DE3927061C2

DE3927061C2 - Uricase-codierende DNA-Sequenzen und Verfahren zur Herstellung von Uricase

Info

Publication number: DE3927061C2
Application number: DE19893927061
Authority: DE
Inventors: Tatsuro Shigyo; Kohji Sugihara; Yuji Takamoto; Masachika Takashio; Minoru Kamimura; Kazumi Yamamoto; Yoshio Kojima; Toshiro Kikuchi; Shigenori Emi
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-08-17
Filing date: 1989-08-16
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2009-08-17
Also published as: JPH0253488A; JPH0671428B2; GB8917690D0; GB2221910A; GB2221910B; DE3927061A1

Description

Die Erfindung betrifft nach den Ansprüchen 1 bis 3 DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der biologischen Aktivität von Uricase codieren. Ferner betrifft die Erfindung nach Anspruch 4 rekombinante Plasmide, die die genannten DNA-Sequenzen enthalten, nach den Ansprüchen 5 und 6 Transformanten, die die genannten rekombinanten Plasmide enthalten, und nach Anspruch 7 gentechnologische Verfahren zur Herstellung von Uricase.

Uricase (EC 1, 7, 3, 3) ist ein Enzym, das die hydrolytische Umsetzung von Harnsäure in Allantoin, Wasserstoffperoxid und Kohlendioxid katalysiert. Es wird beim Nachweis von Harnsäure in Blut oder Urin verwendet.

Bekannt ist ferner eine Untereinheit der knollenspezifischen Uricase-codierenden DNA-Sequenz (Ng uyen et d. Pros. Natl. Acad. Sci., 82 (1985, 5040-5044) und ein Verfahren zur Reinigung von Uricase aus Bacillus sp. TB-90, EP-A 2 204 283).

Bisher wurde Uricase durch Züchtung eines Uricase-bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, beispielsweise von Mikroorganismen der Gattung Candida in Gegenwart von Harnsäure, und Isolierung der Uricase aus dem Kulturmedium hergestellt; vgl. JP-PS 5 192/1967. Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß das Enzym nur mit niedriger Ausbeute erhalten wird.

Somit liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur kostengünstigen Herstellung von Uricase in hohen Ausbeuten und die darin zu verwendenden Werkzeuge bereitzustellen.

Die Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit DNA-Sequenzen, die ein Uricase-codierendes Gen enthalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner DNA-Sequenzen aus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795, JP-A 61-2 80 272), die eine Uricase mit der folgenden Aminosäure-Sequenz codieren:

Der vorstehend genannte Stamm von Bacillis sp. bildet eine Temperatur-beständige Uricase und wurde von den Erfindern aus der Natur isoliert. Er ist bei der bezeichneten japanischen Hinterlegungsstelle nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt.

Ein rekombinantes Plasmid, das die vorstehend genannte DNA-Sequenz enthält, ist erhältlich durch Herstellung einer Genbank mit der chromosomalen DNA von Bacillus sp. TB-90, Absuchen der Genbank mit Kaninchen-anti-Uricase-Antikörpern, Isolierung eines rekombinanten Phagen, der die bezeichnete DNA-Sequenz enthält, Isolierung eines DNA-Fragments aus dem Phagen, der die bezeichnete DNA-Sequenz enthält, und Einbau des genannten DNA-Fragments in ein Plasmid.

Bekannterweise werden Aminosäuren in der Regel von mehr als einem Codon codiert. Dies wird als "Degeneration des genetischen Codes" bezeichnet. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch alle durch die Degeneration des genetischen Codes verwendeten DNA-Sequenzen, die eine Uricase mit der vorstehend angegebenen Aminosäure-Sequenz codieren. Da diese DNA-Sequenzen auch synthetischer Herkunft sein können, ist die vorliegende Erfindung nicht auf natürlich vorkommende DNA-Sequenzen beschränkt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße DNA-Sequenz die folgende:

Die vorstehend genannte DNA-Sequenz kann aus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795) wie vorstehend angegeben erhalten werden.

Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die unter üblichen Bedingungen mit einer der vorstehend genannten DNA-Sequenzen hybridisieren und ein Protein mit der biologischen Aktivität von Uricase codieren. Übliche Hybridisierungsbedingungen sind solche, bei denen der T_m-Wert zwischen etwa T_m-20 und T_m-27 liegt. Stringente Hybridisierungsbedingungen werden bevorzugt.

Durch DNA-Rekombinationsverfahren lassen sich beliebige künstliche Variationen an bestimmten Stellen einer Ausgangs-DNA-Sequenz einführen, ohne dabei die grundsätzlichen Eigenschaften des von der DNA-Sequenz codierten Proteins zu verändern. Andererseits können solche Variationen eingefügt werden, um die Eigenschaften des codierten Proteins zu verbessern. Somit betrifft die Erfindung auch Modifikationen der vorstehend genannten DNA-Sequenzen, die künstliche Insertionen, Deletionen oder Substitutionen aufweisen und somit Gene repräsentieren, die zum natürlich vorkommenden Gen äquivalente oder sogar verbesserte Eigenschaften besitzen. DNA-Sequenzen, die wie angegeben unter üblichen Bedingungen mit einer der vorstehend genannten DNA-Sequenzen hybridisieren, können in üblicher Weise nicht nur aus Bacillus sp. TB-90, sondern auch aus anderen Mikroorganismen isoliert werden.

Erfindungsgemäß lassen sich die bezeichneten DNA-Sequenzen durch DNA-Rekombinations-Verfahren isolieren. Auf diese Weise lassen sich auch DNA-Sequenzen isolieren, die eine Uricase codieren, die stabiler ist als die bisher hergestellte Uricase.

In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform stammen die vorstehend bezeichneten DNA-Sequenzen aus einem Mikroorganismus.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen die vorstehend genannten DNA-Sequenzen die mit ihnen natürlicherweise assoziierten regulatorischen Elemente der 5′-Flanke und 3′-Flanke auf.

Ferner betrifft die Erfindung rekombinante Plasmide, die die vorstehend genannten DNA-Sequenzen enthalten.

Expressionsvektoren, mit denen die Bacillus sp. TB-90-Uricase in Escherichia coli-Zellen hergestellt werden kann, können durch Ligierung des Bacillus sp. TB-90-Uricase-Gens mit einem für E. coli geeigneten Expressionsvektor hergestellt werden. Beispiele solcher Expressionsvektoren sind pUC18, der den lac-Promotor enthält, pKK223-3, der einen wirkungsvollen E. coli-Promotor enthält, nämlich den natürlichen _trp-Promotor und den Terminator der ribosomalen rrnB-RNA, pDR720, der den _tac-Promotor enthält, oder der induzierbare pPL-lambda-Expressionsvektor. Ferner betrifft die Erfindung rekombinante Plasmide, mit denen die Bacillus sp. TB-90-Uricase in Bacillus subtilis-Zellen oder im entsprechenden Kulturmedium hergestellt werden kann. Dazu wird eine der vorstehend bezeichneten DNA-Sequenzen beispielsweise mit dem Shuttle-Vektor pHY300PLK (geeignet für Bacillus subtilis oder Escherichia coli) oder mit dem Plasmid-Vektor pUB110 (J. Bacteriol. 134 (1978), 318-329) ligiert.

Die Erfindung betrifft außerdem Transformanten, die mindestens eines der vorstehenden rekombinanten Plasmide enthalten.

Transformanten, die Uricase intrazellulär oder extrazellulär bilden können, lassen sich durch Einführen der vorstehend beschriebenen rekombinanten Plasmide in Mikroorganismen, vorzugsweise in Wirtszellen, wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis, herstellen.

