CN1113266A - L-苯丙氨酸甲酯和n-苄氧羰基-天冬氨酸的酶催偶合 - Google Patents

L-苯丙氨酸甲酯和n-苄氧羰基-天冬氨酸的酶催偶合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备N-苄氧羰基-α-L-天冬 氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，该方法利用N-苄氧 羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介质中形 成沉淀的酶催偶合反应，该偶合反应用(基本上)等摩 尔的N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯 在中性蛋白酶作用下进行，初始pH值是从4.5至 6.0，反应时有占反应混合物总重量3—25％的碱金 属盐、碱土金属盐或铵盐存在。

Description

本发明涉及一种制备N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，该方法利用N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介质中发生高转化率的酶催偶合，同时形成沉淀。
N-保护的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，特别是例如N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，是“强力甜味剂”天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的重要前体，这种甜味剂是甜度约为蔗糖的200倍的一种产品，具有优良的味型，没有其它甜味剂（例如糖精和环已烷氨基磺酸盐）那种发苦的后味。甜味剂天冬氨酰苯丙氨酸甲酯用在许多种产品中，例如软饮料、糖果、餐桌甜味剂、药物等。
已知有各种制备天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法。除了化学制备方法以外，还有酶催制备法，酶催制备法的重要性主要在于酶催偶合以立体选择性和区域选择性的方式进行。至今已经对N-保护的天冬氨酸（特别是N-苄氧羰基天冬氨酸，以后还称作Z-Asp）和L-（或DL-）苯丙氨酸甲酯之间，或者由它们衍生的酸式盐（例如盐酸盐，以后也用PM表示）之间形成N-保护的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前体的酶催L，L-偶合作了充分的研究和描叙。K.Oyama在“工业中的手性”（Chirality in Industry，John Wiley & Sons公司，1992）一书的第11章（237-247页）对天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的制备方法作了评论。
上述的酶催偶合反应是一种平衡控制的反应，它通常在6-7.5的pH下和一种中性蛋白酶（特别是金属蛋白酶，例如嗜热菌蛋白酶）存在下进行。为了在这类酶催偶合反应中实现高转化率，按照现有工艺必须采取特别措施。例如，US-A-4165311（它被认为代表了最新工艺水平）利用了下述事实：通过N-保护的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，特别是N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（以后也称作Z-APM），与反应混合物中存在的D-或L-苯丙氨酸甲酯形成沉淀的加成化合物，可以将偶合反应的平衡移向右方。天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前体的这些加成化合物还分别称作Z.APM.D-PM或Z.APM.L-PM。为了形成这种加成产物，根据现有的工艺，对于Z-Asp和L-PM的偶合反应最好是Z-Asp与至少两倍摩尔数量的L-PM反应，或者是在有至少相当数量的D-PM存在下反应，以便达到高的转化率，即，按Z-Asp计转化率≥60%，优选≥80%。实际上，这些酶催偶合反应因此常用PM对Z-Asp之比来描述，例如此比例为2.0至2.5∶1或更高。虽然用这种实施方案确实达到了所要产物的高转化率，但是这些方法有一些缺点，即：
（a）为得到最终要求的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯（以下称作APM）而要作的处理和进一步的加工很麻烦，部分原因是该加成产物较难过滤，而为了得到只含少量杂质的APM必须洗彻底;
