JP2003024073A

JP2003024073A - Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法

Info

Publication number: JP2003024073A
Application number: JP2001209712A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiro Takenaka; 康浩竹中; Ikuo Kira; 郁夫吉良; Kenzo Yokozeki; 健三横関
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2003-01-28
Anticipated expiration: 2021-07-10
Also published as: EP1275723B1; US20030148472A1; DE60238810D1; US7060485B2; US20060183892A1; SG95698A1; EP1275723A1; JP4561009B2; US7314738B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】５置換ヒダントインをＤ−アミノ酸に変換す
る能力を持つ微生物より、変換能力に関与しているＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子及びＤ−カルバミラーゼ遺伝子
を単離し、遺伝子増幅、転写及び翻訳活性を高めること
によって目的とする酵素の生産量を高めた組換え体を作
製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率良く
製造する方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有し、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、およ
び、特定の塩基配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−アミノ酸の製
造に好適に利用できるＤ−ヒダントインハイドロラーゼ
（Ｄ−ヒダントイナーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼと呼ぶ）をコードするＤＮＡ、該遺伝子を
含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換
された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造
方法、およびＤ−アミノ酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素を用いたアミノ酸製法の一つとし
て、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合
物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉
分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン
化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬
品、化学工業品、食品添加物などの製造に重要な方法で
ある。

【０００３】この５置換ヒダントイン化合物から光学活
性アミノ酸を製造する方法では、以下の、の酵素が
必要である。５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水
分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：ヒダントインハイドロラーゼ（ヒ
ダントイナーゼ）。生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質
を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する
反応を触媒する酵素：Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロ
ラーゼ（カルバミラーゼ）。

【０００４】ここで、５置換ヒダントイン化合物から光
学活性アミノ酸を製造するためには、上記ヒダントイ
ナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも一方
に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵
素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを
組み合わせた方法が知られている。

【０００５】このうち、Ｄ−アミノ酸生産菌または当該
菌が産生する酵素含有物を用いて５置換ヒダントイン化
合物からＤ−アミノ酸を製造する方法として、シュード
モナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特公昭５６
−００３０３４号公報）、アグロバクテリウム(Agrobac
terium)属細菌を用いる方法（特開平０３−０１９６９
６号公報）などが知られている。これらのＤ−アミノ酸
生産菌では、一般的に、そのヒダントイナーゼ活性がＤ
体の５置換ヒダントインに対して特異的であることが多
く、ＤＬ−５置換ヒダントイン（ここでは５−ベンジル
ヒダントイン）を出発物質とした場合、下記反応式に示
すように、Ｄ体のみが加水分解されてＮ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸となり、さらにＤ体のみに作用するＤ−カ
ルバミラーゼによって加水分解されて、最終的にＤ体の
アミノ酸（ここではＤ−フェニルアラニン）のみが得ら
れる。

【０００６】

【化１】

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ここで、Ｄ−アミノ酸
生産菌の培養菌体を用いて５置換ヒダントイン化合物か
ら光学活性アミノ酸を製造する場合には、反応に必要な
酵素の生産量を増加させるため、ヒダントイン誘導体な
どの誘導物質を使用したり、培養菌体を大量に使用する
必要があるなどの問題点がある。

【０００８】また、光学活性アミノ酸を効率良く製造す
るためには、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カ
ルバミラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子増幅、転写および
翻訳活性を高めることによってこの酵素の生産量を高め
た組み換え体を用いることが好ましい。しかしながら、
従来の方法では反応に多くの時間を要し、反応の中間体
であるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が副生するなどの
問題点があった。

【０００９】本発明は上述の問題点を解決するために成
されたものであり、５置換ヒダントイン化合物をＤ−ア
ミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダントイ
ナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離し
て、そのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列を
解明するとともに、該酵素の生産量を高めた組み換え体
を作製し、５置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を効率
良く製造する方法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記問題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは５置換ヒダントイン化合物をＤ−
アミノ酸に変換する能力を持つ微生物よりＤ−ヒダント
イナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を単離
することに成功し、本発明を完成させた。

【００１１】即ち、本発明は以下のとおりである。

【００１２】（請求項１）下記(a)または(b)の塩基配
列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列

【００１３】（請求項２）下記(c)または(d)のアミノ
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００１４】（請求項３）請求項１または２に記載の
ＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換
えＤＮＡ。

【００１５】（請求項４）前記ベクターＤＮＡは、ｐ
ＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはそ
の誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の
組み換えＤＮＡ。

【００１６】（請求項５）請求項３または４に記載の
組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。

【００１７】（請求項６）前記細胞は、エシェリヒア
・コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細
胞。

【００１８】（請求項７）請求項５または６に記載の
細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積さ
せることを特徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有す
るタンパク質の製造方法。

【００１９】（請求項８）下記(a)または(b)のアミノ
酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００２０】（請求項９）請求項７に記載の製造方法
を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイ
ナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに
作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造する
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造工程と、を含むこと
を特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方
法。

【００２１】（請求項１０）請求項７に記載の製造方
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル
−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素または当該酵素含有
物を、５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸を
製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴と
するＤ−アミノ酸の製造方法。

【００２２】（請求項１１）下記(a)または(b)の塩基
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列

【００２３】（請求項１２）下記(c)または(d)のアミ
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００２４】（請求項１３）請求項１１または１２に
記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる
組み換えＤＮＡ。

【００２５】（請求項１４）前記ベクターＤＮＡは、
ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたは
その誘導体に由来することを特徴とする請求項１３に記
載の組み換えＤＮＡ。

【００２６】（請求項１５）請求項１３または１４に
記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。

【００２７】（請求項１６）前記細胞は、エシェリヒ
ア・コリに由来することを特徴とする請求項１５に記載
の細胞。

【００２８】（請求項１７）請求項１５または１６に
記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細
胞中にＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄
積させることを特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質の製造方法。

【００２９】（請求項１８）下記(a)または(b)のアミ
ノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００３０】（請求項１９）請求項１７に記載の製造
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ
酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製
造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造
方法。

【００３１】（請求項２０）請求項１７に記載の製造
方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質を製造するタンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントイ
ンを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒ
ダントインに作用させてＤ−アミノ酸を製造するＤ−ア
ミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ−アミノ
酸の製造方法。

【００３２】（請求項２１）請求項７に記載の製造方
法を用いてＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク
質を製造する第１のタンパク質製造工程と、請求項１７
に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラーゼ活性を有
するタンパク質を製造する第２のタンパク質製造工程
と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
および前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質
を５置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製
造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とす
るＤ−アミノ酸の製造方法。

【００３３】（請求項２２）請求項９に記載のＮ−カ
ルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒ
ダントイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含
有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダント
イン化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とする
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。

【００３４】（請求項２３）請求項１０、１９、２０
または２１に記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、
５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する酵素または当
該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させ、５置換
ヒダントイン化合物をラセミ化する工程を含むことを特
徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。

【００３５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、 [I]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ [II]Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質の製造方
法 [III]Ｄ−アミノ酸の製造方法の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本
明細書においては、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する
タンパク質をＤ−ヒダントイナーゼと呼ぶことがあり、
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＤ−カル
バミラーゼと呼ぶことがある。

【００３６】[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼをコードするＤＮＡ本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラー
ゼをコードするＤＮＡは、特公昭５６−０２５１１９号
に記載のフラボバクテリウムエスピー(Flavobacteriu
m sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）の染色
体ＤＮＡより単離、取得されたものである。なお、フラ
ボバクテリウムエスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１
１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）はアルカリゲネス
アクアマリヌス(Alcaligenes aquamarinus)として通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された
微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム
エスピー(Flavobacterium sp.)に分類されることが判明
した。現在では、フラボバクテリウムエスピー(Flavo
bacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２
９）として経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。

【００３７】上記微生物について、細菌の分類学書であ
るバージェーズマニュアルオブデターミネイティブ
バクテリオロジー第１巻（第９版 1994年、ウイリ
アムアンドウイルキンス社出版）に照らしあわせて
生理性状試験を実施した試験結果を以下に示す。

【００３８】フラボバクテリウムエスピー(Flavobact
erium sp.)ＡＪ１１１９９の再同定結果グラム染色陰性細胞形態桿菌運動性なし硝酸塩還元 − インドール産生 − ブドウ糖酸性化 − アルギニンジヒドラーゼ − ウレアーゼ＋エスクリン加水分解＋ゼラチン加水分解 − β−ガラクトシダーゼ＋カタラーゼ＋オキシダーゼ＋基質資化能ブドウ糖＋Ｌ−アラビノース＋Ｄ−マンノース＋Ｄ−マンニトール＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋マルトース＋グルコン酸カリウム − ｎ−カプリン酸 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 − クエン酸ナトリウム − 酢酸フェニル −

