Nouveaux composés d'addition d'un dérivé de dipeptide et d'un dérive; d'amino-acide, et leur procédé de préparation et de décomposition.
La présente invention concerne de nouveaux composes d'addition d'un dérivé de dipeptide et d'un dérivé d'amino-acide ainsi qu'un procédé de prépa-
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ration de ces composes d'addition. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux composés d'addition de dipeptides constitués de résidus d'ester de N-substitué monoamino-acide dicarboxylique et de résidus d'ester d'amino-acide carboxylique, avec des esters d'amino-acide carboxylique ainsi que les procédés de préparation de ces composés d'addition en utilisant une réaction enzymatique et de décomposition de ces composés d'addition.
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utiliséespour former des liaisons peptides comme réaction inverse de la décomposition des protéines. Par exemple, Bergman a préparé des anilides en utilisant la papaïne et les synthèses de peptide utilisant des monoamino-acides monocarboxyliques tels que la leucine possédant un groupe benzoyl protecteur du N-terminal et la leucine et la glycine ensemble possédant un groupe anilide ou amide protecteur du C-terminal ont été obtenuespar Fruton avec la papaïne et la chymotrypsine. (Advances in Protein Chemistry Vol. 5, page 33 (1949). Académie Press Inc. New York, N.Y.)
Récemment, quelques inventeurs ont rapporté des synthèses de peptides
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Dans ces procédés, les produits sont déposés dans un milieu aqueux comme produits insolubles dans l'eau obtenus par la perte des groupes solubles dans l'eau (ceci est nécessaire pour forcer la réaction réversible vers la formation des peptides). En conséquence, quand un groupe soluble dans l'eau doit être maintenu dans le produit de réaction, par exemple, comme dans le cas où les amino acidespossédant un second groupe carboxylique sur la chaîne latérale
(par exemple, acide aspartique et acide glutamique) sont utilisés comme produits de départ, on a admis qu'il était souhaitable que le groupe soluble dans l'eau du produit de départ soit masqué avec un groupe protecteur moins hydrophile.
La demanderesse a poursuivi ses études sur ces systèmes et a trouvé que, lorsque l'on utilise comme produits de départ des monoamino-acides carboxyliques tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique qui possèdent un groupe protecteur N-terminal, les peptides résultants ne sont pas eux-mêmes déposés, et que lorsque l'on choisit comme produits de départ pour la contrepartie des amino-acides spécifiques possédant un groupe ester C-terminal (ester d'amino acide carboxylique), les composés d'addition des dipeptides qui sont les produits de la réaction enzymatique et les esters d'amino-acide sont déposés.
On sait que les dérivés de peptides possèdent diverses activités physiologiques, et que ces dérivés de peptides peuvent être préparés par diverses méthodes. Les peptides possédant un résidu amino-acide de caractère acide tel
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composé d'adoucissement, peuvent être obtenus à partir d'un précurseur possédât un.groupe benzyloxycarbonyle comme groupe protecteur du N-terminal en éliminant le groupe protecteur.
Les peptides possédant un groupe protecteur N-terminal tel que
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sont facilement hydrolysés, ce qui conduit à des peptides possédant un simple groupe carboxyle C-terminal et ces peptides hydrolyses ont été utilisés comme substrats pour mesurer l'activité enzymatique d'une carboxypeptidase.
Les esters de dipeptide N-protégés ou non protégés peuvent être obtenus par réaction d'un anhydride d'amino-acide de caractère acide possédant un groupe amino protégé ou non protégé avec un alkyle ester d'amino-acide (Japanese Patent Publication No. 14217/1974 and Japanese Unexamined Patent Publication Nos.
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Cependant, des esters de dipeptides souhaités ne sont pas facilement obtenus par les procédés classiques, puisque selon ces procédés, les esters de dipeptide possédant des liaisons peptides sur les groupes carboxylesde la chaîne latérale des amino-acides de caractère acide sont inévitablement produits avec ceux que l'on désire.
La présente invention a pour but de fournir des composés d'addition répondant à la formule :
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dans laquelle R.. représente un groupe aliphatique oxycarbonyle, benzyloxycarbonyle qui peut posséder des substituants sur le noyau ou un groupe benzoyle, aromatique sulfonyle ou aromatique sulfinyle ; R2 représente un groupe méthyle, isopropyle, isobutyle, isoamile ou benzyle ; R3 représente un groupe alcoxyle inférieur, benzyloxy, benzhydryloxy et n représente 1 ou 2.
Les composés d'addition répondant à la formule (I) comprennent les unités fragmentaires de formule :
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qui peuvent être sous forme LL, ainsi que de formule :
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dans les formules (II) et (III) possédant la même signification que dans la formule (I).
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de préparation de ces composés d'addition. Les composés d'addition sont préparés
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formule :
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avec un ester d'un amino-acide carboxylique répondant à la formule :
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dans lesquelles R., R2 et R3 ont la même signification que dans la formule (I), dans un milieu aqueux en présence d'une protéase, en faisant réagir l'ester de dipeptide résultant avec l'amino-acide carboxylique et en séparant le composé d'addition. Le N-substitué monoamino acide dicarboxylique répondant à la formule (IV) et les esteis domino-acides répondant à la formule (V) sont sous forme L ou DL.
En outre, la présente invention a pour but de fournir un procédé pour effectuer le dédoublement optique des N-substitués monoamino acides diearboxyliques de formule (IV) et de l'ester d'amino-acide de formule (V).
La présente invention a encore pour but de fournir un procédé de décomposition des composés d'addition. Les composés d'addition sont traités avec une solution de caractère acide.afin de séparer le constituant solide pour <EMI ID=14.1>
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méthoxybenzyloxycarbonyle sont dissous dans un milieu liquide et traités avec un acide pour préparer des esters de dipeptide ayant un simple groupe amino de formule :
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phényl alanine qui possèdent un goût sucré comme le sucre. Le méthyl ester de
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celui du sucre dans un de ses objectifs spécifiques.
Dans la formule (I) des composés d'addition selon la présente invention, le squelette de l'acide aspartique est donne dans le cas où n = 1 et le squelette de l'acide glutamique est donné dans le cas où n = 2.
Dans la formule (I) des composés d'addition selon la présente invention, R. comprend les groupes aliphatiques oxycarbonylestels que le groupe
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o-nitrosulfinyle.