（b）必须将过量存在的组分和从偶合产物的沉淀加成产物中释放出的非APM组分回收和/或再循环;如果偶合反应是与DL-PM进行，则剩余的D-PM在加工时通常也应被外消旋化，一般是利用DL-苯丙氨酸。因此这些方法不太适合在工业规模上应用。
应当指出，WO-A-92/02617叙述了基本上等量的Z-Asp和L-PM.HCL（摩尔比约为1.2∶1）在水介质中和乙酸存在下（pH＝7）的酶催偶合反应。在这种情况下，使用了通过交联而固定的蛋白酶晶体，但是所达到的转化率只有20%。EP-A-0149594介绍了利用甲酰-Asp（F-Asp）以1∶1的F-Asp∶L-PM比在水介质中进行酶催偶合反应。但是，因为形成了F-APM·L-PM加成产物，该F-Asp的转化率明显地仍低于50%，发现此过程达到的产率很低（在加工得到F-APM后约为12%）。
同样方式，Zhou F.等（化学反应工程与工艺，1992，8（4），413-419页，中文;化学文摘120（NO.35），31-1-94，文摘48817V）也在其中叙述了Z-L-Asp和L-PM在初始pH6下进行1∶1酶催偶合的试验。但是，由于通常会形成Z-APM·PM加成产物，在这些条件下的Z-Asp的转化率至多也不过是46.1%。应该指出，Zhou F.等人报道的L-PM转化率（最高92.2%）将化学偶合到Z-APM中的L-PM和与Z-APM同时沉淀的一当量L-PM加在一起考虑。该文章没有提到L-PM的化学转化率能达到50%以上。
顺便说说，还应该指出在偶合反应体系中存在的酯对化学水解相当敏感。例如，PM水解形成苯丙氨酸（下面也用phe表示）;Z-APM水解成Z-保护的天冬氨酰苯丙氨酸（有时用Z-AP表示）。在pH≥6或≤4时尤其会发生这种不良的副反应，而且pH偏离该值越大和在反应条件下停留的时间越长，副反应就越强。
至今一般都假定，在由等当量或基本上等当量的Z-Asp和L-PM出发进行Z-Asp和L-PM的酶催偶合而不存在相应数量的D-PM时，或者不采取其它的移动偶合平衡的措施时，按照Z-Asp计算的转化率不能达到50%以上。就在水介质中的酶催偶合而言，Zhou和Huang（Indian J.Chem.，32B，35-39，1993）最近指出，在采用固定的蛋白酶时反应的最佳条件是Z-Asp与PM之比为1∶4。在这方面应当注意，当使用固定的蛋白酶时（例如见Biotechnology，3，459-464页，1985;Nakanishi等），所形成的大部分产物都被吸收在用于固定的树脂之中，必须利用一个分离的萃取步骤从中取出。Nakanishi等用1∶1的Z-Asp和L-PM在水介质中达到的结果（在较低浓度（80mm）下产率至多58%）因此不切合工业实际。另外，在常常用来确定初始反应速度的这样低的浓度下，偶合反应进行时不形成沉淀。
在以下文献中叙述了移动偶合平衡的其它方式，（ⅰ）J.Org.Chem 46，5241页（1981）：使用固定的蛋白酶和与水不混溶的有机溶剂;类似地，JP-B-8533840在使用1∶1摩尔比时产率只有约20-30%;（ⅱ）GB-A-2250023：使用固定的蛋白酶和与水混溶的有机溶剂;类似地，EP-A-0272564是在乙腈中反应，该专利建议N-保护的Asp与L-PM之比可以在10∶1和1∶10之间，但其实施例表明，只考虑有L-PM大量过剩的情形，在化学计量比或基本上化学计量比的情形下得到的转化率和产率差。化学计量比也称作等摩尔比。顺便说说，由GB-A-2250023中所述的实施例同样可见，L-PM与N-保护的Asp之比越高，所达到的产率越高（在2∶1时产率约为85%，1∶1时只约为50%）。在这类其它的实施方案中，平衡的移动不是由形成沉淀实现的，而是由于所形成的偶合产物转移到了有机相。除了在使用有机溶剂时由于常常不可避免的溶剂损失而增高了成本之外，这类其它的实施方案的另一缺点是，在加工制造天冬氨酰苯丙氨酸甲酯期间，必须采取特别措施来除掉在偶合反应中使用的有机溶剂。在加入有机溶剂（或者某些情形可能在有机溶剂中、或在有机溶剂存在下反应），例如加入乙腈或二甲基甲酰胺、或者诸如二或三甘醇二甲醚等物质时（见EP-A-0278190），除非在L-PM（·HCL）与Z-Asp的高摩尔比下进行反应，否则Z-APM和类似物质的产率一般只能很低。
另外还应当指出，在化学偶合反应的情形（由N-保护的天冬氨酸酐，例如N-甲酰基衍生物，和L-Phe或L-PM），反应物按化学计量比或基本上按化学计量比发生反应并不罕见，但是这与用Z-Asp作为起始物的在水中的酶催偶合反应无关。