【００３９】以上の菌学的性質より、ＡＪ１１１９９菌
をフラボバクテリウムエスピー(Flavobacterium sp.)
と同定した。

【００４０】本発明者らは、上記ＡＪ１１１９９菌の染
色体ＤＮＡを用いて作製した遺伝子ライブラリーより、
Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子を単離、取得することに成功
した。また、該遺伝子の下流の塩基配列が目的とするＤ
−ヒダントイナーゼ遺伝子であると予想した。即ち、図
１に示すように、本発明のＡＪ１１１９９菌由来のＤ−
カルバミラーゼ遺伝子およびＤ−ヒダントイナーゼ遺伝
子はクラスターを形成していると考えられる。このよう
にして、本発明のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ
−カルバミラーゼ遺伝子の全長を単離・取得することに
成功した。

【００４１】なお、遺伝子の単離の際に用いたＰＣＲ法
の操作については、White, T.J. etal., Trends Genet.
５巻、１８５ページ、１９８９年などに記載されてい
る。また、染色体ＤＮＡを調製する方法や、さらにＤＮ
Ａ分子をプローブとして用いて遺伝子ライブラリーから
目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Mole
cular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor pre
ss（１９８９年）などに記載されている。

【００４２】さらに、単離されたＤ−ヒダントイナーゼ
若しくはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡの塩基
配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecul
ar Cloning, John Wiley & Sons, Inc.（１９８５年）
などに記載されている。また、Applied Biosystems社製
のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定する
ことができる。

【００４３】なお、添付した本発明の配列表において、
上記方法によって特定されたＡＪ１１１９９菌由来のＤ
−ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを配列番号１に
示し、Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡを配列番
号３に示す。

【００４４】これらのＤＮＡは、いずれもＤ−アミノ酸
の製造に係わるタンパク質をコードするものである。

【００４５】また、配列表の配列番号２に、配列表の配
列番号１の塩基配列がコードするＤ−ヒダントイナーゼ
活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列表
の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコー
ドするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列を示す。

【００４６】配列表の配列番号２に記載のＤ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質、および、配列表の配
列番号４に記載のＤ−カルバミラーゼ活性を有するタン
パク質は、下記反応式に示すように、５−ベンジルヒダ
ントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｄ−フ
ェニルアラニンに代表される光学活性アミノ酸を生成す
る反応を触媒する。

【００４７】

【化１】

【００４８】次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼをコ
ードするＤＮＡおよびＤ−カルバミラーゼをコードする
ＤＮＡについて詳細に説明する。

【００４９】(1)Ｄ−ヒダントイナーゼをコードするＤ
ＮＡ配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＤ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子は、前述したようにフラボバクテ
リウムエスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９
９株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知の
アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子（ＷＯ９６／２０２７５号公
報）と５８％（アミノ酸配列において４６％）の相同性
を示す。

【００５０】ここで、本発明のＤ−ヒダントイナーゼを
コードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤ
ＮＡだけではない。即ち、フラボバクテリウム属に属す
る細菌の種や株ごとに塩基配列の違いが観察される。

【００５１】なお、本発明のＤＮＡは単離されたＤ−ヒ
ダントイナーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然
ながら、単離されたＤ−ヒダントイナーゼをコードする
ＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、
Ｄ−ヒダントイナーゼをコードする場合には本発明のＤ
ＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用
いられるものとして、Method in Enzymol.１５４ペー
ジ、１９８７年などに記載されている部位特異的変異導
入法がある。

【００５２】また、配列表の配列番号１に記載の塩基配
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここ
で「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的な
ハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形
成されない条件をいう。この条件を明確に数値化するこ
とは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ
同士、例えば好ましくは７０％以上、さらに好ましくは
９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼー
ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件
が挙げられる。また、「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」と
は、５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによ
ってＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であ
ればよい。

【００５３】さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮ
ＡがコードするＤ−ヒダントイナーゼと実質的に同一の
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡであ
る。即ち、 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも
本発明のＤＮＡである。

【００５４】なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−ヒダントイナーゼ活性」とは、
５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによって
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成する活性であれば
よい。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を
含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号２に記載
のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵
素活性を保持していることが望ましい。

【００５５】(2)Ｄ−カルバミラーゼをコードするＤＮ
Ａ次に、本発明のＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡ
について説明する。配列表の配列番号３の塩基配列を有
する本発明のＤ−カルバミラーゼは、フラボバクテリウ
ムエスピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株
の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知のアグ
ロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−カル
バミラーゼ遺伝子（特許公報２９０２１１２号）と７８
％（アミノ酸配列において７９％）、既知のシュードモ
ナス（Pseudomonas）属細菌由来のＤ−カルバミラーゼ
遺伝子（特許公報２９０２１１２号）と６７％（アミノ
酸配列において５８％）の相同性を示す。

【００５６】なお、本発明のＤ−カルバミラーゼをコー
ドするＤＮＡは、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡ
だけではない。即ち、フラボバクテリウム属に属する細
菌の種および株ごとに塩基配列の違いが観察されるはず
だからである。

【００５７】また、単離されたＤ−カルバミラーゼをコ
ードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであ
っても、Ｄ−カルバミラーゼをコードする場合には、本
発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として
頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.１５
４ページ、１９８７年などに記載されている部位特異的
変異導入法がある。

【００５８】また、配列表の配列番号３に記載の塩基配
列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基
配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同
士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９
０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズ
しない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。また、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、
Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによ
ってＤ−アミノ酸を生成する活性であればよい。

【００５９】また、上記ＤＮＡがコードするＤ−カルバ
ミラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａも本発明のＤＮＡである。即ち、 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本
発明のＤＮＡである。

【００６０】なお、上記（a）、（b）のアミノ酸配列に
基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、Ｄ
ＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性
を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２
〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２
〜１０個である。「Ｄ−カルバミラーゼ活性」とは、Ｎ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することによっ
てＤ−アミノ酸を生成する活性であればいかなるもので
もよい。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸
配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位
を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の
酵素活性を保持していることが望ましい。

【００６１】[II]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼの製造方法次に、組み換えＤＮＡ技術によってＤ−ヒダントイナー
ゼおよびＤ−カルバミラーゼを製造する方法について説
明する。なお、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生
理活性物質などの有用タンパク質を製造する例は数多く
知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天
然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。

【００６２】図２は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼお
よびＤ−カルバミラーゼの製造工程のフローチャートで
ある。まず、本発明のＤ−ヒダントイナーゼＤＮＡおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼＤＮＡを調製する(ステ
ップＳ１)。次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと
接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組
み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を
作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地
中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダン
トイナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを生成蓄
積させる(ステップＳ４)。その後、ステップＳ５に進
み、該酵素を回収・精製することによってＤ−ヒダント
イナーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを大量生産
する。また、ステップＳ５で生産した酵素またはステッ
プＳ４の酵素が蓄積された培地を用いてアミノ酸を合成
することで、目的とするアミノ酸を大量に製造すること
ができる(ステップＳ６)。

【００６３】なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡ
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼが発現可能であればよい。

【００６４】ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子としては、上述の(a)配列表の
配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)配列
表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな
条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ、(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸
配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコード
するＤＮＡなどを使用できる。

【００６５】また、ベクターＤＮＡと接続されるＤ−カ
ルバミラーゼ遺伝子としては、(a)配列表の配列番号３
に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)配列表の配列番
号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、(c)配列表の
配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡな
どを使用できる。

【００６６】さらに、これらのＤＮＡの他、上記Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子とＤ−カルバミラーゼ遺伝子を連
結したＤＮＡなどを用いることもできる。この場合に
は、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび本発明のＤ−
カルバミラーゼが同時に発現することになる。

【００６７】ところで、組み換えＤＮＡ技術を用いてタ
ンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞
としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細
胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一
般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術
について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくは
エシェリヒア・コリが用いられる。以下、形質転換され
た大腸菌を用いてＤ−ヒダントイナーゼおよび／または
Ｄ−カルバミラーゼを製造する方法を説明する。

