JPH11508452A

JPH11508452A - ペプチドおよびｎ−カルバモイル保護されたペプチドの新規製造法

Info

Publication number: JPH11508452A
Application number: JP9505455A
Authority: JP
Inventors: ボンマリウスアンドレアス; ドラウツカールハインツ; アイヒホルンウーヴェ; ヤクブケハンス−ディーター; コッテンハーンマティアス
Original assignee: デグッサアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1995-07-11
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1999-07-27
Also published as: AR002798A1; US6251625B1; AU6416596A; CN1190406A; CA2227732A1; EP0839153A1; WO1997003091A1; DK0839153T3; EP0839153B1; ATE204291T1; ES2160827T3

Abstract

(57)【要約】保護されたジペプチドおよびオリゴペプチドの酵素的製造法並びに使用された保護基の分離が記載されている。本発明の方法により、ペプチドの簡単かつ安価な合成並びに保護基の入念な分離が可能になる。この方法は、３つの反応工程：１．Ｎ−カルバモイル−アミノ酸もしくはＮ−カルバモイルアミノ酸誘導体の製造、２．カルバモイル保護された求電子体と求核体との間のペプチド結合の形成、３．カルバモイル保護基の分離を内容とする。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチドおよびＮ−カルバモイル保護されたペプチドの新規製造法本発明は、保護されたジペプチドまたはオリゴペプチドの酵素的製造法および使用した保護基の分離に関する。合成短鎖状ペプチドは、薬理学および非経口的栄養補給で使用されている。薬理的有効性のジペプチドの例としては、キョートルフィン（Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ａｒｇ）が挙げられ、これは、エンケファリンの遊離を促進し、脳の中で鎮痛作用および鎮静作用を有している内性物質でもある（Hughes、１９７５）。ジペプチドまたはオリゴペプチドの酵素的製造は既に公知であり、かつ一般に、保護基技術において使用されている。例えば、米国特許第５７１０３７号明細書中には、ホルミル保護基の使用が記載されており、特開昭６２−０７４２９６号公報中には、アセチル保護基が記載されており、米国特許第４９３５３５５号明細書中には、ベンジル保護基が記載されており、また、Tetrahedron、１９９２年、４８、１１１５中には、フェナセチル保護基保護基が記載されている。前記変法には、一部は、安価ではなく（ベンジル、フェナセチル）、再分離が極めて困難である（アセチル、ホルミル）かまたは完全に定められた条件（水素化分解）下でのみ除去可能である（ベンジル）という欠点がある。従って、本発明の課題は、特に簡単かつ安価であり、保護基の簡単かつ入念な分離を可能にし、並びに酵素の簡単な処理および分離を可能にするようなペプチドの合成法を記載することであった。一般式Ｉ：〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立に水素であるか、ヘテロ原子、例えばＮ、ＯまたはＳで１回以上中断されているかまたは置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ₆−アルキル、フェニルまたはベンジル、ヘテロアルアルキル、例えば３−インドリルメチル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチルまたは４−ピリジルメチルであり、この場合、ヘテロ原子は、該ヘテロ原子の側で、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキルまたはベンジルで置換されていてもよいかまたは二重結合を介してアルキル基と結合していてもよく、前記フェニルまたはベンジルは、双方がハロゲン原子またはヒドロキシで１回以上置換されていてもよく、Ｒ³は、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ＮＨ₂、ヒドロキシ、ＮＲ¹Ｒ²であるか、ハロゲン原子、ニトロ、ＮＨ₂、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシによって１回以上置換されていてもよいベンジルオキシであるかまたは式ＩＩ：で示される１種以上の単位を表す〕で示されるペプチドの製造のための本発明の課題は、式ＩＩＩ：〔式中、Ｒ¹、ＲおよびＲは、上記の意味を有し、Ｒ⁴は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルを表すかまたはハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ニトロ、ＣＮ、ＣＦ₃、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルコキシカルボニル、ＣＯＯＨまたは− ＮＲ¹Ｒ²で１回以上置換されていてもよいフェニルであるか、アルアルキル、例えばベンジル、ナフチル、ヘテロアルアルキル、例えば２−チエニル、３−チエニルまたは４−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジルまたは２−キノリニルであり、この場合、ベンジルは、該ベンジルの側で、ハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシで置換されていてもよい〕で示される化合物またはその塩の形を、選択的に溶剤の存在下でカルバモイラーゼを用いて変換させるかまたはカルバモイル保護基を、選択的に溶剤の存在下および選択的に酸の存在下で化学的に分離することによって解決される。更に、一般式ＩＩＩ：〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立に水素であるか、ヘテロ原子、例えばＮ、ＯまたはＳで１回以上中断されているかまたは置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ₆−アルキル、フェニルまたはベンジル、ヘテロアルアルキル、例えば３−インドリルメチル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチルまたは４−ピリジルメチルであり、この場合、ヘテロ原子は、該ヘテロ原子の側で、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキルまたはベンジルで置換されていてもよいかまたは二重結合を介してアルキル基と結合していてもよく、前記フェニルまたはベンジルは、双方がハロゲン原子またはヒドロキシで１回以上置換されていてもよく、Ｒ³は、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ＮＨ₂、ヒドロキシ、ＮＲ¹Ｒ²であるか、ハロゲン原子、ニトロ、ＮＨ₂、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシによって１回以上置換されていてもよいベンジルオキシであり、Ｒ⁴は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルを表すかまたはハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ニトロ、ＣＮ、ＣＦ₃、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルコキシカルボニル、ＣＯＯＨまたは−ＮＲ¹Ｒ²で１回以上置換されていてもよいフェニルであるか、アルアルキル、例えばベンジル、ナフチル、ヘテロアルアルキル、例えば２−チエニル、３−チエニルまたは４−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジルまたは２−キノリニルであり、この場合、ベンジルは、該ベンジルの側で、ハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシで置換されていてもよい〕で示されるカルバモイル保護されたペプチドを、式ＩＶ：〔Ｒ¹およびＲ⁴は、上記の意味を有する〕で示される化合物またはＩＶの塩の形を、選択的に溶剤の存在下および選択的に式Ｖ：〔式中、Ｒ²およびＲ³は、上記の意味を有する〕で示される化合物を有する塩基またはその酸付加塩の存在下で変換させることによって得られることが見出された。