但是，应当注意DE-A-3517361。该专利披露，对于酶催偶合反应，该反应物Z-Asp和L-PM确实可以以基本上等化学计量比存在，但是，为了形成加成物（不是前述现有工艺要求的L-PM或D-PM的极小的当量过剩）使用了至少等当量数量的一种有机胺化合物，该胺中有至少一上C5烃基。实际上，这样一种方法是不大能用于制备APM，因为一方面，所形成的加成产物必须用酸化法分解，释放出胺，另一方面，引入了作为“工艺过程杂质”的另一种有机组分，在工艺过程的再循环及滤液物流中，很难将该组分与合成APM所用的起始物分开。
因此，需要实现Z-Asp和L-PM之间的简单而有效的、最好是化学计量的酶催化偶合，它具有高的转化率、低的起始物消耗率和有限的再循环物流，同时形成容易过滤的产物而无需至少等当量的D-PM（或额外当量的L-PM）或类似物质存在，而且不必在偶合反应中加入有机溶剂或胺。
本发明的目的是提供一种用于Z-Asp和L-PM酶催偶合的高转化率的简单方法，该法避免了上述的缺点，可以使用化学计量或基本上化学计量数量的反应物，而且得到的产物容易过滤，令人惊奇的是，本发明利用等摩尔或基本上等摩尔数量的Z-Asp和L-PM在作为酶的一种中性蛋白酶的作用下进行偶合反应实现了这一目标，上述反应在初始pH为4.5-6.0的条件下进行，同时有占反应混合物总重量的3-25%的碱金属盐、碱土金属盐或胺盐存在。考虑到反应速度，并且为了限制不良的水解反应，该偶合反应最好在初始pH值为4.7-5.5的条件下进行。
还出乎意料地发现，根据本发明的方法在实施时，该偶合反应也可以在相当高的起始物浓度下进行。已发现这样高的浓度在现有的工艺方法中是不可能的，因为反应过程中反应体系的粘度会上升到过高的水平。本申请人设想（但并不受任何特定解释的约束），本发明的优越结果可能要归因于Z-APM和Z.APM.L-PM在不同pH值和盐浓度下溶解度的不同。
在本发明的方法中使用了含有碱金属盐、碱土金属盐或胺盐的水介质（盐含量为反应混合物总重量的3-25%），在初始pH为4.5至6.0和有中性蛋白酶存在下，按照化学计量比或基本上化学计量比，进行了Z-保护的天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯之间的酶催偶合反应，同时形成沉淀。
本申请正文中的水介质一词是指任何均匀的极性含水介质，其中可以含有少量（最多达30%左右）的有机溶剂，例如甲醇或乙腈。
在本发明的方法中可以使用各种碱金属盐、碱土金属盐或铵盐。合适的盐有例如钾、钠、锂、钙、镁和铵的卤化物或硫酸盐，或者它们的混合物。这里的铵一词也指用一个或多个C1-3烷基取代的铵;这类取代的铵盐的实例是三（甲）乙基氯化铵、二（甲）乙基氯化铵等。就本发明规定的3-25wt%的重量百分数范围而言，可能的应用部分地由各个盐的溶解度决定。碱金属和铵盐通常溶解度最高，因此优选使用。特别优选使用氯化锂、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、氯化铵和/或硫酸铵。
在反应体系中盐含量越高，转化就进行得越快，而产率不会受明显影响。但是在盐含量较高时，体系的粘度很快会显著升高，和/或一种或多种起始物和/或盐本身的溶解度极限将被超过，于是所得到的沉淀不必要地被盐沾污，或者导致反应的转化率降低。盐浓度高于25%时，该体系的粘度已使得反应基本上无法进行。反应体系中的盐含量越低，所需的总反应时间将越长，结果使水解（尤其是L-PM的水解）增加，在盐含量低于3%时，盐的存在据信对反应没有显著影响。在较低的盐浓度下也对偶合产物的溶解度有不良的影响。如果加成产物（Z-APM.L-PM）过早地沉淀，这并不干扰本发明的反应，因为平衡的移动会自动地使这一产物在所考虑的特定条件下反应的过程中全部或部分地转化成Z-APM沉淀。该盐含量最好是从10-18%，因为在此范围内以下几个方面都处在最有利的条件：a）体系的粘度;b）起始物的溶解度和末端产物的沉淀形成;和c）反应时间。在后面讨论该体系受到的机械条件时将对此作更详细的说明。
酶催偶合一般在10到60℃的温度范围内进行。温度越低，偶合反应和诸如L-PM及Z-APM水解等副反应进行得越慢。温度越高，酶的失活越快。本领域的技术人员容易确定，为了在转化成Z-APM的百分率和酶的寿命方面达到最佳结果，应当选择多高的温度。