【００６８】Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモ
ーターとしては、通常大腸菌においてタンパク質生産に
用いられるプロモーターを使用することができ、例え
ば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーターな
どの強力なプロモーターが挙げられる。

【００６９】また、生産量を増大させるためには、タン
パク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータ
ーを連結することが好ましい。このターミネーターとし
ては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネータ
ー、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネー
ターなどが挙げられる。

【００７０】Ｄ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−
カルバミラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞に導入す
るためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型の
ものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有す
るプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３
２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられ
る。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿
入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施
したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異
剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異な
どによる改変をも含む。

【００７１】また、形質転換体を選別するために、該ベ
クターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有す
ることが好ましく、このようなプラスミドとして、例え
ば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クロ
ーンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック
製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクタ
ーが市販されている。

【００７２】プロモーター、Ｄ−ヒダントイナーゼおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子、タ
ーミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤ
ＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得ることができる。

【００７３】該組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質
転換し、この細胞を培養すると、Ｄ−ヒダントイナーゼ
および／またはＤ−カルバミラーゼが発現生産される。
なお、形質転換を行う方法および形質転換体を選別する
方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring
Harbor press （１９８９年)などに記載されている方法
を適用することができる。

【００７４】また、生産培地としては、Ｍ９−カザミノ
酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用
いる培地を用いてもよい。さらに、培養条件、生産誘導
条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿
主菌などの種類に応じて適宜選択する。酵素生産量を高
めるため、培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加したり、温度上昇な
どの酵素誘導処理を行うことも好ましい。

【００７５】培養菌体を遠心分離操作などにより回収し
た後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼおよび／またはＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用することができる。菌体破砕には超音波
破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方
法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リ
ゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜
組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じ
て、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなど
の手法により、これらの酵素を精製して用いることも可
能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精
製法も利用できる。

【００７６】上述の組み換え体を用いる方法によって得
られる本発明のＤ−ヒダントイナーゼは、下記(a)また
は(b)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有するタンパク質である。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００７７】また、上述の組み換え体を用いる方法によ
って得られる本発明のＤ−カルバミラーゼは、下記(c)
または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ
活性を有するタンパク質である。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００７８】なお、ここで、「数個」および「Ｄ−ヒダ
ントイナーゼ活性」、「Ｄ−カルバミラーゼ活性」の定
義は、[I]Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバミラ
ーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。

【００７９】[III]Ｄ−アミノ酸の製造方法次に、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／またはＤ
−カルバミラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法につ
いて述べる。

【００８０】本発明のＤ−アミノ酸の製造方法は、ヒダ
ントイナーゼおよびカルバミラーゼのうち、少なくとも
一方に本発明の酵素を用いるものであり、ヒダントイナ
ーゼおよびカルバミラーゼの組み合わせとしては下記の
３通りが考えられる。 (i)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ＋カルバミラーゼ (ii)ヒダントイナーゼ＋本発明のＤ−カルバミラーゼ (iii)本発明のＤ−ヒダントイナーゼ＋本発明のＤ−
カルバミラーゼ

【００８１】(i)の場合、本発明のＤ−ヒダントイナー
ゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質が挙げら
れる。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００８２】また、このようなＤ−ヒダントイナーゼを
コードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み
換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養すること
によって得られたＤ−ヒダントイナーゼを用いることも
できる。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−ヒダントイ
ナーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接
基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、
洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破
砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよ
いし、当該菌体処理物からＤ−ヒダントイナーゼを回収
し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を
精製して用いてもよい。即ち、Ｄ−ヒダントイナーゼ活
性を有する画分であれば、全てを使用することが可能で
ある。

【００８３】本発明のＤ−ヒダントイナーゼの基質とし
ては、当該酵素の基質特異性において加水分解できる５
置換ヒダントイン化合物であればいかなるものも使用で
きる。例えば、ヒダントイン、５−メチルヒダントイ
ン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシ
ベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダン
トイン、５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダン
トイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソ
プロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、
５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−カルボキシエチ
ルヒダントイン、５−カルボキシメチルヒダントイン、
５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキ
シメチルヒダントインなどに代表されるような天然型ア
ミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物の他、５−
フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニ
ル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、
５−ベンジロキシメチルヒダントイン、５−（３,４−
メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウ
ラシルなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若し
くはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙
げられる。

【００８４】本発明のＤ−ヒダントイナーゼと組み合わ
せて用いるカルバミラーゼとしては、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−アミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することに
よりＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または
当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用
いることができる。すなわち、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ア
ミノ酸のみに特異的に作用するカルバミラーゼ（Ｄ−カ
ルバミラーゼ）であっても、光学選択性を有しないカル
バミラーゼであってもよい。ここで、「酵素含有物」と
は、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養
物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理
物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げられる。

【００８５】Ｄ−カルバミラーゼとしては、例えばシュ
ードモナス（Pseudomonas）や、アグロバクテリウム（A
grobacterium）にその存在が知られている（特許２９０
２１１２号公報）。

【００８６】次に(ii)の場合について説明する。本発明
のＤ−カルバミラーゼとしては、下記(a)または(b)のア
ミノ酸配列を有し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタ
ンパク質が挙げられる。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列

【００８７】また、このようなＤ−カルバミラーゼをコ
ードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することに
よって得られたＤ−カルバミラーゼを用いることもでき
る。形質転換された細胞を用いて、Ｄ−カルバミラーゼ
を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を
添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌
体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕ある
いは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、
当該菌体処理物からＤ−カルバミラーゼを回収し、粗酵
素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して
用いてもよい。即ち、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有する
画分であれば、全てを使用することが可能である。

【００８８】また、本発明のＤ−カルバミラーゼの基質
としては、当該酵素の基質特異性において加水分解でき
るＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であればいかなるもの
も使用できる。即ち、上述した５置換ヒダントイン化合
物より得られるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸以外のＮ
−カルバミル−Ｄ−アミノ酸であっても基質として使用
することができる。

【００８９】さらに、本発明のＤ−カルバミラーゼと組
み合わせて用いるヒダントイナーゼとしては、５置換ヒ
ダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解するこ
とによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒
する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく
公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有
物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的に
は培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌
体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含むものが挙げら
れる。ただし、本発明のＤ−カルバミラーゼは、Ｄ体特
異的であるので、光学特異性のないヒダントイナーゼま
たはＤ体に特異的に作用するＤ−ヒダントイナーゼを用
いる必要がある。光学特異性のないヒダントイナーゼ
は、例えばマイクロバクテリウムリクエファシエンス
（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株にそ
の存在が知られている（特願２００１−０６５８１４
号）。また、Ｄ体ヒダントイン化合物に特異的に作用す
るＤ−ヒダントイナーゼは、例えばアグロバクテリウム
エスピー（Agrobacterium sp.）ＡＪ１１２２０株に
その存在が知られている（特公昭５６−００３０３４号
公報）。なお、マイクロバクテリウムリクエファシエ
ンスＡＪ３９１２株は、１９７５年６月２７日に通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与された微生物であ
る。また、アグロバクテリウムエスピー（Agrobacter
ium sp.）ＡＪ１１２２０株（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）
はシュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）とし
て１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同
定の結果、アグロバクテリウムエスピー（Agrobacter
ium sp.）に分類されることが判明した。現在では、ア
グロバクテリウムエスピー（Agrobacterium sp.）Ａ
Ｊ１１２２０（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）として独立行政
法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託
されている。

【００９０】次に、(iii)の場合について説明する。(ii
i)では、(i)で説明した本発明のＤ−ヒダントイナーゼ
および(ii)で説明した本発明のＤ−カルバミラーゼを組
み合わせて用いる。(i)〜(iii)のうち最も好ましい組み
合わせは(iii)である。

【００９１】ここで、反応工程としては、Ｄ−ヒダント
イナーゼとＤ−カルバミラーゼの混合物を５置換ヒダン
トイン化合物に作用させてもよいし、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼを５置換ヒダントイン化合物に作用させた後、Ｄ−
カルバミラーゼを作用させてもよい。反応工程の簡素化
の観点からは前者の方法が好ましい。