「アルキル基」という記載は、「直鎖状」アルキル基並びに「分枝鎖状」アルキル基のことである。「直鎖状アルキル基」という記載は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルのような基のことであり、「分枝鎖状アルキル基」とは、例えばイソプロピルまたは第三ブチルのような基のことである。ハロゲン原子という記載は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素のことである。「アルコキシ基」という記載は、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、イソブトキシまたはペントキシのような基のことである。有利に、前記方法を用いて、ジペプチド、例えばアスパルテームを製造することができる。前記方法のもう１つの利点は、ペプチドカップリングの際に、高濃度の懸濁液中で作業することができるということであり、この場合、基質および生成物は、部分的に固体の形で存在していてもよい。中間生成物としての記載されたカルバモイル保護されたペプチドを使用することによるペプチドの新規合成法は、３つの反応工程を内容とする。Ａ）Ｎ−カルバモイル−アミノ酸もしくはＮ−カルバモイル−アミノ酸誘導体の製造Ｂ）カルバモイル保護された求電子体と求核体との間のペプチド結合の形成Ｃ）カルバモイル保護基の分離Ｎ−カルバモイル−アミノ酸もしくはＮ−カルバモイル−アミノ酸誘導体の製造は、文献により自体公知の方法により実施することができる。有利に、アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体と、一般構造式ＶＩ：Ｒ¹−ＮＣＯＶＩ〔式中、Ｒ¹は、上記の意味を有する〕で示されるイソシアネートとの反応は、Ｈ₂Ｏ／有機溶剤からなる中間相系中で行われ、この場合、有機溶剤は、例えばトルオール、クロロベンゾールまたは第三ブチルメチルエーテルであってもよい。この反応は、０℃〜１２０℃、有利に２０℃〜７０℃の温度で行われる。場合によっては、前記反応混合物に、無機塩基、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｋ₂ＣＯ₃ 、Ｎａ₂ＣＯ₃、炭酸水素カリウムまたは炭酸水素ナトリウムあるいは有機塩基、例えばトリエチルアミンまたはトリブチルアミンを添加することができる。構造式ＩＩＩのフェニルイソシアネートは、有利には僅かな過剰量中で使用することができる。構造式ＶＩＩ：）またはアンモニウムイオン、例えばテトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムまたはベンジルトリエチルアンモニウムを表す〕で示されるシアネートを有するＮ−カルバモイル保護されたアミノＩＩＩもしくはアミノ酸誘導体にするための反応は特に有利である。前記の反応は、自体公知の方法で、水溶液中で、０℃〜１２０℃、有利に６０ ℃〜１００℃の温度で、場合によっては無機塩基、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｋ₂ ＣＯ₃またはＮａ₂ＣＯ₃を添加しながら行われる。この反応が１．０１〜２当量、有利に１．１〜１．２当量のシアネートの若干の過剰量の存在下に実施される場合に有用であることが判明した。ペプチド結合の形成は、自体公知の方法で、加水分 nnecke；Angew. Chem．１９８５、第９７巻、第７９〜８７頁）。この場合、ペプチド結合が動力学的に制御されて進行するのかそれとも熱力学的に制御されて進行するのかということは、反応条件には重要ではない。本発明による方法は、双方の変法に使用可能である。式ＩＶの化合物の「塩の形」という記載は、一例えばテトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムまたはベンジルトリエチルアンモニウムにようなアンモニウムイオンは、式ＩＶの化合物のマイナスの電荷を中和することができる。この場合、マイナスの電荷は、分子（式ＩＶの化合物）の間じゅうに分布していることができるかあるいは窒素原子またはカルボキシル基に接してカルボキシレート基の形で局在化していることができる。驚異的なことに、前記の反応順序にとって新規のカルバモイル基を保護基として用いる前記の反応は、良好な空時収量で進行し、かつ生成物の簡単な単離を可能にしている。前記の反応の幅広い使用可能性は、同様に驚異的なことである。Ｖの酸付加塩とは、例えばＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩またはＨ₂ＳＯ₄塩のことである。カルバモイル保護基の分離は、例えば穏和な反応条件下でカルバモイラーゼを用いて行われる。ペプチドからのカルバモイル基の分離の前記の方法は、新規である。前記方法は、この方法が分離のための使用物質として、酵素の他に水を必要とするにすぎず、かつ分離生成物として、ペプチドの他に二酸化炭素とアンモニアを発生するにすぎないし、これらから、ペプチドは極めて容易に分離できるので極めて有利である。このために、カルバモイラーゼは、部分的に精製された状態、精製された状態、単離された状態または固定化された状態で使用することができる。この反応は、非可逆性であり、かつ１００％までの反応率が観察される。前記反応は、水溶液中で、１０〜５０℃、有利に２０〜３５℃、特に有利に２５〜３０℃の温度および５〜１１、有利に６．５〜８．５および特に有利に７〜８のｐＨ値で行われる。カルバモイラーゼを用いる加水分解の際には、二酸化炭素およびアンモニアが発生し、これは、場合によってはガス湧出によって反応混合物から逃出する。カルバモイラーゼで処理されたペプチド溶液から、保護されていないペプチドは、蒸発濃縮、冷却または場合による有機溶剤の添加を用いる結晶化によって析出させ、かつ単離することができる。下の名称で供託されているカルバモイラーゼが、公的であることが判明した：ＤＳＭ７３２９、ＤＳＭ７３３０、ＤＳＭ９７７１。しかし、この新規方法は、上記のもの以外の微生物を除外するものではない。カルバモイル保護基の分離は、上記と同様に、付加的な酵素（前記のカルバモイラーゼ以外）、例えばサーモリシンの存在下に行うことができる。カルバモイル保護基の分離は、化学的に行うこともできる。ペプチドからのカルバモイル基の分離の前記の方法は、同様に新規である。分離は、原理的に全て、選択的に、水性の環境中および／または不活性有機溶剤中、例えば芳香族炭化水素、例えばトルオールまたはクロロベンゾール中、脂肪族炭化水素中、ハロゲン化された炭化水素中、例えば塩化メチレン中またはエーテル中、例えばメチル−第三ブチルエーテルまたに応じて、この反応は、酸、例えばＨＣｌまたはＨ₂ＳＯ₄の存在下に実施される。反応温度としては、＋１２０℃ないし−３０℃、特に有利に＋６０℃ないし− ２０℃、殊に有利に＋２５℃ないし０℃の温度が特に適している。酸添加の際に、ｐＨ値は、−０．５〜５、有利に０〜２の間でなければならない。この反応は、窒素、ＣＯ₂および場合による塩以外に、別の副生成物を生じることはなく、分離生成物なしに高い収率を伴う反応および望ましい生成物形成が行われるので有利である。前記反応のもう１つの利点は、後処理が簡単なことである。この新規方法は、以下の実施例に基づき詳細に説明されるが、しかし、本発明は、それによって制限されるものではない。例１Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパラギン酸を例にしたＮ−カルバモイルアミノ酸およびその誘導体の例示的製造ＮａＯＨ小片１２ｇ（０．３モル）を、Ｈ₂Ｏ約２００ｍｌ中に装入し、かつ溶解させる。アスパラギン酸（３３．３ｇ、０．２５モル）を水５０ｍｌ中に溶解して添加し、かつこの反応混合物を８０℃に昇温させる。ｐＨ値は、８．７である。５分間で、シアン酸ナトリウム１６．６ｇ（０．２５５モル）を添加する（ｐＨ値は９．