Außerdem sind nicht nur Escherichia coli- oder Bacillus subtilis-Wirts/Vektor-Systeme verfügbar, sondern auch Saccharomyces sp.-, Pseudomonas sp.- oder Streptomyces sp.-Wirts/Vektor-Systeme. Erfindungsgemäß wird somit die Herstellung von Uricase unter Berücksichtigung der jeweiligen Vorteile der genannten Wirts/Vektor-Systeme durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Transformante ein transformierter Mikroorganismus, der zur Art Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces sp., Pseudomonas sp. oder Streptomyces sp. gehört und mindestens eines der vorstehend erläuterten Plasmide enthält, das oder die für die Transformante heterologe DNA-Sequenzen enthalten, die ebenfalls vorstehend beschrieben wurden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Transformante ein Mikroorganismus, der zur Art Escherichia coli oder Bacillus subtilis gehört.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Transformante der Mikroorganismus E. coli JM109 (pUOD316), E. coli JM109 (pKU1), Bacillus subtilis ISW1214 (pEB2). Diese Mikroorganismen sind beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry" unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-1979, FERM BP-1980 bzw. FERM BP-1981 nach den Vorschriften des Budapester Vertrages hinterlegt worden.

Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Uricase, bei dem man eine der erfindungsgemäßen Transformanten in einem Medium unter zur Expression der Uricase-codierenden DNA-Sequenz geeigneten Bedingungen züchtet und die bei der Expression der DNA-Sequenz anfallende Uricase aus der Kultur isoliert. Beispielsweise läßt sich Uricase in einem solchen Verfahren in guter Ausbeute durch Zugabe des Induktors Isopropylthiogalaktosid (IPTG) in einem frühen Stadium der Züchtung der Transformante herstellen. Nach der Züchtung der Transformante läßt sich die Uricase beispielsweise durch Behandlung der Zellen mit Lysozym oder durch Lysieren der Zellen durch eine Ultraschallbehandlung, oder durch Extraktion, Trennung und Reinigung des Kulturmediums isolieren.

Die Figuren zeigen

Fig. 1 zeigt die Uricase-codierende DNA-Sequenz aus Bacillus sp. TB-90 und die entsprechende Aminosäure-Sequenz.

Fig. 2 zeigt die Konstruktion der Expressionsplasmide pUOD316 und pKU1 aus dem rekombinanten E. coli-Plasmid pUOD31, das eine Uricase-codierende DNA-Sequenz aus Bacillus sp. TB-90 enthält. Die schwarzen und weißen Kästchen stellen ein das Uricase-Gen enthaltendes DNA-Fragment bzw. den Bereich des lac- oder trp-Promotors dar. Der Begriff "Ligierung" bedeutet eine Ligierungsreaktion von DNA-Fragmenten mit T4 DNA-Ligase.

Fig. 3 zeigt die Konstruktion des rekombinanten Bacillus subtilis-Plasmids pEB2, das eine Uricase-codierende DNA-Sequenz aus Bacillus sp. TB-90 enthält. Die schwarzen und weißen Kästchen und der Begriff "Ligierung" haben dieselbe Bedeutung wie in Fig. 2.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Clonierung eines Uricase-Gens Schritt 1 Herstellung von Kaninchen-anti-Uricase-Antikörpern

Zur Herstellung von Kaninchen-anti-Uricase-Antikörpern (Antiseren) wurde ein Kaninchen mit durch Extraktion und Reinigung eines Kulturmediums von Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795) erhaltener Uricase immunisiert. Der Titer des Antiserums betrug 10² bis 10³, gemessen nach dem ELISA-Verfahren, bzw. Faktor 16, gemessen nach dem Ouchterlony-Verfahren. Sodann wurde das Antiserum gereinigt. Dabei wurden 10 ml Antiserum einer Säulenchromatographie mit Protein A-Sepharose (4 ml) unterworfen. Es wurden 8,9 ml anti-Uricase-Antikörper vom Typ IgG erhalten.

Schritt 2 Herstellung einer genomischen Genbank von Bacillus sp. TB-90

Bacillus sp. TB-90 wurde in Fleischbrühe-Medium (flüssiges Medium (pH 7,2), 5 g Fleischextrakt, 10 g Pepton und 5 g NaCl auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter) gezüchtet. Sodann wurde chromosomale DNA aus 2,5 g der Zellen isoliert; vgl. R. H. Doi, "Recombinant Techniques", Herausgeber Rodriquez et al., Addison-Wesley Publishing Company, 1983, Seite 162 oder J. Koizumi et al., Biotech. Bioeng. 27 (1985), Seiten 721-728.