Dans la formule (I), le squelette alanine est donné dans le cas où R2 = un groupe méthyle ; le squelette valine est donné dans le cas où R2 = un
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butyle et le squelette isoleucine est donné dans le cas où R2= un groupe isoamyle
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<EMI ID=25.1> inférieur comme les groupes méthoxy (CH30-) ; éthoxy (C2H50-) ; propoxy (C3H70-);
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R ; benzyloxycarbonyle et p-méthoxybenzyloxycarbonyle,
R2 : benzyle,
R3 : méthoxy et éthoxy.
Les composés d'addition selon la présente invention présentent les caractéristiques raisonnablement attendues de la formule sI). Par exemple, un composé d'addition typique obtenu par la réaction de l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et du méthyl ester de la L-phénylalanine, présente les absorp-
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Spectre infrarouge
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monosubstitué vibration hors du plan).
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Les données de l'analyse élémentaire du composé d'addition sont prati-
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benzyle et méthyle et n est égal à 1.
Quand le composé d'addition est traité avec un acide fort tel que l'acide chlorhydrique et que le produit est extrait avec un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle, on obtient un composé de caractère acide de la couche organique. Quand le composé d'addition.typique indiqué ci-dessus est ainsi traité, le composé de caractère acide résultant présente les caractéristiques et les propriétés attendues comme le composé représenté dans la formule
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d'addition typique mentionné ci-dessus.
<EMI ID=35.1> d'addition typique mentionné ci-dessus est réduit catalytiquement avec de l'hydrogène, le produit est le méthyl ester de la LL-aspartyl-phénylalanine.
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Les résultats correspondants identiques sont également obtenus dans
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Quand les composés d'addition selon la présente invention sont traités
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le produit est extrait avec un solvant organique, on peut obtenir les composés répondant à la formule (VI). D'autre part, l'ester de l'amino-acide carboxylique sous la forme L, D ou principalement D, peut être récupéré de la phase aqueuse, et ainsi l'isomérie optique des esters récupérés dépend de celle des unités fragmentaires montrées dans la formule (III) des composés d'addition.
Dans ce cas, la quantité du composé possédant la formule (VI) est équivalente à l'ester de l'amino-acide carboxylique résultant possédant la formule
(III), et ainsi il est clair que le composé original est le composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique (1:1) qui
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Les composés d'addition selon la présente invention peuvent avoir de l'eau de cristallisation. Les composés d'addition selon la présente invention sont remarquablement utiles en tant qu'intermédiaires dans les synthèses de peptides.
Comme indiqué ci-dessus, quand le composé d'addition selon la présente invention est traité avec un acide fort tel que l'acide chlorhydrique, et que le produit est extrait avec un solvant organique, on peut obtenir le dipeptide possédant un groupe protecteur pour le groupe amino. Quand le groupe protecteur
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l'hydrogénation catalytique, on peut obtenir l'ester du dipeptide possédant
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le groupe benzyle et R3 est un groupe alcoxy inférieur, particulièrement le groupe méthoxy, peuvent être utilisés comme matière sucrante.
Le peptide possédant un groupe protecteur N-terminal et un simple groupe carboxyle C-terminal, qui peut dériver de l'ester du dipeptide possédant un groupe protecteur pour le groupe amino selon une technique d'hydrolyse classique,est également utile.
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utilisée comme substrat pour mesurer l'activité enzymatique d'une carboxypepti- <EMI ID=44.1>
La présente invention fournit également des composés d'addition par réaction d'un N-substitué monoamino-acide dicarboxylique avec un ester d'un aminc-acide carboxylique en présence d'une protéase et liaison de l'ester de dipeptide résultant à l'ester de l'amino-acide carboxylique et récupération du composé d'addition.
Ceci étant, l'un des procédés de la présente invention est de préparer le composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique de formule (I) par réaction d'un N-substitué monoamino-acide dicarboxylique de formule (IV) avec un ester d'amino-acide de formule (V) dans un milieu aqueux en présence d'une protéase dans un domaine de pH ou la protéase exerce une activité enzymatique, par liaison de l'ester de dipeptide résultant à l'ester de l'amino-acide carboxylique et séparation du composé d'addition.
Les composés de départ, lies N-substitués monoamino-acides dicarboxyliques sont l'acide N-substitué aspartique dans le cas où n = 1 et l'acide N-substitué glutamique dans le cas où n = 2.
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groupe amino dans la réaction selon la présente invention. Il est nécessaire
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après la réaction, il est nécessaire que R soit éliminé sans affecter le squelette du produit.
aqueux
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un groupe empêchant le dépôt tel qu'un groupe acide sulfonique qui accroît fortement la solubilité dans l'eau du produit.
Les N-substitués monoamino-acides carboxyliques utilisés dans la présente invention peuvent facilement être obtenus en introduisant le groupe protecteur R sur le monoamino-acide dicarboxylique par des procédés classiques.
Les esters d'amino-acides carboxyliques utilisés comme autres composés de départ sont des esters d'amino-acides possédant un groupe hydrophobe sur la
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méthyle ; des esters de la valine dans le cas où R2 = groupe isopropyle ; des
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qui donne les esters de la phénylalanine en tant qu'ester amino-acide est le
cas le plus typique.
Les protéases utilisées dans la présente invention sont de préférence des métalloprotéases qui possèdent un ion métallique dans le centre actif. Des métalloprotéases convenables sont des enzymes provenant de micro-organismes, tels que des protéases neutres de ray fungus, Prolisine,Thermolycine,Collagénase, Cortulus atrox protéase, etc... Il est également possible d'utiliser des enzymes bruts tels que Thermoase, Tacynase-N, Pronase, etc... Afin d'empêcher l'action de l'estérase contenue dans les enzymes bruts, il est préférable d'utiliser un inhibiteur d'enzyme tel qu'un inhibiteur de pomme de terre avec les enzymes bruts. Il est possible d'utiliser des thiol protéases telles que
la papaïne, ou des sérine protéases telles que la trypsine, cependant elles possèdent une activité d'estérase. C'est pourquoi, -cn doit faire attention lorsque l'on effectue la réaction en utilisant un tel enzyme d'empêcher l'hydrolyse des esters.
Dans les synthèses selon la présente invention, la réaction de formation de liaison peptide est réalisée dans un milieu aqueux, de préférence des solutions aqueuses, dans des conditions de pH où la protéase exerce son activité enzymatique.
