KR100350011B1

KR100350011B1 - N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸에스테르를제조하는방법

Info

Publication number: KR100350011B1
Application number: KR1019950001114A
Authority: KR
Inventors: 이리노시게아키; 나카무라신이치로; 오야마기요타카; 피이터얀레오나르드마리오큐애드플라이에그; 테오도루스요하네스갓프리에드마리아반두렌
Original assignee: 홀란드 스위트너 캄파니 브이. 오. 에프.
Priority date: 1994-01-20
Filing date: 1995-01-19
Publication date: 2002-10-31
Also published as: CN1113266A; NL9400092A; TW425428B; US5527689A; RU95100762A; ATE191009T1; CN1066773C; KR950032628A; EP0664338B1; DE69515709D1; DE69515709T2; EP0664338A1

Abstract

본 발명은 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 및 N-벤질옥시카르보닐-아스파르트 산을 침전물 형성을 수반하는 효소 커플링 반응에의해 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것으로, 수성 매질 내에서 상기 커플링 반응이 총 반응 혼합물의 중량을 기준으로 백분율로 계산하여 3내지 25중량 %의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염의 존재하 초기 pH 4.5 내지 6.0에서 효소로서 중성 프로테아제의 영향하에 동일 몰 또는 실질적으로 동일 몰 양의 N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르로 이루어지는 ㄴ것을 특징으로 한다.

Description

N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법

본 발명은 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 및 N-벤질옥시카르보닐-아스파르트 산을 효소 커플링 시킴에의해 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L -페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 수정 매질 내 N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트 산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 침전물 형성을 수반하는 높은 전환율의 효소 커플링에의해 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

N-가려진 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 가령 구체적으로 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르는 "강력한 감미제" 아스파탐의 중요한 선구체이고, 상기 생성물은 예컨대 사카린 및 시클라메이트와 같은 다른 강력한 감미제의 쓴 뒷맛없이 우수한 맛을 가지며 슈크로우스의 대략 200배의 감미 효과를 가지고 있다. 감미제 아스파탐은 무엇보다도, 소프트 드링크, 사탕, "탁상용의 감미제", 약제, 등과 같은 넓은 범위의 생성물내에서 사용된다.

다양한 방법이 아스파탐의 제조에 대해 공지되어 있다. 화학적인 제조 방법 외에, 효소 제조 방법도 있으며, 상기 방법은 입체 선택적이고 위치 선택적인 방법으로 효소 커플링이 일어난다는 사실에 중요성이 있다. N-가려진 아스파탐 선구체의 형성으로의 N-가려진 아스파르트 산,구체적으로 N-벤질옥시 카르보닐 아스파르트 산(이후에, 또한 Z-Asp라 표시됨)과 L-(또는 DL-) 페닐알라닌 메틸 에스테르, 또는 예를들어 염산염같이 그로부터의 유도된 산 염들(하기에서, PM이라 표시됨)의 효소 L, L-커플링이 철저히 연구되고 최근에 기술되고 있다. 아스파탐 제조 방법에 관한 고찰이 " Chirality in Industry", John Wiley & Sons Ltd, 1992, 11장(pp 237-247)내에서 K. 오야마에의해 제시된다.

중성 프로테아제 특히,테르몰리신(thermolysin)과 같은 메탈로-프로테아제, 존재하에서 pH 6 내지 7.5로 수행되는 문제의 효소 커플링 반응은 평형 제어되는 반응이다. 이러한 효소 커플링 반응 내에서 높은 정도의 전환을 이루기 위해서, 특별한 수단이 당기술 분야에서 필수적이다. 따라서, 예를들어 (가장 가까운 당기술 분야로 간주되는) US-A-4165311호는 반응 혼합물내 존재하는 D- 또는 L-페닐알라닌으로 메틸 에스테르를 가진 N-가려진 아스파탐, 구체적으로 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(이후, Z-APM라 표시함)의 침전성 부가 화합물의 형성에 의해 평형이 오른쪽으로 쉬프트될 수 있다는 사실을 이용한다. 이러한 아스파탐 선구체의 부가 화합물은 또한 Z-APM, D-PM 또는 Z-AFM, L-PM으로 나타낸다. 이러한 부가 생성물을 형성하기 위해서, 당기술 분야에 따라서는 Z-Asp 및 L-PM의 커플링 반응이 Z-ASP에 대해서 L-PM 몰 량의 적어도 두 배로 수행되거나또는 높은 전환율, 예를 들어 Z-Asp를 기준으로 60%이상, 바람직스럽기로는 80%이상을 이루기위해서는 D-PM이 적어도 동량의 존재에서 수행되는 것이 바람직스럽다. 실제로, 상기 효소 커플링 반응은 그 결과 대개 PM 대 Z-Asp의 비율이 2.0 내지 2.5 대 1 또는 그보다 높은 PM : Z-Asp의 비로 기술되어 있다. 비록 그 같은 실시에 의해 원하는 생성물의 높은 전환율이 실제로 얻어진다 해도, 이들 방법들은 많은 단점을 가지고 있다: 즉,

(a) 최종적으로 원하는 아스파탐(이후에 APM으로 표시됨)을 얻기 위해서 침전물을 다루고 처리하는 것은 부가 생성물을 여과하기에 어렵고, 매우 소량의 불순물을 함유하는 APM을 얻기 위해서 철저히 세척되어야만 하기 때문에 성가시다.

(b) 회수 및/ 또는 재순환이 과량으로 존재하는 성분 및 비-APM 성분을 커플링 생성물이 침전된 부가 생성물으로부터 유리시키기 위해 필요하고, 만약 커플링 반응이 DL-PM으로 실행된다면, 나머지 D-PM은 대개 가공될 적에 DL-페닐알라닌을 경유하여 라세미화 되어야 한다. 상기 방법들은 그 결과 상업적인 규모로 적응되기에 덜 적합하다.

WO-A-92/02617호는 수성 매질내 pH=7인 아세트 산의 존재하 실질적으로 동일한 양의 (대략 1.2:1의 몰 비로) Z-Asp 및 L-PM.HCl의 실질적으로 동일한 양의 효소 커플링 반응을 기술한다. 상기 경우에, 교차 결합에의해 고정된 프로테아제 효소 결정이 사용되지만, 얻어진 전환율은 대략 20%일 뿐이다, EP-A-0149594호는 포르밀-ASP(F-Asp)대 L-PM의 1:1비로 수성 매질에서 효소 커플링 반응을 위한 포르밀-Aap(F-Asp)의 사용을 기술한다. 그러나, F-APM.L-PM 부가 생성물의 형성때문에, F-Asp의 전환은 50%이하이고, 상기 공정에서 얻어진 수득율은 매우 낮다는 것이 알려졌다(대략 F-APM을 제조하는 가공 후 대략 12%임).