３に上昇し、温度は８６℃に上昇する）。１時間の反応時間後に、アスパラギン酸はもはや検出されない。ペプチドの合成の例：アミノ酸およびペプチドを、国際的に適用される規則により略記する（IUPAC- JUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（JCBN）；Nomenclature a nd Symbolism for Amino Acids and Pep tides. Eur. J. Biochem. １５８、９〜３７（１９８４年））。ＡＣ−：アミノカルボニル−（カルバモイル−、ＮＨ₂ＣＯ−）例２：ＡＣ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成ＡＣ−Ａｓｐ（ＯＫ）−ＯＫ５０ｍｇ（０．２ミリモル）およびＨ−Ｐｈｅ− ＯＭＥ・ＨＣｌ８３ｍｇ（０．４ミリモル）に、密閉可能なポリプロピレン容器中で緩衝液８０μｌ（０．５Ｍのヘペス（Hepes）／Ｎａ⁺；ｐＨ７）を添加し、直ちにへらで強力に混和させる。この反応混合物を水浴中で４０℃に温度調節し、引き続き、サーモリシン（Sigma P 1512）４ｍｇを含有する緩衝液２０μｌを用いて反応を開始させる。１時間後、２．５時間後、１６時間後、２２時間後、２９時間後および３９時間後に、試料を取り出し、かつ４％の水性酢酸０．７５ｍｌ中で停止させる。ここで、分析評価を以下の実施例中と同様にして、ＨＰＬＣおよび標準試料（auth entischen Probe）との比較を用いて行う。収率：例３ａ〜ｅ例２と同様にして、緩衝液８０μｌの代わりに、緩衝液１２０μｌ（ａ）、１６０μｌ（ｂ）、２００μｌ（ｃ）、２４０μｌ（ｄ）および２８０μｌを反応物の懸濁のために使用する。試料抽出を、２９〜３９時間後に行う。収率：例４ＡＣ−Ａｓｐ（ＯＫ）−ＯＫ４４ｍｇ（０．１７５ミリモル）およびＨ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣｌ４１．５ｍｇ（０．２ミリモル）に、密閉可能なポリプロピレン容器中で緩衝液８０μｌ（０．５Ｍのヘペス／Ｎａ⁺；ｐＨ７）を添加し、直ちにへらで強力に混和させる。４０℃に温度調節された水浴中へ前記反応容器を運搬後に、この反応混合物にサーモリシン調製物（Sigma P 1512）１．５ｍｇを含有する緩衝液１５μｌを用いて反応を開始させる。１時間後、２．５時間後、５時間後、６．５時間後および２２時間後に、試料を取り出し、４％の水性酢酸０．７５ｍｌ中で停止させ、かつＨＰＬＣを用いて分析する。収率：例５例４と同様にして、反応物に、緩衝液８０μｌの代わりに、緩衝液１０μｌ（ａ）、３０μｌ（ｂ）、５０μｌ（ｃ）、１３０μｌ（ｄ）および１８０μｌ（ｅ）を添加する。試料抽出を、２２時間後に行う。収率：例６：ＡＣ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の合成ＡＣ−Ａｓｐ（ＯＫ）−ＯＫ２５０ｍｇ（１．０ミリモル）およびＨ−Ｐｈｅ −ＮＨ₂・ＨＣｌ４００ｍｇ（２．０ミリモル）に、密閉可能なポリプロピレン容器中で緩衝液４００μｌ（０．５Ｍのヘペス／Ｎａ⁺；ｐＨ７）を添加し、直ちにへらで強力に懸濁させる。４０℃に温度調節された水浴中へ前記反応容器を運搬後に、サーモリシン調製物（Sigma P 1512）１０ｍｇを含有する緩衝液５０ μｌの添加によって反応を開始させる。４４時間後に、試料を取り出し、４％の水性酢酸０．７５ｍｌ中で停止させ、かつＨＰＬＣを用いて分析する。１Ｎの水性ＨＣｌ１ｍｌの添加によって反応を終了させ、かつ４℃で一晩放置する。引き続き、沈殿物を吸引濾過し、かつ氷冷却水で洗浄する。収率：理論値の６２％溶融範囲：２２１〜２２３℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ⁶−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝２．３８〜２．６（ｍ，２Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ＝２．８〜２．８８（ｍ，１Ｈ）−^βＣＨ₂−）、δ５．７２（ｓ，２Ｈ、−ＮＨ₂）、δ＝６．３０（ｄ，１Ｈ、−^αＮＨ−、Ｊ＝７．６９）、δ＝７．１３（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．２６〜７．２８（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝７．３３（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．８３（ｄ，１Ｈ、−^αＮＨ−、Ｊ＝８．４）例７：ＡＣ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の合成ＡＣ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ６７．４ｍｇ（０．２ミリモル）およびＨ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂２６ｍｇ（０．２ミリモル）（Bachem Biochemica GmbH）を、ポリプロピレン反応容器中で、緩衝液１８０μｌ（０．５Ｍのヘペス／Ｎａ⁺；ｐＨ７．９）中に溶解させる。１０Ｍの水性ＮａＯＨ１０μｌの添加後に、α−キモトリプシン溶液１０μｌ（緩衝液１ｍｌ当たり１０ｍｇ；serva、３×晶出）を用いて反応を開始させる。２分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後および６０分後に、試料を取り出し、４％の水性酢酸１ｍｌ中に溶解し、かつＨＰＬＣを用いて分析する。残留した反応混合物をメタノール１ｍｌ中に入れ、濾過し、かつ濾液に１Ｎの水性ＨＣｌ１ｍｌおよび水４ｍｌを添加する。ＡＣ−Ａｓｐ −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂を４８時間で晶出させた。結晶体を分離し、かつ氷冷却水で２回（それぞれ約１．５ｍｌ）洗浄し、引き続きＰ₄Ｏ₁₀により真空中で乾燥させた。収率： ¹Ｈ−ＮＭＲ；ＣＯＳＹ（ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．８２（ｄ，３Ｈ、Ｌｅｕ−^δＣＨ₃）、δ＝０．８７（ｄ，３Ｈ、Ｌｅｕ−^δＣＨ₃）、δ＝１．４１〜１．６（ｍ，３Ｈ、Ｌｅｕ−γＣＨ−、Ｌｅｕ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．３５〜２．５８（ｍ，２Ｈ、Ａｓｐ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．８１〜３．０６（ｍ，２Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１８（ｄｔ，１Ｈ、Ｌｅｕ−^αＣＨ −）、δ＝４．３３（ｄｔ，１Ｈ、Ａｓｐ−^αＣＨ−）、δ＝４．４４（ｄｔ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＣＨ−）、δ＝５．７０（ｓ，１Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．３０（ｄ，１Ｈ、Ａｓｐ−^αＮＨ−）、δ＝６．９６（ｓ，１Ｈ、Ｌｅｕ−ＮＨ₂）、δ＝７．０５（ｓ，１Ｈ、Ｌｅｕ−ＮＨ₂）、δ＝７．１４〜７．２７（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝７．８５〜７．９６（ｍ，２Ｈ、Ｌｅｕ −^αＮＨ、Ｐｈｅ−^αＮＨ）例８：ＡＣ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの合成例７と同様にして、Ｈ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の代わりに、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ０．２ミリモル（４７．８ｍｇ）を使用する。ｐＨ値調節のために、緩衝液３５μｌを１０Ｍの水性ＮａＯＨで置き換える。７０分後の収率： ¹Ｈ−ＮＭＲ；ＣＯＳＹ（ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７７〜０．