La réaction pour former le composé d'addition du peptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique est également fonction du pH. Il est préférable
de réaliser les réactions selon la présente invention dans un domaine de pH d'environ 4 à 9, particulièrement d'environ 5 à 8. En conséquence, les composés de départ, à savoir les N-substitués monoamino-acides dicarboxyliques et les esters de l'amino-acide carboxylique peuvent être sous forme libre ou sous forme de sel, cependant, lorsqu'ils sont tous les deux dissous dans le milieu aqueux, il est nécessaire d'ajuster le pH dans ledit domaine.
Des agents convenables pour ajuster le pH comprennent des acides minéraux ou organiques et des bases tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide acétique ; les hydroxydes de métal alcalin tels que l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium :les carbonates de métal alcalin tels
que le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de potassium et le bicarbonate de potassium ; des amines organiques et inorganiques telles que l'ammoniac, la triméthylamine, la triéthyl amine, l'éthanol amine, etc...
Les quantités d'ions d'hydrogène et d'ions hydroxy libérais dans la réaction sont équivalentes et ainsi la variation du pH-dans la réaction n'et pas élevée. Aussi, afin d'empêcher la variation du pH, il est possible d'utiliser un agent tampon. Dans le procédé industriel, il convient de contrôler le pH '
en utilisant un appareil de réglage du pH en réponse à un appareil de détection du pH.
Le milieu aqueux est généralement une solution aqueuse. Il est possible d'ajouter un solvant organique miscible à l'eau au milieu aqueux dans la mesure où le solvant n'empêche pas le dépôt du produit.
La réaction selon la présente invention s'effectue dans un domaine de température allant d'environ 10 à 90[deg.] C, de préférence 20 à 50[deg.] C, et ceci dans l'optique de maintenir l'activité enzymatique. La réaction est généralement <EMI ID=52.1>
pas critique.
Les concentrations de l'ensemble des produits de départ dans le milieu de réaction ne sont pas critiques. Le procédé selon la présente invention
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sont de préférence plus élevées. Les solubilités des composés d'addition dans l'eau sont relativement faibles. Par exemple, la solubilité du composé d'addi-
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En conséquence, les concentrations peuvent être relativement faibles et géné-
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Le rapport des composés de départ utilisé n'est pas critique.
Cependant, la réaction selon la présente invention est de lier une molécule de ::-substitué monoamino-acide dicarboxylique à 2 molécules d'ester
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produits de départ est 1 : 2, et le rapport réellement utilisé se situe généralement dans un domaine de 100 : 1 à 1 : 100, de préférence 5 : 1 à 1 : 5, plus particulièrement 2 : 1 à 1 : 3.
Il n'est pas toujours nécessaire de dissoudre toutes les quantités des produits de départ dans le milieu aqueux, et il est possible de mettre en suspension des quantités partielles des composés de départ puisque les concentrations des produits de départ diminuent comme la réaction avance, et ainsi les produits de départ en suspension sont progressivement dissous.
Dans ce cas, il peut se produire une variation du pH et il est alors nécessaire d'ajuster le pH de la solution alors que la réaction se poursuit.
La quantité de protéase utilisée dans le procédé selon la présente invention n'est pas critique. Quand la concentration de l'enzyme est élevée, la réaction peut être achevée dans un temps court. Quand la concentration de l'enzyme est faible, le temps de la réaction est prolongé. Ainsi, elle se
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La réaction de formation de liaison peptide selon la présente invention se produit seulement sur les isomères L et non sur les isomères D. Par ailleurs, les esters d'amino-acides utilisés pour réaliser la réaction de l'addition afin de former les composés d'addition peuvent être soit sous forme L, ou sous forme D ou un de leursmélanges. Quand on utilise l'ester amino-acide carboxylique sous forme DL, l'isomère L de l'ester de l'amino-acide carboxylique dans la solution est consommé dans les synthèses de peptide et'ainsi l'ester d'amino-acide restant possédant la forme D prédominante est utilisé pour la <EMI ID=59.1> production du composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique.
La réaction selon la présente invention se fait dans des rendements pratiquement quantitatifs lorsque les concentiations des produits de départ sont élevées.Quand deux moles des esters d'amino-acides carboxyliques sous forme DL sont utilisées pour une mole de N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme L, on peut obtenir le composé d'addition pratiquement composé de l'ester de dipeptide LL et de l'ester de l'amino-acide carboxylique D. Ainsi, le
composé d'addition résultant peut être facilement divisé en deux composés à savoir l'ester de dipeptide LL et l'ester de l'amino-acide D comme décrit cidessus.
En conséquence, la production de l'ester de dipeptide et le dédoublement optique de l'ester de l'amino-acide carboxylique DL peuvent être obtenus simultanément dans ce procédé.
L'ester de l'amino-acide sous la forme D séparée ou sous la forme D prédominante peut être racémisé selon un procédé classique et le procédé peut être utilisé comme produit de départ pour le procédé selon la présente invention.
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sous la forme DL et l'ester de l'amino-acide sous la forme L, l'isomère D du N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous la forme DL est inerte pour rester dans le milieu aqueux et ainsi on peut obtenir le composé d'addition de l'ester de dipeptide LL et de l'ester de l'amino-acide carboxylique L. En conséquence, quand le N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme D est récupéré du milieu aqueux, il est possible d'obtenir simultanément la production des composés d'addition et le dédoublement optique du N-substitué DL monoaminoacide dicarboxylique. Quand le N-substitué-D-monoamino-acide dicarboxyliquc récupéré est racémisé selon un procédé classique, on peut utiliser le produit comme produit de départ.
Quand on utilise le N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme DL et l'ester de l'amino-acide carboxylique sous la forme DL, on peut obtenir du milieu aqueux le N-substitué DL monoamino-acide dicarboxylique et
on peut obtenir le composé d'addition de l'ester dipeptide LL et de l'ester
du D-amino-acide carboxylique , lequel peut être divisé en composants tels qu'in-
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optique du N-substitué DL monoamino-acide dicarboxylique et de l'ester du DL amino-acide carboxylique peuvent être simultanément atteints.
Selon le procédé de la présente invention, il est possible d'éliminer les étapes d'introduction et d'élimination d'un groupe protecteur pour le groupe carboxyle dans la chaîne latérale qui avaient été considérées comme indispensables dans les procédés classiques. En conséquence la perte des produits de départ
peut être éliminée. Le rendement des produits peut être remarquablement élevé <EMI ID=62.1>
Dans le procédé selon la présente invention, on peut utiliser des composés de départ sous forme DL. Dans les procédés classiques utilisant un enzyme, l'isomère D des composés de départ sous forme DL ne sont pas utiles dans la réaction bien qu'ils n'affectent pas cette réaction, c'est pourquoi ils tendent à provoquer
la perte des produits de départ. Or, dans le procédé selon la présente invention, les composés de départ du type D peuvent être utilisés effectivement comme
agent pour déposer le dipeptide et il peut être récupéré ensuite.