동일한 방법으로, Zhou F.et al.문헌(in: Huaxue Fanying Goncheng Yu Gongyj, 1992, 8(4) , pp 413-419(중국어) ; Chemical Abstracts , 120(no. 35), 31-1-94, 초록 Abstract 48817v)은 여러가지 중에서 초기 pH 6에서 Z-L-asp및 L-PM의 1:1 효소 커플링 실험을 기술한다. 그러나, 또한 상기 조건하에서, 통상적인 Z-APM.PM 부가 생성물의 형성에 기인하여 Z-Asp의 전환율은 기껏해야 46.1%이다. Zhou F. et al.에 의해 보고된 바와 같은 (많아야 92.2%인) L-PM의 전환은 L-PM의 Z-APM으로의 (화학적) 커플링 및 일당량의 L-PM이 Z-APM과의 부수적인 침전의 합임을 알아야 한다. 상기 문헌에서는 50%이상의 L-PM 화학적 전환이 이루어 질 수 있다는 가르침이 없다.

첨언하면, 커플링 반응 시스템내 존재하는 에스테르가 상대적으로 화학적 가수분해에 민감하다는 것이 주목되어야만 한다. 그 결과, PM은 가수분해되어 페닐알라닌(이 후, Phe라 함)을 형성하고, Z-APM은가수분해되어 Z-가려진 아스파르틸페닐알라닌(종종, Z-AP라 함)을 형성한다. 상기 바람직스럽지않은 부 반응은 pH≥ 6, 또는 ≤ 4에서 발생하고, pH가 상기 값에서 벗어날수록 보다 강해지고 반응조건하 잔류시간이 보다 길어질수록 강해진다.

현재까지, 상응하는 양의 D-PM이 없거나 커플링 평형을 흔드는 어떤 다른 조치가 취해짐이 없이 동량 또는 실질적으로 동일한 양의 Z-Asp 및 L-PM으로부터 개시하는 Z-Asp 및 L-PM의 효소 커플링에서, Z-Asp를 기초로하여 계산된 50%보다 큰전환율은 이루어질 수 없었다. 수성 매질 내 효소 커플링에 관한 한, Zhou 및 Huang(Indian J.Chem.,32B, pp 35-39, 1993)은 심지어 최근에도 고정된 프로테아제를 사용한 반응에 대한 최적 조건은 Z-Asp대 PM의 비가 1:4라고 언급하고 있다. 상기 맥락에서, 고정된 프로테아제가 사용될 적에 (비교., 예를들면 Biotechnology, 3, pp. 459-464, 1985; 나카니시 et al.) 형성된 생성물의 대부분은 고정을 위해 사용된 수지내 흡수되고 분리된 추출 단계를 거쳐 그곳에서 떨어져야 한다는 것을 알아야만 한다. 수성 매질내 Z-Asp대 L-PM의 1:1의 비로 나카니시 et al.에 의해 이루어진 비교적 낮은 농도(80mM)에서 기껏해야 58%인 수득율은 때문에 공업적인 실행에 관계가 없다. 또한, 초기 반응 속도를 정하기 위해 사용되는 이러한 낮은 농도에서, 커플링 반응은 침전물을 형성하지 않고 진행한다.

커플링 평형을 변동시키는 대안적인 방법이 ( i ) J. Org. Chem. 46, p.5241 (1981) : 고정된 프로테아제 및 물과 섞이지 않는 유기 용매의 사용; 유사하게, JP-B-8533840, 여기에는 1:1 몰비가 사용될 적에, 대략 20-30%만의 수득율이 명시된다; (ii) GB-A-2250023: 물과 섞이는 유기 용매 및 고정된 프로테아제의 사용; 유사하게 EP-A-0272564 아세토니트릴에서, N-가려진 Asp 대 L-PM의 비가 10:1 내지 1;10일 수 있다는 것이 제안되면서, 실시예는 그럼에도 불구하고 상당한 과량의 L-PM만이 고려되고 정량적이거나 실질적으로 정량적인 비의 경우에서 빈약한 전환율 및 수득율이 얻어진다는 것을 보인다.

정량적인 비가 또한 동일 몰 비라고 불리워진다. GB-A-2250023내 기술된 실시예로부터, 마찬가지로 동시에 보다 높은 수득율이 얻어지면 얻어질수록 L-PM 대N-가림된 Asp의 비가 높다는 것이 명시될 수 있다( 2:1에서, 수득율은 대략 85%, 1:1에서 수득율은 대략 50%), 이러한 대안적인 구체적 실시예에서, 평형의 변동이 형성된 침전물에 의해 이루어지는 것이 아니라, 형성된 커플링 생성물이 유기 상으로 전달됨에 의해 이루어진다. 유기 용매를 사용할 적에, 종종 불가피한 용매 손실의 결과로서 비용 증가되는 면과는 별개로, 이러한 대안적인 구체적 실시예의 또 다른 결점은 아스파탐을 제조하는 가공시 특수한 조치가 커플링 반응시 사용되는 유기 용매를 제거하기위해서 취해져야만 한다는 것이다. 예컨대, 아세토니트릴 또는 디메틸 포름아미드와 같은 유기 용매 또는 디- 및 트리글림과 같은 물질을 첨가(또는 경우에 따라서는 상기 물질내에서 또는 존재하에서 반응을 수행)할 적에(EP-A-0278190), 반응이 L-PM(.HCl) 대 Z-Asp의 높은 몰비로 수행되지 않으면 대개 Z-APM등의 낮은 수득량만이 얻어진다.

첨언하면, 정량적이거나 실질적으로 정량적인 비의 반응물에서 일어나는 반응에 대해, (N-가림된 아스파르트 무수물, 예컨대 N-포르밀 유도체, 및 L-Phe 또는 L-PM으로부터 개시하는) 화학적 커플링 반응의 경우에 통상적인 것이지만 이것이 물내에서 개시 물질로서 Z-Asp를 사용한 효소 커플링 반응에 관하여는 어떤 가르침도 없다는 것을 추가적으로 주목하여야 한다.

그러나, 효소 커플링 반응에 대해, 반응물 Z-Asp 및 L-PM이 실질적으로 정량적인 비로 존재할 수 있는, 그러나 부가물 생성에대해 - ( 및 상기 인용된 기술분야에 따른 L-PM 또는 D-PM에 관해 요구되는 최소 동등한 과량 대신에 ) 적어도 동일양의 유기 아민 화합물이 선택되고 여기에서 적어도 하나의 C₆탄화수소 라디칼이존재한다는 것을 기술하는 DE-A-3517361이 주목되어야만 한다. 실제로, 이러한 방법은 한편으로는 형성된 부가 생성물들이 산성화에의해 쪼개어져서 아민을 방출하고 다른 한편으로는 공정의 재순환 및 여과물 흐름에서 APM합성에 사용되는 개시물질로부터 분리하기에 어려운 또 하나의 " 공정에 이질적인" 유기 성분이 도입되기 때문에 APM의 제조에 별로 관계가 없다.

