die Enzyme E, H und P wurden zur Kartierung der Agrobakterium-DNA verwendet), S = SalI, Tc^R = Tetracyclin-Resistenzgen,
cos = cos-Stelle des Bakteriophagen lambda,
Die Linie repräsentiert die DNA von pCP19,
Der schraffierte Teil repräsentiert DNA von Agrobakterium 80/44-2A
4 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR6 zeigt; Abk.:
C = ClaI, B = BglII, Ba = BamHI, H = HindIII, E = EcoRI
P = PstI, (nur die Enzyme E, H und P wurden zur Kartierung der Insertion in diesem Plasmid verwendet (und ClaI), S = SalI,
Die Linie repräsentiert die DNA von pCP19,
Der schraffierte Teil repräsentiert DNA von Agrobakterium
5 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pIJ2925 zeigt;
Abk.:
Ap^R = Ampicillin-Resistenz
6 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR12 zeigt;
In dem mit "Polylinker" gekennzeichneten Bereich sind nicht alle Restriktionsschnittstellen in der pIJ2925=DNA gezeigt.
Abk.:
Der nicht schraffierte Teil repräsentiert pCP19-DNA (cloniert aus pCAR6 zusammen mit Agrobakterium-DNA),
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
Die Linie repräsentiert die DNA von pIJ2925
7 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR21 zeigt;
In dem mit "Polylinker" gekennzeichneten Bereich sind nicht alle Restriktionsschnittstellen in der pIJ2925-DNA gezeigt.
Abk.:
Der nicht schraffierte Teil repräsentiert pCP19-DNA (cloniert aus pCAR12 zusammen mit Agrobakterium-DNA),
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
Die Linie repräsentiert die DNA von pIJ2925
8 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR27 zeigt;
Abk.:
Die Linie repräsentiert M13mp19-DNA
Der nicht schraffierte Teil repräsentiert pIJ2925-DNA
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
9 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von Plasmid pCAR28 zeigt;
Abk.:
Die Linie repräsentiert M13mp19-DNA
Der nicht schraffierte Teil repräsentiert pIJ2925-DNA
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
10 die Sequenz der Agrobakterium-DNA von pCAR27 und pCAR28 zeigt. Nur der "Sinn"- oder codierende Strang des DNA-Moleküls ist gezeigt. Der DNA-Strang ist 5' → 3' von links nach rechts gezeigt. Die Nucleotidsequenz ist unmittelbar – unter der Sequenz numeriert. Die Aminosäuresequenz (im Drei-Buchstaben-Code) der von der DNA codierten Carbamoylase ist über jeder Zeile der Nucleotidsequenz gezeigt;
11 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pTR550 zeigt;
Abk.:
rrnB term. repräsentiert den Transkriptions-Terminator aus einem ribosomalen RNA-Operon, P_tac repräsentiert den tac-Transkriptionspromotor
12 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR29 zeigt;
Abk.:
Die Linie repräsentiert pTR550-DNA
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
13 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pKT210 zeigt;
Abk.:
A = AccI, E = EcoRI, H = HindIII, Pf = PflMI, P = PstI, S = SalI
14 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR26 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BglII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, Pf = PflMI, S = SstI,
Sa = SalI, Sp = SphI, Sm = SmaI, K = KpnI,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
Der Pfeil repräsentiert Carbamoylase codierende Sequenz
Die Vektor-DNA wurde nicht mit allen Enzymen kartiert, die im Polylinker, oder der Agrobakterium-DNA schneiden. Die Agrobakterium-DNA wurde mit AccI und PflMI nicht vollständig kartiert
15 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pWOR901 zeigt;
Abk.:
A = AccI, E = EcoRI, H = HindIII, Pf = PflMI, P = PstI, S = SstI
16 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pWOR902 zeigt;
Abk.:
A = AccI, E = EcoRI, H = HindIII, Pf = PflMI (keine Schnittstellen in pWOR902), P = PstI, S = SstI;
17 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR44 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BglII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI,
S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI, X = XbaI,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA,
Der Pfeil repräsentiert Carbamoylase codierende Sequenz.
Die Vektor-DNA wurde nicht mit allen Enzymen kartiert, die im Polylinker oder der Agrobakterium-DNA schneiden.
18 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pWOR903 zeigt;
Abk.:
A = AvaI,, E = EcoRV, P = PstI, S = SstI
19 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pWOR904 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BalII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, Sm = SmaI,
S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI, X = XbaI, V = EcoRV, C = ClaI, K = KpnI,
Xh = XhoI, N = NruI
Die Vektor-DNA wurde nicht mit allen Enzymen kartiert, die im Polylinker schneiden.
20 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pWOR905 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BalII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, Sm = SmaI,
S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI, X = XbaI, V = EcoRV, C = ClaI, K = KpnI,
Xh = XhoI, N = NruI
Die Vektor-DNA wurde nicht mit allen Enzymen kartiert, die im Polylinker schneiden.
21 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR46 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BalII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI,
Sm = SmaI, S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI, X = XbaI, V = EcoRV, C = ClaI,
K = KpnI,
Der schraffierte Teil repräsentiert DNA von Agrobakterium 80/44-2A,
Der Pfeil repräsentiert Carbamoylase codierende Sequenz.
Die Vektor-DNA wurde nicht mit allen Enzymen kartiert, die im Polylinker oder der Agrobakterium-DNA schneiden;
22 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR31 zeigt;
Abk.:
B = BglII, Ba = BamHI, Bs = BspHI, C = ClaI, E = EcoRI, V = EcoRV,
H = HindIII, N = NruI, P = PstI, S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI,
Sc = ScaI, Tc^R = Tetracyclin-Resistenzgen,
cos = cos-Stelle des Bakteriophagen λ,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
23 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR32 zeigt;
Abk.:
B = BglI, Ba = BamHI, Bs = BspHI, C = ClaI, E = EcoRI, V = EcoRV,
H = HindIII, N = NruI, P = PstI, S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI, Sc = ScaI, Tc^R = Tetracyclin-Resistenzgen, cos = cos-Stelle des Bakteriophagen λ,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
24 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pCAR36 zeigt;
Abk.:
A = AccI, B = BglI, Ba = BamHI, Bs = BspHI, C = ClaI, E = EcoRI, V = EcoRV,
H = HindIII, N = NruI, P = PstI, Pf = PflMI, S = SstI, Sa = SalI, Sp = SphI,
Sc = ScaI, Cm^R = Chloramphenicol-Resistenzgen,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
25 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pDAN3 zeigt; und
Abk.:
B = BglII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, S = SstI, Sa = SalI,
Sp = SphI, X =XbaI,
Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
26 eine Restriktionsschnittstellen- und funktionelle Karte von pDAN4 zeigt.
Abk.:
B = BglII, Ba = BamHI, E = EcoRI, H = HindIII, P = PstI, S = SstI,
Sa = SalI, Sp = SphI, X= Xbal. Der schraffierte Teil repräsentiert Agrobakterium-DNA
Die erfindungsgemäße DNA kann in jeden geeigneten Vektor ligiert werden. Normalerweise ist der Vektor ein Plasmid, zum Beispiel ein aus E. coli abgeleitetes Plasmid, oder ein temperenter oder virulenter Bakteriophage.
Spezielle Vektoren schließen Vektoren mit einem breiten Wirtsbereich wie etwa pCP19 oder pKT210 oder Derivate davon, ein. Die Vektoren pIJ2925 und pTR550, hier im Detail beschrieben, können ebenso vorteilhafterweise verwendet werden.
Ein besonders nützlicher Vektor ist der Mobilisations-defekte (Mob^-) Vektor pWOR902, ein Derivat von pKT210. pWOR902, erhalten durch eine spontane DNA-Deletion aus dem instabilen Mob^--Vektor pWOR901, ist weniger mobil als pKT210. Ein Vorteil von pWOR902 besteht darin, daß rekombinante Stämme sicherer sind, wenn sie mit pWOR902 transformiert sind, als zum Beispiel mit pKT210. E. coli HB 101 (pWOR902) wurde in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland am 4. November 1991 unter der Eingangsnummer NCIMB 40451 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentierungsverfahrens durchgeführt. pWOR902, Derivate davon und damit transformierte Wirte bilden eine weitere Anwendung dieser Erfindung.
Besonders nützliche Derivate von pWOR902 sind die hier im Folgenden beschriebenen Plasmide pWOR903, pWOR904 und pWOR905. Diese können aus pWOR902 durch Standard-Verfahren erhalten werden.
Der rekombinante, erfindungsgemäße Vektor kann durch Standard-Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch Ligierung von DNA, die das Carbamoylase-Gen enthält, in den ausgewählten Vektor durch direkte Kombination kohäsiver Enden, Homopolymer-Tailing oder durch Verwendung eines Linker- oder Adaptermoleküls.
Es versteht sich, daß gemäß den oben genannten Verfahren hergestellte rekombinante Vektoren die eingefügte DNA in einer von zwei möglichen Orientierungen enthalten können. Rekombinante Vektoren, die die Insertions-DNA in jeder der beiden Orientierungen besitzen, sind im Umfang der Erfindung enthalten.
Spezielle rekombinante Vektoren schließen die als pCAR1, pCAR6, pCAR12, pCAR21, pCAR26, pCAR27, pCAR28, pCAR29, pGal2789RS3Carb, pCAR31, pCAR32, pCAR36, pCAR44 und pCAR46 bezeichneten ein, deren Herstellung und Charakterisierung im Folgenden genau beschrieben werden.
In einer besonders bevorzugten Anwendung der Erfindung werden die Plasmide pCAR26, pCAR44 und pCAR46 bereitgestellt. pCAR26, und besonders pCAR44 und pCAR46 erzeugen eine große Menge an Carbamoylase-Aktivität, wenn Wirtszellen, besonders Agrobakterium, damit transformiert und unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden.
Es versteht sich, daß die Carbamoylase-Protein codierende Sequenz von einem heterologen Promotor wie etwa dem tac-Promotor exprimiert werden kann. Eine solche Expression ist im Umfang der Erfindung enthalten.
In einer besonderen Anwendung stellt die Erfindung einen mit pCAR46 transformierten Wirt, insbesondere Agrobakterium, bereit. In einer besonderen Anwendung stellt die Erfindung NCIMB 40478 bereit, gemäß dem Budapester Vertrag am 14. Februar 1992 hinterlegt.
Ein Verfahren, um DNA zu erhalten, die das Carbamoylase-Enzym codiert, enthält die Schritte:

a) Konstruktion einer Genbank aus chromosomalen DNA-Fragmenten, erhalten aus einem Carbamoylase produzierenden Mikroorganismus;
b) Durchführung eines oder mehrerer Hybridisierungsexperimente, um aus der Genbank Clone auszuwählen, die die erfindungsgemäße DNA enthalten; und
c) Isolierung der erfindungsgemäßen DNA.

Die Genbank kann durch das herkömmliche "Schrotschoß"-Verfahren hergestellt werden durch:

a) partielle Spaltung der chromosomalen DNA des Carbamoylase produzierenden Mikro organismus mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsendonucleasen, zum Beispiel HindIII;
b) Größenfraktionierung, um Fragmente geeigneter Länge zu erhalten;
c) Ligierung der Fragmente in einen Vektor, um einen rekombinanten Vektor zu erhal ten; und
d) Transformation oder Transfektion eines geeigneten Wirts mit dem rekombinanten Vektor.

Wie hier beschrieben, kann die Transformation oder Transfektion mit auf dem Fachgebiet gut bekannten herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
Die Größenfraktionierung kann geeigneterweise auf einem Saccharosegradienten durchgeführt werden und Fragmente im gewählten Größenbereich können ausgewählt werden.
In einer bevorzugten Ausführung kann eine Genbank durch die Auswahl von Fragmenten von etwa 15 bis 30 kb Länge und Ligierung dieser Fragmente in einen Plasmid-vektor, zum Beispiel den Vektor pCP19, hergestellt werden. Ein geeigneter Wirt ist E. coli, zum Beispiel E. coli DH1.
Um in der Genbank Clone zu identifizieren, die das Carbamoylase-Gen enthalten, ist es erforderlich, Kolonien auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von N-Carbamoyl-4-hydroxyphenylglycin in D(-)-4-Hydroxyphenylglycin abzusuchen. "Positive" Kolonien können durch den Nachweis der Ammoniak-Produktion (das in der oben genannten Reaktion gebildet wird) einfach durch Standardverfahren identifiziert werden, zum Beispiel durch Verwendung eines Indikators wie etwa Phenolrot.