Dabei wurden 900 µg gereinigte chromosomale DNA erhalten (OD₂₆₀/OD₂₈₀ = etwa 1,8). Sodann wurde die erhaltene chromosomale DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3AI in üblicher Weise partiell gespalten und einer Dichtegradienten-Zentrifugation (5 bis 20% Saccharose) unterzogen, wobei DNA-Fraktionen mit 2 bis 20 kb erhalten wurden.

1 µg Arme des λ-Phagen-Clonierungsvektors EMBL3 wurden mit 0,4 µg der vorstehend erhaltenen, mit Sau3AI partiell gespaltenen chromosomalen DNA vermischt, mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase ligiert und mit einem in vitro- "Packaging-kit" verpackt. Mit den erhaltenen Phagen wurde E. coli Q 359 infiziert und so ausplattiert, daß 2000 Plaques pro Platte erhalten wurden.

Schritt 3 Selektion von rekombinanten Phagen, die das Uricase-Gen enthalten (Isolierung eines Clons mit einem Uricase-Gen durch Plaque-Hybridisierung)

Das in Schritt 1 erhaltene, gereinigte IgG wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRPO) vermischt, um ein IgG-HRPO-Konjugat zu erhalten. Mit diesem Konjugat wurde unter Verwendung eines Gen-Expressions-Kit ein Clon mit einem Uricase-Gen isoliert. Die Nachweisempfindlichkeit betrug dabei 100 pg DNA. Beim Absuchen der Phagen-Genbank ergaben positive Clone eine blaugrüne Farbe. Es wurden stark gefärbte Clone selektiert und die entsprechenden Phagen gereinigt, bis bei einer Infektion alle Plaques gefärbt waren. Somit wurden die Phagen 1 und 3 isoliert. Mit diesen Phagen wurde E. coli Q359 infiziert und der Überstand des jeweiligen Kulturmediums wurde auf Uricase-Aktivität geprüft. Es wurden 7 mU/ml bzw. 9 mU/ml erhalten.

Schritt 4 Identifizierung des Uricase-Gens von Bacillus sp. TB-90

Aus den vorstehend erhaltenen positiven Clonen 1 und 3 wurde in üblicher Weise Phagen-DNA isoliert; vgl. "Molecular Cloning", Herausgeber Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A, 1982, Seite 85. Sodann wurden die Phagen-DNA's mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten und einer Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel unterzogen. Die Analyse ergab, daß in den Phagen 1 und 3 ein 18 kb bzw. ein 15 kb SalI-DNA-Fragment inseriert ist.

Außerdem wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI, SphI und KpnI eine Restriktionskarte der in die Phagen 1 und 3 inserierten DNA erstellt. Sodann wurde DNA des Phagen 1 mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und das inserierte 18 kb DNA-Fragment aus einem Agarosegel extrahiert (Yoshiyuki Sakaki, "Vektor DNA", Kohdansha, Seite 67). In einer Hybridisierungsanalyse nach Southern mit dem 18 kb Fragment als Sondenmolekül (J. Mol. Biol., 98 (1975), Seiten 503-517) wurde gezeigt, daß das 18 kb DNA-Fragment des Phagen 1 nicht nur mit dem 15 kb DNA-Fragment des Phagen 3, sondern auch mit chromosomaler DNA von Bacillus sp. TB-90 hybridisiert. Daraus folgte, daß die DNA der eine Uricase-Aktivität induzierenden Phagen 1 und 3 einen gemeinsamen Bereich enthält, und weiter, daß in die DNA der beiden Phagen ein von der chromosomalen DNA von Bacillus sp. TB-90 abgeleitetes DNA-Fragment inseriert ist.

Sodann wurde aus DNA des Phagen 3 nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren das 15 kb DNA-Fragment isoliert, mit SalI-gespaltenem Plasmid-Vektor pUC18 ligiert und subcloniert. Auf diese Weise konnte die Lage des Uricase-Gens in der Insertion des Phagen 3 ermittelt und einem 4,8 kb BamHI-SphI-Fragment zugeordnet werden, das im Plasmid pUOD31 enthalten ist. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist in Fig. 2 oben in der Mitte abgebildet.