때문에, Z-Asp 및 L-PM의 단순하고 효과적이며, 바람직스럽기로는 정량적인, 효소 커플링에 대한 요구가 있으며, 개시물질에 높은 전환율을 부가하고 낮게 소비시키며 재순환 흐름을 제한하고, 최소한 동등한 양의 D-PM(또는 L-PM의 부가적인 동등량)등의 존재에 대한 필요성이 없이 커플링 반응내 유기 용매나 아민을 첨가할 필요성 없이 여과가능한 생성물을 제조할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 Z-Asp 및 L-PM의 효소 커플링에 대한 높은 전환율을 가진 단순한 공정을 제공하는 것으로, 상기 언급된 결점이 피해질 수 있고, 정량적이거나 실질적으로 정량적인 양의 반응물이 사용되어질 수 있고 쉽게 여과가능한 생성물이 얻어진다. 놀랍게도, 본 발명의 목적은 총 반응 혼합물 중량을 기준으로 백분율로 계산하여 3 내지 25중량%의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염 존재하에서, 초기 pH 4.5 내지 6.0, 효소로서 중성 프로테아제, Z-Asp와 L-PM이 동일 몰 또는 실질적으로 동일 몰로 수행됨에 의해 이루어질 수 있다. 반응속도와 관련하여 바람직스럽지 않은 가수분해를 제한하기위해서, 커플링 반응은 4.7 내지 5.5의 초기 pH로 수행된다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 공정을 수행할 적에, 커플링 반응은 개시 물질의비교적 높은 농도에서 매우 편리하게 수행될 수 있다. 이러한 높은 농도는 반응 과정시 높게 올라가는 반응 시스템의 점성도 때문에 당기술분야에 따른 공정 내에서는 불가능하다는 것이 알려져 있다. 어떠한 설명없이, 본 출원인은 본 발명의 출원인은 본 발명의 적합한 결과가 여러 pH 값과 염농도에서 Z-APM 및 Z-APM.L-PM의 용해도 차이에서 연유할 수 있다고 추정한다.

본 발명에 따른 공정에서, 침전물의 형성과 함께 정량적이거나 실질적으로 정량적인 비로 Z-가림된 아스파르트 산 및 L- 페닐 알라닌 메틸 에스테르사이의 중성 프로테아제로의 효소 커플링 반응을 수행하기 위해서 4.5 내지 6.0의 초기 pH 및 총 반응 혼합물의 중량을 기준으로 백분율로 계산하여 3 내지 25중량%의 양인 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 또는 암모늄염을 함유하는 수성 매질이 이용된다. 본 발명의 맥락에서, 수성 매질이라는 용어는 임의의 균일한 극성 수용액 시스템에 관한 것으로 예컨대 메탄올 또는 아세토니트릴 같은 소량의 (대략 30%까지의) 유기 용매를 함유할 수 있다.

모든 종류의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속염 또는 암모늄 염이 본 발명에 따른 공정에서 사용될 수 있다. 적합한 염은 예컨대, 칼륨, 나트륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘 및 암모늄의 할라이드 또는 황산염이거나 그의 혼합물이다. 암모늄이라는 용어는 여기서 하나이상의 C_1-3알킬 그룹으로 치환된 것이고 이러한 치환된 암모늄 염의 예는 트리에틸(메틸)암모늄 클로라이드, 디에틸(메틸)암모늄 클로라이드 등,이다. 중량부의 범위에 관한 한, 본 발명에 따르면 3 내지 25중량 %의 범위이고 잠재적인 적용은 부분적으로 각각의 염의 용해도에 의해 결정된다. 알칼리 금속 염 및 암모늄 염은 일반적으로 최상의 용해도를 가지며 바람직스럽다. 특히 바람직스럽기로는, 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 설페이드, 칼륨 설페이드, 암모늄 클로라이드 및 / 또는 암모늄 설페이트이다.

반응 시스템내 염 함량이 높으면 높을수록, 전환율에 영향을 미침이 없이, 보다 빨리 전환된다. 보다 높은 함량에서, 그러나 시스템의 점성도는 곧 강하게 증가하고/또는 하나 이상의 개시 재료 및/또는 염 그 자체의 용해도 제한이 증가하는 결과 얻어진 침전물이 불필요하게 상기 염으로 오염되거나 반응 전환율은 보다 낮아진다. 25%이상에서, 시스템의 점성도는 실질적으로 반응을 수행하기에 불가능해진다. 반응 시스템내 염 함량은 더 낮아지면 낮아질수륵, 필요한 반응 시간도 더 길어지며 구체적으로 L-PM의 가수분해를 증가시킨다. 3%이하의 함량에서 염의 존재는 반응에 어떠한 주요한 효과도 가지지 않는 것으로 생각된다. 보다 낮은 염 농도에서, 커플링 생성물의 용해도에 바람직스럽지 않은 효과도 있다. 만약 부가 생성물(Z-APM.L-PM)을 조숙하게 침전시켜야만 한다면, 문제의 특정 조건하 반응 과정에서 평형의 이동이 자동적으로 이물질의 전부 또는 일부을 Z-APM 침전물로 전환을 시키기 때문에 우연히도 본 발명에 따른 반응을 방해하지 않는다. 바람직스럽기로는, 염 함량은, 가장 바람직스러운 조건이 a) 시스템의 점성도, b) 개시 물질의 용해도 및 최종 생성물의 침전물 생성 및 c) 반응 시간과 관련하여,찾아질 수 있기 때문에 10 내지 18% 범위 내이다. 이것은 이 후에 시스템이 속하는 기계적 조건에 관한 언급시 보다 자세해져서 명백해질 것이다. 대개 효소 커플링은 10 내지 60℃의 범위 내에서 발생한다. 온도가 낮으면 낮을 수륵, L-PM 및 Z-APM의 가수분해와 같은 커플링 반응 및 부 반응 둘다가 늦어진다. 온도가 높으면 높을수록, 효소의 불활성화는 보다 빨리 일어난다. 당기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 Z-APM으로의 전환 및 효소 수명의 견지에서 최적의 결과를 이루기 위해서 사용되는 효소에대해 어떤 온도가 선택되어야만 하는가를 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 효소 커플링은 중성 프로테아제를 사용해서 수행된다. 중성 프로테아제라는 용어는 Z-Asp 및 L-PM 로부터 Z-APM을 합성할 수 있는 것 뿐만아니라 필적할만한 또는 심지어 증가된 활성도를 가지는 그의 돌연변이체로부터의 어떤 중성 단백질 가수분해의 효소에 관한 것이다. 예는 Bacillus thermoproteolyticus 에 의해 제조된 테르몰리신 및 다양한 Bacillus종, 가령 Bacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefacienens, Bacillus cereus , 콜라게나제 등에의해 제조된 기타 프로테아제이다. 일반적으로, 상기 효소들은 대략 6 내지 8의 pH에서 프로테아제 활성도에 있어서 최적치를 나타내지만, 본 발명에 따른 조건하 사용될 적에, 과량의 부가적인 양의 효소를 넣을 필요없이 4.5 내지 6.0 구체적으로 4.7 내지 5.5의 초기 pH에서 우수한 결과가 이루어진다는 것이 발견되었다. 일반적으로 소량의 Ca²⁺존재가 효소의 안정성 및 작용에 관해 적합한 효과를 가진다는 것이 주목되어야만 한다.