Um dem Fachmann die leichte Ausführung der Erfindung zu ermöglichen, wurde eine in diesem Nachweis positive Kolonie, genauer ein mit pCAR1 transformierter E. coli AG1-Mikroorganismus, in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland, am 26. April 1989 unter der Eingangsnummer NCIMB 40133 hinterlegt. E. coli NCIMB 40133 bildet eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung.
Die in einer positiven Kolonie, zum Beispiel E. coli NCIMB 40133, vorliegende Plasmid-DNA kann, wie hier in den Beispielen beschrieben, weiter bearbeitet werden, um die Bestimmung der Sequenz des dadurch codierten Carbamoylase-Enzyms zu ermöglichen [vgl. nachstehend, 10(b)].
Es sollte selbstverständlich sein, daß die Aminosäuresequenz dieses natürlich vorkommenden Enzyms einer bestimmten Variabilität unterliegen kann. Diese besitzen im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz, wie nachstehend in 10(b) gezeigt, und besitzen Carbamoylase-Aktivität.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird DNA oder rekombinante DNA bereitgestellt, die die nachstehend in 10(b) gezeigte codierende Sequenz von Nucleotid 891 bis Nucleotid 1802 umfaßt. Die DNA-Sequenz codiert ein Carbamoylase-Enzym mit einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 34,100.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung wird ein im Wesentlichen gereinigtes Carbamoy-ase-Enzym mit der in 10(b) gezeigten Aminosäuresequenz vom N- bis zum C-Terminus bereitgestellt.
In einer noch weiteren Anwendung der Erfindung wird ein wie vorstehend beschriebenes Carbamoylase-Enzym, immobilisiert an einen festen Träger, zum Beispiel ein Anionenaustauscherharz wie etwa das Phenol-Formaldehyd-Anionenaustauscherharz Duolite A568 (Rohm and Haas) bereitgestellt.
Die in 10(b) gezeigte, codierende DNA-Sequenz oder Aminosäuresequenz kann, falls erwünscht, mit herkömmlichen Verfahren, zum Beispiel mit einem automatischen Synthesegerät, synthetisiert werden.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann die Aminosäuresequenz des Carbamoylase-Enzyms durch mehrere alternative DNA-Sequenzen codiert werden. Es sollte selbstverständlich sein, daß die erfindungsgemäße DNA weiterhin solche alternativen Sequenzen umfaßt.
In noch einer weiteren Anwendung stellt die Erfindung eine DNA-Verbindung bereit, ausgewählt aus:

a) einem Teil der DNA-Insertion von pCAR1, wobei dieser Teil ein BspHI – HindIII-Fragment von 986 Basenpaaren ist;
b) DNA-Sequenzen, die zu diesem Teil unter stringenten Bedingungen hybridisieren und die ein Carbamoylase-Enzym codieren, das in der Lage ist, ein D-N-Carbamoyl(gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin in das entsprechende D- (gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-glycin umzuwandeln.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls, daß das Carbamoylase-Enzym trotz anfänglicher Schwierigkeiten, die Erzeugung von löslichem aktivem Enzym mit Standardverfahren zu bewerkstelligen, einfach in E. coli produziert werden kann. In dieser Anwendung der Erfindung wird zunächst das Carbamoylase-Gen umfassende DNA in irgendeinen geeigneten Vektor cloniert, der so bearbeitet ist oder wurde, daß das Gen in E. coli unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert wird.
Bevorzugterweise ist der Vektor ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, zum Beispiel pUC18 oder ein Derivat des natürlich vorkommenden E. coli-Plasmids NR1 (Foster, T.J. et al., J. Bact. 124 (1975), 1153).
Um eine effektive Expression des Carbamoylase-Enzyms zu erreichen, ist der Promotor bevorzugt nicht induzierbar, d.h. es ist nicht erforderlich, chemische Verbindungen zuzugeben oder die Temperatur zu erhöhen, um ihn zu dereprimieren oder zu induzieren. Überraschenderweise wurde gefunden, daß E. coli-Zellenunter diesen Bedingungen während ihres gesamten Wachstumszyklus Carbamoylase-Enzym produzieren, das sowohl löslich als auch aktiv ist.
Ein für die Expression des Carbamoylase-Enzyms in E. coli bevorzugter Promotor ist der Galactose-Promotor, wie hier im Folgenden beschrieben.
In E. coli NCIMB 40133 vorhandene Plasmid-DNA oder Derivate davon können auch bearbeitet werden, um Hochleistungs-Expression von Hydantoinase zu erreichen, wie hier im Folgenden beschrieben.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Züchtung von Agrobakterium 80/44-2A und Isolierung chromosomaler DNA
50 ml AJ-1-Medium (20 g Hefeextrakt, 1 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄·7H₂O, 0.1 g CaCl₂.2H₂O, 15 mg MnSO₄·4H₂O, 20 mg FeSO₄·7H₂O und 5 g Glucose pro Liter, eingestellt auf pH 7.0 mit 5 M NaOH) wurde mit einer Kultur Agrobakterium 80/44-2A (aus Boden isoliert) angeimpft und in einem Schüttelinkubator bei 25°C für etwa 24 Stunden inkubiert. Die Kultur wurde bei ungefähr 1500 × g für 7 Minuten bei 10°C zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde verworfen und der Zell-Niederschlag wurde in 10 ml Salz-Phosphatpuffer (8.5 g NaCl, 7.2 g KH₂PO₄, 7.0 g K₂HPO₄ pro Liter) gewaschen und dann erneut sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und der Zell-Niederschlag wurde in 8 ml Lyse-Lösung mit 3% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, resuspendiert und in einem Wasserbad bei 65°C für 15 Minuten inkubiert. Die Lösung lysierter Zellen konnte auf Raumtemperatur abkühlen und wurde zweimal mit 5 ml gepuffertem Phenol/Chloroform (ein 50:50-Gemisch aus Phenol und Chloroform, gepuffert auf einen pH-Wert von ungefähr 7 mit Tris-HCl, pH 8.0) extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde mit 5 ml Chloroform extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde durch Zugabe von 0.1 Volumenteilen 3 M Natriumacetat (NaOAc), Mischen, Überschichtung der Lösung mit 2.5 Volumenteilen kaltem (–20°C) Ethanol und Verwirbelung zur Durchmischung gefällt. Der Klumpen gefällter DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt und in 3 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH=8.0) mit 40 μg/ml Ribonuclease A wieder gelöst. Die Lösung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloro-form extrahiert und dann mit NaOAc und Ethanol gefällt. Die DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt und in 3 ml TE wieder gelöst.
Beispiel 2
Konstruktion einer Genbank von Agrobakterium 80/44-2A
Der Plasmidvektor pCP19 (1) ist ein Derivat des Plasmids mit breitem Wirtsspektrum pLAFR1 (Friedman et al., Gene 18 (1982), 289–296) und ist pCP13 ähnlich (beschrieben von Darzins und Chakrabarty, Journal of Bacteriology 159 (1984), 9–18), ihm fehlt jedoch das in pCP13 vorhandene Kanamycin-Resistenzgen. 2 μg des Plasmids pCP19 wurden mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Gibco BRL, Paisley, PA3 4EF, Schottland) bei 37°C für 3 Stunden in HindIII-Spaltungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl) gespalten. Das Gemisch wurde mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit Chloroform extrahiert und die erhaltene wäßrige Phase mit 0.1 Volumenteilen 3M NaOAc und 2.5 Volumenteilen Ethanol versetzt. Das Gemisch wurde zur Fällung der DNA bei –20°C für 1 Stunde inkubiert. Nach Zentrifugation in Mikrozentrifugenröhrchen bei 12000 × g für 5 Minuten wurde der DNA-Niederschlag in 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA (pH 8.0) wieder gelöst. Eine Einheit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP; von BCL, Boehringer Mannheim House, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. 45 μl Wasser und 5 μl einer 10%-igen SDS-Lösung wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei etwa 68°C für 15 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt, mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und durch Zugabe von NaOAc und Ethanol gefällt. Der DNA-Niederschlag wurde in 40 μl TE wieder gelöst.
25 μg DNA von Agrobakterium 80/44-2A (Beispiel 1) wurden mit 12 Einheiten HindIII in 150 μl HindIII-Spaltungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl) bei 37°C für 10 bis 30 Minuten gespalten, um Spaltung an einigen, aber nicht allen Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym zu erreichen. Der Fortgang der Spaltung wurde durch die Entnahme von Aliquots und Abstoppen der Reaktion durch Phenol/Chloroform-Extraktion überwacht. Teile der erhaltenen DNA-Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 0.6 %-igen Agarose (Ultrapure, von Gibco BRL) -Gel in TBE-Puffer (89 mM Tris-Base; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA, pH 8.0) mit 0.5 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt und die DNA-Banden wurden mit ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die erforderlichen Größen der partiell gespaltenen DNA-Fragmente betragen ungefähr 15 bis ungefähr 30 kbp. Diese Fragmente wurden erhalten, indem geeignete Aliquots aus der partiellen Spaltung ausgewählt, vereinigt, und durch Elektrophorese auf einem 0.8 %-igen Gel aus Agarose mit niedriger Schmelztemperatur (Ultrapure, von Gibco BRL) in TBE-Puffer mit Ethidiumbromid aufgetrennt wurden. Nach Sichtbarmachung der DNA-Banden mit ultraviolettem Licht wurde der Teil des Gels, der Fragmenten mit einer Größe von ca. 15 kbp bis ca: 30 kbp entsprach, ausgeschnitten und bei 65°C für 15 Minuten geschmolzen. Das Gemisch wurde auf etwa 37°C gekühlt und zweimal mit einer mit Tris-HCl (pH 8.0) auf neutralen pH-Wert gepufferten Phenollösung extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die DNA durch Zugabe von NaOAc und Ethanol gefällt. Die DNA wurde in 100 μl TE wieder gelöst.
Ungefähr 0.8 μg HindIII gespaltene, CIAP behandelte pCP19-DNA und etwa 4 μg mit HindIII partiell gespaltene chromosomale DNA von Agrobakterium 80/44-2A wurden durch Zugabe von NaOAc und Ethanol gemeinsam gefällt und in 12 μl DNA-Ligasepuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8.0; 4 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit; 50 μg/ml Rinderserumalbumin und 0.5 mM ATP) wieder gelöst. Eine Einheit T4 DNA-Ligase (Gibco BRL) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für etwa 16 Stunden inkubiert. 3 μl der ligierten DNA wurde in lambda-Bakteriophagenpartikel mit dem Gigapack Gold Packaging-Kit von Stratagene, La Jolla, Kalifornien 92037 (vgl. auch Enquist und Sternberg, Methods in Enzymology 68 (1979), 281 – 298) verpackt. Dies ergab 500 μl einer Suspension aus Bakteriophagenpartikeln.
Eine 10 ml-Kultur Escherichia coli AG1 (ein Derivat von E. coli DH1: Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983), 557 – 580), bezogen von Stratagene, wurde in L-Medium (10 g Bacto-Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose pro Liter) mit 0.4 % Maltose und 10 mM MgSO₄ bei 37°C in einem Schüttelinkubator für ungefähr 16 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei ca. 1500 × g für 7 Minuten gesammelt und in 10 mM MgSO₄ zu einer endgültigen optischen Dichte von 0.5 bei 600 nm resuspendiert. Elf 400 μl-Aliquots von Zellen der E. coli-Kultur wurden mit jeweils 40 μl der Bakteriophagenpartikel gemischt und bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Jedes Gemisch wurde zu 800 μl L-Medium zugegeben, auf einem Schüttler bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und bei 12000 × g für 2 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Jeder Zell-Niederschlag wurde in 100 μl L-Medium resuspendiert und auf eine Platte aus L-Agar (wie für L-Medium, aber mit 1.5 % Agar), supplementiert mit 10 μg/ml Tetracyclin, ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37°C für etwa 16 Stunden inkubiert. 800 Kolonien wurden auf L-Agarplatten mit Tetracyclin (10 μg/ml) überimpft, so daß sich auf jeder Platte 50 Kolonien befanden. Diese Platten wurden bei 37°C für etwa 16 Stunden inkubiert und dann wurden Replikas von jeder Platte auf 2 L-Agarplatten mit Tetracyclin hergestellt, die bei 37°C für etwa 16 Stunden inkubiert wurden. Dies ergab 2 Gruppen von 16 Platten; diese Gruppen waren Kopien einer Genbank von Agrobakterium 80/44-2A-DNA in E. coli.