Dans le procédé selon la présente invention, le dédoublement optique
du N-substitué DL amino-acide dicarboxylique et de l'ester DL amino-acide carboxylique peut être obtenu simultanément.
Cette invention fournit en outre des procédés pour décomposer les composés d'addition. Les composés d'additon répondant à la formule(I)sont mélangés avec une solution de caractère acide aqueuse et les esters de dipeptide de
formule (VI) sont ensuite récupérés par séparation sous forme de solide restant.
Les constituants de caractère acide de la solution aqueuse de caractère acide peuvent être des acides minéraux ou organiques. Les acides minéraux convenables comprennent l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. Les acides organiques convenables comprennent l'acide formique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide toluènesulfonique etc. Le concentration de l'acide n'est pas critique et peut être choisie
suivant les autres conditions.
Le constituant de caractère acide dans la solution aqueuse de caractère
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que ou plus à savoir de 1 à 100 eq. de préférence de 1 à 20 eq. plus particuliè-
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caractère acide est utilisé pour ioniserl'unité de l'ester de l'amino acide carboxylique pour donner une solution aqueuse de son sel.
Dans quelques cas, l'ester de dipeptide (VI) ne nécessite pas une pureté élevée. Dans un tel cas, il est possible d'utiliser une quantité du cons-
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il peut être, par exemple, d'environ 0,8 eq. pour une mole du composé d'addition
(I).
La proportion de la solution aqueuse de caractère acide auc produits
de départ peut se situer dans un domaine où l'ester.de dipeptide (VI) peut exister sous forme solide puisque l'ester de dipeptide résultant (VI) est séparé comme solide.
Cependant, les esters de dipeptide (VI) possèdent une faible solubilité dans l'eau ou dans la solution aqueuse de caractère acide, par exemple, c'est le
<EMI ID=66.1> dont la solubilité est de 0,028 g/100 g d'eau et de 0,017/100 g d'acide
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solution aqueuse de caractère acide peut être relativement élevée. Dans le
procédé selon la présente invention, par ailleurs, le composé d'addition
(I) est mis en contact avec la solution aqueuse de caractère acide afin
de se trouver dans une condition de séparation solide-liquide. En conséquence,
il n'est pas souhaitable d'utiliser des proportions trop faibles. Des quantités convenables de la solution aqueuse acide se situe dans le domaine de 1,5 à 50 parties en poids, de préférence de 2 à 10 parties en poids , pour 1 partie
en poids du composé d'addition (I).
La température pour faire réagir le composé d'addition (I) avec la solution aqueuse de caractère acide se situe généralement dans un domaine
allant de 0 à 100[deg.]C, de préférence de 5 à 80[deg.]C. Quand l'agitation du mélange
est suffisante, la décomposition du composé d'addition(I) est achevée au bout d'environ 10 minutes.
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de contrôler le temps de réaction et la température de réaction avec précausion afin d'éviter l'élimination de ce groupe.
Selon le procédé, le composé d'addition est décomposé pour produire l'ester de dipeptide (VI) et un sel de l'ester de l'amino acide (V) avec un consti- tuant acide de la solution acide aqueuse. Une partie substantielle de
l'ester de dipeptide (VI) est à l'état solide après la réaction de décomposition, puisqu'il possède une faible solubilité dans la solution acide aqueuse comme indiqué ci-dessus. Comme le sel est bien dissous dans la solution, le système
de réaction devient un mélange de l'ester de dipeptide solide et de la solution de sel qui peut contenir un excès du constituant acide. L'ester de dipeptide solide résultant 'peut être séparé d'une manière classique telle que filtration ou centrifugation. De la solution de sel séparé-, on peut récupérer l'ester de l'amino acide d'une manière conventionnelle telle que cristallisation ou extrac- tion par solvant après la libération de l'ester de l'amino acide.
Selon ce procédé, l'ester de dipeptide (VI) peut être facilement préparé et séparé en décomposant le composé d'addition (I) et ceci sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des étapes compliquées d'extraction et de traitement par une résine échangeur d'ion. Le rendement et la pureté de l'ester de dipeptide
(VI) peuvent être remarquablement élevés.
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utilisés comme matière sucrante sera illustrée.
L'autre procédé de décomposition du composé d'addition (VI) dans un
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ester de la phénylalanine (1 : 1) est dissous dans un milieu liquide et décomposé avec un acide dans le milieu liquide pour obtenir l'ester de dipeptide possédant un'simple groupe amino de formule (VII) .
Des milieux liquides convenables utilisés pour dissoudre le composé
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cétones telles que l'acétone ; des solvants organiques contenant de l'oxygène
tels que le dioxane et le tétrahydrofurane ; des hydrocarbures inférieurs chlorés tels que le chloroforme, le dichlorure de méthylène, le dichlorure d'éthylène ; des solvants organiques polaires non protoniques tels que le diméthyl formamide, le diméthyl sulfoxyde et des acides carboxyliques liquides tels
que l'acide acétique et l'acide formique. On peut utiliser un mélange de deux
ou plusieurs solvants.
Il est possible d'utiliser des esters tels que l'acétate d'éthyle -et des alcools tels que le méthanol, l'éthanol et le propanol. Quand on utilise
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secondaire indésirable telle que la réaction de transestérification ou l'estérification vis-à-vis du groupe carboxyle.
Le composé d'addition possède une faible solubilité dans l'eau.
En conséquence, l'eau elle-même n'est pas convenable comme milieu liquide
dans ce cas bien qu'il soit possible d'ajouter de l'eau au milieu liquide
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vis-à-vis du milieu liquide.
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liquide et de la faculté de dissolution vis-à-vis du composé d'addition et
elle est généralement supérieure à 10 parties en poids, et de préférence elle
se situe dans un domaine de 20 à 100 parties en poids pour une partie en poids du composé d'addition.
Les acides utilisés pour décomposer le composé d'addition sont des acides de Bronsted de préférence des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique,l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide perchlorique et des acides organiques tels que l'acide trifluoro acétique, l'acide p-toluène sulfonique, etc.
La proportion de l'acide par rapport au composé d'addition est de
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valents ou plus de l'acide pour une mole du composé d'addition.