본 발명이 우수한 결과로 사용될 수 있는 (초기 pH로 표시된) pH범위의 값이 본출원의 맥락에서 효소 커플링의 개시에서 수용성 반응 시스템내 pH값으로서 본 발명의 맥락에서 이해되어야만 하고, 본 발명에 따른 커플링 반응시 대개 소량의 pH감소가 관찰되며 그 이후에 반응이 진행할 적에 증가가 일어난다. 감소 및 증가중에 상기 pH한계는 결과에 대하여 불리한 효과를 가져오지 않으면서 깨어질 수 있다. 그러나, 커플링 반응시 특히 및 반응 후기동안에 pH가 6.2이하, 바람직스럽기로는 5.7이하로 유지되는 것이 바람직스럽다.

4.5이하의 초기 pH에서는 전환을 및 수득율은 낮은 효소 활성도에 기인하여 감소한다. 6.0이상의 초기 pH에서는, 에스테르의 바람직스럽지 않은 가수분해뿐만 아니라 상기 조건하에서는 더이상 Z-APM으로 전환되지 않는 Z-APM.L-PM의 형성이 증가하기 때문에 전환율 및 수득율이 또한 감소한다. 부가적으로, 사용되는 효소에따라, pH의 상기 한계가 매우 적은 정도로 변할 수 있다. 그 결과, 예컨대, 보다 낮은 pH에서 활성인 돌연변이 효소로 실시할 적에, pH범위의 하한 치의 낮춤, 예컨대 3.5 내지 4로의 낮춤이 이루어질 수 있을 것이다.

반응 사이클의 말기에 즉, 최대의 전환율이 이루어질 적에, 효소의 활성도는 대개 변하지 않거나 거의 변하지 않으며 이것은 효소의 재사용을 가능하게 한다. 그 결과, - 특히, 용해된 효소를 사용할 적에 - 획득되어진 침전물의 분리후에 효소 커플링 반응에 재사용되어질 효소에 대하여 이것이 권유된다. 이렇게 할적에, 필요한, 수성 매질의 조성물이 정확한 개시 조건이 다시 얻어질 때까지 약간 조정되어야만 한다. 효소 커플링 반응은 그 결과 동일한 양의 효소로 여러차례 반복될 수 있고, 초기 활성도가 약간 떨어진다면, 필요하다면 신선한 효소가 첨가되며, 원하는 정도의 전환율이 상기 목적을 위해 수용가능한 시간 내에서 이루어질 수 있다.

본 발명에서 z-가 언급되는 경우에, 이것은 비극성 특성의 견지에서, 하나이상의 알킬, 알곡시, 아실 또는 할로겐 그룹에의해 벤질 고리 내 치환된 벤질옥시카르보닐 화합물과같은 z-에 관련된 임의의 가림 그룹에 관한 것으로 이해되어야만 한다. 본 출원에서, L-페닐알라닌 메틸 에스테르(L-PM)이 언급되는 경우에, 예컨대 하이드로클로라이드(L-PM.HCl)와 같은 유도된 산 염에 관한 것이라고도 이해되미야만 한다. 본 출원에서 벤질옥시카르보닐 아스파르트 산(Z-Asp)이 언급되는 경우에, 예컨대 이나트륨 염(2-Asp.디Na)과 같은 그로부터 유도된 염에 관한 것으로 이해되어야만 한다.

명백히, L-PM 대신에 산 염 및/또는 Z-AsP대신에 염을 사용할 적에, 제한된 정도까지, 설정된 pH가 되도록 선택된 화합물의 양을 조정하는 것이 필수적일 것이다,

정량적이거나 실질적으로 정량적 비라는 개념은 본 발명에서, 1:0.7 매지 0.7.1의 범위내 Z-Asp,L-PM 몰비를 언급하는 것으로 이해된다. 바람직스럽기로는, 1:0.8 내지 1.1의 몰비가 사용된다. 약간 과량의 Z-Asp는 전환율 및 수득율의 견지에서 최상의 결과를 만든다. 1:1의 상황에서, 미반응된 개시 재료중 하나 또는 둘 다의 어떠 필요한 재순환이 최소화된다.

본 발명에 따른 공정에서, 침전물은 화학적 조성물과 결정성 및 여과성의 견지에서 당기술 분야에 따른 공정내 얻어진 Z-APM.(D/L)-PM 부가 생성물과는 상이하다. 명백하게, 얻어지는 결정은 크고, 따라서 여과율이 같이 커져서, 생성물의 정제가 불순물이 거의 걸리지 않거나 부착된 수분에 남아 있기 때문에 보다 간단한 것이 된다.

본 출원인은 반응을 수행하는 것에 관한 한, 많은 형태가 필요하다면,시스템을 고정하거나 작동하게 하기 위해서 사용될 수 있는 장치 및 수단 성질의 견지에서, 가능하다. 커플링 반응은 불리한 방법으로 반응을 방해하지 않는 유리, 스테인레스 강 등의 재료로부터 제조된 모든 종류의 용기 및 컬럼내에서 수행될 수 있다. 컬럼은 특히 지지된 효소와 같은 고정된 효소가 사용될 적에, 적합하다. 장치의 치수는 폭넓게 달라질 수 있다. 반응은 그 결과 시험관 또는 비이커로부터 10㎥ 크기까지 원하는 규모로 수행될 수 있다.

회분식 또는 부분적으로 연속적인 반응을 선택하는 것이 또한 가능하다. 본 발명의 공정이 (반) 연속적으로 수행된다면, 침전물의 연속적인 분리는 바람직스런 기로는 초기 반응 혼합물의 전환율의 적어도 대략 60%가 이루어지는 순간부터 개시되고, 이후에 실질적으로 정량적인 비로의 개시 재료의 투여는 침전들이 분리되는 정도까지 실행될 수 있다.