Beispiel 3
Isolierung eines Clons, der Carbamoylase-Aktivität aufweist
Eine Gruppe von 800 Kolonien (Beispiel 2), die eine Genbank der Agrobakterium 80/44-2A-DNA in dem Plasmid pCP19 in E. coli AG1 repräsentiert; wurde auf die Fähigkeit abgesucht, N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin (N-Carb.) in D(-)-p-Hydroxyphenylglycin (D(-)HPG) umzuwandeln. Zellen von der Hälfte einer Platte (d.h. von 25 verschiedenen Clonen) der Genbank wurden in Mikrozentrifugengefäße mit 800 μl Testpuffer geschabt. Der Testpuffer war eine Lösung mit 1 % N-Carb., 10 mM Phosphatpuffer, 0.0012 % Phenolrot (0.6 ml einer 2 %-igen Lösung pro 100 ml N-Carb.-Lösung), mit NaOH auf pH 6.7 eingestellt. Diese Lösung hatte eine gelbliche Farbe. Der Inhalt des Gefäßes wurde gemischt und das Gefäß wurde in einem Wasserbad bei 42°C für 24 Stunden inkubiert. Die Umwandlung von N-Carb. zu D(-)HPG führt zur Produktion von Ammoniak (2), das den pH-Wert erhöht und durch einen Farbwechsel des Phenolrot von gelb zu rosa-rot nachgewiesen werden kann. Eines der 32 Gefäße wechselte die Farbe zu rosa-rot. Die diesem Gefäß entsprechenden 25 Kolonien wurden von der zugehörigen Platte der Duplikat-Genbank erneut auf L-Agarplatten mit Tetracyclin ausgestrichen, die bei 37°C für etwa 16 Stunden inkubiert wurden. Eine Impföse voll Zellen aus jedem Neuausstrich wurde mit dem oben beschriebenen Phenolrot-Test auf Carbamoylase-Aktivität untersucht. Eine der 25 Kolonien produzierte eine rosa-rote Färbung. Das Reaktionsgefäß wurde zum Sedimentieren der Zellen bei 12000 × g für 2 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde mit HPLC untersucht, um zu bestätigen, daß D(-)HPG anwesend war. Der Carbamoylase-Aktivität codierende Clon wurde bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland am 26. April 1989 unter der Eingangsnummer NCIMB 40133 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentverfahrens durchgeführt.
Beispiel 4
Isolierung und Charakterisierung von pCAR1 aus Escherichia coll NCIMB 40133
400 ml L-Medium mit 10 μg/ml Tetracyclin wurden mit einer Kultur von E. coll NCIMB 40133 (Beispiel 3) angeimpft und in einem Schüttelinkubator bei 37°C für etwa 20 Stunden inkubiert. Die Kultur wurde bei ca. 6000 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der entstandene Zell-Niederschlag wurde in 2.5 ml 25 %-iger Saccharose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) resuspendiert: 0.5 ml einer 10 mg/ml Lysozym-Lösung wurden zugegeben und das Gemisch wurde auf Eis für 10 Minuten inkubiert. 1 ml 0.25 M EDTA (pH 8.0) wurde zu den Lysozym behandelten Zellen zugegeben, gefolgt von 4 ml Lyse-Lösung (0.25 % Triton X-100; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; und 62.5 mM EDTA, pH 8.0). Die Lösungen wurden gemischt und auf Eis für weitere 5 bis 10 Minuten inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Die lysierten Zellen wurden bei ungefähr 38000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und 8.0 ml des Überstands wurden zu 8.4 g CsCl zugegeben. Nachdem sich das CsCl gelöst hatte, wurde 1.0 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung zugegeben und das Gemisch wurde in ein 16 × 76 mm-Polyallomer-Gefäß (Beckman Instruments, Palo Alto, California 94304) überführt. Das Gefäß wurde verschlossen und bei ca. 185000 × g für 60 Stunden zentrifugiert. Die erhaltene Plasmidbande wurde mit ultraviolettem Licht sichtbar gemacht und die DNA wurde mit einer Spritze, ausgestattet mit einer 21 Gauge-Nadel, abgezogen. Das Ethidiumbromid wurde durch mehrere Extraktionen mit mit 5 M NaCl gesättigtem Isopropanol aus der DNA-Lösung entfernt. Die erhaltene wäßrige Phase wurde gegen dreimal gewechselten TE-Puffer für jeweils 1 Stunde dialysiert, mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die DNA wurde durch Zugabe von NaOAc und Ethanol gefällt. Die Plasmid-DNA (ungefähr 50 μg) wurde in 500 μl TE wieder gelöst. Dieses Plasmid wurde pCAR1 genannt; eine Restriktionskarte ist in 3 gezeigt.
Beispiel 5
Konstruktion von Plasmid pCAR6
Ungefähr 4 μg von Plasmid pCAR1 (Beispiel 4) wurden mit HindIII bei 37°C für 3 Stunden in einem HindIII-Spaltungspuffer gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.9 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Gibco-BRL) durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ungefähr 12 kbp HindIII-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten, durch Erhitzen auf 65°C für 10 Minuten geschmolzen, auf ungefähr 37°C gekühlt und zweimal mit gepuffertem Phenol (Phenol mit Tris-HCl, pH 8.0 auf einen pH-Wert von ungefähr 7 gepuffert) extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit 0.1 Volu menteilen 3 M NaOAc und 2.5 Volumenteilen Ethanol versetzt. Das Gemisch wurde zur Fällung der DNA bei –20°C für 1 Stunde inkubiert, wobei die DNA durch Zentrifugation in Mikrozentrifugengefäßen bei 12000 × g für 5 Minuten sedimentiert und in 20μl TE wieder gelöst wurde.
Ungefähr 0.6 μg HindIII gespaltene; CIAP behandelte pCP19-DNA (Beispiel 2) und etwa 0.6 μg des ungefähr 12 kbp HindIII-Fragments von pCAR1 (vgl. vorstehend) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl Ligasepuffer vereinigt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für ungefähr 16 Stunden inkubiert.
E. coli HB101 [H. Boyer and D. Roulland-Dussoix, Journal of Molecular Biology 41 (1969), 459] wurde in 50 ml L-Medium bei 37°C in einem Schüttelinkubator bis zu einer O.D. von ungefähr 0.5 bei 600 nm gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1500 × g für 7 Minuten bei 4°C sedimentiert, in 4 ml 100 mM MgCl₂ resuspendiert, erneut sedimentiert, in 2 ml 100mM CaCl₂ resuspendiert, erneut sedimentiert und wieder in 2 ml 100 mM CaCl₂ resuspendiert. Diese Zellen wurden für 1 Stunde auf Eis gehalten. Die Transformation der E. coli-Zellen wurde durchgeführt wie folgt:- 10 μl des Ligierungs-Reaktionsgemisches wurden zu 200μl Zellen zugegeben. Das Gemisch wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert, bei 42°C für 2 Minuten inkubiert, zu 800 μl L-Medium zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Verdünnungen dieses Gemisches wurden auf L-Agarplatten, supplementiert mit 10 μg ml^–1 Tetracyclin, ausgestrichen und die Platten wurden bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. 20 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten, supplementiert mit 10μg ml^–1 Tetracyclin, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert Eine Impföse voll Zellen wurde von jeder Platte abgeschabt und mit dem in Beispiel 3 beschriebenen "Phenolrot-Test" auf Carbamoylase-Aktivität untersucht. 15 von 20 Isolaten ergabert positive Nachweise für Carbamoylase-Aktivität.
Plasmid-DNA wurde (in kleinem Maßstab) von jedem der 20 Isolate isoliert wie folgt: Zellen würden von einer Platte in 100 μl 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EDTA in ein Mikrozentrifugengefäß abgeschabt, mit einem Vortexgerät gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 200 μl eines frischen Gemisches aus 0.2 M NaOH und 1 % Natriumdodecylsulfat wurden zugegeben, das Gefäß wurde zur Durchmischung des Inhalts umgedreht und wurde auf Eis für 5 Minuten inkubiert. 150 μl 3 M Kaliumacetat, mit Essigsäure auf pH 4.8 eingestellt, wurde zu dem Gefäß zugegeben, der Inhalt durch Umdrehen des Gefäßes gemischt und das Gefäß wurde auf Eis für 5 Minuten inkubiert. Das Gefäß wurde bei 12000 × g für 2 Minuten zentrifugiert, der erhaltene Überstand wurde mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die erhaltene wäßrige Phase wurde mit 800 μl kaltem (–20°C) Ethanol versetzt. Der Inhalt des Gefäßes wurde gemischt und bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert, das Gefäß wurde zur Sedimentierung der Nucleinsäure bei 12000 × g für 2 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in TE gelöst und ein Teil wurde zur Restriktionsenzym-Spaltung verwendet, um die Restriktionskarte des Plasmids zu überprüfen. Von 20 untersuchten Isolaten enthielten die 5 Isolate, die kein Carbamoylase-Enzym produzierten, pCP19-DNA, wie aus den Restriktionsenzym-Spaltungen der Plasmid-DNA ersichtlich war. Alle 15, die Carbainoylase-Enzym ergaben, enthielten ein Plasmid mit dem 12 kbp-HindIII-Fragment von pCAR1. Die Plasmid-DNA war je eine von zwei Arten; die sich nur in der Orientierung des 12 kbp-HindIII-Fragments relativ zum Rest des Plasmidvektors unterschieden. Eines der E. coli-Isolate mit Carbamoylase-Aktivität wurde bei 37°C in einem Schüttelinkubator über Nacht in 400 ml L-Medium, supplementiert mit 10 μg ml^–1 Tetracyclin, inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde aus dieser Kultur mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren isoliert. Das Plasmid wurde pCAR6 genannt; eine Restriktionskarte ist in 4 gezeigt.
Beispiel 6
Konstruktion von Plasmid pCAR12
Der Plasmidvektor pIJ2925 (5) ist pUC18 ähnlich (Norrander et al., Gene 26 (1983), 101 – 106), hat aber einen anderen Polylinker in der multiplen Clonierungsstelle nahe dem 5'-Ende des lacZ'-Gens. 2 μg pIJ2925-DNA wurden mit 10 Einheiten BamHI (Gibco-BRL) bei 37°C für 3 Stunden in 100 μl BamHI-Spaltungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl) gespalten. Eine Einheit CIAP wurde zugegben und die Inkubation wurde für 30 Minuten fortgesetzt. 5 μl 10 %-iges SDS wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei ungefähr 68°C für 15 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde dann auf Raumtem-peratur gekühlt, mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und durch Zugabe von 0.1 Volumenteilen 3 M NaOAc und 2.5 Volumenteilen Ethanol gefällt. Nach Inkubation bei –20°C für eine Stunde wurde das Gefäß bei 12000 × g für 5 Minuten zentrifugiert und der DNA-Niederschlag wurde in 10 μl TE wieder gelöst.
Etwa 20 μg pCAR6-DNA wurde mit 12 Einheiten Sau3AI (Gibco-BRL) in Sau3AI-Spaltungspuffer (20 mM Tris-HCl pH7.4, 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl) bei 37°C für 1 – 30 Minuten gespalten, um Spaltung an einigen, aber nicht an allen Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym zu erreichen. Der Fortgang der Spaltung wurde durch die Entnahme von Aliquots und Abstoppen der Reaktion durch Phenol/Chloroform-Extraktion überwacht. Teile der erhaltenen DNA-Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 0.8 %-igen Agarosegel in TBE-Puffer mit Ethidiumbromid aufgetrennt, und die DNA-Banden wurden mit ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die DNA aus einem Aliquot; in dem die meisten der DNA-Fragmente in Größenbereich von 1 bis 5 kbp lagen, wurde mit NaOAc und Ethanol gefällt, und in 20 μl TE wieder gelöst.
Etwa 0,5 μg BamHI gespaltene, CIAP-behandelte pIJ2925-DNA und etwa 1 μg mit Sau3AI partiell gespaltene pCAR6-DNA wurden in 12 μl DNA-Ligase-Puffer gemischt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für 16 Stunden inkubiert.