本发明的酶催偶合用中性蛋白酶进行。这里所说的中性蛋白酶是指可以用于从Z-Asp和L-PM合成Z-APM的任何已知的中性蛋白水解酶以及它们的活性相当甚至更高的突变体。其实例是金属蛋白酶，例如由嗜热解蛋白杆菌（Bacillus thermoproteolyticus）制得的嗜热菌蛋白酶，以及由各种杆菌如嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus Stearother-mophilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、胶原酶等制造的其它蛋白酶。一般来说，这些酶在pH约为6至8时具有最佳的蛋白酶活性，但是业已发现，当在本发明的条件下使用时，在初始pH为4.5至6.0、特别是从4.7至5.5时也得到良好的结果，而不需要使用额外的大量酶。应当指出，少量的Ca2+离子的存在一般对酶的稳定性和作用起着有利的影响。
本申请中提到的能够利用本发明得到良好结果的pH范围值（表示成初始pH值），应当理解为含水反应体系在开始酶催偶合时pH值;在根据本发明进行酶催偶合反应期间，通常先观察到pH略有减小，而后随反应进行pH增大。在减小和增大期间可以突破所述的pH极限而对结果没有不利影响。但是，偶合反应期间的pH，特别是后期阶段的pH，以保持低于6.2为佳，最好是低于5.7。
在初始pH低于4.5时，由于酶的活性较低，转化率和产率减小。在初始pH高于6.0时，转化率和产率也减小，这特别是因为酯的不良水解的增加以及Z-APM.L-PM的形成，该物质在这些条件下不再转化成Z-APM。顺便应当指出，pH的这些极限也可以根据所用的酶而有小范围的变化。例如，当使用一种在较低的pH下有活性的酶突变体时，可以进一步降低pH范围的低限，例如到pH为3.5-4。
在反应循环结束时，即，当达到最终的转化率时，酶的活性一般不变或者几乎不变，所以酶可以重新使用。因此建议在分离出所得的沉淀之后将酶再用于酶催偶合反应，特别是当使用溶解的酶时。在这样作时，若有必要应当对水介质的成分略加调节，直到再次达到正确的起始状态。因此该酶催偶合反应可以用同样数量的酶重复几次;如果起始活性略有下降，则在必要时补加新鲜的酶，以便在对于这一应用来说可以接受的时间内达到所要求的转化率。
在本申请中提到Z-的场合，应当理解为其非极性特点与Z-有关的任何保护基团，例如苄基环被一个或多个烷基、烷氧基、酰基或卤素等基团取代的苄氧羰基化合物。在本申请中提到L-苯丙氨酸甲酯（L-PM）的场合，还应该理解是指由其衍生的酸式盐，例如，盐酸盐（L-PM.HCI）。在本申请中提到苄氧羰基天冬氨酸（Z-Asp）的场合，也应该理解是指由其衍生的盐，例如，二钠盐（Z-Asp.2Na）。显然，在使用酸式盐代替L-PM和/或用盐代替Z-Asp时，有必要在有限的程度内调节为达到所设定的pH值而使用的化学物质的数量。
术语化学计量比或基本上化学计量比在本申请中是指Z-Asp∶L-PM的摩尔比处在从1∶0.7到0.7∶1的范围。最好是使用从1∶0.8到1∶1的摩尔比。轻微过量的Z-Asp会导致最佳的转化率和产率。在1∶1的情形下，需要再循环的一种或两种未反应的起始物减至最少。
本发明方法中的沉淀在化学组成和结晶性质及可滤性方面都与在现有工艺方法中得到的Z-APM.（D/L）-PM加成产物不同。特别是，所得的结晶较大，因此过滤速度也较高，结果是产物的纯化比较简单，因为夹杂或保留在所附着的水分内的杂质较少。
申请人发现，就进行反应而言，在装置方面和可以用来固定或保持体系运动（如果需要的话）的方式的本质方面，都可以有很多形式。该偶合反应可以在所有各种反应器和反应柱内进行，只要它们由不以有害的方式影响反应的材料制成，例如玻璃、不锈钢等。在使用固定的酶（例如承载的酶）时，反应柱特别合适。设备的尺寸可以在很宽的范围内变化。因此可以在所希望的任何规模上进行该反应，从试管或烧杯到例如10m3的规模。
还可以选择采用间歇式或部分连续式反应。如果本发明方法（半）连续地进行，最好是在初始的反应混合物的转化率已达到至少约60%时才开始连续分离沉淀，此后可以根据沉淀被分离的程度进一步加入基本上化学计量比的起始物。
根据本发明的转化在反应体系不受任何机械作用下进行得很完全，此种情形处于所谓静止状态。因此所选择的反应器不必装配搅拌器或者保持反应介质以某种其它方式运动的装置。如果利用机械搅动或者以摇动反应容器的方式使反应体系保持或多或少的激烈运动状态（连续地或间歇地），也达到了很好的结果。在这里搅动和摇动两个术语包括了本领域技术人员可以考虑的所有实施方案。例如，对于搅动，原则上可以使用任何类型的搅拌器;但是，使用可调速的搅拌器比较方便，因为这样可以使搅速固定到最佳值，而且还可以进行调节以适应粘度及类似变量的变化。顺便说说，搅速只有很小的影响。用外设泵循环反应器的内容物应该被看作是搅动的一种形式。泵速和反应器的尺寸决定了体系内的混合程度。显然，当反应在最大约1000L的较小规模上进行时，采用摇动的实施方式更为合适。申请人所作的实验表明，在使用“摇动法”时达到了很高的转化率。一项也很合适的实施方案是在静止状态下进行第一部分反应，直到达到约20-60%、最好是30-50%的转化率，然后在搅拌的条件下继续该反应，直到达到所要求的转化度。这些“机械”处理的所有可能的组合同样可以在本发明的范围内使用。