８８（ｍ，６Ｈ、Ｉｌｅ−^δＣＨ₃）、δ＝１．００〜１．１５（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ −γＣＨ₂−）、δ＝１．３８〜１．５２（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ ＝１．６５〜１．７８（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^βＣＨ−）、δ＝２．３４〜２．５８（ｍ，２Ｈ、Ａｓｐ−^βＣＨ２−）、δ＝２．７８〜２．８８（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ ＝２．９４〜３．２（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝３．６２（ｓ，３Ｈ、ＯＣＨ₃）、δ＝３．７５〜３．９５（ｍ，２Ｈ、Ｇｌｙ−^αＣＨ₂−）、δ ＝４．１７（ｔ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＣＨ−）、δ＝４．３０〜４．４０（ｍ，１Ｈ、Ａｓｐ−^αＣＨ−）、δ＝４．４８〜４．５８（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＣＨ −）、δ＝５．７（ｓ−幅広、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．３０（ｄ，１Ｈ、Ａｓｐ−^αＮＨ−）、δ＝７．１２〜７．２６（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅−）、δ ＝７．８０（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ−）、δ＝７．９２（ｄ，１Ｈ、Ｌｅｕ −^αＮＨ−）、δ＝８．３２（ｔ，１Ｈ、Ｇｌｙ−^αＮＨ−）。例９：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂の合成ａ）ＡＣ−Ｔｙｒ−ＯＨ４４．８ｍｇ（０．２ミリモル）およびＨ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌ４７．４ｍｇ（０．２ミリモル）に、密閉可能なポリプロピレン容器中で緩衝液４５μｌ（０．５Ｍのヘペス／Ｎａ⁺；ｐＨ７）を添加し、直ちにへらで強力に懸濁させる。ｐＨ値調節を、１０Ｍの水性ＮａＯＨ２５μ ｌの添加によって行う。４０℃に温度調節された水浴中へ前記反応容器を運搬後に、サーモリシン調製物（Sigma P 1512）１ｍｇを含有する緩衝液１０μｌの添加によって反応を開始させる。３時間後に、試料を取り出し、４％の水性酢酸１ｍｌおよびアセトニトリル２００_μｌ中で停止させ、かつＨＰＬＣを用いて分析する。１ＮのＨＣｌの代わりに、４％の水性酢酸を使用することを別として、残留した反応混合物の後処理を、例７中と同様に行う。３時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂の収率：理論値の７６％¹ Ｈ−ＮＭＲ；ＣＯＳＹ（ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７６〜０．８４（ｍ，６Ｈ、Ｉｌｅ−^δＣＨ₃、Ｉｌｅ−γＣＨ₃）、δ＝０．００〜１．１２（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ＝１．２２（ｄ，３Ｈ、Ａｌａ−^βＣＨ₃）、δ＝１．３６〜１．４２（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ＝１．６８〜１．７８（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^βＣＨ−）、δ＝２．５６〜２．６８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．８０〜２．９０（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂ −）、δ＝４．１２〜４．２４（ｍ，２Ｈ、Ａｌａ−^αＣＨ−、Ｉｌｅ−^αＣＨ −）、δ＝４．２８〜４．３８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ−）、δ＝５．５８（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０３（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、 δ＝６．６１（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９２〜６．９８（ｍ，３Ｈ、２Ｔｙｒ−ＡｒＨ、１Ａｌａ−ＮＨ₂）、δ ＝７．２０（ｓ，１Ｈ、Ａｌａ−ＮＨ₂）、δ＝７．８４（ｄ，１Ｈ、Ａｌａ−^α ＮＨ−）、δ＝７．９２（ｄ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＮＨ−）、δ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）ｂ）例９ａと同様にして、ＡＣ−Ｔｙｒ−ＯＨ２２４ｍｇ（１．０ミリモル）、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌ２３７．７ｍｇ（１．０ミリモル）、緩衝液２２５μｌ、１０ＭのＮａＯＨ１２５μｌと、サーモリシン（Sigma P 1512）５ｍｇを含有するサーモリシン懸濁液５０μｌとを使用する。１６時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂の収量：２２８ｍｇ（＝理論値の５６％）例１０：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｖａｌ−ＮＨ₂・ＨＣｌ．２ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。１８時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＨ₂の収率：理論値の６５％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７８〜０．８８（ｍ，６Ｈ、Ｖａｌ−γＣＨ₃ ）、δ＝１．９２〜２．００（ｍ，１Ｈ、Ｖａｌ−^βＣＨ−）、δ＝２．５８〜２．６８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．８０〜２．９０（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１１（ｄｄ，１Ｈ、Ｖａｌ−^αＣＨ−）、δ＝４．２８〜４．３８（ｍ，１Ｈ、Ｖａｌ−^αＣＨ−）、δ＝５．５７（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０８（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９７（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．０３（ｓ，１Ｈ、Ｖａｌ−ＮＨ₂）、δ＝７．３１（ｓ，１Ｈ、Ｖａｌ−ＮＨ₂）、δ＝７．６７（ｄ，１Ｈ、Ｖａｌ−^αＮＨ−）、δ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１１：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｍｅｔ−ＮＨ₂・ＨＣｌ３７ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。１４時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂の収率：理論値の７５％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝１．７５〜１．８５（ｍ，１Ｈ、Ｍｅｔ−^βＣＨ₂−）、δ＝１．８８〜２．００（ｍ，１Ｈ、Ｍｅｔ −^βＣＨ₂−）、δ＝２．０２（ｓ，３Ｈ、Ｍｅｔ−Ｓ−ＣＨ₃）、δ＝２．３０〜２．４５（ｍ，２Ｈ、Ｍｅｔ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．