【００９２】なお、上記(i)〜(iii)の方法によってＤ−
アミノ酸を製造する際に、Ｌ体のＮ−カルバミルアミノ
酸やアミノ酸を製造することも可能である。例えば、本
発明のＤ−ヒダントイナーゼを用いて、ＤＬ−５置換ヒ
ダントインからＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を製造し
たあと、残存するＬ−５置換ヒダントインとＮ−カルバ
ミル−Ｄ−アミノ酸とを分離して、Ｌ−５置換ヒダント
インを回収し、これを加水分解させることによりＮ−カ
ルバミル−Ｌ−アミノ酸を、さらに加水分解反応を進行
させることによりＬ−アミノ酸を製造できる。当該加水
分解反応には、Ｌ体に作用する加水分解酵素を用いても
よいが、亜硝酸等による化学的な加水分解処理を施すこ
とによっても、光学活性を維持したまま、高収率でＬ−
アミノ酸を製造することが可能である。

【００９３】また、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物
をＤ−アミノ酸へと変換させる際には、５置換ヒダント
イン化合物の自発的ラセミ化若しくは化学的なラセミ化
若しくはヒダントインラセマーゼを用いるラセミ化反応
などを組み合わせることにより、ＤＬ体の５置換ヒダン
トイン化合物からモル収率５０％以上でＤ−アミノ酸を
製造することが可能となる。

【００９４】換言すれば、Ｄ−ヒダントイナーゼおよび
Ｄ−カルバミラーゼの他、さらにヒダントインラセマー
ゼを用いることが好ましい。ヒダントインラセマーゼと
しては、例えば、特願２００１−０６５８１５号に記載
のマイクロバクテリウムリクエファシエンス（Microb
acterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株（ＦＥＲＭ−
Ｐ３１３３）由来のヒダントインラセマーゼを好ましく
用いることができる。この場合、下記反応式に示すよう
に、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが
５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、
ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル
収率１００％でＤ−アミノ酸を製造することが可能とな
る。

【００９５】

【化２】

【００９６】なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カ
ルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例え
ば、上記混成タンパクにＤ−カルバミラーゼの阻害剤な
どを添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で
止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造でき
る。

【００９７】本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよび／ま
たはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベクター
が接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換
された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理
物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵
素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５
置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌
体、菌体処理物、粗酵素液、または、精製酵素を含む反
応液を２５〜６０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９
に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。

【００９８】また、本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよ
び／またはＤ−カルバミラーゼをコードするＤＮＡとベ
クターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形
質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミ
ノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイ
ン化合物を含み、かつ、形質転換された細胞の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水
溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸など
の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる
場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加して
もよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃
の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日間培養するこ
とが好ましい。

【００９９】培養液あるいは反応液中のＤ−アミノ酸の
定量は周知の方法を用いて速やかに測定することができ
る。即ち、簡便にはMerck製のHPTLC CHIRなどを利用し
た薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より
分析精度を高めるには、ダイセル化学工業製のCHIRALPA
K WHなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いればよい。

【０１００】培養液あるいは反応液中に蓄積されたＤ−
アミノ酸は、定法により培養液あるいは反応液中より採
取することができる。例えば、濾過、遠心分離、真空濃
縮、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、結晶化
などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いること
ができる。特に、高濃度の５置換ヒダントイン化合物か
らの変換を行った際には、培養液あるいは反応液を冷却
し、ｐＨを調整するなどによってＤ−アミノ酸を容易に
結晶として得ることができる。

【０１０１】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定され
るものではない。なお、実施例における５置換ヒダント
イン化合物、Ｎ−カルバミルアミノ酸、およびアミノ酸
の定量および光学純度測定には、ダイセル化学工業製光
学分割カラムCHIRALPAK WHを利用したＨＰＬＣを用い
た。分析条件は以下のとおりである。カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×
２５ｃｍ移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ₄ カラム温度：５０℃ 流速：１．５ｍｌ/分検出：ＵＶ₂₁₀

【０１０２】（実施例１）ＡＪ１１１９９菌由来のＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝
子の単離

【０１０３】１．菌体の取得フラボバクテリウムエスピー（Flavobacterium sp.）
ＡＪ１１１９９株をＣＭ２Ｇ寒天培地（グルコース０．
５％、酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣ
ｌ０．５％、寒天２％、ｐＨ７．０）上で３０℃、２
４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣ
Ｍ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ｍｌ容の坂口フラ
スコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振と
う培養した。

【０１０４】２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４
℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌ
の５０:２０ＴＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ
８．０)、２０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心
分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１
０ｍｌの５０:２０ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁
液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍ
ｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間
インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１
０:１ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行っ
た。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡ
を０．５ｍｌ５０:２０ＴＥに溶解した後、５μlの１
０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ Pro
teinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応
後、１倍容の１０:１ＴＥ飽和のフェノールで除タンパ
クを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の
２４:１クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて
攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った
後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２
倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡ
を回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌ
の１０:１ＴＥに溶解させた。

【０１０５】３．遺伝子ライブラリーからのＤ−カルバ
ミラーゼ遺伝子の単離まず、フラボバクテリウムエスピー（Flavobacterium
sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡ２００μｇに制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩを１Ｕ添加し、３７℃にて１５分間
反応させて部分消化した。次に、このＤＮＡからアガロ
ース電気泳動にて３〜８ｋｂｐの断片を回収した。これ
をプラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ切断物とライゲー
ションさせ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ラ
イブラリーを作製した。これをアンピシリンを含むＬＢ
培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム１％、アンピシリン０．０１％、寒天２％、ｐＨ
７．０）にプレーティングした後、コロニーをＮ−カル
バミル−Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源とする液体
培地（グルコース０．２％、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェ
ニルアラニン０．２％、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ０．６％、ＫＨ
₂ＰＯ₄ ０．３％、ＮａＣｌ０．０５％、ＭｇＳＯ₄
０．０１２％、ＣａＣｌ₂ ０．１ｍＭ、アンピシリ
ン０．０１％、チアミン０．０００１％、ｐＨ７．０）
に植菌し、集積培養することによってＮ−カルバミル−
Ｄ−フェニルアラニンを単一窒素源として生育可能な株
を選抜した。こうして得られた形質転換体を単離し、ア
ンピシリンとイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地にて培養後、
遠心・集菌した菌体を０．５％のＮ−カルバミル−Ｄ−
フェニルアラニンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液に１％添
加し、３７℃にて５時間反応させた。反応液を解析した
ところ、Ｄ−フェニルアラニンの生成が確認できたこと
から、この形質転換体が目的とする遺伝子を含むプラス
ミドを保持していると確認した。この形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ６３２−１と命名し
た。

【０１０６】４．挿入断片の塩基配列プラスミドｐＵＣ６３２−１の挿入断片の塩基配列をジ
デオキシ法によって決定した。プラスミドｐＵＣ６３２
−１の挿入断片の塩基配列を配列表の配列番号５に示
す。その結果、挿入断片の長さは４．１ｋｂｐであり、
Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子であると考えられる約０．９
ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；塩基番
号３０６〜１２２０）を含むことが明らかとなった。こ
のＯＲＦをＯＲＦ１と命名した。また、ＯＲＦ１の下流
には約１．１ｋｂのＯＲＦ（塩基番号１２８７〜２３３
６）が存在しており、さらにその下流に約１．５ｋｂの
ＯＲＦ（塩基番号２３４１〜３７９８）が見出された。
これらのＯＲＦをそれぞれＯＲＦ２、ＯＲＦ３と命名し
た（図１）。

【０１０７】５．各オープンリーディングフレームと既
知配列との相同性こうして得られた各ＯＲＦについて、既知配列との相同
性検索を行ったところ、ＯＲＦ１は、既知のアグロバク
テリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−カルバミラ
ーゼ遺伝子と７８％（アミノ酸配列において７９％）、
シュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のＤ−カル
バミラーゼ遺伝子と６７％（アミノ酸配列において５８
％）の相同性を示した。また、ＯＲＦ３は既知のアグロ
バクテリウム(Agrobacterium)属細菌由来のＤ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子と５８％（アミノ酸配列において４６
％）の相同性を示した。一方、ＯＲＦ２は特に既知配列
との相同性は確認されなかった。以上の結果より、ＯＲ
Ｆ１がＤ−カルバミラーゼ遺伝子であり、ＯＲＦ３がＤ
−ヒダントイナーゼ遺伝子であることが予想された。Ｄ
−ヒダントイナーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配
列番号１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号
２に示した。また、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子全長の塩
基配列を配列表の配列番号３に、対応するアミノ酸配列
を配列表の配列番号４に示した。