偶合反应中的酶的用量并非关键，但是一般来说酶的用量应当使该反应达到高转化率（≥60%，最好是≥80%）所需的时间不超过150小时。通常，用反应混合物总重量的百分数表示的酶（这里应理解为是具有所讨论的酶活性的蛋白质，所谓的活性蛋白）的数量以从0.08%到1.5%为宜，最好是从0.15%到0.75%。如果酶的数量表示成所用的（干）酶制剂的总量，即，活性蛋白和其它蛋白以及其它辅助剂（例如盐）的总量，则上面提到的百分含量一般相当于从约0.5%到10%，或者最好是从1%到5%。酶常常以酶制剂的形式使用，市场上买到的也是这种形式。通常，这类制剂中活性蛋白的含量约占制剂重量的15%。
在本发明的方法中酶可以以适合这一用途的任何形式使用，即，溶解的形式或是固定化的形式。最好是作用溶解的酶（将酶制剂溶在反应介质中得到），因为这在分离出所得的沉淀物并作进一步处理以及重新使用生物催化剂本身方面都更为方便。如前所述，也可以使用所讨论的酶的突变体。上面规定的酶的用量百分数可以根据所用的酶的活性有所变动，在使用酶突变体时肯定是这样。
起始物Z-Asp和L-PM的浓度同样可以在很广的范围内变化，它特别要由这些物质在该初始反应混合物中的溶解度决定。但是，少量不溶解的起始物的存在不影响反应的进程，因为这些数量在反应期间会进入溶液。在现有工艺方法中，由于产物抑制以及反应期间粘度上升过高，不可能在起始物摩尔浓度高于约200-700mM下进行反应;本发明则可以在高达约1200mM量级的较高的起始物（以及因此较高的偶合产物）摩尔浓度下达到良好的转化率。这表明了本发明的另一个优越性，因为这有可能提高每单位反应器容积的产量。
现在将参照以下实施例和对照实施例更详细地解释本发明，但本发明不受这些实施例的限制。事先应当指，实施例中给出的反应混合物的组成（初始溶液中的摩尔浓度和重量百分数）是以实际确定的用量和所制备的反应混合物的重量和容积为基础计算的。转化率（在反应结束时发生的L-PM水解的结果也一样）是用所谓反相高效液相色谱（反相HPLC）测定的，使用紫外分光光度计在257nm下检测，采用装有Nucleosil C18和pH3.0的多梯度洗脱体系（水/乙腈/磷酸三乙铵）的柱子。将取自该反应混合物的样品在每种情形里都立即加入到甲醇中以便停止酶催反应，在分析（自动注射到洗脱液的连续液流中）之前于低温下贮存。下述实施例中提到的酶浓度和初始酶活性均以所用的酶制剂的数量为基础。所提到的L-PM水解值在反应结束时测定，根据开始时存在的L-PM的数量表示成平均每小时水解百分数。
实施例Ⅰ
将一定数量的L-PM.HCL（4.01g;18.6mmol）和Z-Asp·2Na（7.28g;23.4mmol），在水（20.57g）中的溶液，在室温下于100ml烧杯中搅拌混合。接着将所得的溶液与2.59g Nacl和0.17g Cacl22H2O在搅拌下混合，然后加入3N HCl将pH调到5.0。将此透明溶液与2.98g的嗜热菌蛋白酶（粉末，Daiwa公司，含约15%的嗜热菌蛋白酶蛋白质和70%NaCl）混合。
这样就得到了成分如下的反应混合物：
总重量：39.7g
总体积：33.1ml
[Z-Asp]。：707mM（按L-PM计过量26%）
[L-PM]。：562mM
[NaCl]：14.5%
[酶]：7.5%（制剂）
pH：5.0
在所有情形下，都将约2.0ml的许多份反应化合物立即转移到15根试管中，同时将试管置于40℃的水浴中，悬挂在与摇荡机（Gyrotory）水浴摇荡机，G76D型，New Brunswick Scientific公司）相连的支架上。该摇荡机的速度固定为每分钟200转。在一定时间间隔之后，在某一时刻从水浴中取出一根试管以确定该反应的进展。为此，在加入约15ml甲醇以便停止该反应之后，将试管冷却到约5℃，随后用反相HPLP分析内容的成分。测得酶制剂的初始酶活性为32nmol.min-1mg-1。另外，确定了在约30分钟后首次出现沉淀，在2.5小时的反应时间后，最终转化率（按L-PM计）达到87%。如果该反应持续更长，转化率不再增加。在反应2.5小时后没有可检测出的L-Phe形成。因此，在这些条件下L-PM未发生水解。
实施例Ⅱ