Eine Kultur von E. coli DH5a (bezogen von Gibco-BRL) wurde in ähnlicher Weise, wie für E. coli HB101 in Bespiel 5 beschrieben, gezüchtet. Die Zellen aus dieser Kultur wurden mit MgCl₂ und CaCl₂ behandelt und dann mit der ligierten DNA transformiert. Transformanten wurden auf L-Agarplatten mit 50 μg ml^–1 Ampicillin, 12.5 μg ml^–1 Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG, von Gibco-BRL) und 40 μg ml^–1 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal, von Gibco-BRL) selektiert. Ungefähr 300 "weiße" Kolonien, die das X-Gal nicht in eine blaue Verbindung umwandeln konnten und daher wahrscheinlich eine Insertion im Polylinker von PIJ2925 enthalten, die das lacZ'-Gen auf dem Plasmid unterbrechen, wurden auf L-Agarplatten mit 50μg ml^–1 Ampicillin übertragen und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Auf jeder Platte befanden sich 25 Flecken, und davon wurden Platten-Duplikate hergestellt. Eine Gruppe von Platten wurde mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren zum Nachweis der Carbamoylase-Enzymaktivität verwendet. Die Zellen von 25 Flecken wurden in jedem Gefäß untersucht; eines von 12 Gefäßen ergab einen positiven Nachweis. Die Kolonien der entsprechenden Duplikat-Platte wurden erneut ausgestrichen, über Nacht gezüchtet und einzeln auf Carbamoylase-Aktivität untersucht. Einer von 25 Clonen ergab einen positiven Nachweis; 400 ml L-Medium, supplementiert mit 50 μg ml^–1 Ampicillin, wurden mit einer Kultur dieses Clons angeimpft und dann für etwa 20 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 37°C gezüchtet. Plasmid-DNA aus dieser Kultur wurde mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren isoliert. Das Plasmid wurde pCAR12 genannt; eine Restriktionskarte ist in 6 gezeigt.
Beispiel 7
Konstruktion von Plasmid pCAR21
Ungefähr 2 μg von Plasmid pCAR12 (Beispiel 6) wurden mit 5 Einheiten BglII (Gibco BRL) bei 37°C für 3 Stunden in BglII-Spaltungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl) gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.9%-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 1.9 kbp BglII-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 0,5 μg dieses DNA-Fragments wurden mit ungefähr 0,5 μg BamHI-gespaltener, CIAP-behandelter pIJ2925-DNA (Beispiel 6) in einem Gesamtvolumen von 12 μl DNA-Ligase-Puffer gemischt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für etwa 16 Stunden inkubiert und dann zur Transformation von E. coli DH5α verwendet. Die Zellen wurden auf L-Agarplatten, supplementiert mit Ampicillin, IPTG und X-Gal (Beispiel 6), ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 4 "weiße" Kolonien (vgl. Beispiel 6) wurden erneut auf L-Agarplatten mit Ampicillin, IPTG und X-Gal ausgestrichen, über Nacht bei 37°C gezüchtet und Plasmid-DNA-Präparationen im Kleinmaßstab wurden mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren mit einigen der Zellen durchgeführt.
Teile der DNA wurden mit Restriktionsenzymen gespalten, um die Restriktionskarte des Plasmids zu überprüfen. 3 der 4 untersuchten Clone enthielten ein BglII-Fragment von ungefähr 2 kbp, wie von dem ca. 1,9 kbp-Fragment von pCAR12 plus den Polylinkersequenzen von pIJ2925 zu erwarten war. Zellen dieser 3 Clone wurden mit dem "Phenolrot-Test" (Beispiel 3) auf Carbamoylase-Aktivität untersucht. Alle Nachweise waren positiv. 400 ml L-Medium mit 50 μg ml^–1 Ampicillin wurden mit einer Kultur von einem der 3 "positiven" Clone angeimpft und für etwa 20 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 37°C gezüchtet. Plasmid-DNA aus dieser Kultur wurde mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren isoliert. Dieses Plasmid wurde pCAR21 genannt; eine Restriktionskarte ist in 7 gezeigt.
Beispiel 8
Konstruktion von pCAR27 und pCAR28
Ungefähr 2 μg Plasmid pCAR21 wurden mit 5 Einheiten HindIII bei 37°C für 3 Stunden in HindIII-Spaltungspuffer gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.9%-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 1,9 kbp HindIII-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten, die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren extrahiert und die DNA wurde in 20 μl TE gelöst.
Ungefähr 1μg M13mp19-DNA [Norrander, Kempe und Messing, Gene 26 (1983), 101 – 106] in replikativer Form (RF) wurde mit 5 Einheiten HindIII für 3 Stunden bei 37°C in HindIII-Spaltungspuffer gespalten. Das Gemisch wurde mit gepuffertem Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die DNA wurde aus der erhaltenen wäßrigen Phase mit 3 M NaOAc und Ethanol gefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 20 μl TE wieder gelöst.
Etwa 0.8 μg der HindIII-gespaltenen M13mp19-DNA und etwa 0.2 μg des ca. 1.9 kbp HindIII-Fragments von pCAR21 wurden in 15 μl DNA-Ligase-Puffer gemischt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für 16 Stunden inkubiert.
Eine Kultur von E. coli DHSαF' (bezogen von Gibco-BRL) würde in ähnlicher Weise, wie für E. coli HB101 in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet. Die Zellen aus dieser Kultur wurden mit MgCl₂ und CaCl₂ behandelt (wie in Beispiel 5 beschrieben) und auf Eis für 2 Stunden inkubiert. Die Transfektion der E. coli-Zellen wurde durchgeführt wie folgt: 0.5 μl oder 4 μl des Ligierungs-Reaktionsgemisches wurden zu 200 μl Zellen zugegeben, auf Eis für 30 Minuten inkubiert, bei 42°C für 2 Minuten inkubiert und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. 100 μl einer Übernacht-Kultur von E. coli DH5α', 30 μl 2 %-iges X-Gal und 30 μl 2.5 %-iges IPTG wurden zu dem Gemisch aus Zellen und DNA zugegeben. Dieses Gemisch wurde zu 2.5 ml eines 1:1-Gemisches aus L-Medium und L-Agar (flüssig gehalten bei 48 – 50°C) zugegeben, schnell durchmischt und dann auf eine L-Agarplatte gegossen, um eine dünne Schicht über die gesamte Platte zu erzeugen. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
Ein Gemisch aus blauen (verursacht durch die auf X-Gal wirkende β-Galactosidase-Aktivität) und "weißen" (d.h. nicht blaue) Plaques war auf dem Belag aus DHSaF'-Zellen sichtbar. Die HindIII-Stelle liegt innerhalb des lacZ'-Gens von M13mp19. Daher sollte die Insertion von DNA an dieser Stelle das lacZ'-Gen inaktivieren und damit die β-Galactosidase-Aktivität in mit diesen M13mp19-Derivaten infizierten DHSαF'-Zellen inaktivieren. E. coli DHSαF' wurde in L-Medium bei 37°C für etwa 16 Stunden gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde 1:100 mit L-Medium verdünnt, und "weiße" Plaques wurden in 1 ml dieser verdünnten Kultur überimpft und in einem Schüttellinkubator (ca. 300 UpM) für 5 Stunden inkubiert. Die Kulturen wurden in Mikrozentrifugengefäße überführt und bei 12000 × g für 3 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Die Überstände wurden bei 4°C aufbewahrt; RF-DNA wurde aus jeder Zellprobe mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zur Plasmidisolierung im Kleinmaßstab isoliert. Restriktionsenzym-Spaltungen dieser Plasmide identifizierten zwei Isolate, die das ca. 1.9 kbp-Fragment von pCAR21, in beiden Orientierungen in M13mp19 inseriert, enthielten. 800 μl des Überstands von jeder der Kulturen, aus denen diese Plasmide isoliert wurden, wurden einzeln in 400 ml L-Medium überimpft, da 4 ml einer Übernacht-Kultur von E. coli DHSαF' enthielt. Die Überstände enthalten Bakteriophagenpartikel; diese können die DHSαF'-Zellen infizieren und doppelsträngige RF-DNA in den Zellen produzieren. Jede der 400 ml-Kulturen wurde für 20 Stunden bei 37°C gezüchtet und, wie in Beispiel 4 beschrieben, behandelt, um Plasmid (RF)-DNA aufzureinigen. Restriktions-enzym-Spaltungen bestätigten die Strukturen der Plasmide. Das Plasmid aus der einen Kultur wurde pCAR27 genannt (8) und das Plasmid aus der anderen Kultur wurde pCAR28 genannt (9).
Beispiel 9
Bestimmung der Nucleotidsequenz der Agrobakterium-DNA in pCAR27 und pCAR28
Die Plasmide pCAR27 und pCAR28 wurden in ähnlicher Weise behandelt, um ineinandergeschachtelte ("nested") Sätze deletierter Clone und Matrizen zur Sequenzierung zu erzeugen:
Ungefähr 8 μg RF-DNA wurde mit 10 Einheiten KpnI und 10 Einheiten BamHI in 100 μl 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl gespalten. Die DNA wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol in Gegenwart von 0.3 M NaOAc gefällt. Die erhaltene DNA wurde nach dem von Henikoff beschriebenen Verfahren (Gene 28 (1984), 351 – 359) mit Exonuclease III behandelt, um Teile der Agrobakterium-DNA in den Plasmiden zu deletieren. Die ligierten Produkte wurden nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren zur Transfektion von E. coli DHSαF'-Zellen verwendet. Matrizen-DNA zur Verwendung in den Sequenzierunsreaktionen wurde hergestellt wie folgt: "Weiße" Plaques wurden einzeln in 1 ml einer E. coli DHSαF'-Kultur überimpft (vgl. Beispiel 8), für 5 – 6 Stunden bei 37°C unter lebhaftem Schütteln (300 Upm) gezüchtet und die Zellen wurden dann durch Zentrifugation sedimentiert. 800 μl Überstand wurden in ein neues Gefäß mit 150 μl 20 %-igem Polyethylenglykol (PEG 6000), 2.5 M NaCl überführt, gemischt und bei Raumtemperatur für 12 Minuten inkubiert. Das Gefäß wurde bei 12000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Bakteriophagenpartikel zu sedimentieren und der Überstand wurde verworfen. Das Gefäß wurde erneut kurz zentrifugiert, der Überstand wurde vollständig entfernt und der Niederschlag wurde in 100 μl 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA (pH 8.0) resuspendiert. 50 μl Phenol (mit 100 mM Tris-HCl pH 8.0 auf pH-Wert 7 gepuffert) wurden zugegeben, gemischt und das Gefäß wurde bei Raumtemperatur für 5 Minu-ten inkubiert. Das Gefäß wurde bei 12000 × g für 3 Minuten zentrifugiert und die wäßrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, mit Chloroform extrahiert und mit NaOAc und Ethanol versetzt, um die DNA zu fällen. Die DNA wurde durch Zentrifugation erhalten und in 16 μl Wasser gelöst. Diese DNA ist einzelsträngige DNA aus M13-Bakteriophagenpartikeln und wurde als Matrize für die Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die Sequenzierung wurde mit Sequenase-Enzym (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, 44122, USA) nach dem Verfahren, das mit dem das Enzym enthaltenden Kit bereitgestellt wurde, durchgeführt. Mehrere Matrizen wurden sequenziert, um die vollständige Sequenz der pCAR27-Insertion zu erhalten. Matrizen aus den Deletionen von pCAR28 wurden zur Bestimmung der Sequenz des Fragments in der Gegenrichtung verwendet. Die Sequenzen aus beiden Richtungen wurden mit der Software von DNASTAR Inc., Madison, WI 53715, USA, verglichen, um eine Consensus-Sequenz für die 1880 bp-Agrobakterium-DNA zu erzeugen; diese Consensus-Sequenz ist, zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Carbamoylase-Enzyms, in 10 gezeigt.
Beispiel 10
Konstruktion von pCAR29
Ungefähr 2 μg RF-DNA von pCAR28 (Beispiel 8; 9) wurden mit 5 Einheiten BspHI (New England Biolabs, Beverly MA 01915, USA) in 50 μl 20 mM Tris-HCl pH7.4, 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl gespalten. Die DNA wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Chloroform-Extraktion gereinigt, mit NaOAc und Ethanol gefällt, durch Zentrifugation erhalten und in 40 μl 10mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 50 μg ml^–1 Rinderserumalbumin, 10 mM 2-Mercaptoethanol wieder gelöst. 1 μl eines Gemisches aus 250 μM Desoxyguanosintriphosphat, 250μM Desoxythymidintriphosphat und 250μM Desoxycytidintriphosphat wurde zugegeben, gefolgt von 2 Einheiten "Klenow-Fragment" der E. coli-DNA-Polymerase I (Gibco-BRL). Das Gefäß wurde bei 37°C für 10 Minuten inkubiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Chloroform extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde zur Fällung der DNA mit NaOAc und Ethanol versetzt, wobei die DNA durch Zentri fugation erhalten und in 50 μl 50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl wieder gelöst wurde. Jeweils 5 Einheiten der Restriktionsenzyme HindIII und EcoRV (Gibco-BRL) wurden zugegeben, der Inhalt des Gefäßes gemischt und das Gefäß bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Die gespaltene DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0.9 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das 990 bp-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren aus dem Agarosestück isoliert. Die DNA wurde in 20 μl Wasser wieder gelöst.
pTR550 (11) ist ein von Dr. G.M.P. Lawrence (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Great Burgh, Epsom, Surrey, UK) konstruierter Plasmidvektor und ist ein Derivat von pKK223-3 (Pharmacia LKB Biotechnology, S-751 82 Uppsala, Schweden). In pTR550 wurde der Großteil von pKK223-3, der von pBR322 abstammt, durch DNA von pAT153 ersetzt. Ungefähr 1μg pTR550 wurde mit 5 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (Gibco-BRL) in 30 μl 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl für 3 Stunden bei 37°C gespalten. Die gespaltene DNA wurde mittels Phenol/Chloroform- und Chloroform-Extraktion gereinigt, mit NaOAc und Ethanol gefällt, durch Zentrifugation erhalten und in 30 μl 50 mM Tris-HCl (pH8.0), 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl mit 5 Einheiten HindIII wieder gelöst. Das Gemisch wurde bei 37°C für 3 Stunden inkubiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die erhaltene wäßrige Phase wurde zur Fällung der DNA mit NaOAc und Ethanol versetzt. Die DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 20 μl Wasser wieder gelöst.