본 발명에 따른 전환은 반응 시스템에 부과되는 어떠한 기계적 영향 없이 매우 잘 진행되며 상기 경우에 소위 정적 조건이 존재한다. 선택된 반응기는 다음으로 교반기 또는 어떤 다른 방법으로 반응 매질이 운동하도록 하는 수단이 장치되어 있을 필요는 없다. 연속적으로 또는 간헐적으로 예컨대 기계적 교반 또는 반응용기를 진탕에 의해 운동을 유지시킴에 의해 대략 격렬한 동작으로 유지된다면 우수한 결과가 이루어 질 수 있다. 상기 문맥에서, 교반 및 진탕이라는 용어는 당 기술 분야내 통상의 지식을 가진 자에 의해 고려될 수 있는 모든 구체적 실시예를 구성한다. 그 결과, 원칙적으로 교반을 위해 임의의 형태의 교반기가 사용될 수 있고 그러나, 교반 속도가 그 후 최적 치로 설정될 수 있으며 심지어 점성도 등에 변화에 조정될 수 있기 때문에 변속 교반기를 사용하는 것이 이점이 있다. 교반 속도의 효과는 부가적으로 작다. 외부펌프에 의한 반응 용기의 함유물을 순환시키는 것은 교반의 형태로 간주되어야만 한다. 반응 용기의 펌프 속도 및 치수는 그 후 시스템내 혼합 정도를 결정한다. 진탕에 사용되는 변형이 반응이 비교적 작은 규모에서 대략 1000ℓ 까지의 규모로 수행될 적에, 보다 적합하다는 것은 명백하다. 본 출원인에의해 수행된 실험은 매우 높은 정도의 전환율은 " 진탕 방법" 을 사용할 적에 이루어질 수 있다는 것을 나타낸다. 매우 적합한 것으로 명시되는 구체적실시예는 반응의 첫번째 단계에서 전환의 20 내지 60%, 바람직스럽기로는 30 내지 50%가 이루어질 때 까지, 정적 조건하에서 수행되고 반응은 그 후 원하는 전환율이 얻어질 때까지, 교반 조건하에서 계속된다. 상기 " 기계적" 처리의 모든 가능한 결합은 마찬가지로 본 발명의 영역 내에서 사용될 수 있다.

커플링 반응에서 사용되는 효소의 양은 결정적이지 않지만, 대개 이러한 양의 효소는 높은 전환율(≥60, 바람직스럽기로는 ≥80%)이 될 때까지, 반응의 지속시간이 150시간이상이 아닌 양으로 사용된다. 대개, 총 반응 혼합물의 무게에 의한 %로 표현되어서 0.08내지 1.5%, 바람직하게 0.15 내지 0.75%의 (당해 효소 활성도를 가진 단백질, 소위 활성 단백질인)효소 양이 적합하다. 만약 효소양이 채택된 (건조) 효소 전체양으로 주어진다면, 즉 활성 단백질 및 다른 단백질 뿐만 아니라 염과 같은 다른 보조제로서 주어진다면, 대개 여기서 언급된 백분율은 0.5 내지 10%이거나 1 내지 5%이다. 효소는 종종 효소 조제로 사용되고 또한 그와 같은 것이 상업적으로 판매되고 있다. 대개, 이러한 조제내 활성 단백질의 양은 대략 조제물의 15중량%이다.

본 발명에 따른 공정에서 효소가 용해된 형태 및 고정된 형태로 상기 목적을위해 적합한 형태로 사용될 수 있다. 바람직스럽기로는, 얻어진 침전물의 분리및 그의 가공 뿐만아니라 생촉매 그자체의 재사용에 있어서 이점을 가지기 때문에,(반응 매질 내 효소 조제물을 용해시킴에 의해 얻어진) 용해된 효소가 사용된다. 보다 앞서 기술된 바와 같이, 당해 효소의 돌연변이를 사용하는 것이 가능하다. 효소의 양에 대해 상기 명시된 백분율은 사용되는 효소의 활성도에 따라 달라질 수 있고 특히 돌연변이체가 사용될 적에 달라질 수 있다.

개시 물질 Z-Asp 및 L-PM의 농도는 마찬가지로 폭넓은 범위 내에서 달라질 수 있고 무엇보다도 초기 반응 혼합물내 상기 재료들의 용해도에의해 결정되어질 수 있다. 그러나, 소량의 용해되지 않은 개시재료의 존재는 상기 양이 반응시 용액에 들어가기 때문에, 반응을 방해하지 않는다. 당기술 분야의 공정에서, 생성물 억제의 결과로, 반응시 상당한 정도까지 상승하는 점성도와 관련하여 개시 물질이 200 내지 700mM의 몰 농도로 반응을 수행하는 것이 불가능하다. 본 발명은 개시 물질의 보다 높은 몰농도에서 우수한 전환율을 이루고 그 결과 대략 1200mM의 크기까지 커플링 생성물의 전환율을 이루는 것이 가능하다. 이것은 반응기 부피당 향상된 생산량을 얻을 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 공정의 부가적인 이점을 나타낸다.

본 발명은 보다 상세하게 한정됨이 없이, 하기 실시예와 비교 실시예를 세부적으로 참조하여 설명될 것이다. 이에 앞서, 실시예내 명시된 반응 혼합물의 조성물(초기 몰농도 및 중량당 퍼센트)은 준비된 반응 혼합물의 정확히 결정된 양 및 중량 및 부피를 기초로 하여 계산된다. 전환율( 및 마찬가지로 반응 시간의 말기에 일어난 L-PM 가수분해에 관련된 결과)이 뉴클레오실 C₁₈로 충전된 컬럼 및 다구배 용리제 시스템 (물 /아세토니트릴/ 트리에틸암모늄 포스페이트)을 이용해서, 257nM에서 UV- 분광 광도계을 사용하여 소위 역-상 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정된다. 반응 혼합물로부터 취해진 샘플에 각각의 경우에 효소 반응을 멈추도록 하기 위해서 메탄올을 넣어주고 (용리제의 연속적인 흐름으로 자동 주입을 통하여) 분석되기 전에 낮은 온도에서 저장된다. 하기 실시예내 명시된 효소 농도 및 초기 효소 활성도는 각각의 경우에 선택된 효소 조제물의 양을 기초로 하여 계산된다. L-PM 가수분해에 대한 명시된 값은 반응 말기에 결정되고 처음에 존재하는 L-PM의 양에 기초하여서 퍼센트로 시간당 평균 가수분해로 표현된다,

실시예 1

일정량의 L-PM.HCl(4.01 g; 18.6 mmol)이 100㎖ 비이커내에서 교반하면서 물(20.57g)내 Z-Asp.diNa(7.28g; 23.4 mmol)와 혼합된다. 연속적으로, 얻어진 용액은 마찬가지로 교반하면서 2.59g NaCl 및 0.17g CaC_l2·2H₂O와 혼합되고 pH는 3N HCl을 첨가하여 5.0으로 설정된다. 남아 있는 투명한 용액은 그 후 2.98g의 테르몰리신(분말, 다이와 제조; 대략 15%의 테르몰리신 단백질 및 70% NaCl을 함유)과 혼합된다.