将L-PM.HCL（3.34g;15.5mmol）和Z-Asp（4.96g;18.6mmol）在水（14.9g）中的悬浮液与一定量的重量浓度22%的NaOH（6.72g;37.0mmol NaOH）在室温下于烧杯中搅动混合，从而形成pH＝5.0的透明溶液。接着仍然在搅拌下使此溶液与3.26g的NaCl、0.12g的CaCl2.2H2O和1.40g嗜热菌蛋白酶（粉末，Amano公司，约含15%的嗜热菌蛋白酶蛋白质和34%NaCl）混合。于是得到成分如下的反应混合物：
总重量：34.7g
总体积：29.3ml
[Z-Asp]。：634mM（按L-PM计过量20%）
[L-PM]。：529mM
[NaCl]：13.5%
[酶]：4.0%
pH：5.0
将该反应混合物立即分配到各试管之中，象实施例1中所述作进一步处理。测得酶制剂的初始酶活性为27nmol.min-1mg-1。还发现在约120分钟后可以观察到初次出现沉淀，在反应9小时后最终转化率（按L-PM计）达到80%。在连续该反应时，转化率不再增加。在反应9小时后，产生了少量L-Phe（0.21mmol），相当于L-PM每小时水解0.16%。
实施例Ⅲ
重复实施例Ⅱ的步骤，但是现在采用下述括号内的初始物用量：L-PM.HCl（4.70g;21.8mmol）;Z-Asp（5.28g;19.8mmol）;水（13.68g）;22%NaOH（6.36g;35.0mmol NaOH）;NaCl（2.95g）;CaCl2.2H2O（0.13g）;嗜热菌蛋白酶（粉末，Amano公司，1.50g;与实施例Ⅱ中相同）。
这形成了成份如下的初始反应混合物：
总重量：34.6g
总体积：29.0ml
[Z-Asp]。：683mM
[L-PM]。：752mM（按Z-Asp计过量10%）
[NaCl]：13.7%
[酶]：4.3%
pH：5.0
将该反应混合物立即分配到各试管之中，如实施例Ⅰ中所述作进一步处理。测得酶制剂的初始酶活性为32nmol.min-1mg-1。还观察到在约60分钟后初次形成沉淀。在反应13.5小时后转化率达到57%（按L-PM计），在继续反应时转化率有所提高。在反应13.5小时后观察到有少量的L-Phe（0.32mmol），相当于L-PM每小时约水解0.1%。
实施例Ⅳa
重复实施例Ⅱ的步骤，但是现在采用下述括号内的初始物用量：L-PM.HCl（4.31g;20.0mmol）;Z-Asp（5.87g;22.0mmol）;水（14.53g）;22% NaOH（6.89g;37.9mmol NaOH）;NaCl（3.20g）；CaCl2.2H2O（0.12g）;嗜热菌蛋白酶（Amino公司，1.42g;同实施例Ⅱ）。这形成了成分如下的初始反应混合物：
总重量：36.3g
总体积：30.8ml
[Z-Asp]。：714mM（按L-PM计过量10%）
[L-PM]。：649mM
[NaCl]：13.4%
[酶]：3.9%
pH：5.0
将该反应混合物立即分配到各试管之中，按照实施例Ⅰ中所述作进一步处理。测得酶制剂的初始酶活性为27.9nmol.min-1mg-1。还发现在反应15小时后转化率（按L-PM计）达到83%，连续反应时转化率不再增加。在反应15小时后只观察到很小量的L-Phe，相当于每小时水解0.2%。
实施例Ⅳb
重复实施例Ⅳa的步骤，但是水、22%NaOH和NaCl的用量不同，即：水（13.58g）;22%NaOH（7.30g;40.1mmol）;NaCl（4.60g）。这形成了成分如下的初始反应混合物：
总重量：37.2g
总体积：31.2ml
[Z-Asp]。：706mM（按L-PM计过量10%）
[L-PM]。：641mM
[NaCl]：17.2%
[酶]：3.8%
pH：5.0
将该反应混合物立即分配到各试管之中，按实施例Ⅰ中所述作进一步处理。测得酶制剂的初始酶活性为42.0nmol.min-1mg-1。还发现在反应约4小时后转化率（按L-PM计）达到77%，继续该反应时转化率不再增加。在反应4小时后，观察到少量的L-Phe（0.23mmol），即，每小时水解0.16%。
实施例Ⅳc
再次重复实施例Ⅳa的步骤，但是使用的水、22% NaOH和NaCl的数量又不同，即：水（15.78g）;22% NaOH（6.82g;37.5mmol）;NaCl（2.00g）。这形成了成份如下的初始反应混合物：
总重量：36.3g
总体积：30.8ml
[Z-Asp]。：714mM（按L-PM计过量10%）
[L-PM]。：649mM
[NaCl]：10.0%
[酶]：3.9%
pH：5.0
将该反应混合物立即分配到各试管中，按实施例Ⅰ中所述作进一步处理。测得酶制剂的初始酶活性为18.0nmol.min-1mg-1。还发现，在反应约16小时后转化率（按L-PM计）达到84%，继续反应时转化率不再增加。在反应16小时后，观察到一定数量的L-Phe（1.1mmol），相当于每小时水解0.3%
实施例Ⅴ