Sodann wurde die DNA-Sequenz des Uricase-Gens ermittelt. Dazu wurde das vorstehend genannte DNA-Fragment mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und in die Vektoren pUC18 und 19 subcloniert. Danach wurden Plasmid-DNA's nach Birnboim und Doly hergestellt; vgl. Nucleic Acids Res. 7 (1979), Seiten 1513-1523. Die so erhaltene DNA wurde in 18 µl TE-Puffer (10 mM Tris-Salzsäure, pH 7,4, 1 mM EDTA) suspendiert, mit 2 µl 2 N NaOH vermischt, 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, mit 8 µl 5 M Ammoniumacetat gemischt und zur Äthanolfällung mit 100 µl kaltem Äthanol vermischt. Die DNA-Sequenz der Insertionen der so erhaltenen Plasmid-DNAs wurde mit einem M13-Sequenzierungs-Kit und α³²P dCTP (400 Ci/mMol) ermittelt.

Die so bestimmte DNA-Sequenz des Uricase-Gens von Bacillus sp. TB-90 weist einen codierenden Bereich von 999 Nucleotiden auf, der bei einem ATG als Startcodon beginnt und mit einem TGA als Stopcodon endet. Von diesem codierenden Bereich werden somit 332 Aminosäuren codiert; vgl. Fig. 1.

Beispiel 2 Konstruktion des Expressionsplasmids pUOD316 und pKU1 zur Expression des Uricase-Gens von Bacillus sp. TB-90 in Escherichia coli-Zellen

10 µg des das Uricase-Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids pUOD 31 wurden mit EcoRI und HincII in 30 µl M-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol und 50 mM NaCl) 2 Stunden bei 37°C gespalten und das Reaktionsgemisch einer Elektrophorese in 0,8%igem Agarosegel enthaltend 0,1 µg/ml Äthidiumbromid unterworfen. Dann wurde das 1,4 kb EcoRI-HincII-DNA-Fragment isoliert.

Sodann wurde 1 µg DNA der Expressionsvektoren pUC18 (Toyobo) oder pKK223-3 mit EcoRI und HincII bzw. mit EcoRI und SmaI gespalten und DNA-Fragmente einer Größe von 2,7 kb bzw. 4,6 kb wie vorstehend beschrieben isoliert.

Sodann wurde 1 µg des wie vorstehend hergestellten 1,4 kb EcoRI-HincII-DNA-Fragments mit jeweils 1 µg des wie vorstehend beschrieben hergestellten Fragments der Expressions-Vektoren pUC18 oder pKK223-3 vermischt und mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in 45 µl Ligase-Reaktions-Puffer (66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 1,0 mM ATP) 6 Stunden bei 16°C ligiert.

Mit den erhaltenen Ligierungsprodukten wurde Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) nach dem Verfahren von Hanahan transformiert; vgl. J. Mol. Biol. 166 (1983), S. 557. Die Transformanten wurden auf L-Medium-Agar ausplattiert (10 g Trypton (Difco), 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 15 g pulverförmiger Agar in 1 Liter destilliertem Wasser (pH 7,2)), der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Es wurde auf Ampicillin-Resistenz selektiert. Plasmid-DNA wurde nach dem Verfahren von Birnboim und Doly hergestellt und mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten. Die Restriktionsfragment-Analyse mit einer Agarosegel-Elektrophorese zeigte eine richtige Insertion eines 1,4 kb EcoRI-HincII-DNA-Fragments in den entsprechenden Expressions-Vektoren. Der auf pUC18 basierende rekombinante Expressions-Vektor wurde als pUOD316 und der auf pKU1 basierende als pKK223-3 bezeichnet. Fig. 2 zeigt das Konstruktionsschema der Expressions-Vektoren pUOD316 und pKU1 aus dem rekombinanten Plasmid pUOD31.