그 결과, 하기의 조성물을 가진 반응 혼합물이 얻어진다.

층 중량 : 39.7 g

총 부피 : 33.1 ㎖

[Z-Asp]₀: 707 mM (L-PM에 기초하여 26% 과량)

[L-PM]₀: 562 mM

[NaCl] : 14.5 %

[효소] : 5.0

일부의 대략 2.0㎖의 상기 반응 혼합물이 직접 진탕기( 가이로터리 수조 진탕기, 뉴우 브룬즈위크 사이언티픽 캄파니 인코포레이티드 제조, 모델 G76D)에 연결된 호울더내 부유된 40℃의 수조내 동시에 놓여진 15개의 시험관으로 옮겨진다. 진탕기는 분당 200레볼루우션의 속도로 설정된다. 특정 간격후, 하나의 시험관이 반응의 진전을 측정하기 위해서 수조로부터 취해진다. 상기 목적을 위해 반응을 정지시키기위해서 메탄올 15㎖를 첨가한 후 시험관은 대략 5℃로 냉각되고, 이후에 함유물의 조성은 역상 HPLC에의해 분석된다. 효소 조제물이 32nmol/분· mg 의 초기 효소 활성도가 발견된다. 부가적으로, 첫번째 침전물은 대략 30분 후 존재하고 (L-PM으로 계산된) 87%의 최종 전환율은 2.5시간의 반응 시간 후 얻어진다. 반응 시간이 보다 오래 계속되면 될수록, 전환율은 더이상 증가하지 않았다. 2.5의 반응 시간 후, L-Phe. 의 어떠한 탐지가능한 형성도 없었고 상기 조건하에서, 때문에 L-PM의 어떠한 가수분해도 일어나지 않는다.

실시예 2

물(14.9 g)내에서 L-PM.HCl(3.34g ; 15.5 mmol) 및 Z-Asp(4.96 g ; 18,6 mmol)의 현탁액을 실온의 비이커내에서 교반하면서 NaOH 22중량 %(6.72 2 ; 37.0 mmol NaOH)와 혼합하는 결과 pH=5.0을 가진 투명한 용액이 형성된다. 연속적으로, 마찬가지로 교반하면서 상기 용액을 3.26g NaCl 및 0.12s CaCl₂·2H₂O 및 1.40g의 테르몰리신( 분말, 아마노사제조 ; 대략 15%의 테르몰리신 단백질 및 34%의 NaCl을 함유)와 혼합한다. 그 결과 하기의 조성물을 가진 반응 혼합물이 얻어진다.

총 중량 : 34.7 g

총 부피 : 29.3 ㎖

[Z-Asp]₀: 634 mM (L-PM에 기초하여 20% 과량)

[L-PM]₀: 529 mM

[NaCl] : 13.5 %

[효소] : 40%

pH : 5.0

상기 반응 혼합물이 직접 시험관에 나뉘어지고 실시예 1내에서와 같이 더욱더 처리된다. 효소 조제물은 27nmol/분·mg의 초기 효소 활성도가 발견된다. 첫번째 침전물은 대략 120분 후 관찰되고 (L-PM으로 계산된) 80%의 최종 전환율은 9 시간의 반응 시간 후 얻어진다. 반응이 보다 계속될 적에, 전환율은 더이상 증가하지 않았다. 반응이 9시간 계속된 후, 시간당 0.16%의 L-PM의 가수분해에 상응해서 소량의 L-Phe.(0.21 mmol)가 생산되었다.

실시예 3

괄호안에 하기에 언급된 초기 재료의 양이 선택된다는 것을 제외하고는 실시예 2의 절차가 반복된다:

L-PM.HCl(4.70g ; 21.8 mmol) 및 Z-Asp(5.28 g ; 19.8 mmol); 물(13.68g); NaOH 22 중량 %(6.36 g ; 35.0 mmol NaOH); NaCl(2.95g); CaCl₂·2H₂O(0.13g); 테르몰리신 (분말, 아마노사제조 ; 1.50g; 실시예 2와 동일함)

이것은 초기 반응 혼합물이 하기 조성물이 된다.

총 중량 : 34.6 g

총 부피 : 29.0 ㎖

[Z-Asp]₀: 683 mM

[L-PM]₀: 752 mM (Z-Asp에 기초하여 10%)

[NaCl] : 13.7 %

[효소] : 4.3%

pH : 5.0

상기 반응 혼합물이 직접 시험관에 나뉘어 지고, 실시예 1 내에서와 같이 더욱더 처리된다. 효소 조제물은 32nmol/분·mg의 초기 효소 활성도가 발견된다. 첫번째 침전물은 대략 60분 후 형성되는 것이 관찰된다. (L-PM으로 계산된) 57%의 전환율은 13.5 시간의 반응 시간 후 얻어지고, 반응이 계속될 적에, 약간의 전환율증가가 나타났다. 반응이 13.5시간 계속된 후, 시간당 0.1%의 L-PM의 가수분해에 상응해서 소량의 L-Phe.(0.32 mmol)가 관찰되었다.

실시예 4a

괄호 안에 하기에 언급된 초기 재료의 양이 선택된다는 것을 제외하고는 실시예 2의 절차가 반복된다:

L-PM.HCl(4.31g ; 20.0 mmol) 및 Z-Asp(5.87g ; 22.0 mmol); 물(14.53g); 22%

NaOH(6.89 g ; 37.9 mmol NaOH); NaCl(3.20g), CaCl₂·2H₂O(0.l2g); 테르몰리신

(아마노사제조 ; 1.42g, 실시예 2와 동일함)

이것은 초기 반응 혼합물이 하기 조성물이 된다.

총 중량 : 36.3 g

총 부피 : 30.8 ㎖

[Z-Asp]₀: 714 mM (L-PM에 기초하여 10%과량)

[L-PH]₀: 649 mM

[NaCl] : 13.4 %

[효소] : 3.9%

pH : 5.0

상기 반응 혼합물이 직접 시험관에 나뉘어지며 실시예 1 내에시와 같이 처리된다. 효소 제조물은 27.9nmol/분·mg의 초기 효소 활성도가 발견된다. (L-PM으로 계산된) 83%의 전환율은 15 시간의 반응 시간 후 얻어지고, 반응이 계속될 적에, 전환율은 더이상 증가하지 않았다. 반응이 15시간 계속된 후, 시간당 0.2%의 L-PM의 가수분해에 상응해서 소량의 L-Phe.가 관찰된다.