【０１０８】（実施例２）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子
のＥ．ｃｏｌｉにおける発現

【０１０９】１．発現プラスミドの構築両遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１
８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプ
ラスミドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃを以下の
ようにして構築した。まず、フラボバクテリウムエス
ピー（Flavobacterium sp.）ＡＪ１１１９９株の染色体
ＤＮＡを鋳型とし、表１に示すオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した。これ
らの断片を、それぞれＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｐＵＣ１８のＸｂａＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断物とライゲ
ーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に導入し
た。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持
った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミ
ドｐＵＣ６３２ＨおよびｐＵＣ６３２Ｃと命名した。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】２．無細胞抽出液の調製ｐＵＣ６３２Ｈを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体および
ｐＵＣ６３２Ｃを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．
１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、
１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込ん
だ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍ
ｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５
時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加
し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗
浄を行い、菌体を５ｍｌの５０ｍＭＫＰＢ (ｐＨ８．
０)に懸濁し、０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分
間（３０秒×６回、９０秒のインターバル）ビーズビー
ターにて破砕した。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１
０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液と
した。

【０１１２】３．Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼ活性測定Ｄ−ヒダントイナーゼ活性の測定は、１２０ｍｇ／ｄｌ
Ｄ−５−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ｍＭＫ
ＰＢ (ｐＨ８．０)および酵素溶液を含む反応液を３７
℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．１ｍＭ
ＣｕＳＯ₄、１１．１ｍＭＨ₃ＰＯ₄を添加し、２０，
０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除い
た後、生成したＮ−カルバミルフェニルアラニン（Ｎ−
Ｃａｒ−Ｐｈｅ）をＨＰＬＣにて定量することによっ
た。酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１
μｍｏｌのＮ−カルバミルフェニルアラニンを生成する
酵素活性をもって１Ｕと定義した。

【０１１３】Ｄ−カルバミラーゼ活性の測定は、８０ｍ
ｇ／ｄｌＮ−カルバミル−Ｄ−フェニルアラニン、５
０ｍＭＫＰＢ (ｐＨ７．５)および酵素溶液を含む反
応液を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の
１．１ｍＭＣｕＳＯ₄、１１．１ｍＭＨ₃ＰＯ₄を添加
し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱
を取り除いた後、生成したＤ−フェニルアラニン（Ｄ−
Ｐｈｅ）をＨＰＬＣにて定量することによった。酵素活
性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌの
Ｄ−フェニルアラニンを生成する酵素活性をもって１Ｕ
と定義した。

【０１１４】その結果を表２に示す。ｐＵＣ６３２Ｈを
用いて形質転換した株ではＤ−ヒダントイナーゼ活性が
検出され、ｐＵＣ６３２Ｃを用いて形質転換した株には
Ｄ−カルバミラーゼ活性が検出されたことから、両遺伝
子がフラボバクテリウムエスピー（Flavobacterium s
p.）ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子
およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉ
の菌体内で発現されていることを確認した。

【０１１５】

【表２】

【０１１６】（実施例３）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たＤ−フェニルアラニンの生産実施例２と同様にして培養したＪＭ１０９／ｐＵＣ６３
２Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ６３２Ｃの洗
浄菌体を調製し、１ｇ／ｄｌのＤ−５−ベンジルヒダン
トインを含む０．１ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれ
ぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させ
た。反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰ
ＬＣで解析することにより、生成したＤ−フェニルアラ
ニンを定量した。

【０１１７】その結果を３に示した。この表に示される
ように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバ
ミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用
いることにより、ベンジルヒダントインから効率良くＤ
−フェニルアラニンを生成させることができた。

【０１１８】

【表３】

【０１１９】（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用い
たＤ−アミノ酸の生産実施例３と同様にして調製したＪＭ１０９／ｐＵＣ６３
２Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ６３２Ｃの洗
浄菌体を、１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントイン化合物
を含む０．１ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）にそれぞれ１
ｇ／ｄｌとなるように添加して３０℃で反応させた。反
応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで
解析することにより生成したＤ−アミノ酸を定量した。

【０１２０】その結果を表４に示した。この表に示され
るように、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子およびＤ−カル
バミラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を
用いることにより、各種５置換ヒダントイン化合物から
効率良くＤ−アミノ酸を生成させることができた。

【０１２１】

【表４】

【０１２２】（実施例５）ヒダントインラセマーゼによ
るラセミ化との組み合わせによるＤ−フェニルアラニン
の生産特願２００１−０６５８１５号に記載のマイクロバクテ
リウムリクエファシエンス（Microbacterium liquefa
ciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来の
ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドｐＵＣＦ
ＨＲを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード
培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容
坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７
℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃
度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間
培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、洗浄菌
体を調製した。また、実施例３と同様にしてＪＭ１０９
／ｐＵＣ６３２Ｈの洗浄菌体およびＪＭ１０９／ｐＵＣ
６３２Ｃの洗浄菌体を調製し、上記ヒダントインラセマ
ーゼ発現株の洗浄菌体とともに１ｇ／ｄｌのＤＬ−５−
ベンジルヒダントインを含む０．１ｍＭＫＰＢ（ｐＨ
７．５）にそれぞれ１ｇ／ｄｌとなるように添加して３
０℃で反応させた。反応２４、４８、７２時間後にサン
プリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することによ
り、生成したＤ−フェニルアラニンを定量した。

【０１２３】その結果を表５に示した。この表に示され
るように、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、Ｄ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子およびＤ−カルバミラーゼ遺伝子を発
現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、Ｄ
Ｌ体のベンジルヒダントインから効率良くＤ−フェニル
アラニンを生成させることができた。

【０１２４】

【表５】

【０１２５】（実施例６）実施例５と同様にして反応を
行い、Ｄ−フェニルアラニンを含む反応液５００ｍｌを
得た。この反応液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０
分）して菌体を分離し、遠心上清を減圧濃縮操作により
２０ｍｌまで濃縮することによって、Ｄ−フェニルアラ
ニンの結晶を析出させた。析出結晶は、濾紙を用いて濾
過により回収し、粗結晶とした。粗結晶（２．４g）に
水１０ｍｌ、濃硫酸１ｍｌを加えて溶解させ、これに１
００mgの活性炭を加え、溶液の脱色を行わせた。次に、
濾過により活性炭を除いた後、濾液に２８％アンモニア
水を５ｍｌ加えてｐＨ３．５とし、Ｄ−フェニルアラニ
ンを再結晶させた。その後、濾紙を用いて濾過により回
収した析出結晶を乾燥させ、１．８ｇのＤ−フェニルア
ラニンを得た。ＨＰＬＣ分析に供したところ、物質純度
９９%、光学純度は９９%e.e.以上であった。

【０１２６】

【発明の効果】本発明によって、Ｄ−ヒダントイナーゼ
およびＤ−カルバミラーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主
において安定に大量に発現させることが可能となった。
この結果、このような形質転換体から該酵素を容易に調
製することができるようになり、該形質転換体やその抽
出液、精製酵素等を用いることによって医薬品、化学工
業品、食品添加物等の製造に有用なＤ−アミノ酸を効率
良く生産できるようになった。