６０〜２．８５（ｍ，２Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１５〜４．２８（ｍ，２Ｈ、Ｔｙｒ−^α ＣＨ−、Ｍｅｔ−^αＣＨ−）、δ＝５．６５（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．２８（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６３（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ− ＡｒＨ）、δ＝６．９７（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．０４（ｓ，１Ｈ、Ｍｅｔ−ＮＨ₂）、δ＝７．２５（ｓ，１Ｈ、Ｍｅｔ−ＮＨ₂）、δ＝８．０８（ｄ，１Ｈ、Ｍｅｔ−^αＮＨ−）、δ＝８．５４（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１２：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｎｖｌ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｎｖｌ−ＮＨ₂・ＨＣｌ３１．２ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。１４時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｎｖｌ−ＮＨ₂の収率：¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．８５（ｔ，３Ｈ、Ｎｖｌ−^δＣＨ₃）、δ＝１．１８〜１．３２（ｍ，２Ｈ、Ｎｖｌ−γＣＨ₂−）、δ＝１．４５〜１．６８（ｍ，２Ｈ、Ｎｖｌ−^βＣＨ₂ −）、δ＝２．５５〜２．６８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７８〜２．８８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１２〜４．３０（ｍ，２Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ−、Ｎｖｌ−^αＣＨ−）、δ＝５．５９（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０２（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９４〜６．９９（ｍ，３Ｈ、２Ｔｙｒ− ＡｒＨ）１Ｎｖｌ−ＮＨ₂）、δ＝７．２１（ｓ，１Ｈ、Ｎｖｌ−ＮＨ₂）、δ＝７．７９（ｄ，１Ｈ、Ｍｅｔ−^αＮＨ−）、δ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ− ＯＨ）例１３：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｐｈｅ−ＮＨ₂・ＨＣｌ４０ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。１時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の収率：理論値の８６％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝２．７２〜２．８８（ｍ，３Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ＝１．９８〜３．０６（ｍ，１Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ ＝４．１２〜４．２０（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、 δ＝４．３８〜４．４６（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、δ＝５．５９（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝５．９７（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６１（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、 δ＝７．０８（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．１５〜７．２８（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝７．３２（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂−）、δ＝７．９２（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ−）、δ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１４：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｐｈｅ−ＯＭｅ−ＨＣｌ４３ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。使用したサーモリシン量は、２ｍｇである。１４時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの収率：理論値の８１％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝２．５０〜２．６２（ｍ，１Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７２〜２．８５（ｍ，１Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ ＝２．９０〜３．０８（ｍ，２Ｈ、−^βＣＨ₂−）、δ＝３．５８（ｓ，３Ｈ、−Ｏ−ＣＨ₃）、δ＝４．２５〜４．３５（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、δ＝４．４４〜４．５２（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、δ＝５．５２（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝５．９９（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ −）、δ＝６．６２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９４（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．１５〜７．３０（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ ＝８．３６（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ−）、δ＝９．１４（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ −ＯＨ）例１５：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｉｌｅ−ＮＨ₂・ＨＣｌ３３．２ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。１８時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−ＮＨ₂の収率：理論値の６８．９％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７６〜０．８６（ｍ，Ｈ、Ｉｌｅ−^βＣＨ₃、Ｉｌｅ−γＣＨ₃）、δ＝０．９９〜１．１２（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ＝１．３５〜１．