실시예 4b

상이한 양의 물, 22% NaOH 및 NaCl, 즉 물(13.58g); 22% NaOH(7.30g; 40.1mmol ); NaCl(4.60g)이 선택되는 것을 제외하고 실시예 4a의 절차가 반복된다. 이것은 초기 반응 혼합물이 하기 조성이 된다:

총 중량 : 37.2 g

총 부피 : 31.2 ㎖

[Z-Asp]₀: 706 mM ( L-PM에 기초하여 10%과량)

[L-PM]₀: 641 mM

[NaCl] : 17.2 %

[효소] : 3.8 %

PH : 5.0

상기 반응 혼합물이 직접 시험관으로 나뉘어지고 실시예 1 내에서와 같이 처리된다. 효소 조제물이 42.0 nmol/분·mg의 초기 효소 활성도를 보인다. (L-PM에 기초하여서) 77%의 전환율이 4 시간의 반응 시간 후 얻어지고, 반응이 계속될 적에, 전환율은 더이상 증가하지 않았다. 반응이 4시간 계속된 후, 소량의 L-Phe.(0.23 mmol), 즉 시간당 0.16%의 가수분해가 관찰된다.

실시예 4c

상이한 양의 물, 22% NaOH 및 NaCl, 즉 물(15.78g); 22% NaOH(6.82g; 37.5mmol ); NaCl(2.00g)이 선택되는 것을 제외하고 실시예 4a의 절차가 다시 반복된다. 이것은 초기 반응 혼합물이 하기 조성이 된다.

총 중량 : 36.3 g

총 부피 : 30.8 ㎖

[Z-Asp]₀: 714 mM ( L-PM에 기초하여 10% 과량)

[L-PM]₀: 649 mM

[NaCl] : 10.0 %,

[효소] : 3.9 %

pH : 5.0

상기 반응 혼합물이 직접 시험관으로 나뉘어지고 실시예 1 내에서와 같이 처리된다. 효소 조제물이 18.0 nmol/분·mg의 초기 효소 활성도를 보인다 (L-PM을 기초로 하여) 84%의 전환율은 대략 16 시간의 반응 시간 후 얻어지고, 반응이 계속될 적에, 전환율은 더이상 증가하지 않았다. 반응이 16지간 계속된 후, 시간당 0.16%의 가수분해에 상응해서 L-Phe(1.1mmol)가 관찰된다.

실시예 5

실시예 2의 절차가 괄호내 언급된 초기 재료의 양이 선택되고 운동정도의 효과를 결정하기 위해서 실험이 상이한 진탕 속도로 정적 조건하에 수행되는 점을 제외하고 반복된다:

L-PM.HCl(12.93g ; 60.0 mmol); Z-Asp(18.33 g ; 68.6 mmol); 물(43.86g); 22%

NaOH(19.99 g ; 109.9 mmol NaOH); NaCl(9.75g); CaCl₂·2H₂O(0.42g);

테르몰리신 (분말, 아마노사제조 4.26g; 실시예 2와 동일함)

이것은 초기 반응 혼합물이 하기 조성물이 된다:

총 중량 : 109.5 g

총 부피 : 91.2 ㎖

[Z-Asp]₀: 752 mM (L-PM에 기초하여 14%과량)

[L-PH]₀: 658 mM

[NaCl] : 13.4 %

[효소] : 3.9 %

pH : 5.0

얻어진 반응 혼합물 중에서, 15㎖가 직접 40℃의 수조내 배치되고 진탕기에 연결된 호울더에 연결된 3.3cm의 직경을 가진 유리 반응 용기로 이동된다. 진탕기는 분당 150 레볼루우션의 속도로 설정된다.

동시에, 동일 반응 혼합물의 두번재 15㎖를 분당 250레볼루우션의 속도로 설정된 또 하나의 진탕기내에 넣어 동일한 방법으로 처리한다. 부가적으로, 세 번째10㎖를 넣어 40℃에서 정적 조건하에 저장한다.

특정 간격 후에 반응의 진행을 결정하기 위해서 용기로부터 샘플을 취한다(침전물을 전혀 함유하지 않거나 소량의 침전물만을 함유하는 제 1샘플은 피펫에 의해; 침전의 결과로서 반응 혼합물의 점성도가 증가할 적에 나중 샘플은 주걱에 의하여). 상기 목적을 위하여, 취해진 샘플들은 대략 15㎖의 메탄올로 희석되고 대략 5℃까지 냉각하며 역 상 HPLC에의해 그의 조성물에대해 분석한다. 각기 효소 각각의 조제물의 초기 효소 활성도은 37.8, 30.0, 21.0 nmol/분·mg(각기, 150rpm, 250rpm, 및 정적 조건하) 이었다. 이들 세가지 상황에서, 각기 8시간 (150rpm) 및 12시간의 반응시간후 대략 89%의 (L-PM에 기재된) 전환율이 이루어지고 반응이 계속될 적에, 전환율에 어떠한 증가도 없다는 것이 밝혀졌다. 상기 세가지 상황에서, L-PM가수분해가 분당 대략 0.2%에 달한다. 진탕이 가해지는 상황에서의 4시간 후 존재하는 침전물의 일정량은 부가적으로 그의 화학적 조성물에 대해 분석되고 적어도 98%로 이루어진 것이 발견되었다.

실시예 6

실시예 5에서 제조된 것과 같은 초기 반응 혼합물 50㎖가 40℃로 유지되는 바닥 이상의 액체 수준이하에 놓인 플레이트를 가진 가변 속도 교반기가 구비되고, 대략 5cm의 직경을 가진 온도 조절된 유리 반응 용기에 전달된다. 교반기의 속도는 분당 60 회전으로 설정된다. 특정 간격 후 각기 실시예 5에서와 같이 피펫 및 주걱으로 샘플이 취해지고 분석된다. 효소 조제물이 20.1 nmol/분·mg의 초기 효소 활성도를 보인다. 또한, 25시간의 반응시간 후, 67%의 (L-PM기재된) 전환율이이루어지고 또한 반응이 계속될 적에 전환율은 증가한다. 25 시간 반응 후, 소량의 L-Phe(0.55 mmol)가 관찰되었고, 즉 가수분해는 시간당 0.07%에 달했다.

각기 4시간 및 20시간 후 침전물의 조성물이 얻어지고 분석되며, 두시간에 있어 상이하다는 것이 알려졌다: 4시간 후, 98%가 Z-APM,L-PM으로 존재하고 2%가 Z-APM으로 존재하지만, 20시간 후, 상기 백분율은 각기 67% 및 33%로 변경된다.