【０１２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO Co,LTD <120> AJINOMOTO <130> PAMA-13136 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Flavobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1455) <300> <400> 1 atg acc cat tac gat ctc gtc att cgc gga gga acc gtc gcc acg gcg 48 Met Thr His Tyr Asp Leu Val Ile Arg Gly Gly Thr Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 agt gat tgc ttc cgg gcg gat gtt gcg gtc acc gac ggc agg atc gtc 96 Ser Asp Cys Phe Arg Ala Asp Val Ala Val Thr Asp Gly Arg Ile Val 20 25 30 gcc atc ggc gag aat ctc ggg ccc gcc gcc cgc gag atc tcg gcg gaa 144 Ala Ile Gly Glu Asn Leu Gly Pro Ala Ala Arg Glu Ile Ser Ala Glu 35 40 45 ggc cgc ctc gtt ctg ccc ggc ggc gtc gat tcc cat tgc cat atc gag 192 Gly Arg Leu Val Leu Pro Gly Gly Val Asp Ser His Cys His Ile Glu 50 55 60 gag ccg cag gtc ggc gag gtg cgc aac gcg gaa acc ttc gcc tcc gcc 240 Glu Pro Gln Val Gly Glu Val Arg Asn Ala Glu Thr Phe Ala Ser Ala 65 70 75 80 acc tct tcg gcg gcc gcg ggc ggc acg acg acg gtc att tcc ttc tct 288 Thr Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Val Ile Ser Phe Ser 85 90 95 cag cag gtg aaa ggc ggc ggc atc acc gag gcc ctg cgc gac tat cac 336 Gln Gln Val Lys Gly Gly Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Asp Tyr His 100 105 110 gag aag gcg acc cgc gcg ctg atc gac tat tcc ttc cat ctc gtc gtg 384 Glu Lys Ala Thr Arg Ala Leu Ile Asp Tyr Ser Phe His Leu Val Val 115 120 125 acc gat ccc acg gat gcg gtg ctg gag gaa ctg gtg ccg ctg atc gag 432 Thr Asp Pro Thr Asp Ala Val Leu Glu Glu Leu Val Pro Leu Ile Glu 130 135 140 gaa ggg cac cgg tcg ctg aag atc ttc atg acc tat acc aat gtc gtg 480 Glu Gly His Arg Ser Leu Lys Ile Phe Met Thr Tyr Thr Asn Val Val 145 150 155 160 ctc gac gac gag cag acg ctg cgc gtg ctg gcg ctc gcc cgc aag acc 528 Leu Asp Asp Glu Gln Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Lys Thr 165 170 175 ggc gct ctc gtc acg gtg cat gcc gag aac cat gcc gcg atc atg tac 576 Gly Ala Leu Val Thr Val His Ala Glu Asn His Ala Ala Ile Met Tyr 180 185 190 ctc acg cgt gcc ttg gaa aag gcc ggg ctc acc gcc ccg aag tac cac 624 Leu Thr Arg Ala Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Ala Pro Lys Tyr His 195 200 205 gcc tgg gcc aag ccc atg ccg gtg gaa cgg gag gcc tgc cac cgc atc 672 Ala Trp Ala Lys Pro Met Pro Val Glu Arg Glu Ala Cys His Arg Ile 210 215 220 atc atg ctc tcc gaa ctg ctg gat gtt ccc att cag atc ttc cac gtt 720 Ile Met Leu Ser Glu Leu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ile Phe His Val 225 230 235 240 tcc ggg gcg gag gcg gcc gag gaa atc cgc cgc gcg cag aat cgc ggc 768 Ser Gly Ala Glu Ala Ala Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Asn Arg Gly 245 250 255 ctc aag gtc ttc ggc gag acc tgc ccg caa tat ctg atg ctg acg gcg 816 Leu Lys Val Phe Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu Met Leu Thr Ala 260 265 270 gcg gat ctc gac cgg ccg gat ttc gag ggt gcg aaa ttc ctg tgc agc 864 Ala Asp Leu Asp Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Phe Leu Cys Ser 275 280 285 ccc gcg ccg cgc acg acg gcc gat cag gaa gcc ctg tgg gac tat atc 912 Pro Ala Pro Arg Thr Thr Ala Asp Gln Glu Ala Leu Trp Asp Tyr Ile 290 295 300 cgc acg gga acg atc ggg gtc gtg tcg tcc gac cac gcg ccg aac cgc 960 Arg Thr Gly Thr Ile Gly Val Val Ser Ser Asp His Ala Pro Asn Arg 305 310 315 320 ttc gac gat ccg cac ggc aag aag gtc ggc ggg gtg gac gcg ccc ttc 1008 Phe Asp Asp Pro His Gly Lys Lys Val Gly Gly Val Asp Ala Pro Phe 325 330 335 agc gcc att ccg aac ggc gtg ccg ggg ctg gcg acg cgc ctg ccg atc 1056 Ser Ala Ile Pro Asn Gly Val Pro Gly Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ile 340 345 350 ctg ttt tcc gaa ggg gtc gtc aag ggg cgc atc gac ctc aac acc ttc 1104 Leu Phe Ser Glu Gly Val Val Lys Gly Arg Ile Asp Leu Asn Thr Phe 355 360 365 gtc gcg ctg acg gcg gcc aat ccg gcg aag ctc ttt ggc ctg cat ccc 1152 Val Ala Leu Thr Ala Ala Asn Pro Ala Lys Leu Phe Gly Leu His Pro 370 375 380 aga aag ggc acc atc gcc gtc gga gcc gat gcg gat atc gcg atc tgg 1200 Arg Lys Gly Thr Ile Ala Val Gly Ala Asp Ala Asp Ile Ala Ile Trp 385 390 395 400 gat ccc gag cgc aag gtg acg atc cgc aac gac atg ctg cat cac ggc 1248 Asp Pro Glu Arg Lys Val Thr Ile Arg Asn Asp Met Leu His His Gly 405 410 415 gtc gac tac acg gtc tac gag ggc gtc gag gtg acc gga tgg ccg gtg 1296 Val Asp Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Val Glu Val Thr Gly Trp Pro Val 420 425 430 atg acg ctc tcg cgc ggc gag gtg gtc tat gat gac ggc gcg gtg gtc 1344 Met Thr Leu Ser Arg Gly Glu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Val Val 435 440 445 ggc aag ccg ggt cac ggg cgc ttc ctt gcc cgc ggt ccc tat gac gcg 1392 Gly Lys Pro Gly His Gly Arg Phe Leu Ala Arg Gly Pro Tyr Asp Ala 450 455 460 atc aag ccg cgc ggc agg cat gtg acg cct ttc gac ccg gtg acg ggc 1440 Ile Lys Pro Arg Gly Arg His Val Thr Pro Phe Asp Pro Val Thr Gly 465 470 475 480 gaa gtg gaa acg gcc tga 1458 Glu Val Glu Thr Ala 485 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Flavobacterium sp. <400> 2 Met Thr His Tyr Asp Leu Val Ile Arg Gly Gly Thr Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ser Asp Cys Phe Arg Ala Asp Val Ala Val Thr Asp Gly Arg Ile Val 20 25 30 Ala Ile Gly Glu Asn Leu Gly Pro Ala Ala Arg Glu Ile Ser Ala Glu 35 40 45 Gly Arg Leu Val Leu Pro Gly Gly Val Asp Ser His Cys His Ile Glu 50 55 60 Glu Pro Gln Val Gly Glu Val Arg Asn Ala Glu Thr Phe Ala Ser Ala 65 70 75 80 Thr Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Val Ile Ser Phe Ser 85 90 95 Gln Gln Val Lys Gly Gly Gly Ile Thr Glu Ala Leu Arg Asp Tyr His 100 105 110 Glu Lys Ala Thr Arg Ala Leu Ile Asp Tyr Ser Phe His Leu Val Val 115 120 125 Thr Asp Pro Thr Asp Ala Val Leu Glu Glu Leu Val Pro Leu Ile Glu 130 135 140 Glu Gly His Arg Ser Leu Lys Ile Phe Met Thr Tyr Thr Asn Val Val 145 150 155 160 Leu Asp Asp Glu Gln Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Ala Arg Lys Thr 165 170 175 Gly Ala Leu Val Thr Val His Ala Glu Asn His Ala Ala Ile Met Tyr 180 185 190 Leu Thr Arg Ala Leu Glu Lys Ala Gly Leu Thr Ala Pro Lys Tyr His 195 200 205 Ala Trp Ala Lys Pro Met Pro Val Glu Arg Glu Ala Cys His Arg Ile 210 215 220 Ile Met Leu Ser Glu Leu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ile Phe His Val 225 230 235 240 Ser Gly Ala Glu Ala Ala Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Asn Arg Gly 245 250 255 Leu Lys Val Phe Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu Met Leu Thr Ala 260 265 270 Ala Asp Leu Asp Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Phe Leu Cys Ser 275 280 285 Pro Ala Pro Arg Thr Thr Ala Asp Gln Glu Ala Leu Trp Asp Tyr Ile 290 295 300 Arg Thr Gly Thr Ile Gly Val Val Ser Ser Asp His Ala Pro Asn Arg 305 310 315 320 Phe Asp Asp Pro His Gly Lys Lys Val Gly Gly Val Asp Ala Pro Phe 325 330 335 Ser Ala Ile Pro Asn Gly Val Pro Gly Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ile 340 345 350 Leu Phe Ser Glu Gly Val Val Lys Gly Arg Ile Asp Leu Asn Thr Phe 355 360 365 Val Ala Leu Thr Ala Ala Asn Pro Ala Lys Leu Phe Gly Leu His Pro 370 375 380 Arg Lys Gly Thr Ile Ala Val Gly Ala Asp Ala Asp Ile Ala Ile Trp 385 390 395 400 Asp Pro Glu Arg Lys Val Thr Ile Arg Asn Asp Met Leu His His Gly 405 410 415 Val Asp Tyr Thr Val Tyr Glu Gly Val Glu Val Thr Gly Trp Pro Val 420 425 430 Met Thr Leu Ser Arg Gly Glu Val Val Tyr Asp Asp Gly Ala Val Val 435 440 445 Gly Lys Pro Gly His Gly Arg Phe Leu Ala Arg Gly Pro Tyr Asp Ala 450 455 460 Ile Lys Pro Arg Gly Arg His Val Thr Pro Phe Asp Pro Val Thr Gly 465 470 475 480 Glu Val Glu Thr Ala 485 <210> 3 <211> 915 <212> DNA <213> Flavobacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(912) <400> 3 atg cca gga aag atc att ctc gcg gtg ggc cag ctt gga ccc atc gcc 48 Met Pro Gly Lys Ile Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 cgc agc gac agc cgc gaa cag gtg gtg aag cgg ctc gtc gac atg ctg 96 Arg Ser Asp Ser Arg Glu Gln Val Val Lys Arg Leu Val Asp Met Leu 20 25 30 gag gag gcc gcg gcc cgc aat tcg gat ttc atc gtc ttt ccc gag ctg 144 Glu Glu Ala Ala Ala Arg Asn Ser Asp Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 gcg ctg acc acc ttc ttc ccc cgc tgg tat ttc acc gac gag gcg gaa 192 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 ctg gac gcg ttc tac gag acg gaa atg ccg agc ccg gtg aca cgc ccg 240 Leu Asp Ala Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro 65 70 75 80 ctg ttc gag gcc gcc gcg aaa cac ggc gtc ggg ttc aat ctc ggc ttc 288 Leu Phe Glu Ala Ala Ala Lys His Gly Val Gly Phe Asn Leu Gly Phe 85 90 95 gcg gag ctc gtg tcg gag ggc ggc agg aag cgc cgc ttc aac acg tcc 336 Ala Glu