Ungefähr 0.5 μg der mit SmaI und HindIII gespaltenen pTR550-DNA wurde mit ungefähr 0.2 μg des 990 bp-Fragments (von der BspHI-Stelle am Beginn des Carbamoylase-Gens bis zu der HindIII-Stelle am Ende der sequenzierten DNA) von pCAR28 in 20 μl DNA-Ligasepuffer gemischt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für etwa 16 Stunden inkubiert.
Eine Kultur von E. coli JM101 (Messing, Reconbinant DNA Technical Bulletin (NIH) 2, Nr. 2 (1979); 43 – 48) wurde gezüchtet, und die Zellen in ähnlicher Weise, wie für E. coli HB101 in Beispiel 5 beschrieben, mit CaCl₂ und MgCl₂ behandelt. Die Zellen wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit dem Ligierungs-DNA-Gemisch transformiert: Verdünnungen der Zellen wurden auf L-Agarplatten mit 50 μg ml^–1 Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 22 Ampicillin-resistente Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten mit 50 μg ml^–1 Ampicillin ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und dann wurden Plasmid-DNA-Isolierungen im Kleinmaßstab (mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) aus Zellen von jedem dieser Isolate durchgeführt. Restriktionsenzym-Spaltungen der DNA-Präparationen ergaben ein Plasmid der gewünschten Konstruktion. Das dieses Plasmid enthaltende Isolat wurde in 400 ml L-Medium mit 50 μg ml^–1 Ampicillin überimpft, über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 37°C gezüchtet und die Plasmid-DNA wurde mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren isoliert. Restriktionsenzym-Spaltungen bestätigten die korrekte Struktur dieses Plasmids; das Plasmid wurde pCAR29 genannt (12).
Beispiel 11
Expression der Carbamoylase in pCAR29 enthaltendem E. coli JM101
pCAR29 enthaltender E. coli JM101 (Beispiel 10) wurde in 10 ml L-Medium mit 50 μg ml^–1 Ampicillin überimpft und über Nacht bei 37°C in einem Schüttelinkubator gezüchtet. 600 μl dieser Kultur wurde in 60 ml L-Medium mit 50 μg ml^–1 Ampicillin in einen 250 ml Erlenmayerkolben überimpft und in einem Schüttelinkubator bei 37°C gezüchtet. Nach 2 Stunden (Optische Dichte bei 600 nm = ca. 0.3) wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Züchtung wurde für 3 weitere Stunden fortgeführt. Die E. coli-Zellen in der Kultur besaßen Carbamoylase-Aktivität. pTR550 enthaltende E. coli JM101-Zellen, in der vorstehend beschriebenen Weise gezüchtet, besaßen keinerlei Carbamoylase-Aktivität.
Beispiel 12
Übertragung von pCAR1 von E. coli auf Agrobakterium
Das Plasmid pCAR1 wurde durch eine Dreifach-Kreuzung durch Konjugation der Bakterien mit E. coli (pRK2013) als "Helferstamm", der die zur Plasmid-Übertragung notwendigen Funktionen liefert, von E. coli auf Agrobakterium übertragen. Agrobakterium 15-10 ist ein durch Mutagenese mit ultraviolettem Licht von Agrobakterium 80/44-2A abgeleiteter Stamm. Eine 10 ml-Kultur von Agrobakterium 15-10 wurde in L-Medium bei 30°C in einem Schüttelinkubator für ungefähr 20 Stunden gezüchtet. Eine 10 ml-Kultur von E. coli AG1 (pCAR1) – vgl. Beispiel 3 – wurde in L-Medium mit 10 μg/ml Tetracyclin bei 37°C in einem Schüttelinkubator für ungefähr 16 Stunden gezüchtet. Eine 10 ml-Kultur von E. coli HB101 (pRK2013) – vgl. Figurski and Helinski, Proceedings of the National Academy of Science, USA 76 (1979), 1684 – 1652 – wurde in L-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat bei 37°C in einem Schüttelinkubator für ungefähr 16 Stunden gezüchtet. 800 μl von jeder Kultur wurden durch einen sterilen HA-Filter mit 0.45 μm-Porengröße (Millipore, Blackmoor Lane, Watford, WD1 8YW, U.K.) filtriert. Der Filter, der die Zellen aus der Kultur zurückhält, wurde dann auf die Oberfläche einer L-Agarplatte gelegt und wurde für 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Der Filter wurde von der Oberfläche der Platte in einen Schraubdeckel-Behälter mit 1 ml sterilem Salz-Phosphat-Puffer überführt und der Behälter wurde geschüttelt, um die Zellen vom Filter zu resuspendieren. 100 μl dieser Lösung und Verdünnungen in Salz-Phosphat-Puffer wurden auf Minimal-Medium (MM: 1 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄·7H₂O, 0.1 g CaCl₂·2H₂O, 15 mg MnSO₄·4H₂O, 20 mg FeSO₄·7H₂O, 5 g Glucose, 2 g (NH₄)₂S0₄ und 15 g Agar, mit 5 M NaOH auf pH-Wert 7.0 eingestellt) mit 100 μg/ml Streptomycinsulfat und 10 μg/ml Tetracyclin ausplattiert. Die E. coli-Elternstämme sollten nicht in der Lage sein, auf MM mit 100 μg/ml Streptomycin zu wachsen. Agrobakterium 15- 10 sollte nicht in Gegenwart von 10 μg/ml Tetracyclin wachsen. Daher sollten nur pCAR1-enthaltende Agrobakterium 15-10-Zellen auf diesem Medium wachsen. Nach 5-tägiger Züchtung bei 30°C wurden Kolonien erneut auf L-Agarplatten mit 25 μg/ml Streptomycinsulfat und 10 μg/ml Tetracyclin ausgestrichen und bei 30°C für weitere 3 Tage inkubiert. Die Plasmid-DNA von vier Isolaten wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert. Restriktionsenzym-Spaltung eines Teils der Plasmid-DNA wurde verwendet, um zu bestätigen, daß die Tetracyclin-resistenten Exkonjuganten (d.h. die Nachkommen aus der Konjugation) tatsächlich pCAR1 enthielten.
Beispiel 13
Übertragung von pCAR6 von E. coli auf Agrobakterium
Das für diese Übertragung verwendete Verfahren war dem für pCAR1 in Beispiel 12 beschriebenen sehr ähnlich. Die Eltern in der Kreuzung waren E. coli HB101 (pCAR6) – vgl. Beispiel 5 – E. coli HB101 (pRK2013) – vgl. Beispiel 12 – und Agrobakterium 15-10 – vgl. Beispiel 12. Da beide E. coli-Eltern-Stämme auxotroph sind, wurden die Nachkommen der Kreuzung auf MM mit 10 μg/ml Tertacyclin, aber ohne Streptomycin, ausplattiert, um auf Agrobakterium 15-10 (pCAR6)-Kolonien zu selektieren. Die Anwesenheit von pCAR6 wurde durch Analyse einer Restriktionsenzym-Spaltung der aus den Exkonjuganten isolierten Plasmid-DNA bestätigt.
Beispiel 14
Übertragung von pCP19 von E. coli auf Agrobakterium
Das für diese Übertragung verwendete Verfahren war das gleiche wie das für pCAR6 in Beispiel 13 beschriebene, außer daß E. coli HB101 (pCP19) statt E. coli HB101 (pCAR6) ein Elternstamm in der Kreuzung war. Die Anwesenheit von pCP19 in Exkonjuganten wurde durch Analyse einer Restriktionsenzym-Spaltung der aus den Exkonjuganten isolierten Plasmid-DNA bestätigt.
Beispiel 15
Nachweis einer mit pCAR1 und pCAR6 assoziierten zusätzlichen Hydantoinase-Aktivität
Agrobakterium 15-10 (pCAR1), Agrobakterium 15-10 (pCAR6) und Agrobakterium 15-10 (pCP19) wurden jeweils in 50 ml AJ-1-Medium mit 0.1 % Alanin-Hydantoin und 10 μg/ml Chloramphenicol überimpft und für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30°C gezüchtet. Jede der Kulturen wurde dann behandelt wie folgt: Die Zellen aus 5 ml Kultur wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Feuchtgewicht der Zellen wurde bestimmt. Die Zellen wurden in 20 ml 1 %-igem D,L-5-(p-Hydroxyphenyl)-hydantoin in 0.2 M Tris in einem 50 ml Erlenmayerkolben mit Schraubverschluß resuspendiert und in einem Wasserbad bei 42°C geschüttelt. Proben wurden nach 10-minütiger und nach 30-minütiger Inkubation entnommen; die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand wurde mit HPLC auf die Anwesenheit von D-N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin untersucht. Die Hydantoinase-Aktivität, in μmol Produkt pro g Zellen (Feuchtgewicht) pro Stunde, wurde aus der Differenz der Mengen des D-N-Carbamoyl-p-hydroxyphenylglycin-Produkts nach 30 Minuten und nach 10 Minuten berechnet. Die Hydantoinase-Aktivität von pCAR1 oder pCAR6 enthaltendem Agrobakterium 15-10 war 5 – 6-mal höher als die Aktivität von pCP19 enthaltendem Agrobakterium 15-10, was darauf hinweist, daß pCAR1 und pCAR6 das die Hydantoinase-Aktivität codierende Gen enthalten.
Beispiel 16
Konstruktion von Plasmid pCAR26
Der Plasmidvektor pKT210 (Bagdasarian et al., Gene 16 (1981), S. 237 – 247; Karte in 13) ist ein Chloramphenicol-resistentes Derivat von dem Plasmid mit breitem Wirtsspektrum RSF1010. Ungefähr 2 μg der pKT210-DNA wurden mit 5 Einheiten EcoRI (Gibco-BRL) bei 37°C für 3 Stunden in EcoRI-Spaltungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl) gespalten. Ein Teil des Spaltungsgemisches wurde durch Elektrophorese analysiert; die Spaltung war scheinbar nicht vollständig, dennoch wurde eine Einheit CIAP zugegeben und die Inkubation wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Das Spaltungsgemisch wurde auf ein 0.9 %-iges Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetragen und die DNA wurde durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das der linearisierten Plasmid-DNA entsprechende ca. 11.4 kbp-EcoRI-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 2 μg pCAR12 (Beispiel 6; vgl: auch 6) wurde mit 10 Einheiten EcoRI bei 37°C für 3 Stunden in EcoRI-Spaltungspuffer gespalten. Die gespaltene DNA würde auf einem 0.9 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 2.7 kbp-EcoRI-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 0.5 μg dieses ca. 2.7 kbp-DNA-Fragments wurden mit ungefähr 0.5 μg der EcoRI gespaltenen, CIAP behandelten pKT210-DNA in einem Gesamtvolumen von 12 μl Ligasepuffer gemischt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für etwa 16 Stunden inkubiert.