실시예 7

실시예 5및 6의 개시 용액과 유사하게, 염 함량 13.4중량%가 주로 KCl 또는 Na₂SO₄를 사용해서 얻어지는 개시 용액이 또한 제조되고, 다른 조성물은 동일하다. 혼합물 A에는, 12.1% KCl 및 1.3% NaCl이 존재하고, 혼합물 B에는 8.9% Na₂SO₄및 4.5% NaCl이 존재한다. 커플링 반응이 수행될 적에, 실시예 5 및 6의 결과에 필적하는 결과가 명시된다.

실시예 8

실시예 5에 기재된 바와 동일한 방법으로, 신규한 반응 혼합물이 제조된다. 이중에서, 50㎖가 직접 40℃로 유지되는 실시예 6의 온도 조절된 유리 반응 용기로 전달된다. 현재, 그러나 교반기는 정적 조건하 5시간의 반응 후 개시될 뿐이고 그 후 분당 60 회전으로 설정된다. 어떤 간격 후, 샘플들이 실시예 5에서와 같이 취해지고 분석된다. 효소 제조물이 20.6 nmol/분·mg의 초기 효소 활성도를 보인다. 5시간 후 전환율은 43%이다. 20시간의 반응 시간 후, 86%의 (L-PM기에 기초하여) 전환율에 도달하고 전환율은 반응이 계속될 적에 또한 증가한다. 25시간의 반응시간 후, 소량의 L-Phe(1.1mmol)가 시간당 대략 0.17%의 가수분해도에 상응해서 관찰된다.

실시예 9

하기 조성물을 가진 반응 혼합물(총 중량: 339.96g ; 총 중량 : 275.6㎖)이 제조된다.

[Z-Asp]₀: 745 mM (L-PM에 기초하여 14%과량)

[L-PM]₀: 653 mM

[NaCl] : 13.0 %,

[효소] : 3.8 % (제조물; 아마노사가 제조한 테르몰리신)

pH : 5.3

상기 혼합물은 90㎖의 세개의 분획(A, B, C)로 나누어지고, 상기 부분들은 실시예 6에 기재된 바와 같이 사용된다. 분획 A의 pH는 커플링 반응시 더 영향을 받지 않았고 ; 분획 B의 pH가 대략 5.3으로 (pH가 감소된다면) NaOH용액 및 (pH가 증가한다면) HCl용액을 적가하여 유지되고 C분획의 경우에, (pH가 5.3이상으로 상승할 적에) HCl용액을 적가함에의해 대략 5.3으로 pH를 유지한다.

분획 A와의 커플링 반응 및 분획 B와의 커플링 반응 둘 다에서, 결정이 30분 후 이미 형성되고, 대략 C분획의 경우에는 1시간이 걸린다. (효소 조제물의 초기 효소 활성도 33.0 nmol/분·mg를 가진) 부분 A에서 대략 70%의 전환율이 24시간 후 도달되고, 이것은 반응이 계속될 적에 증가하지 않았다. 최종 pH는 6.16이고 PM가수분해는 대략 시간당 0.1%였다. (동일한 초기 효소 활성도를 가진) 분획 B 및 C에서 95 내지 96%의 전환율에 각기 60 및 45시간 후 도달되고 대략 시간당 0.07%의 PM가수분해가 관찰된다.

비교 실시예 A

실시예 2의 절차가 괄호 안에 하기에 언급된 초기 재료의 양이 사용되고 6.0의 pH가 설정된다는 것을 제외하고는 동일하게 반복된다.

L-PM.HCl (4.04g ; 18.8 mmol) ; Z-Asp(5.34 g ; 20.0 mmol) ; 물(44.35g) ; 22%

NaOH(7.56 g ; 41.6 mmol NaOH); NaCl(8.08g); CaCl₂·2H₂O(0.12g):

테르몰리신 (분말, 아마노사제조 1.42g; 실시예 2와 동일함)

이것은 초기 반응 혼합물이 투명한 용액인 하기 조성물이 된다.

총 중량 : 70.01 g

총 부피 : 61.7 ㎖

[Z-Asp]₀: 324 mM (L-PM에 기초하여 6% 과량)

[L-PM]₀: 305 mM

[NaCl] : 13.4 %

[효소] : 1.0 %

pH : 6.0

상기 반응 혼합물은 시험관으로 나뉘어지고 또한 실시예 1에 기술된 바와 같이 더욱더 처리된다. 효소 조제물의 초기 효소 활성도는 61 nmol/분·mg의 효소 활성도로 나타났다. (L-PM에 기초하여) 46%의 최종 전환율에 3시간의 반응 시간 후 도달되고 전환율에 있어서 어떠한 증가도 반응이 계속될 적에 일어나지 않는다는 것이 발견되었다. 그런데, 3시간의 반응 시간 후, 65mmol의 L-Phe가 형성되었고 L-PM의 가수분해(즉, 대략 초기 18mmol에 기초하여 시간당 1.15%) 에의해 생산되었다는 것이 발견되었다.

Claims

커플링 반응이 총 반응 혼합물의 중량을 기준으로 백분율로 계산하여 3내지 25중량 %인 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염의 존재하에서, 초기 pH 4.5 내지 6.0에서, 효소로서 중성 프로테아제 영향하에 동일 몰 또는 실질적으로 동일 몰의 양의 N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트 산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 사용해서 수행되는 것을 특징으로 하는 수성 매질내에서 침전물을 형성하면서 N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트 산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 높은 전환율로 효소 커플링시켜서 N-벤질옥시카르보닐-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서,

초기 pH가 4.7 내지 5.5의 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염이 10 내지 18%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

사용되는 알칼리 금속 염 또는 암모늄 염이 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 설페이트, 칼륨 설페이트, 암모늄 클로라이드 및/또는 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

커플링이 총 반응 혼합물에 기초하여 효소(활성 단백질) 0.08 내지 1.5 중량% 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

용해된 효소가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트산 및 L-페닐알라닌 메틸에스테르가 1:0.7 내지 0.7:1의 범위내 몰 비로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

N-벤질옥시카르보닐-L-아스파르트산 및 L-페닐알라닌 메틸 에스테르의 몰비가 1:0.8 내지 1:1의 비인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

커플링 반응의 수용성 반응 시스템의 pH가 6.2이하로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

커플링이 반응 혼합물이 적어도 커플링 공정 기간 중에 운동 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

반응 혼합물이 적어도 커플링 공정의 기간 중에 진탕에 의해 운동상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

커플링 반응이 침전물의 연속적인 제거가 초기 반응 혼합물이 적어도 60% 전환되는 순간부터 일어나고, 상기 순간부터 실질적으로 정량적인 비로 개시 재료를 더욱더 부가하면서 반 연속적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

대략 20 내지 60%의 전환이 이루어질 때 까지, 커플링 반응의 첫 번째 기간이 정적 조건하에 수행되고 난 후 반응 혼합물이 적어도 이후의 커플링 공정의 기간에 운동상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.