La concentration de l'acide dans le milieu liquide se situe généralement dans un domaine de 0,1 à 10 N, de préférence de 1 à 5 N et il est souhaitable de décider-de la concentration réelle en considérant les autres conditions de réaction puisque la réaction peut également dépendre.du temps
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Cependant, des concentrations élevées excédant les domaines ci-dessus qui peuvent provoquer des réactions secondaires indésirables telles que l'hydrolyse des esters doivent être évitées.
L'acide peut être aqueux ou anhydre. Quand le milieu liquide non miscible à l'eau tel qu 'un hydrocarbure chloré est utilisé il est préférable d'utiliser un acide anhydre puisque si l'on utilise un acide aqueux il se forme
deux phases ce qui conduit à une réaction très lente.
La température et le temps de réaction ne sont pas critiques et généralement la réaction s'effectue de 20 à 100[deg.]C pendant 10 minutes à 6 heures.
Quand on utilise l'acide dans une concentration plus faible, le
temps de réaction peut être plus long ou la température de réaction plus élevée. Quand le concentration de l'acide est plus élevée, il est souhaitable de choisir un temps de réaction plus court ou une température de réaction plus faible.
Après décomposition du composé d'addition, l'ester de dipeptide résul-
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acide (V) peuvent être séparés par les procédés suivants. Par exemple, après la réaction, 1 'alcool d'anis est extrait dans une phase solvant formée en ajoutant à la solution de réaction des quantités convenables d'eau et d'un solvant susceptible de former une phase séparée avec l'eau tel que le chloroforme et
le diéthyl éther puis en mélangeant et en laissant reposer pour obtenir deux phases du solvant et de l'eau. Par ailleurs, le pH de la phase aqueuse est ajusté de 5 à 6 avec une base telle que NaOH, NaHCO , Na2C03, l'ammoniaque la triéthyl amine etc. et l'ester de dipeptide déposé possédant le groupe amino simple (VII) est séparé par filtration ou analogue.. Le pH du filtrat est ensuite ajusté de 8 à 10 avec la base et l'alkyl ester de phénylalanine libre résultant
<EMI ID=80.1>
etc. L'ester de dipeptide possédant le groupe amino simple et l'ester de l'amina :
acide peuvent également être facilement récupérés par des procédés classiques
en utilisant une résine échangeur de cation.
Les techniques de dédoublement optique discutées ci-dessus sont également appliquées dans ce cas.
<EMI ID=81.1>
alkyle inférieur, plus particulièrement méthyle ou éthyle et 1.
Selon le procédé, l'élimination de l'unité fragmentaire de l'amino-acide <EMI ID=82.1>
carbonyle.de l'ester de dipeptide peuvent être obtenus simultanément. L'alcool d'anis séparé peut être récupéré et transformé en un agent de p-méthoxybenzyloxycarbonylation en le faisant réagir avec du phosgène.
La présente invention sera illustrée par certains exemples qui sont seulement donnés à titre d'illustration.
Exemple 1
1 335 mg (5 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et
1 078 mg (5 m moles) de chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 20 ml d'eau sont ajoutés pour les
<EMI ID=83.1>
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine
<EMI ID=84.1>
méthyl ester de la L-phénylalanine (1:1) ; (Rendement : 75,5 % par rapport
au chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants.
<EMI ID=85.1>
Analyse élémentaire (C32H37N309)
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
téristiques que décrites ci-dessus.
<EMI ID=88.1>
extrait 3 fois avec 30 ml d'acétate d'éthyle.Les extraits sont mélangés
et lavés avec 20 ml d'eau (3 fois) et déshydratés avec du sulfate de magnésium anhydre. La solution est concentrée et la séparation à l'état de cristaux s'effec-
<EMI ID=89.1>
propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants.
Point de fusion : 115 à 125[deg.]C
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
Les spectres infrarouge et RMN présentent les caractéristiques attendues pour le méthyl ester de la N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine.
Les résultats coïncident avec ceux d'un composé obtenu par benzyloxycarbonylation du groupe amino du méthyl ester de la L-aspartyl-L-phénylalanine.
Le méthyl ester de la L-phénylalanine est récupéré à partir d'un mélange de la phase acide chlorhydrique et de la fraction d'eau de lavage séparée par l'extraction de la phase acétate d'éthyle..
En conséquence, il est confirmé que le composé obtenu par la réaction précédente est un composé d'addition du méthyl ester de la N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la L-phénylalanine. Il est
<EMI ID=93.1>
Exemple 2
<EMI ID=94.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 1 078 mg (5 m moles) du chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine, on ajoute 10 ml d'eau pour les dissoudre et on ajuste le pH à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine
<EMI ID=95.1>
ester de la L-phénylalanine (1 : 1) (rendement-: 99, 1 % par rapport au chlorhy-
<EMI ID=96.1>
Exemple 3
Selon le procédé de l'exemple 2 mais en faisant varier les quantités de l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et du méthyl ester de la L-phénylalanine à 534 mg (2 m moles) et 863 mg (4 m moles) respectivement on effectue la réaction
<EMI ID=97.1>
de la N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la Lphénylalanine (1 : 1). (point de fusion : 116 à 119[deg.]C ; rendement : 70,4 %
par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Exemple 4
Dans un ballon de 30 ml on introduit 534 mg (2 m moles) d'acide N-
<EMI ID=98.1>
ester de L-phénylalanine, on ajoute 8 ml d'eau pour les dissoudre et on ajuste le pH à 6,2 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et
<EMI ID=99.1>
de la solution et séché pour obtenir 1 099 mg d'un composé d'addition du méthyl ester -de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la L-phénylalanine (1 : 1) (rendement : 90,5 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Exemple 5
On dissout dans 5 ml d'une solution tampon de McIlvain (pH :7,0)
267,2 mg (1 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 537,6 mg
(3 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine.
<EMI ID=100.1>
d'inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant 20 heures. Le précipité est recueilli et lavé avec de l'eau et séché pour obtenir 580 mg d'un composé d'addition cristallin brut du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=101.1>
123 à 125[deg.]C ; rendement : 95,5 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-Laspartique.
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
acide sous forme H est ajoutée à la solution sous agitation vigoureuse puis la résine est séparée et le filtrat est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissous dans du diméthyl formamide et l'eau est ajoutée à la solution pour
<EMI ID=104.1>
point de fusion 123 à 125[deg.]C).