Herstellung von Uricase in Escherichia coli

Die wie vorstehend konstruierten Expressions-Plasmide pUOD316 und pKU1 wurden jeweils in Escherichia coli JM109 nach dem Verfahren von Hanahan eingeführt. Die von den erhaltenen Transformanten E. coli JM109/pUOD316 und JM109/pKU1 hergestellte Uricase wurde jeweils identifiziert und wie nachstehend angegeben untersucht.

Jede der Transformanten von E. coli wurde in flüssigem L-Medium über Nacht bei 37°C gezüchtet. Sodann wurden 0,1 ml der Kultur entnommen und 10 ml L-Medium wurden damit angeimpft und bei 37°C gezüchtet. Sobald der OD₆₆₀ einen Wert von 0,2 erreicht hatte, wurde Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Nachdem die Anzucht dann weitere 16 Stunden durchgeführt wurde, wurden 1,0 ml des Kulturmediums entnommen, mit 0,5 ml Extraktionspuffer (50 mM Borat-Puffer (pH 8,0), 10 mM EDTA · 3 Na, 0,3% Triton X-100 und 0,3% Lysozym) vermischt, 10 Minuten bei 37°C inkubiert und 10 Minuten bei 12 000 UpM zentrifugiert, so daß ein Bakterienlysat (Überstand) erhalten wurde. 20 µl des so erhaltenen Lysats wurden in derselben Menge Probenauftragungs-Puffer (62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoäthanol und 0,001% BPB) suspendiert, 5 Minuten auf 100°C erhitzt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach Laemmli et al. unterzogen; vgl. Nature, 227 (1970), Seiten 680-685. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brillantblau gefärbt, entfärbt, getrocknet und auf einem Filterpapier befestigt. Es wurde eine Uricase-Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 bei E. coli JM109 nachgewiesen, die ein Expressions-Plasmid enthielten. Diese Protein-Bande reagierte spezifisch mit anti-Uricase-Antikörpern (IgG). Durch Messung der Protein-Bande auf dem Gel mit einem Densitometer wurde festgestellt, daß E. coli JM109/pUOD316 und JM109/pKU1 Uricase in einer Menge von jeweils 1% bzw. 3% des intrazellulären Gesamtproteins bilden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die E. coli-Transformanten die Uricase von Bacillus sp. TB-90 wirksam herstellten. E. coli JM109/pUOD316 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1979 und E. coli JM109/pKU1 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1980 hinterlegt.

Die wie vorstehend beschrieben erhaltene Uricase weist die folgenden Merkmale auf:

(1) Biologische Aktivität:
Sie katalysiert die Umsetzung, bei der Harnsäure oxidativ abgebaut wird, so daß Wasserstoffperoxid freigesetzt wird.
(2) pH-Optimum: 5-10.
(3) pH-Stabilitätsbereich: 5-9.
(4) Temperatur-Optimum: 45-50°C.
(5) Temperatur-Stabilitätsbereich:
Durch eine 10minütige Behandlung bei 50°C vermindert sich die Uricase-Aktivität nicht.
(6) Substrat-Spezifität:
Die Uricase weist eine Substrat-Spezifität für Harnsäure auf.

Beispiel 3 Konstruktion des rekombinanten Plasmids pEB2 zur Expression des Uricase-Gens in Bacillus subtilis