Eine Kultur von E. coli AG1 (vgl. Beispiel 2) wurde in ähnlicher Weise, wie für E. coli HB101 in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet. Die Zellen aus dieser Kultur wurden mit MgCl₂ und CaCl₂ behandelt und dann in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit der ligierten DNA transformiert. Das Gemisch aus Zellen und DNA wurde auf L-Agarplatten, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, ausgestrichen und die Platten wurden bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. 17 Chloramphenicol-resistente Transformanten wurden erneut auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Ein Impföse voll Zellen jeder Transformante wurde von der Platte abgeschabt und in 600 μl des "Phenolrot"-Testpuffers resuspendiert (Beispiel 3). Nach Inkubation für 5 Stunden bei 42°C hatten 3 der Reaktionen eine rosa Färbung entwickelt. Die Plasmid-DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren im Kleinmaßstab aus den Kulturen, die der Rosafärbung in den Tests entsprachen, isoliert. Restriktionsenzym-Spaltung der DNA-Präparationen zeigte die Anwesenheit des ca. 2.7 kbp-Fragments von pCAR12. Eine der Plasmid-Präparationen besaß zwei Kopien des Fragments von pCAR12; dieses Plasmid wurde pCAR26 genannt. Weitere Restriktionsenzym-Spaltungen zeigten, daß pCAR26 die gesamte Agrobakterium-DNA aus pCAR12 enthielt, d.h. das Fragment von pCAR12 erstreckt sich hinter der EcoRI-Stelle im Carbamoylase-Gen (vgl. 6 und 10) bis zu der EcoRI-Stelle im Polylinker. Daher muß das isolierte Fragment (von ca. 2.7kbp) aus partiell gespaltenem pCAR12 entstanden sein. Eine Karte von pCAR26 ist in 14 gezeigt. Das Plasmid pCAR26 enthält zwei Kopien des vollständigen Carbamoylase-Gens.
Beispiel 17
Übertragung von pCAR26 von E. coli auf Agrobakterium
Wie pCP 19-Derivate können von pKT210 abgeleitete Plasmide durch Kreuzung unter Verwendung des Helferplasmids pRK2013 übertragen werden. Das für die Übertragung von pCAR26 verwendete Verfahren war ähnlich dem für pCAR1 in Beispiel 12 beschriebenen, jedoch mit den nachstehend beschriebenen Veränderungen. E. coli AG1 (pCAR26) wurde bei 37°C für 16 Stunden in L-Medium mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol gezüchtet; E. coli HB101 (pRK2013) und Agrobakterium 15-10 wurden, wie in Beispiel 12 beschrieben, gezüchtet. Zellen aus diesen 3 Kulturen wurden auf Filtern gekreuzt und dann auf MM mit 10 μg ml^–1 Chloramphenicol ausplattiert. Nach 5-tägigem Wachstum wurden Kolonien auf L-Agar mit 25 μg ml^–1 Streptomycin und 10 μg ml^–1 Chloramphenicol erneut ausgestrichen und bei 30°C für 3 Tage inkubiert. Die Plasmid-DNA eine Isolats wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert. Restriktionsenzym-Spaltung dieser DNA bestätigte die Anwesenheit von pCAR26.
Beispiel 18
Konstruktion eines Mobilisations-defekten Derivats von pKT210
Ungefähr 2 μg pKT210 wurden mit 5 Einheiten PflMI (New England Biolabs; c/o CP Laboratories P.O. Box 22 Bishop's Stortford, Herts CM23 3DH) in PflMI-Puffer (100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH7.9; 10 mM MgCl₂; 1 mM Dithiothreit; 100 μg ml^–1 Rinderserumalbumin) bei 37°C für 16 Stunden gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.75 %- igen Agarosegel durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der dem 10.5 kb-Fragment entsprach, wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde durch Elektroelution mit einem Elektroelutionsgerät, Modell UEA (International Biotechnologies Inc. PO Box 9558 New Haven, Connecticut CT 06535) unter den im Gerätehandbuch beschriebenen Bedingungen isoliert, gefolgt von einer Isopropanol-Fällung und einer anschließenden Zentrifugation, um die DNA zu sammeln. Die DNA wurde in 32 μl TE wieder gelöst, 8 μl eines Gemisches aus 150 mM Natriumacetat (pH5.0), 250 mM NaCl, 5 mM Zinkacetat, 25 % Glycerin wurden zugegeben, gefolgt von 20 Einheiten Mungbohnen-Nuclease (New England Biolabs). Dieses Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, wodurch glatte Enden an dem DNA-Fragment erzeugt werden sollten. Die gespaltene DNA wurde aufgetrennt und das 10.5 kbp-Fragment, wie vorstehend beschrieben, isoliert. Die DNA wurde in 20 μl TE wieder gelöst, dazu wurden 5 μl 5× Ligierungspuffer (Gibco-BRL) und eine Einheit T4 DNA-Ligase zugegeben. Das Ligierungsgemisch wurde bei 12°C für 16 Stunden inkubiert.
E. coli HB101 wurde mit 10 μl des Ligierungsgemisches, wie in Beispiel 5 beschrieben, transformiert. Verdünnungen dieses Gemisches wurden auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert; nur wenige Transformanten wurden erhalten und diese wuchsen langsam auf den ursprünglichen Selektionsplatten. 16 Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen und für 16 Stunden bei 37°C inkubiert, wonach die Zellen abgeschabt und Präparationen im Kleinmaßstab mit einer veränderten Version des Schnellkoch-Verfahrens durchgeführt wurden (Holmes, D.S. and Quigley M., Anal. Biochem. 114 (1981), S. 193). Die Zellen jeder Transformante wurden in 300 μl STET (8 % Saccharose Gew. / Vol.; 0.5 % Triton X-100 Gew. / Vol.; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) in einem Mikrozentrifugengefäß resuspendiert und 10 μl 33 mg/ml Lysozym in STET wurden zugegeben. Die Suspension wurde auf Eis für 30 Minuten inkubiert und dann für 3 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Das Gefäß wurde für 15 Minuten zentrifugiert und der Niederschlag mit einem Zahnstocher mit flachen Seiten entfernt. Das Volumen wurde auf 330 μl mit STET korrigiert und weitere 330 μl Isopropanol wurden zugegeben. Das Gefäß wurde zur Durchmischung des Inhalts geschüttelt, für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Der Niederschlag konnte trocknen und wurde dann in 30 μl TE resuspendiert. 2 μl-Portionen wurden mit Restriktionsenzymen gespalten, um die Restriktionskarte jedes Plasmids zu bestimmen. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym AccI (Gibco-BRL) in einem Gesamtvolumen von 10 μl React 3-Restriktionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH8.0; 10 mM MgCl₂; 100 mM NaCl), der 5 Einheiten AccI enthielt, für 2 Stunden bei 37°C gespalten. Die Plasmid-DNA eines der Clone hatte offensichtlich eine der in pKT210 anwesenden AccI-Stellen verloren (13), was, wie erwartet, auf den Verlust des größeren (526 bp) PflMI-Fragments von pKT210 hindeutet. Durch Spaltung dieses pWOR901 genannten Plasmids mit PflMI wurde jedoch gefunden, daß nur eines von zwei PflMI-Fragmenten deletiert worden war, wobei das kleinere erhalten blieb (15). Dies war unerwartet und legte nahe, daß das aus der PflMI-Spaltung isolierte Fragment ein Fragment von ungefähr 10.9 kbp aus einer partiellen Spaltung von pKT210 enthalten haben mußte (13). Es wurde gefunden, daß die Übertragungshäufigkeit von pWOR901 in Dreifach-Kreuzungen (mit einem dem in Beispiel 17 beschriebenen ähnlichen Verfahren durchgeführt) ungefähr 10⁴ - 10⁵-fach, verglichen mit der Übertragungshäufigkeit von pKT210, geringer war. 500 ml L-Medium, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, wurden mit dem pWOR901 enthaltenden E. coli HB101-Isolat angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren isoliert.
Beispiel 19
Elektroporation von pWOR901 in Agrobakterium 15-10 und Isolierung von pWOR902
Ungefähr 200 ng pWOR901-DNA (Beispiel 18) wurden zur Transformation von Agrobakterium 15-10 durch Hochspartnungs-Elektroporation verwendet (Wen-jun. S. und Forde B.G., Nucleic Acids Research 17 (1989), 5.8385). Die größte Effizienz wurde bei Verwendung eines Widerstands von 600 Ohm erzielt. Transformanten wurden auf L-Agarplatten mit 10 μg ml^–1 Chloramphenicol bei Züchtung bei 30°C für 4 Tage selektiert. 22 Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab wurden mit Zellen von erneut ausgestrichenen Transformanten-Kolonien mit dem in Beispiel 18 beschriebenen Schnellkoch-Verfahren durchgeführt. Restriktionsspaltungen der Plasmid-DNA wurden mit 5 Einheiten PstI in React 2-Restriktionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM MgCl₂; 50 mM NaCl) für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. In diesen Ergebnissen wurden verschiedene Restriktionsmuster beobachtet. Vertreter der verschiedenen Plasmidtypen wurden zur Transformation von E. coli HB101 (mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) verwendet. Nur eines der zur Transformation von E. coli verwendeten Plasmide ergab stabile Chloramphenicol-resistente Kolonien. Spaltungen der aus diesen Chloramphenicol-resistenten Kolonien isolierten Plasmid-DNA zeigten, daß eine weitere Deletion von ungefähr 500 bp stattgefunden hatte. Diese Deletion entfernte das kleine PflMI-Fragment von pWOR901 vollständig. Das neue Plasmid wurde pWOR902 genannt. Eine DNA-Präparation im Großmaßstab wurde mit einer 400 ml-Kultur von E. coli HB101 (pWOR902) durchgeführt. Diese DNA besaß keine PflMI-Stellen (in 16 gezeigte Karte). Nach Übertragung durch Elektroporation wurde pWOR902 offensichtlich stabil in Agrobakterium 15-10 aufrechterhalten. Somit ist pWOR902 ein stabiles, Mobilisations-defizientes (Mob^-) Derivat von pKT210, das geeignet ist zur Verwendung in E. coli und in Agrobakterium. E. coli HB101 (pWOR902) wurde in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland am 4. November 1991 unter der Eingangsnummer NCIMB 40451 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde gemäß dem Budapester Vertrag für die Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentierungsverfahrens durchgeführt.
Beispiel 20
Konstruktion von pCAR44 und Übertragung in Agrobakterium
Ungefähr 2 μg von Plasmid pCAR21 (Beispiel 7) wurden mit 5 Einheiten HindIII bei 37°C für 3 Stunden in HindIII-Spaltungspuffer gespalten. Das 1.9 kbp-Fragment wurde durch Elektroelution aus einem Agarose-Gelstück nach Auftrennung durch Elektrophorese in TBE isoliert (Beispiel 18). Die erhaltene DNA wurde in 10 μl TE wieder gelöst.
Ungefähr 0.5 μg pWOR902 (Beispiel 19) wurden mit HindIII gespalten, CIAP behandelt und in 10 μl TE wieder gelöst. In einem Versuch, mehrfache Insertionen zu erhalten, wurde ein Überschuß von Fragment (von pCAR21) mit Vektor ligiert: 0.1 μl geschnittenes pWOR902 und 10 μl des 1.9 kbp-Fragments wurden in einem Gesamtvolumen von 15 μl Ligierungspuffer (Gibco-BRL), der 1 Einheit T4 DNA-Ligase enthielt, für ungefähr 16 Stunden bei 12°C gemischt: 5 μl des Ligierungsgemisches wurden zur Transformation von E. coli HB101 (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) verwendet und die Zellen wurden auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen und bei 37°C für 2 Tage inkubiert. 24 Transformanten wurden erneut auf L-Agar mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, über Nacht bei 37°C gezüchtet und dann wurden Zellen von der Platte abgeschabt und für Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab verwendet (Beispiel 18). Um die Zahl der Insertionen und ihre Orientierung zu bestimmen, wurde eine EcoRI-Spaltung mit einem DNA-Aliquot jeder Präparation durchgeführt. Die Analyse der gespaltenen DNA zeigte, daß 5 der Clone Doppelinsertionen des Fragments von pCAR21 enthielten; alle diese Plasmide zeigten die gleiche Insertions-Orientierung, und dieser Plasmidtyp wurde pCAR44 genannt (Karte in 17). 16 dieser Clone enthielten eine Insertion des pCAR21-Fragments in pWOR902. Eine Plasmidpräparation im Großmaßstab wurde mit einer 500 ml Kultur von einem der E. coli HB101 (pCAR44)-Isolate durchgeführt (Verfahren aus Beispiel 4) und 200 ng dieser DNA wurde zur Transförmation von Agrobakterium 15-10 durch Elektroporation verwendet (Beispiel 19). Die Transformanten wurden Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab unterzogen; Restriktionsenzym-Spaltungen bestätigten die Anwesenheit von pCAR44.