Leu Val Ser Glu Gly Gly Arg Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 atc gcc gtc gac agg acc ggc agg atc atc ggc aag tac cgc aag atc 384 Ile Ala Val Asp Arg Thr Gly Arg Ile Ile Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 cat ctg ccg ggc cac aag gac tat gaa gac tac cgc ccg ttc cag cat 432 His Leu Pro Gly His Lys Asp Tyr Glu Asp Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 ctg gag aag cgg tac ttc gag acc ggc aat ctc gga ttc ccg gtc tat 480 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Thr Gly Asn Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 gag gtc gat ggt ttc aag atg ggc atg ttc atc tgc aac gac cgg cgc 528 Glu Val Asp Gly Phe Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 tgg ccg gag acc tgg cgc gtg atg ggt ctc aag ggc gcg gag ctg atc 576 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Leu Ile 180 185 190 tgc ggc ggc tac aac acg ccg ctg cac aat ccg ccg gtg ccg cag cac 624 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 gac cag ctc agc tcc ttc cac cat ctc ctg tcg atg cag gcg ggc gcc 672 Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala 210 215 220 tac cag aac ggt gcg tgg acc gcc gga gcg ggc aag gtc ggg gtg gag 720 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Thr Ala Gly Ala Gly Lys Val Gly Val Glu 225 230 235 240 gaa ggc tgc atg ctg ctc ggc cat tcc tgc atc gtc gcg ccc acc ggg 768 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 gag ctt gcc gcg ctc acc aac acg ctg gag gac gag gtc atc acg gcc 816 Glu Leu Ala Ala Leu Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 gct gcc gat ttt gcc cgc tgc cgg gaa atc cgc gag aac atc ttc aat 864 Ala Ala Asp Phe Ala Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn 275 280 285 ttc gag cag cat cgc gag ccg cag gaa tac ggg ttg atc gcc gcc gtc 912 Phe Glu Gln His Arg Glu Pro Gln Glu Tyr Gly Leu Ile Ala Ala Val 290 295 300 tga 915 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> Flavobacterium sp. <400> 4 Met Pro Gly Lys Ile Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ser Asp Ser Arg Glu Gln Val Val Lys Arg Leu Val Asp Met Leu 20 25 30 Glu Glu Ala Ala Ala Arg Asn Ser Asp Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ala Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Ala Ala Ala Lys His Gly Val Gly Phe Asn Leu Gly Phe 85 90 95 Ala Glu Leu Val Ser Glu Gly Gly Arg Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Ala Val Asp Arg Thr Gly Arg Ile Ile Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Asp Tyr Glu Asp Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Thr Gly Asn Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Glu Val Asp Gly Phe Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Leu Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Leu His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp Gln Leu Ser Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ala 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Thr Ala Gly Ala Gly Lys Val Gly Val Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Leu Ala Ala Leu Thr Asn Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Ala Asp Phe Ala Arg Cys Arg Glu Ile Arg Glu Asn Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Glu Gln His Arg Glu Pro Gln Glu Tyr Gly Leu Ile Ala Ala Val 290 295 300 <210> 5 <211> 4054 <212> DNA <213> Flavobacterium sp. <400> 5 gatcggccgc gcgctgatgt cgaagccgcg ccttctgctt ctcgacgaac cctcgctggg 60 actggcgccg ctcgtcgtgc gcgacatcgc ccgtctcgtc acggagatca accgggagca 120 gggcaccagc atcgtgctgg tcgagcagaa ttcgcgcatg gcgctgcgca tcagccgata 180 cgcctatgtg ctcgaaaccg ggcgcatcgg tctcgaagga gcctcgcaga gcctcctcga 240 cgacgacaag gtcaagcaac tctatctcgg cggttgaggc tccgggaaag gaaaaggaga 300 ggaatatgcc aggaaagatc attctcgcgg tgggccagct tggacccatc gcccgcagcg 360 acagccgcga acaggtggtg aagcggctcg tcgacatgct ggaggaggcc gcggcccgca 420 attcggattt catcgtcttt cccgagctgg cgctgaccac cttcttcccc cgctggtatt 480 tcaccgacga ggcggaactg gacgcgttct acgagacgga aatgccgagc ccggtgacac 540 gcccgctgtt cgaggccgcc gcgaaacacg gcgtcgggtt caatctcggc ttcgcggagc 600 tcgtgtcgga gggcggcagg aagcgccgct tcaacacgtc catcgccgtc gacaggaccg 660 gcaggatcat cggcaagtac cgcaagatcc atctgccggg ccacaaggac tatgaagact 720 accgcccgtt ccagcatctg gagaagcggt acttcgagac cggcaatctc ggattcccgg 780 tctatgaggt cgatggtttc aagatgggca tgttcatctg caacgaccgg cgctggccgg 840 agacctggcg cgtgatgggt ctcaagggcg cggagctgat ctgcggcggc tacaacacgc 900 cgctgcacaa tccgccggtg ccgcagcacg accagctcag ctccttccac catctcctgt 960 cgatgcaggc gggcgcctac cagaacggtg cgtggaccgc cggagcgggc aaggtcgggg 1020 tggaggaagg ctgcatgctg ctcggccatt cctgcatcgt cgcgcccacc ggggagcttg 1080 ccgcgctcac caacacgctg gaggacgagg tcatcacggc cgctgccgat tttgcccgct 1140 gccgggaaat ccgcgagaac atcttcaatt tcgagcagca tcgcgagccg caggaatacg 1200 ggttgatcgc cgccgtctga gcggcgcggc tccatacaat catgatgccc gagccgcctt 1260 cctgtgggag gcggaacggg caaggcatgc ccgccggaca tacggcgggc ggaggagaaa 1320 ggagggagac catgcgcgcg atcctgctgg atcagcccgg cgaagccgcc ggcctgttgc 1380 gcgtcgccga gctgcccgcg ccggtcgcgg ggcgcggaga actcgtcgtc gcggtcgcct 1440 gctgcggctg caacttcgcc gacacgatga tgcggcgcgg tacctatccg catccgaagc 1500 aatacccgct cgttcccggt ttcgagatcg tgggccgggt gacggcggtc ggtgcgggcg 1560 tcgatggttt tgccgtcggc gaccgggtgg cgggctatgc cgagtcgggc ggcggctttg 1620 ccgcgctctg cgccgttgcg gcggacggtg ccgttcgcct tcccgattcc gttcccttcg 1680 aaacggcggc agccttcctc atccaggcgc agacggcctg gcatctgctg cataccgtct 1740 cggcggtgcg accgggtgag gtcgtcctga tccacgccat cggcggcggt gtcgggctct 1800 atctcaccca gctcgccgtg caggccggag ccgtcgttgt cggtaccgtc ggcacggccg 1860 gcaaggaaag gcgggcgctc gattatggcg caagcctcgt cgtcaaccgc gcggaggctg 1920 atttcgtgga ggagatcggc cgcttcctga acgggcgcgg cgtcgacagg atttacgatt 1980 ccaccggggc gacgatcctc gaccgtagct ttgcgctcct gcgcccgctc ggccagatcg 2040 tcagtttcgg cgaggccgag ggccgcccgc tcgacaatct ctgggcgcgg ctggtggaga 2100 aatcggcgac cttcacgcgc ttccatctcg gccatctcga tttcgccgcg caagcctggc 2160 gcgacgggct gcgccttacc cttgccgccg tcgcggacgg tacgcttcgc gtgccggtcg 2220 aacgcgtctt ttccttcgaa caggcagagc agatgtatga atgcctcgaa tcccgcacgg 2280 tgtcgggaaa gctcctgctt gccgtcaacc ctaccgcaac cgatagccgg agctgatacc 2340 atgacccatt acgatctcgt cattcgcgga ggaaccgtcg ccacggcgag tgattgcttc 2400 cgggcggatg ttgcggtcac cgacggcagg atcgtcgcca tcggcgagaa tctcgggccc 2460 gccgcccgcg agatctcggc ggaaggccgc ctcgttctgc ccggcggcgt cgattcccat 2520 tgccatatcg aggagccgca ggtcggcgag gtgcgcaacg cggaaacctt cgcctccgcc 2580 acctcttcgg cggccgcggg cggcacgacg acggtcattt ccttctctca gcaggtgaaa 2640 ggcggcggca tcaccgaggc cctgcgcgac tatcacgaga aggcgacccg cgcgctgatc 2700 gactattcct tccatctcgt cgtgaccgat cccacggatg cggtgctgga ggaactggtg 2760 ccgctgatcg aggaagggca ccggtcgctg aagatcttca tgacctatac caatgtcgtg 2820 ctcgacgacg agcagacgct gcgcgtgctg gcgctcgccc gcaagaccgg cgctctcgtc 2880 acggtgcatg ccgagaacca tgccgcgatc atgtacctca cgcgtgcctt ggaaaaggcc 2940 gggctcaccg ccccgaagta ccacgcctgg gccaagccca tgccggtgga acgggaggcc 3000 tgccaccgca tcatcatgct ctccgaactg ctggatgttc ccattcagat cttccacgtt 3060 tccggggcgg aggcggccga ggaaatccgc cgcgcgcaga atcgcggcct caaggtcttc 3120 ggcgagacct gcccgcaata tctgatgctg acggcggcgg atctcgaccg gccggatttc 3180 gagggtgcga aattcctgtg cagccccgcg ccgcgcacga cggccgatca ggaagccctg 3240 tgggactata tccgcacggg aacgatcggg gtcgtgtcgt ccgaccacgc gccgaaccgc 3300 ttcgacgatc cgcacggcaa gaaggtcggc ggggtggacg cgcccttcag cgccattccg 3360 aacggcgtgc cggggctggc gacgcgcctg ccgatcctgt tttccgaagg ggtcgtcaag 3420 gggcgcatcg acctcaacac cttcgtcgcg ctgacggcgg ccaatccggc gaagctcttt 3480 ggcctgcatc ccagaaaggg caccatcgcc gtcggagccg atgcggatat cgcgatctgg 3540 gatcccgagc gcaaggtgac gatccgcaac gacatgctgc atcacggcgt cgactacacg 3600 gtctacgagg gcgtcgaggt gaccggatgg ccggtgatga cgctctcgcg cggcgaggtg 3660 gtctatgatg acggcgcggt ggtcggcaag ccgggtcacg ggcgcttcct tgcccgcggt 3720 ccctatgacg cgatcaagcc gcgcggcagg catgtgacgc ctttcgaccc ggtgacgggc 3780 gaagtggaaa cggcctgagg cggaaaggac aggacgatga agatcaaggt gatcaatccg 3840 aacacgacat tgaccatgac cgccaagatc ggcgaggcgg ccgccgccgt cgcctcggcg 3900 ggaaccgagg tcgtcgccgt cagccccgct atggggccgg cctccatcga ggggcattat 3960 gacgaggcgg tcagtgcgct cggcgtgctc gacgaagtgc gcaagggaaa ggcggaagga 4020 tgcgacggct atcttatcgc ctgcttcgac gatc 4054 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 6 <400> 6 cgctctagat agccggagct gataccatga 30 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer7 <400> 7 cgcaagcttt ccgcctcagg ccgtttcca 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer8 <400> 8 cgcgaattct atctcggcgg ttgaggctc 29 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer9 <400> 9 cgctctagat ggagccgcgc cgctcaga 28