Exemple 6
. 267,2 mg (1 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 358,4 mg (2 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine sont dissous-dans 5 ml
<EMI ID=105.1>
La solution résultante est mélangée avec 100 mg de Tacynase N et
100 mg d'inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant 6 heures.
Le précipité est recueilli et lavé avec de l'eau'et séché pour donner 120 mg du composé d'addition cristallin brut du méthyl ester de N-benzyloxycarbonylL-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine (1 : 1)
(point de fusion : 119 à 123[deg.]C ; rendement : 19,7 %).
Selon le procédé de l'exemple 5, on traite le produit avec une résine échangeur de cation de caractère fortement acide sous forme
H pour obtenir 50 mg de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartylL-phénylalanine (point de fusion : 95 à 105[deg.]C; rendement : Il,7 %).
\
Exemple 7
1'335 mg (5 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl -L-aspartique et
1 078 mg (5 m moles) de methyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un
<EMI ID=106.1>
ajusté à 6,8 avec de la triéthylamine.
La solution résultante est mélangée avec 20 mg de Thermolysine et
<EMI ID=107.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
point de fusion : 120 à 12�[deg.]C
<EMI ID=108.1>
Analyse élémentaire :
<EMI ID=109.1>
Exemple 8
Selon le procédé de l'exemple 7, mais en ajustant le pH à 5,2 , on effectue la réaction et le traitement ce qui conduit à l'obtention de 753 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=110.1>
par rapport au méthyl ester de L-phénylalanine).
Exemple 9
133,6 mg (0,5 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 89,6 mg (0,5 m mole) de méthyl ester de L-phénylalanine sont dissous dans 2,5ml d'une solution tampon de Mcllvain (pH: 7,0) avec 0,07 ml de triétbylamine.
<EMI ID=111.1>
Thermoase et 50 mg d'un inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant
20 heures. Le précipité est recueilli par filtration, lavé avec de l'eau ce
<EMI ID=112.1> <EMI ID=113.1>
global 70 % par rapport à l'utilisation de 50 % de la quantité du méthyl ester de L-phénylalanine de départ).
Exemple 10
Selon le procédé de l'exemple 9 mais en utilisant 0,05 ml de N-méthyl morpholine à la place de 0,07 ml de triéthylamine, on effectue la réaction à
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
Le produit est.traité avec une résine échangeur de cation de caractère fortement acide sous forme H selon le procédé de l'exemple 9 pour obtenir
<EMI ID=116.1>
Exemple 11
<EMI ID=117.1>
et en agitant pendant 1 heure,on effectue la réaction pour obtenir 920 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-Lphénylalanine et de méthyl ester de L-phénylalanine (l : 1) (rendement 75,8 %).
Exemple 12
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et 5,5 ml de NaOH-lN sont ajoutés pour ajuster le pH à 7.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=120.1>
lalanine (1 : 1) (point de fusion 106 à 118[deg.]C ; rendement 60,5 %).
Exemple 13
<EMI ID=121.1>
,dans un ballon de 30 ml, 7 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et. le pH est ajuste à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 100 mg de Thermoase et agitée
<EMI ID=122.1>
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
(2 m mole) de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 4 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à
<EMI ID=125.1>
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermoase et agitée de
<EMI ID=126.1>
ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et d'un méthyl ester de
<EMI ID=127.1>
Exemple 15
<EMI ID=128.1>
inhibiteur de pomme de terre dans la solution pour la réaction, on effectue la réaction ce qui donne 381 mg du même produit (point de fusion 105 à 117[deg.]C ; rendement 62,7 %).
Exemple 16
<EMI ID=129.1>
(4 m moles) de chlorhydrate de méthyl ester de DL-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30. ml, 7 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,2 avec de l'ammoniaque à 7 % .
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de T-hermolysine et agitée
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
% par rapport à l'acide N-benzoylcarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et nhexane ce qui conduit à l'obtention du produit possédant les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire suivants :
Point de fusion : 127 à 135[deg.]C
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
On admet que le produit est le composé d ' addition du méthyl ester
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
les mêmes caractéristiques que le produit de l'exemple 1.
<EMI ID=136.1>
de dichlorure de méthylène 3 fois, la phase de dichlorure de méthylène est lavée avec de l'eau et déshydratée avec du sulfate de magnésium anhydre, le dichlorure de méthylène est éliminé par distillation et le constituant solide est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce
<EMI ID=137.1>
résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 124 à 132[deg.]C
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
alanine.
La phase aqueuse résiduelle d'extraction par un dichlorure de méthylène est mélangée avec du bicarbonate de sodium pour ajuster le pH à 8,7 et le pro-
<EMI ID=141.1>
té avec du sulfate. de magnésium anhydre, le chlorure d'hydrogène est introduit dans l'extrait pendait ; environ 10 minutes, la solution de chlorure de méthylène est concentrée et l'êthyl éther est ajouté à la solution pour recristalliser le produit ce qui donne 29,0 mg de chlorydrate de méthyl ester de D-phênylalanine.
<EMI ID=142.1>
(le spectre infrarouge et le spectre RMN : coïncident avec ceux de.la forme L).
En conséquence l'hypotèse du composé d'addition-est correcte.
<EMI ID=143.1>
de D-phénylalanine (l : 1)
Exemple 17
<EMI ID=144.1>
(4 m moles) de chlorhydrate de methyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau sont ajoutes pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
<EMI ID=145.1>
lavé avec 20 ml d'eau et séché ce qui donne 787 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl- L-phénylalanine
et de méthyl este.r de L-phénylalanine (l : 1) (point de fusion : 105 à 110[deg.]C ; rendement 64,8 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle
25
<EMI ID=146.1>
7,2 (C=l, méthanol).
Par ailleurs, on récupère l'acide N-benzyloxycarbonyl aspartique (principalement la forme D) de la solution de la réaction résiduelle.
Exemple 18
On répète l'exemple 17 mais en utilisant du méthyl ester de DL-phénylalanine à la place du methyl ester de L-phénylalanine pour obtenir 756 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phênylalanine et de méthyl ester de D-phénylalanine (1 : 1) (point de fusion : 105 à 111[deg.]C ; rendement 62, 3 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle
<EMI ID=147.1>
-6,5 (C=l, méthanol).
Par ailleurs, on récupère l'acide N-benzyloxycarbonyl aspartique (principalement la forme D) de la solution de réaction résiduelle.