Beispiel 21
Nachweis einer zusätzlichen mit pCAR26 und pCAR44 assoziierten Carbamoylase- Aktivität in Agrobakterium
Agrobakterium 15-10 wurde in 50 ml AJ-1-Medium überimpft; Agrobakterium 15-10 (pCAR26) und Agrobakterium 15-10 (pCAR44) wurden jeweils in 50ml AJ-1-Medium mit 10μg ml^–1 Chloramphenicol überimpft. Alle drei Kulturen wurden für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30°C gezüchtet; dann wurde jede Kultur behandelt wie folgt: 1.36 ml Kulturmedium wurden in einem Mikrozentrifugengefäß mit 140 μl 1 %-igem Hexadecyltrimethylammoniumbromid (in 65 mM Na₂HPO₄, 35 mM NaH₂PO₄, pH 7.0) gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. 50 μl dieses Gemisches wurde in ein Mikrozentrifugengefäß überführt, das 1.45 ml 1.5 %-iges (Gew. / Vol.) D-N-Carbamoyl-phydroxyphenylglycin in 65 mM Na₂HPO₄, 35 mM NaH₂PO₄ (pH 7.0; neu eingestellt auf pH 7.0 nach Auflösung des Reaktionssubstrats) enthielt. Der Inhalt des Gefäßes wurde gemischt und bei 48°C für 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand wurde mit HPLC auf die Anwesenheit von D(-)-p-Hydroxyphenylglycin, erzeugt durch das Carbamoylase-Enzym, analysiert. Die Carbamoylase-Aktivitäten für Agrobakterium 15-10 mit pCAR26 oder pCAR44 waren, pro ml Kulturmedium, 10 – 30-mal höher als die Aktivität für Agrobakterium 15-10, wahrscheinlich weil die zusätzlichen Kopien des Carbamoylase-Gens in den rekombinanten Stämmen dazu führten, daß mehr Carbamoylase-Enzym produziert wurde.
Beispiel 22
Konstruktion von pWOR903
Ungefähr 2 μg pWOR902-DNA (Beispiel 19) wurden mit 10 Einheiten HindIII bei 37°C für 15 Stunden in HindIII-Spaltungspuffer gespalten. Die DNA wurde über Phenol/Chloroform-Extraktion und Chloroform-Extraktion gereinigt, mit NaOAc und Ethanol gefällt, durch Zentrifugation erhalten und in 40 μl 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 50 μg ml^–1 Rinderserumalbumin, 10 mM 2-Mercaptoethanol wieder gelöst. 1 μl eines Gemisches aus 250 μM Desoxyguanosintriphosphat, 250 μM Desoxythymidintriphosphat und 250 μM Desoxycytidintriphosphat würde zugegeben, gefolgt von 2 Einheiten "Klenow-Fragment" der E. coli-DNA-Polymease I (Gibco-BRL). Das Gefäß wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Chloroform extrahiert. Die erhaltene wäßrige Phase wurde zur Fällung der DNA mit NaOAc und Ethanol versetzt, wobei die DNA durch Zentrifugation erhalten und in 15 μl DNA-Ligasepuffer wieder gelöst wurde. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 12°C für etwa 16 Stunden inkubiert.
5 μl des Ligierungsgemisches wurde zur Transformation von E. coli HB101 (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) und die Zellen wurden auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen und bei 37°C für 2 Tage inkubiert. 16 Transformanten wurden erneut auf L-Agar mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, über Nacht bei 37°C gezüchtet und dann wurden Zellen von der Platte abgeschabt und für Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab verwendet (Beispiel 18).
Ziel dieses Experiments war die Auffüllung der durch die HindIII-Spaltung erzeugten zurückgesetzten Enden, um DNA-Fragmente mit glatten Enden zu erzeugen. Dies würde nach Religierung die Erkennungsstellen für HindIII entfernen. Um zu bestimmen, ob dies stattgefunden hat, wurden DNA-Aliquots der Plasmidpräparationen mit HindIII gespalten. Weitere Aliquots wurden mit EcoRV gespalten. Die meisten der Transformanten enthielten scheinbar ein Plasmid ohne HindIII-Stellen, aber mit pWOR902-ähnlichen EcoRV-Spaltungsmustern. Eine Plasmidpräparation im Großmaßstab wurde mit einer 500 ml-Kultur eines dieser Isolate durchgeführt (Verfahren aus Beispiel 4). Dieses Plasmid, pWOR903 (in 18 gezeigte Karte), besaß eine pWOR902 ähnliche Restriktionskarte, jedoch ohne die HindIII-Stelle.
Beispiel 23
Konstruktion von pWOR904 und pWOR905
Ungefähr 1 μg pWOR903-DNA (Beispiel 22) wurde mit 5 Einheiten EcoRI bei 37°C für 3 Stunden in EcoRI-Puffer gespalten. Das Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und die DNA wurde durch Fällung mit NaOAC und Ethanol erhalten. Die erhaltene DNA wurde in 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA (pH 8.0), die 1 Einheit CIAP enthielten, gelöst. Diese Phosphatase-Behandlung und die Gewinnung der DNA waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Die DNA wurde in 10 μl Wasser wieder gelöst.
Das Plasmid pIC20R (Marsh et al., Gene 32 (1984), 481 – 485) ist den pUC-Plasmiden ähnlich (Vieira and Messing, Gene 19 (1982), 259 – 268), aber mit einem modifizierten Polylinker. Ungefähr 2 μg pIC20R-DNA wurden mit 5 Einheiten EcoRI bei 37°C für etwa 15 Stunden in EcoRI-Puffer gespalten. Das dem Polylinker-Segment von pIC20R entsprechende 84 bp-Fragment wurde durch Elektroelution aus einem Agarosestück nach Auftrennung durch Elektrophorese in TBE-Puffer isoliert (Beispiel 18). Die erhaltene DNA wurde in 10 μl Wasser wieder gelöst.
8 μl des 84 bp-EcoRI-Fragments von pIC20R wurde mit 0.5 μl des EcoRI-geschnittenen, CIAP-behandelten pWOR903 in einem Gesamtvolumen von 12μl Ligierungspuffer, der 1 Einheit T4 DNA-Ligase enthielt, für ungefähr 16 Stunden bei 12°C gemischt. 5 μl des Ligierungsgemisches wurden zur Transformation von E. coli JM101 verwendet (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) und die Zellen wurden auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramplienicol ausgestrichen und bei 37°C für 2 Tage inkubiert. 64 Transformanten wurden erneut auf L-Agar mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, über Nacht bei 37°C gezüchtet und dann wurden Zellen von der Platte abgeschabt und für Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab verwendet (Beispiel 18).
Aliquots der DNA-Präparationen wurden mit HindIII gespalten, um die Anwesenheit des Polylinkers nachzuweisen. Weitere Spaltungen mit PstI, SstI und Doppelspaltungen mit BglII und SstI wurden durchgeführt, um die Orientierung des Polylinkers zu bestimmen. Isolate, die den Polylinker in der einen oder der anderen Orientierung enthielten, wurden erhalten; Plasmidpräparationen im Großmaßstab wurde mit 500 ml-Kulturen mit je einem Isolattyp durchgeführt (Verfahren aus Beispiel 4). Restriktionskarten der Plasmide, genannt pWOR904 und pWOR905, sind in den 19 und 20 gezeigt.
Beispiel 24
Konstruktion von pCAR46 und Übertragung auf Agrobakterium
Ungefähr 2 μg pCAR29-DNA (Beispiel 10) wurden mit 5 Einheiten BglII und 5 Einheiten HindIII in insgesamt 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl für 3 Stunden bei 37°C gespalten. Das 1.35 kbp-Fragment wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegelstück nach Auftrennung durch Elektrophorese isoliert (Beispiel 18). Die erhaltene DNA wurde in 10 μl TE wieder gelöst.
Ungefähr 2 μg pWOR904-DNA (Beispiel 23) wurden mit HindIII gespalten, gefolgt von einer Spaltung mit BglII. Die DNA wurde dann mit CIAP behandelt (Beispiel 2) und schließlich in 10 μl Wasser wieder gelöst.
1 μl des geschnittenen pWOR904 wurde mit 4 μl des 1.35 kbp-Fragments von pCAR29 in einem Gesamtvolumen von 12 μl Ligierungspuffer, der eine Einheit 74 DNA-Ligase enthielt, gemischt und für ungefähr 16 Stunden bei 12°C inkubiert.
5 μl des Ligierungsgemisches wurden zur Transformation von E. coli DH5α verwendet (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) und die Zellen wurden auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen und bei 37°C für 2 Tage inkubiert. 15 Transformanten wurden erneut auf L-Agar mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, über Nacht bei 37°C gezüchtet und dann wurden Zellen von der Platte abgeschabt und für Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab verwendet (Beispiel 18).
DNA-Aliquots wurden mit EcoRI und mit PstI gespalten, um die Anwesenheit der aus pCAR29 erhaltenen Insertion nachzuweisen. Eine Plasmidpräparation im Großmaßstab wurde mit einer 500 ml-Kultur eines der Isolate durchgeführt (mit dem Verfahren aus Beispiel 4). Eine Restriktionskarte des Plasmids, genannt pCAR46, ist in 21 gezeigt. 200ng dieser DNA wurde zur Transformation von Agrobakterium 15-10 durch Elektroporation verwendet (Beispiel 19). Transformanten wurden Plasmidpräparationen im Kleinmaßstab unterzogen; Restriktionsenzym-Spaltungen bestätigten die Anwesenheit von pCAR46. Agrobakterium 15-10 (pCAR46) wurde in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland am 14. Februar 1992 unter der Eingangsnummer NCIMB 40478 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde gemäß dem Budapester Vertrag für die Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentierungsverfahrens durchgeführt.
Beispiel 25
Nachweis einer zusätzlichen mit pCAR46 assoziierten Carbamoylase-Aktivität in Agrobakterium
Agrobakterium 15-10 wurde in 50 ml AJ-1-Medium überimpft; Agrobakterium 15-10 (pCAR46) wurde in 50 ml AJ-1-Medium mit 10 μg ml^–1 Chloramphenicol überimpft. Die Kulturen wurden für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30°C gezüchtet; dann wurde jede Kultur behandelt wie folgt: 1.36 ml Kulturmedium wurden in einem Mikrozentrifugengefäß mit 140 μl 1 %-igem Hexadecyltrimethylammoniumbromid (in 65 mM Na₂HPO₄, 35 mM, NaH₂PO₄, pH 7.0) gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. 50 μl dieses Gemisches wurden in ein Mikrozentrifugengefäß überführt, das 1.45 ml 1.5 %-iges (Gew. / Vol.) D-N-Carbamoyl-phydroxyphenylglycin in 65 mM Na₂HPO₄, 35 mM NaH₂PO₄ (pH 7.0; neu eingestellt auf pH 7.0 nach Auflösung des Reaktionssubstrats) enthielt. Der Inhalt des Gefäßes wurde gemischt und bei 48°C für 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und der Überstand wurde mit HPLC auf die Anwesenheit von D(-)-p-Hydroxyphenylglycin, erzeugt durch das Carbamoylase-Enzym, analysiert. Die Carbamoylase-Aktivität für Agrobakterium 15-10 mit pCAR46 war, pro ml Kulturmedium, 20 – 30-mal höher als die Aktivität für Agrobakterium 15-10.
Beispiel 26
Konstruktion von pCAR31 und pCAR32
Ungefähr 2 μg pCAR6-DNA (Beispiel 5) wurden mit 5 Einheiten ClaI in insgesamt 50 μl 50 mM Tris-HCL (pH 8.0), 10 mM MgCl₂ für 3 Stunden bei 37°C gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.8 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 4.7 kbp-ClaI-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 0.6 μg ClaI gespaltene, CIAP behandelte pCP19-DNA (Beispiel 2) und etwa 0.6 μg des 4.7 kbp-ClaI-Fragments von pCAR6 wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl DNA-Ligase-Puffer vereinigt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei 4°C für etwa 16 Stunden inkubiert.
10 μl des Ligierungsgemisches wurden zur Transformation von E. coli DHSα (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) verwendet und die Zellen wurden auf L-Agarplatten, supplementiert mit 10 μg ml^–1 Tetracyclin, ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 18 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten mit 10 μg ml^–1 Tetracyclin ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und dann wurden Plasmid-DNA-Präparationen im Kleinmaßstab (nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) an Zellen von jedem dieser Isolate durchgeführt. Restriktionsenzym-Spaltungen der DNA-Präparationen wiesen darauf hin, daß Clone mit beiden Orientierungen des ClaI-Fragments in dem Vektor erhalten wurden. Diese Vektoren wurden pCAR31 und pCAR32 genannt (22 und 23).