重复实施例Ⅱ的步骤，但是这次采用括号内的下述起始物的数量，同时为了确定运动程度的影响，还在不同的摇动速度和静止状态下进行了试验：
L-PM.HCl（12.93g;60.0mmol）;Z-Asp（18.33g;68.6mmol）;水（43.86g）;22% NaOH（19.99g;109.9mmol NaOH）;NaCl（9.75g）;CaCl2.2H2O（0.42g）;嗜热菌蛋白酶（粉末，Amano公司，4.26g;与实施例Ⅱ相同）。这形成了成分如下的初始反应混合物：
总重量：109.5g
总体积：91.2ml
[Z-Asp]。：752mM（按L-PM计过量14%）
[L-PM]。：658mM
[NaCl]：13.4%
[酶]：3.9%
pH：5.0
在所得的该反应混合物中，取15ml立即转移到直径3.3cm的玻璃反应器中，该反应器置于40℃水浴中，悬挂在与摇荡机相连的支架上。摇荡机的速度固定为每分钟150转。
与此同时，将第二份15ml的同一反应混合物在转速固定为250转/分的摇荡机中用类似方式处理。另外，第三份10ml反应混合物在静止状态下于40℃贮存。
在一定时间间隔后从各容器中取样以确定反应的进展（第一批样中仍然没有或只有少量的沉淀，它们用移液管取样;如果反应混合物的粘度由于形成沉淀而升高，后面各批择用括勺取样）。为此将取出的样品用约15ml甲醇稀释，冷却到约5℃，用反相HPLC分析。发现酶制剂的初始酶活性分别为37.8、30.0和21.0nmol.min-1mg-1（分别在150rpm、250rpm和静止条件下）。还发现，在这三种情况下，分别在反应时间短至8小时（150rpm）和12小时后，转化率（按L-PM计）达到约89%，在继续该反应时，转化率不再增加。在这三种情形中，L-PM水解量约为每小时0.2%。对于施加摇动的情形，另外分析了4小时后出现的一定量的沉淀的化学成份，发现含Z-APM至少98%。
实施例Ⅵ
将另一份50ml实施例Ⅴ中制备的初始反应混合物转移到直径约5cm的恒温玻璃反应器中，该反应器恒温40℃，装有带叶片的可调速搅拌器，叶片刚好高于器底而低于液面。该搅拌器的速度设定在每分钟60转。在一定的时间间隔后象实施例Ⅴ中一样分别用移液管或用刮勺取样并进行分析。发现酶制剂的初始酶活性为20.1nmol.min-1mg-1。还观察到，在反应25小时后转化率（按L-PM计）达到67%，继续反应时转化率仍进一步增加。在反应25小时后，观察到少量的L-Phe（0.55mmol），即，水解量为每小时0.07%。
分析在4小时和20小时后得到的沉淀成分，发现这两个时刻的样品成分不同：4小时后，98%以Z-APM.L-PM、2%以Z-APM的形式存在，但20小时后这两个百分数分别改变成67%和33%。
实施例Ⅶ
与实施例Ⅴ和Ⅵ的起始溶液相似，也配制起始溶液，其中占13.4%重量的盐含量主要是用KCl或Na2SO4达到，其它成分则相同。在混合物A中，有12.1%KCl和1.3%NaCl;在混合物B中，有8.9%Na2SO4和4.5%NaCl。在进行偶合反应时，观察到与实施例Ⅴ和Ⅵ相似的结果。
实施例Ⅷ
按照实施例Ⅴ中所述的相同方式，配制一个新的反应混合物。其中取50ml立即转移到保持在40℃的实施例Ⅵ的恒温玻璃反应器中。但是这次在反应于静止状态下进行5小时后才开动搅拌器，随后固定在每分钟60转。在一定时间间隔后，象实施例Ⅴ中一样取样并分析。测得酶制剂的初始酶活性为20.6nmol.min-1mg-1。5小时后转化率为43%。还观察到，在反应20小时后，转化率（按L-PM计）达到86%，而且随着反应的继续，转化率还进一步增加。在反应25小时后，观察到少量L-Phe（1.1mmol）相当于水解度约为每小时0.17%。
实施例Ⅸ
配制成分如下的反应混合物（总重量：339.96g;总体积：275.6ml）：
[Z-Asp]。：745mM（按L-PM计过量14%）
[L-PM]。：653mM
[NaCl]。：13.0%
[酶]：3.8%（制剂;Amono公司的嗜热菌蛋白酶）
pH：5.3
将此混合物分成各为90ml的三份（A、B、C），按照实施例Ⅵ中所述使用各份。A份的pH在偶合反应期间不作进一步的调节;B份的pH用逐滴加入NaOH溶液（如果pH减小）和HCl溶液（如果pH增加）的方法保持在5.3左右;在C份的情形，用逐滴加入HCl溶液的方法（当pH升至5.3以上时）小心地将pH保持在5.3左右。
在用A份和B份溶液的偶合反应中，在30分钟后都已经形成了晶体，在C份的情形则花费了约1小时。在A份中（酶制剂的初始酶活性为33.0nmol.min-1mg-1），24小时后的转化率达到约70%，继续反应不再增加;最终的pH为6.16，PM水解约为每小时0.1%。在B份和C份中（初始酶活性相同），分别在60和45分钟后达到95%至96%的转化率，PM的水解约为每小时0.07%。