４６（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂ −）、δ＝１．６２〜１．７６（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^βＣＨ−）、δ＝２．５８〜２．６８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７９〜２．８８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１２（ｄｄ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＣＨ−）、δ＝４．２６〜４．３７（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ−）、δ＝５．５８（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０６（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９６（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．０２（ｓ，１Ｈ、Ｉｌｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．３１（ｓ，１Ｈ、Ｉｌｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．６８（ｄ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＮＨ−）、δ ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１６：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、ＡＣ−Ｔｙｒ−ＯＨ２２４ｍｇ（１．０ミリモル）、Ｈ −Ｌｅｕ−ＮＨ₂１３０ｍｇ（１．０ミリモル）（Bachem Feinchemikalien AG）、緩衝液２２５μｌを使用し、ＮａＯＨを使用せず、かつサーモリシン（Sigma P 1512）５ｍｇを含有するサーモリシン懸濁液５０μｌを使用する。１６時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の収量：１２７．８ｍｇ（＝理論値の３８％）¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．８０〜０．９２（ｍ，６Ｈ、Ｌｅｕ−^δＣＨ₃）、δ＝１．４２〜１．６２（ｍ，３Ｈ、Ｌｅｕ−γＣＨ−、Ｌｅｕ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．５８〜２．７０（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７９〜２．８８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１６〜４．３０（ｍ，２Ｈ、Ｌｅｕ−^αＣＨ−、Ｔｙｒ−^αＣＨ−）、δ＝５．６０（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０２（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６３（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９３〜７．００（ｍ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ、１Ｈ、Ｌｅｕ−ＮＨ₂ ）、δ＝７．１９（ｓ，１Ｈ、Ｌｅｕ−ＮＨ₂）、δ＝７．８３（ｄ，１Ｈ、Ｌｅｕ−^αＮＨ−）、δ＝９．１５（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１７：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂・ＨＣｌの代わりに、Ｈ− Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ・ＨＣｌ４７．８ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。３時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＭｅの収率：理論値の８９％¹ Ｈ−ＮＭＲ；ＣＯＳＹ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７６〜０．８８（ｍ，６Ｈ、Ｉｌｅ−^δＣＨ₃、Ｉｌｅ−γＣＨ₃ ）、δ＝１．００〜１．１４（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ＝１．３６〜１．５２（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−γＣＨ₂−）、δ＝１．６５〜１．７８（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^βＣＨ−）、δ＝２．５５〜２．６８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７５〜２．８６（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝３．６２（ｓ，３Ｈ、−Ｏ−ＣＨ₃）、δ＝３．８４（ｔ，２Ｈ、Ｇｌｙ−^αＣＨ₂− ）、δ＝４．２７〜４．３５（ｍ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＣＨ−）、δ＝４．３８〜４．４８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ−）、δ＝５．５７（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．０５（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６１（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９５（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．７９（ｄ，１Ｈ、Ｉｌｅ−^αＮＨ）、δ＝８．３２（ｔ，１Ｈ、Ｇｌｙ−^αＮＨ −）、δ＝９．１１（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１８：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌの合成例１６と同様にして、Ｈ−Ｌｅｕ−ＮＨ₂の代わりに、Ｈ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ・ｐＴｏｓ（Bachem Feinchemilalien AG）３７９．４ｍｇ（１．０ミリモル）、緩衝液１７５μｌ、１０Ｍの水性ＮａＯＨ１２５μｌと、サーモリシン（Sigm a P 1512）１０ｍｇを含有するサーモリシン懸濁液１００μｌとを使用する。８８時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌの収量：２３０ｍｇ（＝理論値の５５％）¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．８１〜０．９２（ｍ，６Ｈ、Ｖａｌ−γＣＨ₃）、δ＝２．０１〜２．１４（ｍ，１Ｈ、Ｖａｌ−^βＣＨ−）、δ＝２．５０〜２．６４（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７５〜２．８５（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．２３（ｄｄ，１Ｈ、Ｖａｌ−^αＣＨ−）、δ＝４．３６〜４．４５（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ− ）、δ＝５．１３（ｓ，２Ｈ、−Ｏ−ＣＨ₂−）、δ＝５．５２（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ²）、δ＝６．