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＪ１１１９９株のＤ−ヒダントイナーゼおよ
びＤ−カルバミラーゼをコードする遺伝子群の構造を示
す図である。

【図２】本発明のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カル
バミラーゼの製造工程を示すフローチャートである。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成１４年９月１２日

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭ −Ｐ３１３３

【新寄託機関の名称】独立行政法人産業技術総合研
究所特許生物寄託センター

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ− ７６４３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者横関健三神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社アミノサイエンス研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 CA01 DA06 GA11 HA20 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AE03 CA19 CB05 CC24 CD12 DA01 4B065 AA26X AA27Y AB01 AC14 BA02 BB13 CA17 CA44 (54)【発明の名称】Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、該遺伝子を含む組み換えＤＮＡ、該組み換えＤＮＡにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、Ｄ−アミノ酸の製造方法

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｄ
−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項３】請求項１または２に記載のＤＮＡとベク
ターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項４】前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラス
ミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由
来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮ
Ａ。
【請求項５】請求項３または４に記載の組み換えＤＮ
Ａによって形質転換された細胞。
【請求項６】前記細胞は、エシェリヒア・コリに由来
することを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】請求項５または６に記載の細胞を培地中
で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−ヒダント
イナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特
徴とするＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質
の製造方法。
【請求項８】下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項９】請求項７に記載の製造方法を用いてＤ−
ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタ
ンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を５
置換ヒダントインに作用させて、Ｎ−カルバミル−Ｄ−
アミノ酸を製造するＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸製造
工程と、を含むことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｄ−
アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】請求項７に記載の製造方法を用いてＤ
−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
びＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素ま
たは当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させ
てＤ−アミノ酸を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を
含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】下記(a)または(b)の塩基配列を有し、
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ。 (a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列 (b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項１２】下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ。 (c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１３】請求項１１または１２に記載のＤＮＡ
とベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮ
Ａ。
【請求項１４】前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラ
スミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に
由来することを特徴とする請求項１３に記載の組み換え
ＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１３または１４に記載の組み換
えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１６】前記細胞は、エシェリヒア・コリに由
来することを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】請求項１５または１６に記載の細胞を
培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＤ−カ
ルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させること
を特徴とするＤ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク
質の製造方法。
【請求項１８】下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有
し、Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質。 (a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列 (b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１９】請求項１７に記載の製造方法を用いて
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−
カルバミルアミノ酸に作用させてＤ−アミノ酸を製造す
るＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ
−アミノ酸の製造方法。
【請求項２０】請求項１７に記載の製造方法を用いて
Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を製造する
タンパク質製造工程と、前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質および
５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素
含有物を５置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸
を製造するＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴
とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２１】請求項７に記載の製造方法を用いて
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造す
る第１のタンパク質製造工程と、請求項１７に記載の製造方法を用いてＤ−カルバミラー
ゼ活性を有するタンパク質を製造する第２のタンパク質
製造工程と、前記Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およ
び前記Ｄ−カルバミラーゼ活性を有するタンパク質を５
置換ヒダントインに作用させて、Ｄ−アミノ酸を製造す
るＤ−アミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＤ
−アミノ酸の製造方法。
【請求項２２】請求項９に記載のＮ−カルバミル−Ｄ
−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダントイン化
合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物を５置換
ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン化合物を
ラセミ化する工程を含むことを特徴とするＮ−カルバミ
ル−Ｄ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２３】請求項１０、１９、２０または２１に
記載のＤ−アミノ酸の製造方法において、５置換ヒダン
トイン化合物をラセミ化する酵素または当該酵素含有物
を５置換ヒダントインに作用させ、５置換ヒダントイン
化合物をラセミ化する工程を含むことを特徴とするＤ−
アミノ酸の製造方法。