500 ml-Kulturen von E. coli DH5α (pCAR31) und E. coli DH5α (pCAR32) wurden in L-Medium mit 10 μg ml^–1 Tetracyclin angesetzt. Beide Kulturen wurden behandelt wie folgt: Die Kultur wurde bei ca. 6000 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert und die entstandenen Zell-Niederschläge wurden in 10 ml 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 5 mg ml^–1 Lysozym resuspendiert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. 10 ml einer Lösung mit 0.2 M NaOH, 1 % SDS wurden zu den Lysozym behandelten Zellen zugegeben und die Lösungen wurden gemischt und auf Eis für 20 Minuten inkubiert. 15 ml eiskaltes 3 M Kaliumacetat (pH 5.8) wurden zum Reaktionsgemisch zugegeben und die Lösungen wurden gemischt und auf Eis für weitere 60 Minuten inkubiert. Die lysierten Zellen wurden bei ungefähr 38000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und 0.6 Volumina Isopropanol zugegeben und die DNA konnte für 15 Minuten bei Raumtemperatur ausfallen. Das Reaktionsgemisch wurde bei ungefähr 6000 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und die gefällte DNA in 4.0 ml TE resuspendiert. Dann wurden CsCl-Gradienten hergestellt (wie in Beispiel 4) und die Plasmid-DNA wurde in 500 μl TE wieder gelöst. Weitere Restriktionsenzym-Spaltung dieser DNA bestätigte die korrekte Struktur von pCAR31 und pCAR32.
Beispiel 27
Übertragung von pCAR31 und pCAR32 von E. coli auf Agrobakterium
pCAR31 und pCAR32 wurden auf Agrobakterium 15-10 durch Kreuzung unter Verwendung des Helferplasmids pRK2013 übertragen (wie für pCAR1 in Beispiel 12 beschrieben). Plasmid-DNA wurde aus Isolaten mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert. Restriktionsenzym-Spaltung eines Teils der Plasmid-DNA wurde zur Bestätigung verwendet, daß die Tetracyclin-resistenten Exkonjuganten tatsächlich entweder pCAR31 oder pCAR32 enthielten.
Beispiel 28
Nachweis einer zusätzlichen mit pCAR31 und pCAR32 assoziierten Hydantoinase-Aktivität
Agrobakterium 15-10 (pCAR1), Agrobakterium 15-10 (pCAR6), Agrobakterium 15-10 (pCAR26), Agrobakterium 15-10 (pCAR31), Agrobakterium 15-10 (pCAR32) und Agrobakterium 15-10 wurden jeweils in getrennte Kolben überimpft, die 50 ml AJ-1-Medium mit 0.1 % Alanin-Hydantoin und das entsprechende Antibiotikum enthielten. Die Kulturen wurden für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30°C gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen wurden auf Hydantoinase-Aktivität untersucht (wie in Beispiel 15). Es wurde bestätigt, daß pCAR1 und pCAR6, nicht aber pCAR26, zu erhöhter Hydantoinase-Aktivität in Agrobakterium 15-10 führten. pCAR31 oder pCAR32 enthaltende Stämme zeigten eine Hydantoinase-Aktivität, die ungefähr 20-mal höher war als die Aktivität für Agrobakterium 15-10, was darauf hinwies, daß pCAR31 und pCAR32 das Hydantoinase-Aktivität codierende Gen enthielten.
Beispiel 29
Konstruktion von pCAR36
Ungefähr 2 μg pCAR31-DNA (Beispiel 26) wurden mit 5 Einheiten HindIII in insgesamt 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl für 3 Stunden bei 37°C gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.8 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 4.7kbp HindIII-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 0.6 μg HindIII gespaltene, CIAP behandelte pKT210-DNA (Beispiel 16) und etwa 0.6 μg des 4.7 kbp-HindIII-Fragments von pCAR31 wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl DNA-Ligase-Puffer vereinigt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch bei 4°C für 16 Stunden inkubiert.
10 μl des Ligierungsgemisches wurde zur Transformation kompetenter E. coli HB101-Zellen (mit einem dem in Beispiel 5 beschriebenen ähnlichen Verfahren) verwendet und die Zellen wurden auf L-Agarplatten, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, ausgestrichen. 17 Chloramphenicol-resistente Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und dann wurden Plasmid-DNA-Präparationen im Kleinmaßstab (nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) an Zellen von jedem dieser Isolate durchgefiührt. Restriktionsenzym-Spaltungen bestätigten die Anwesenheit von pCAR36. Eine Restriktionskarte ist in 24 gezeigt.
500 ml L-Medium, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, wurden mit E. coli HB101 (pCAR36) angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde nach dem Verfahren in Beispiel 26 isoliert.
Beispiel 30
Übertragung von pCAR36 von E. coli auf Agrobakterium
pCAR36 wurde auf Agrobakterium durch Kreuzung unter Verwendung des Helferplasmids pRK2013 übertragen (wie für pCAR1 in Beispiel 12 beschrieben). Plasmid-DNA wurde aus Isolaten mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert. Restriktionsenzym-Spaltungen eines Teils der Plasmid-DNA wurde zur Bestätigung verwendet, daß die Chloramphenicol-resistenten Exkonjuganten tatsächlich pCAR36 enthielten.
Beispiel 31
Nachweis einer zusätzlichen mit pCAR36 assoziierten Hydantoinase-Aktivität
Agrobakterium 15-10 und Agrobakterium 15-10 (pCAR36) wurden jeweils in getrennte Kolben überimpft, die 50 ml AJ-1-Medium mit 0.1 % Alanin-Hydantoin (plus 10 μg ml^–1 Chloramphenicol für die Agrobakterium 15-10 (pCAR36)-Kultur) enthielten, und für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30°C gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen wurden auf Hydantoinase-Aktivität untersucht (wie in Beispiel 15). Die Hydantoinase-Aktivitäten für pCAR36 enthaltendes Agrobakterium 15-10 waren 6 – 7-mal höher als die Aktivität für Agrobakterium 15-10, was bestätigte, daß pCAR36 das Hydantoinase-Aktivität codierende Gen enthielt.
Beispiel 32
Konstruktion von pDAN3 und pDAN4
Ungefähr 2 μg pCAR36-DNA (Beispiel 29) wurden mit 5 Einheiten SstI (SacI) in insgesamt 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl für 3 Stunden bei 37°C gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 0.8 %-igen Gel aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese in TBE-Puffer aufgetrennt. Der Teil des Gels, der das ca. 3.3 kbp-SstI-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren isoliert.
Ungefähr 0.5 μg SstI gespaltene, CIAP behandelte pWOR902-DNA (Beispiel 19) und 0.5 μg des 3.3 kbp-SstI-Fragments von pCAR36 wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl DNA-Ligase-Puffer vereinigt. Eine Einheit T4 DNA-Ligase wurde zugegeben und das Gemisch bei 4°C für 16 Stunden inkubiert.
10 μl des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation kompetenter E. coli HB101-Zellen (nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) verwendet und die Zellen wurden auf L-Agarplatten, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, ausgestrichen. 4 Chloramphenicol-resistente Kolonien wurden erneut auf L-Agarplatten mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert und dann wurden Plasmid-DNA-Präparationen im Kleinmaßstab (nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren) an Zellen von jedem dieser Isolate durchgeführt. Restriktionsenzym-Spaltungen der DNA-Präparationen wiesen darauf hin, daß Clone mit beiden Orientierungen des SstI-Fragments in dem Vektor erhalten wurden. Diese wurden pDAN3 und pDAN4 genannt und Restriktionskarten sind in den 25 und 26 gezeigt.
500 ml L-Medium, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, wurden mit E. coli HB101 (pDAN3) angeimpft und weitere 500 ml L-Medium, supplementiert mit 25 μg ml^–1 Chloramphenicol, wurden mit E. coli HB101 (pDAN4) angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren isoliert.
Beispiel 33
Elektroporation von pDAN3 und pDAN4 in Agrobakterium
Ungefähr 200 ng pDAN3 oder pDAN4 wurden zur Transformation von Agrobakterium 15-10 durch Elektroporation verwendet (Beispiel 19). Transformanten wurden Plasmid- Präparationen im Kleinmaßstab unterzogen; Restriktionsenzym-Spaltungen bestätigten die Anwe-senheit von pDAN3 und pDAN4.
Beispiel 34
Nachweis einer zusätzlichen mit pDAN3 und pDAN4 assoziierten Hydantoinase-Aktivität
Agrobakterium 15-10 (pCAR36), Agrobakterium 15-10 (pWOR902), Agrobakterium 15-10 (pDAN3) und Agrobakterium 15-10 (pDAN4) wurden jeweils in getrennte Kolben überimpft, die 50 ml AJ-1-Medium (Beispiel 1), supplementiert mit 5 g l^–1 (NH₄)₂SO₄ und 10 μg ml^–1 Chloramphenicol, enthielten, und für 24 Stunden bei 30°C gezüchtet. Jede der Kulturen wurde dann behandelt wie folgt: 500 μl einer 1 M MnSO₄-Lösung wurde zu der Kultur zugegeben, die dann bei 30°C für weitere 35 Minuten geschüttelt wurde. Das Kulturmedium wurde auf folgende Weise untersucht:- 1360 μl Kulturmedium, entweder unverdünnt oder verdünnt, wurden zu 140 μl einer 1 %-igen Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung in einem Eppendorf-Gefäß zugegeben, gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. 1 ml dieser Lösung wurde zu 19 ml 1 %-igem D,L-S-(p-Hydroxyphenyl)-hydantoin in 0.2 M Tris in einem 50 ml Erlenmeyerkolben mit Schraubverschluß zugegeben und in einem Wasserbad bei 42°C geschüttelt. Proben wurden nach 10-minütiger und 30-minütiger Inkubation entnommen und mit HPLC untersucht (Beispiel 15). Die Hydantoinase-Aktivität in μmol Produkt pro ml Zellen pro Stunde wurde berechnet.
Es wurde nachgewiesen, daß pCAR36, pDAN3 und pDAN4 zu erhöhter Hydantoinase-Aktivität in Agrobakterium 15-10 führten. pDAN4 enthaltende Stämme zeigten eine Hydantoinase-Aktivität, die ungefähr 230-mal höher war als die Aktivität für pWOR902 enthaltendes Agrobakterium 15-10.
Beispiel 35
Konstruktion von pGal2789RS3Carb
Eine Kopienzahl-Mutante des natürlich vorkommenden E. coli-Plasmids NR1 wurde durch Spontanmutation erhalten. Dieses Plasmid (pRR21) wurde dann durch die Deletion unnötiger Bereiche in der Größe verringert, was pDPT2789 lieferte. Dies ist ein Plasmid mit 125 Kopien, das die incF11-Region und die Chloramphenicol- und Spectinomycin-Resistenzmarker enthält. pDPT2789 wurde dann mit NdeI geschnitten, aufgefüllt und zur Herstellung von pDPT2789 (Nde^-) religiert. pDPT2789 (Nde^-) wurde dann mit StuI und EspI gespalten und ein StuI-EspI-Fragment, das einen P_gal-Promotor mit einer synthetischen Ribosomen-Bindungsstelle stromabwärts enthielt, wurde eingesetzt. Dieser Vektor wurde pGal2789RS3V1V2 genannt.
pGal2789RS3V1V2 wurde mit NdeI gespalten, mit Klenow aufgefüllt und dann mit BamHI gespalten. pCAR21 (Beispiel 7) wurde mit BspHI gespalten, mit Klenow aufgefüllt und dann mit BamHI gespalten. Diese Spaltungen setzten ein etwa 900bp-Fragment frei, das die für das Carbamoylase-Gen codierenden Sequenzen enthielt, was zu Plasmid pGal2789RS3Carb führte, das das Carbamoylase-Gen vom Gal-Promotor aus exprimiert.
Dieses Plasmid wurde dann in eine Anzahl von E. coli K12-Wirtsstämmen mit herkömmlichen CaCl₂-Verfahren transformiert und die Carbamoylase-Produktion wurde während der Züchtung der Zellen durch Coomassie Blau-Färbung von SDS-Gelen, auf denen Gesamt-Zellextrakte aufgetrennt worden waren, verfolgt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Carbamoylase-Enzyms, das ein D-N-Carbamoyl (gegebenenfalls substituiertes Phenyl)-Glycin in das entsprechende D (gegebenenfalls substituierte Phenyl)-Glycin umwandeln kann, durch Exprimieren von rekombinanter DNA, die ein Carbamoylase-Enzym codiert, in einen homologen Wirt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die codierende DNA aus 10 von Agrobacterium stammt und der Wirt Agrobacterium ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA pCAR1 (NCIMB 40133) oder pCAR26 (mit der Konfiguration der Restriktionsstellen aus 14) ist, erhältlich durch das Verfahren von Beispiel 16.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA ein rekombinanter DNA-Vektor ist, der auf pWOR902 (NCIMB 40451) basiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der rekombinante DNA-Vektor pCAR44 (mit der Konfiguration der Restriktionsstellen aus 17) ist, erhältlich durch das Verfahren von Beispiel 20, oder pCAR46 (NCIMB 40478) ist.