０４（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６２（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９６（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ ＝７．３０〜７．４０（ｍ，５Ｈ、−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝８．２０（ｄ，１Ｈ、Ｖａｌ−^αＮＨ−）、δ＝９．１３（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例１９：ＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＢｚｌの合成例９ａと同様にして、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ₂ ・ＨＣｌの代わりに、Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ・ＴＦＡ８８ｍｇ（０．２ミリモル）を使用する。３時間後のＡＣ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＢｚｌの収率：理論値の７２％¹ Ｈ−ＮＭＲ；ＣＯＳＹ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝１．３３（ｄ，３Ｈ、Ａｌａ−^βＣＨ₃）、δ＝２．４８〜２．５８（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．７０〜２．８５（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．９５〜３．０５（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝４．１４〜４．２４（ｍ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＣＨ−）、δ＝４．３２〜４．４１（ｍ，１Ｈ、Ａｌａ−^α ＣＨ−）、δ＝４．５１〜４．６２（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＣＨ−）、δ＝５．１３（ｓ，２Ｈ、Ｏ−ＣＨ₂−）、δ＝５．５６（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、 δ＝５．９４（ｄ，１Ｈ、Ｔｙｒ−^αＮＨ−）、δ＝６．６０（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝６．９０（ｄ，２Ｈ、Ｔｙｒ−ＡｒＨ）、δ＝７．７９〜７．２８（ｍ，５Ｈ、ＯＢｚｌ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝７．３０〜７．４０（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝８．０１（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ）、δ＝８．４６（ｄ，１Ｈ、Ａｌａ−^αＮＨ−）、δ＝９．１２（ｓ，１Ｈ、Ｔｙｒ−ＯＨ）例２０：ＡＣ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の合成例９ａと同様にして、ＡＣ−Ｔｙｒ−ＯＨの代わりに、ＡＣ−Ｍｅｔ−ＯＨ７６．８ｍｇ（０．２ミリモル）、Ｈ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂・ＨＣｌ（デグッサ社（Deg ussa AG））８０ｍｇ（０．４ミリモル）、緩衝液９０μｌ、１０Ｍの水性ＮａＯＨ５０μｌと、サーモリシン（Sigma P 1512）２ｍｇを含有するサーモリシン懸濁液２０μｌを使用する。３時間後のＡＣ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の収率：理論値の９６％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝１．５８〜１．８０（ｍ，２Ｈ、Ｍｅｔ−^βＣＨ₂−）、δ＝１．９９（ｓ，３Ｈ、Ｍｅｔ−Ｓ−ＣＨ₃）、 δ＝２．２５〜２．３６（ｍ，２Ｈ、Ｍｅｔ−γＣＨ₂−）、δ＝２．７６〜２．８８（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．９８〜２．０８（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝３．９８〜４．０８（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、 δ＝４．３６〜４．４７（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、δ＝５．６３（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、δ＝６．２３（ｄ，１Ｈ、Ｍｅｔ−^αＮＨ−）、δ＝７．０９（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．１２〜７．２８（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ −Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝７．４２（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．９６（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ−）例２１：ＡＣ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の合成例２０と同様にして、ＡＣ−Ｍｅｔ−ＯＨの代わりに、ＡＣ−Ｌｅｕ−ＯＨ６９．６ｍｇ（０．４ミリモル）を使用する。７０時間後のＡＣ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨ₂の収率：理論値の９７％¹ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₆−ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）：δ＝０．７８〜０．８８（ｍ，６Ｈ、Ｌｅｕ−^δＣＨ₂−）、δ＝１．１６〜１．３５（ｍ，２Ｈ、Ｌｅｕ−^β ＣＨ₂−、Ｌｅｕ−γＣＨ−）、δ＝１．４５〜１．５６（ｍ，１Ｈ、Ｌｅｕ−^β ＣＨ₂−）、δ＝２．７８〜２．９０（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝２．９９〜３．０８（ｍ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^βＣＨ₂−）、δ＝３．９０〜４．００（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ−）、δ＝４．３６〜４．４５（ｍ，１Ｈ、−^αＣＨ− ）、δ＝５．５８（ｓ，２Ｈ、ＡＣ−ＮＨ₂）、^δ＝６．０８（ｄ，１Ｈ、Ｌｅｕ−^αＮＨ−）、δ＝７．０６（ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ＝７．１２〜７．２８（ｍ，５Ｈ、Ｐｈｅ−Ｃ₆Ｈ₅）、δ＝ｓ，１Ｈ、Ｐｈｅ−ＮＨ₂）、δ ＝７．８２（ｄ，１Ｈ、Ｐｈｅ−^αＮＨ−）例２２酵素技術を用いるカルバモイル保護基の分離（例示的にカルバモイル−アスパルテームの例）カルバモイラーゼ１６ｍｌ（６５．６Ｕ）およびサーモリシン５０．６ｍｇを、一緒に水中に装入し、かつ一晩（約１８時間）撹拌する。カルバモイル−アスパルテーム（４７０ｍｇ、１．２５ミリモル）を添加する。全容量：≒１６ｍｌ。ｐＨ値は、６．５〜７．０の間である。２４時間後に、カルバモイル−アスパルテームは、もはや検出されない。ＨＰＬＣ較正により、アスパルテームに対する変換率は９８．３％である。例２３亜硝酸ナトリウムの添加によるカルバモイル保護基分離（例示的にカルバモイル−Ｌ−アスパルテームの例）カルバモイル−Ｌ−アスパルテーム−カリウム塩４．７２ｇ（１２．