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde das das Uricase-Gen enthaltende 3,0 kb BamHI-BglII-Fragment aus dem rekombinanten E. coli-Plasmid pUOD31 isoliert. Sodann wurden 2 µg des E. coli-Bacillus subtilis "shuttle"-Vektors pHY300 PLK mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, mit 2 µg des das Uricase-Gen enthaltenden 3,0 kb BamHI-BglII-Fragments unter Verwendung von 2 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und E. coli C600 wurde nach dem Verfahren von Hanahan mit den Ligierungsprodukten transformiert. Ampicillin-resistente Stämme wurden auf L-Agar selektiert. Aus einem der transformierten E. coli C600-Stämme, der eine Uricase-Aktivität aufwies, wurde nach dem Verfahren von Birnboim et al. das Plasmid pEB2 isoliert. Fig. 3 zeigt ein Konstruktionsschema dieses Plasmids. Sodann wurden kompetente Zellen von Bacillus subtilis ISW 1214 mit diesem Plasmid nach Rodriguez et al., (Herausgeber, Recombinant DNA Techniques, Addison-Wesley Publishing Company, 1983, Seiten 184-186) transformiert. Die Zellen wurden auf L-Agar enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin und 0,2% Glucose ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Durch Selektion Tetracyclin-resistenter Kolonien wurde ein mit dem rekombinanten Plasmid pEB2 transformierter Stamm von Bacillus subtilis isoliert. Diese Transformante wurde in L-Medium, enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin und 0,2% Glucose über Nacht bei 37°C gezüchtet und das Plasmid wurde isoliert und nach Rodriguez et al., (Herausgeber, Recombinant DNA Techniques, Addison-Wesley Publishing Company, 1983, Seiten 164-165) isoliert und extrahiert. Das Plasmid dieser Transformante wurde mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen. Dadurch wurde bestätigt, daß es das Uricase-Gen enthaltende 3,0 kb BamHI-BglII-Fragment trägt. Eine Bacillus-subtilis-Transformante, nämlich die Transformante Bacillus-subtilis ISW1214/pEB2 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1981 hinterlegt.

Herstellung von Uricase in Bacillus subtilis-Zellen

Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 (FERM BP-1981) wurde in L-Medium enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin und 0,2% Glucose über Nacht bei 37°C gezüchtet. Sodann wurden 1,0 ml des Kulturmediums entnommen und 5 Minuten bei 8000 UpM zentrifugiert, um den Überstand von den Zellen abzutrennen. Die Zellen wurden in 1,0 ml Extraktions-Puffer suspendiert, 10 Minuten bei 37°C inkubiert und 10 Minuten bei 12 000 UpM zentrifugiert, um ein Zellysat zu erhalten. Sodann wurden jeweils 20 µl des Kultur-Überstandes und des Zell-Lysats mit jeweils 20 µl des vorstehend genannten Proben-Auftrags-Puffers vermischt, 5 Minuten auf 100°C erhitzt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach dem Verfahren von Laemmli et al. unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brillantblau gefärbt, entfärbt, getrocknet und auf einem Filterpapier befestigt. Dabei wurde sowohl für den Kulturüberstand als auch das Zellysat von Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 eine Uricase-Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 ermittelt. Diese Protein-Bande zeigte eine spezifische Kreuzreaktion mit anti-Uricase-Antikörpern (IgG). Durch Untersuchung der Protein-Bande mit einem Densitometer wurde ferner festgestellt, daß Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 0,6% Uricase pro intrazellulärem Gesamt-Protein hergestellt. Außerdem wurden 40% der von den Zellen hergestellten Uricase in den Kultur-Überstand sezerniert, also extrazellulär hergestellt. Somit wurde gefunden, daß die Transformante Bacillus subtilis ISW1214/pEB2 Uricase sowohl intrazellulär als auch extrazellulär herstellt.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein Uricase-codierendes Gen aus einem Mikroorganismus enthält und eine Uricase mit der folgenden Aminosäure-Sequenz codiert: oder die die folgende DNA-Sequenz ist:

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die aus dem Mikroorganismus Bacillus sp. TB-90 (FERM BP-795) stammt.

3. DNA-Sequenz, die komplementär zu einer DNA-Sequenz ist, die unter üblichen Bedingungen mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche1 bis 2 hybridisiert, und ein Protein mit der biologischen Aktivität von Uricase codiert.

4. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1-3 enthält.

5. Transformante, die ein rekombinantes Plasmid nach Anspruch 4 enthält.

6. Transformante nach Anspruch 5, die der Mikroorganismus Escherichia coli, JM 109 (pUOD 316), Escherichia coli JM109 (pKU1) oder Bacillus subtilis ISW 1214 (pEBB2) ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Uricase, bei dem man eine Transformante nach Anspruch 5 oder 6 in einem Medium unter zur Expression der Uricase-codierenden DNA-Sequenz geeigneten Bedingungen züchtet und die bei der Expression der DNA-Sequenz anfallende Uricase aus der Kultur isoliert.