Exemple 19
5,34 g (20 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 7,53 g
(42 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 100 ml et 70 ml d'eau sont ajoutés pour le dissoudre. On obtient une solution possédant un pH de 6,2 à 6,3.
La solution résultante est mélangée avec 200 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=148.1>
lavé avec 70 ml d'eau et séché ce qui donne 10,11 g de cristaux (point de fusion :
117 à 120[deg.]C). Il se confirme que le produit est un composé d'addition
<EMI ID=149.1> ester de L-phénylalanine (1 : 1) puisque le produit est recristallisé dans un
<EMI ID=150.1>
et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
<EMI ID=151.1>
Analyse élémentaire : C32H37N309
<EMI ID=152.1>
Les spectres infrarouge et RMN présentent les mêmes caractéristiques
que mentionnées ci-dessus pour le composé d'addition 1 : 1 de méthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine avec le méthyl ester de Lphénylalanine. Le produit est également traité avec un acide fort et extrait avec un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle ce qui est suivi par l'élimination du solvant organique par distillation pour donner le méthyl ester
<EMI ID=153.1>
nine est introduit dans un ballon de 30 ml et 2 ml d'eau et 2,0 ml de
HC1-1N sont ajoutés en agitant à température ambiante pendant 10 minutes. La bouillie résultante est filtrée et le précipité est lavé avec 4 ml d'eau et séché ce qui donne 0,72 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxyearbonyl-Laspartyl-L-phénylalanine (rendement 98,8 %).
Les cristaux résultants sont dissous dans de l'acétate d'éthyle et du n-hexane est ajouté pour recristalliser le produit- Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit final sont les suivants :
Point de fusion : 121 à 1240 C
<EMI ID=154.1>
Analyse élémantaire : C22H24N207
<EMI ID=155.1>
Le spectre infrarouge du produit coïncide avec celui du composé standard.
L'identification du produit est également confirmée par comparaison
d'une solution aqueuse du produit avec celle du composé standard dans une chromatographie liquide à grande vitesse. La puretée est mesurée suivant cette méthode pour être 100 %. L'appareil et les conditions de l'analyse chromatographique liquide à grande vitesse sont les suivants. Cette méthode est utilisée
Pour l'estimation de la pureté des produits de décomposition des composés d'addition dans les exemples suivants sauf indication contraire.
Les mêmes appareils et conditions sont utilisés dans les exemples dans la mesure eu ce procédé est concerné.
Appareil de chromatographie liquide à grande vitesse :
(TSK-HLC 801 fabriqué par Toyo soda K.K.)
Colonne : diamètre intérieur 7,5 mm x longeur 30 cm ;
<EMI ID=156.1>
170 fabriqué par Toyo Soda K.K.).
Eluant : Solution aqueuse d'acétate de sodium à 0,5 %
Débit : 0,8 ml/mn.
Perte de charge : 20 Kg/cm
Température de mesure : température ambiante
Détecteur : réfractomètre différentiel.
Exemple 20
1,00 g (1,65 m mole) du composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxy-
<EMI ID=157.1>
dans l'exemple 19 est introduit dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau et 1,32 ml de HC1-1N y sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante
<EMI ID=158.1>
0,70 g de cristaux prismatiques fins possédant un point de fusion de 100 à
126[deg.]C (teneur en méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine : 96,8 %).
Exemple 21
0,53� g (2 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 0,863 g
<EMI ID=159.1>
dans un ballon de 30 ml, 10 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=160.1>
d'eau puis séché ce qui donne 0,90 g de cristaux possédant un point de fusion de 120 à 126[deg.]C.
Une partie des cristaux est recristallisée dans un mélange de solvant acétate d' éthyJe et n-hexane pour obtenir le produit qui possède un point
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L� phénylalanine et du méthyl ester de phénylalanine ( 1 : l).
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
Alors le produit est traité avec un acide pour former du méthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méhtyl ester de D-phény:
alanine dans un rapport molaire de 1 : 1.
Il est confirmé, de ces résultats, que les cristaux résultants correspondent au composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=165.1>
0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition sont mélangés avec 4 ml
d'eau et 0,26 g d'acide citrique et le mélange est agité à température ambiante pendant 10 minutes et traité d'une manière similaire à celle de l'exemple 19
ce qui donne 0,35 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-Laspartyl-L-phénylalanine (puretée : 100 % ; rendement : 99,3 %).
Exemple 22
<EMI ID=166.1>
carbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine obtenu:
dans l'exemple 19 sont introduits dans un ballon de 30 ml, 4 ml d'eau et 0,24 g
(1,2 m mole) d'acide p-toluenesulfonique monohydrate sont ajoutés et traités par le procédé de l'exemple 19 pour obtenir 0,33 g de cristaux de méthyl
<EMI ID=167.1>
ment : 93,6 %).
Exemple 23
0,45 g (8,2 m moles) d'acide formique à 85 % et 8 ml d'eau sont introduit:
dans un ballon de 30 ml, 0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et.de méthyl ester de L-phénylalanine obtenus dans l'exemple 19 sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes puis le produit est filtré et lavé avec 10 ml d'eau et séché ce qui donne 0,312 g de cristaux blancs
de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (pureté :
100 % ; rendement : 88,6 %).
Exemple 24
0,47 g (8,2 m moles.) d'acide acétique glacial et 8 ml d'eau sont introduit dans un ballon de 30 ml, 0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition du méthyl
<EMI ID=168.1>
de L-phénylalanine sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant 30 minutes puis le produit est filtré et lavé avec 10 ml d'eau et séché
<EMI ID=169.1>
partyl-L-phénylalanine (pureté : 100 % ; rendement : 87,2 %).
Exemple 25
<EMI ID=170.1>
3 minutes puis traité d'une manière semblable à celle de l'exemple 19 pour obtenir 0,35 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-
<EMI ID=171.1>
Exemple 26
0,594 g ( 2 m moles) d'acide N-p-méthoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartique
<EMI ID=172.1>
sont introduits dans un ballon de 30 ml et NaOH-lN est ajouté pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=173.1>
lavé avec 10 ml d'eau-et séché ce qui donne 0,928 g de cristaux possédant un
<EMI ID=174.1>
phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine (1 : 1).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce qui. donne le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 72 à 76[deg.]C
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
Spectre infrarouge .
<EMI ID=177.1>
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
Ces résultats montrent que le produit est le compose d'addition de formule
<EMI ID=180.1>
3 minutes.
La bouillie résultante est filtrée.et lavée avec 6 ml d'eau puis séchée ce qui donne 0,38 g de cristaux.