６ミリモル）を、Ｈ₂Ｏ６０ｍｌ／ＨＣｌ４０ｍｌ（濃厚、工業用品質）中に装入し、５ ℃に冷却し（ｐＨ＝０．８０）およびＮａＮＯ₂溶液１５．１ｍｌ（１５．１ミリモル）を緩徐に（１０分間当たり１ｍｌ）供給する。約１時間、後反応させてから、この反応混合物を５０重量％の苛性ソーダ溶液を用いて中和する。反応混合物を一晩室温で放置してから、生じた沈殿物を分離し、かつ廃棄する。引き続き、アスパルテームが生じるまで母液を濃縮する。こうして取得されたアスパルテームを、真空中で６０℃で一定重量になるまで乾燥させる。反応を定量的に進行させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号１９６０７１００．３ (32)優先日 1996年２月26日 (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＳ (72)発明者ウーヴェアイヒホルンドイツ連邦共和国Ｄ−01454 グローサーカムスドルフバウツナーラントシュトラーセ 37 (72)発明者ハンス−ディーターヤクブケドイツ連邦共和国Ｄ−04279 ライプツィッヒヨハネス−エル−ベッヒャー−シュトラーセ４ (72)発明者マティアスコッテンハーンドイツ連邦共和国Ｄ−63579 フライゲリヒトブリュッケンシュトラーセ９

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式Ｉ〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立に水素であるか、ヘテロ原子、例えばＮ、ＯまたはＳで１回以上中断されているかまたは置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ₆−アルキル、フェニルまたはベンジル、ヘテロアルアルキル、例えば３−インドリルメチル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチルまたは４−ピリジルメチルであり、この場合、ヘテロ原子は、該ヘテロ原子の側で、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキルまたはベンジルで置換されていてもよいかまたは二重結合を介してアルキル基と結合していてもよく、前記フェニルまたはベンジルは、双方がハロゲン原子またはヒドロキシで１回以上置換されていてもよく、Ｒ³は、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ＮＨ₂、ヒドロキシ、ＮＲ¹Ｒ²であるか、ハロゲン原子、ニトロ、ＮＨ２、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシによって１回以上置換されていてもよいベンジルオキシであるかまたは式ＩＩ：で示される１種以上の単位を表す〕で示されるペプチドを製造するための方法において、式ＩＩＩ：〔式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、上記の意味を有し、Ｒ⁴は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルを表すかまたはハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄− アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ニトロ、ＣＮ、ＣＦ₃、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルコキシカルボニル、ＣＯＯＨまたは−ＮＲ¹Ｒ²で１回以上置換されていてもよいフェニルであるか、アルアルキル、例えばベンジル、ナフチル、ヘテロアルアルキル、例えば２−チエニル、３−チエニルまたは４−チエニル、２−ピリジル、３− ピリジルまたは２−キノリニルであり、この場合、ベンジルは、該ベンジルの側で、ハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシで置換されていてもよい〕で示される化合物またはその塩の形を、カルバモイル保護基の分離のために、選択的に溶剤の存在下でカルバモイラーゼと反応させることを特徴とする、ペプチドの製造法。２．一般式ＩＩＩ：〔式中、Ｒ¹およびＲ²は、互いに独立に水素であるか、ヘテロ原子、例えばＮ、ＯまたはＳで１回以上中断されているかまたは置換されていてもよいＣ₁〜Ｃ₆−アルキル、フェニルまたはベンジル、ヘテロアルアルキル、例えば３−インドリルメチル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチルまたは４−ピリジルメチルであり、この場合、ヘテロ原子は、該ヘテロ原子の側で、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキルまたはベンジルで置換されていてもよいかまたは二重結合を介してアルキル基と結合していてもよく、前記フェニルまたはベンジルは、双方がハロゲン原子またはヒドロキシで１回以上置換されていてもよく、Ｒ³は、Ｃ¹〜Ｃ₄−アルコキシ、ＮＨ₂、ヒドロキシ、ＮＲ¹Ｒ²であるか、ハロゲン原子、ニトロ、ＮＨ₂、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシによって１回以上置換されていてもよいベンジルオキシであり、Ｒ⁴は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルを表すかまたはハロゲン原子、Ｃ₁〜Ｃ₄− アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ニトロ、ＣＮ、ＣＦ₃、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルコキシカルボニル、ＣＯＯＨまたは−ＮＲ¹Ｒ²で１回以上置換されていてもよいフェニルであるか、アルアルキル、例えばベンジル、ナフチル、ヘテロアルアルキル、例えば２−チエニル、３−チエニルまたは４−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジルまたは２−キノリニルであり、この場合、ベンジルは、該ベンジルの側で、ハロゲン原子、Ｃ₁ 〜Ｃ₄−アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシで置換されていてもよい〕で示されるペプチドを製造するための方法において、式ＩＶ：〔Ｒ¹およびＲ⁴は、上記の意味を有する〕で示される化合物またはＩＶの塩の形を、加水分解酵素の存在下で、選択的に溶剤の存在下および選択的に式Ｖ：〔式中、Ｒ²およびＲ³は、上記の意味を有する〕で示される化合物を有する塩基またはその酸付加塩の存在下で反応させることを特徴とする、一般式ＩＩＩで示されるペプチドの製造法。３．カルバモイラーゼを用いる変換を、１０℃〜５０℃、有利に２０℃〜３５℃ 、特に有利に２５℃〜３０℃の温度範囲内で行う、請求項１に記載の方法。４．カルバモイラーゼを用いる変換を、５〜１１、有利に６．５〜８のｐＨ範囲内で行う、請求項１に記載の方法。５．カルバモイラーゼが、ＤＳＭ７３２９、ＤＳＭ７３３０またはＤＳＭ９７７１に由来するものである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。６．カルバモイラーゼを、部分的に精製したか、精製したか、単離したかまたは固定化にした状態で使用する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。、請求項１に記載の方法。８．分離を、＋１２０℃ないし−３０℃、有利に＋６０℃ないし−２０℃、特に有利に２５℃ないし０℃の温度範囲内で行う、請求項７に記載の方法。９．変換を、酸を添加しながら、−０．５ないし５、有利に０ないし２のｐＨ範囲内で行う、請求項７に記載の方法。 10．変換を、水性媒体中で実施する、請求項３または７に記載の方法。 11．分離されたペプチド誘導体がアスパルテームである、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。 12．ペプチドカップリングを高濃度の懸濁液中で行う、請求項２に記載の方法。 13．基質および生成物が部分的に固体の形で存在する、請求項１２に記載の方法。