对照实施例A
重复实施例Ⅱ的步骤，但是现在使用括号内的下述起始物，pH固定在6.0：
L-PM.HCl（4.04g;18.8mmol）;Z-Asp（5.34g;20.0mmol）;水（44.35g）;22% NaOH（7.56g;41.6mmol NaOH）;NaCl（8.08g）;CaCl2.2H2O（0.12g）;嗜热菌蛋白酶（粉末，Amano公司，1.429g;用实施例Ⅱ）。这形成了成分如下的透明的起始反应混合物溶液：
总重量：70.1g
总体积：61.7ml
[Z-Asp]。：324mM（按L-PM计过量6%）
[L-PM]。：305mM
[NaCl]：13.4%
[酶]：1.0%
pH：6.0
将此反应混合物分配到试管中，按实施例Ⅰ中所述作进一步的处理。发现酶制剂的初始酶活性为61nmol.min-1mg-1。还发现在反应3小时后最终转化率（按L-PM计）达到46%，继续反应时转化率不再增加。在反应3小时后发现，由于L-PM水解而形成了0.65mmol的L-Phe（即，按最初为18mmol计，每小时约水解1.15%）。

Claims (15)

1、通过N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介质中以高转化率酶催偶合并形成沉淀来制备N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，其特征在于，该偶合反应用等摩尔或基本上等摩尔数量的N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在以中性蛋白酶作为酶的作用下进行，初始pH值是从4.5至6.0，反应时有占反应混合物总重量3-25%的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐存在。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于，初始pH值是从4.7到5.5的范围。
3、根据权利要求1～2中任一项的方法，其特征在于，碱金属盐、碱土金属盐或铵盐的用量为10-18%。
4、根据权利要求1～3中任一项的方法，其特征在于，所用的碱金属盐或铵盐是氯化锂、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、氯化铵和/或硫酸铵。
5、根据权利要求1～4中任一项的方法，其特征在于，偶合反应在有占反应混合物总重量0.08%至1.5%、特别是从0.15%至0.75%的酶（活性蛋白质）存在下进行。
6、根据权利要求1～5中任何一项的方法，其特征在于使用溶解的酶。
7、根据权利要求1～6中任何一项的方法，其特征在于，所用的N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯摩尔比在从1∶0.7到0.7∶1的范围内。
8、根据权利要求7的方法，其特征在于，N-苄氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯的摩尔比在1∶0.8至1∶1的范围内。
9、根据权利要求1～8中任何一项的方法，其特征在于，偶合反应的含水反应体系的pH保持低于6.2，最好是低于5.7。
10、根据权利要求1～9中任何一项的方法，其特征在于，在进行偶合反应时，至少在偶合过程的部分时间内反应混合物保持运动状态。
11、根据权利要求1～10中任何一项的方法，其特征在于，至少在偶合过程的部分时间内用摇动的方法使反应混合物保持运动。
12、根据权利要求1～11中任何一项的方法，其特征在于，偶合反应以半连续的方式进行，在初始反应混合物的转化率至少达到60%时，开始连续取出沉淀物，同时基本上按照化学计量比补加起始物。
13、根据权利要求1～12中任何一项的方法，其特征在于，在转化率达到20-60%之前的第一部分偶合过程是在静止状态下进行，在随后的偶合过程的至少一部分时间内保持反应混合物处于运动状态。
14、基本上如正文和实施例中所述的制备N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法。
15、根据权利要求1～14中任何一项的方法可以得到的N-苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
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