H est confirmé des résultats suivants que le produit est le méthyl ester
<EMI ID=181.1>
ajouté pour recristalliser afin d'obtenir le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 128 à 130[deg.]C
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
Ces résultats montrent que le produit final est .le composé.de formule
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
aspartyl-L-phénylalanine résultant sont dissous dans 2 parties en poids d'acétone et 1 partie en poids d'HCl-4N est ajoutée à la solution résultante, puis le mélange est chauffé au bain marie à reflux doux pendant 1,5 heures pour le décomposer complètement afin de former une solution contenant les principaux constituants, méthyl ester de L-aspartyl-L-phénylalanine, méthyl ester de L-phénylalanine et alcool d'anis,solution de laquelle on obtient
le méthyl ester de L-aspartyl-L-phénylalanine.
Exemple 27
0,562 g (2 m moles) d'acide N benzyloxycarbonyl-L-glutamique et 0,860 g
<EMI ID=188.1>
ballon de 30 ml, du NaOH-1N est ajouté pour les dissoudres et le pH est ajusté à 6,0.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et
<EMI ID=189.1>
avec 10 ml d'eau puis séché ce qui donne 0,510 g de cristaux possédant un point de fusion de 80[deg.]C à 85[deg.]C.
Les résultats suivants confirment que le produit est un composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phénylalanine et du
<EMI ID=190.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce qui donne le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 92 à 97[deg.]C
<EMI ID=191.1>
Analyse élémentaire : C33H39N309
<EMI ID=192.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=193.1>
<EMI ID=194.1>
Ces résultats montrent que le produit est le composé d'addition de formule
<EMI ID=195.1>
et le mélange est agité ensuite à température ambiante pendant 15 minutes.
Le précipité blanc résultant est filtré et lavé avec 3 ml d'eau puis séché ce qui donne 0,683 g de cristaux.
Les résultats suivants confirment que le produit est le méthyl ester
<EMI ID=196.1>
95,8 %).
Les cristaux sont dissous dans de l'acétate d'éthyleet du n-hexane est ajouté pour recristalliser et obtenir le produit.
Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 97 à 99[deg.]C
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
Ces résultats montrent que le produit final est le composé de formule
<EMI ID=202.1>
peut être transformé par réduction avec de l'hydrogène en méthyl ester de Lglutamyl-L-phénylalanine et il peut également être transformé par hydrolyse
<EMI ID=203.1>
Exemple 28
Dans un ballon de 100 ml on introduit 0,686 g (3,12 m moles) de chlorhydrate
<EMI ID=204.1>
une solution aqueuse de NaOH-2N à la solution en : refroidissant avec de la glace et en agitant pour avoir un pH de 7,5, on ajoute graduellement 0,360 g
(1,44 m mole) d'anhydride d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique à la solution en agitant et en maintenant le pH de7,0 à 7,5 en ajoutant une solution aqueuse de NaOH-2N. Après l'addition, on agite encore le mélange pendant 2 heures, et on ajoute au mélange de réaction une solution aqueuse de HC1-1N pour avoir un pH de 6. Le précipité résultant est recueilli par filtration, lavé avec 50 ml
<EMI ID=205.1>
ester de L-phénylalanine (1 : 1) (point de fusion 108 à 115[deg.]C). Au cours de la réaction, une quantité considérable de méthyl ester de N-benzyloxycarbo-
<EMI ID=206.1>
reste dans le filtrat et l'eau de lavage.
Dans un bécher de 12 ml, on ajoute 0,200 g (0,329 m mole) du composé d'addition résultant à savoir le méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspar-
<EMI ID=207.1>
<EMI ID=208.1>
le mélange à température ambiante pendant 15 minutes.
Le précipité blanc résultant est filtré, lavé avec 3 ml d'eau et séché ce qui donne 0,136 g (rendement-96,3 %) de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (contenant 17 % de méthyl
<EMI ID=209.1>
fusion : 110[deg.]C à 118[deg.]C).
Exemple 29
Dans un ballon de 30 ml, on dissout dans 5 ml d'eau 0,543 g (2 m moles)
<EMI ID=210.1>
d'éthyl ester de N-phénylalanine, et on ajoute une solution aqueuse de NaOH- <EMI ID=211.1>
4N pour ajuster le pH à 6.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et le
<EMI ID=212.1>
Il est confirmé que le produit est le composé d'addition de l'éthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et de l'éthyl ester de L-phényla
<EMI ID=213.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane et les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 93 à 95[deg.]C
<EMI ID=214.1>
Analyse élémentaire : C34H41N309
<EMI ID=215.1>
Spectre infrarouge : 3 300 cm" (N-H vibration d'allongement) ;
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
et 1.
Dans un ballon de 30 ml, 0,125 g (0,197 m mole) du composé d'addition résultant d'éthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et
<EMI ID=221.1> <EMI ID=222.1>
bonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (pureté : 100 % ; rendement 92, 6 %). Les cristaux sont recristallisés dans un mélange de solvant acétate d'éthyleet nhexane ce qui conduit au produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 128 à 135[deg.]C
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=225.1>
Exemple 30
5,00 g (16,82 m moles) d'acide N-p-méthoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 7,26 g (33,64 m moles) dechlorhydrate de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 100 ml , une solution aqueuse de NaOH-lN est ajoutée pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0.
<EMI ID=226.1>
Le précipité est recueilli par filtration , lavé avec 100 ml d'eau puis
séché ce qui donne 8,11 g de cristaux possédant un point de fusion de 88 à
92[deg.]C. (rendement : 75,6 % en tant que composé d'addition du méthyl ester de N-p-
<EMI ID=227.1>
et n-hexane et les cristaux résultants présentent les caractéristiques physiques et les résultats de l'analyse élémentaire pratiquement identiques à ceux du composé d'addition préparé dans l'exemple 26.
<EMI ID=228.1>
Une partie du mélange de réaction est mélangée avec de l'eau, une solution aqueuse de NaHC03 1,2N et du cyclohexane comme standard interne pour préparer l'échantillon et la transformation en méthyl ester c�-L-aspartylL-phénylalanine est confirmée par la chromatographie liquideà grande vitesse. Le rendement est de 72,7
Exemple 31
<EMI ID=229.1>
sont obtenus dans l'exemples 30 sont introduits dans un ballon de 20 ml.
Selon le procédé de l'exemple 30 mais en utilisant du dioxane à la
place de l'acétone, on effectue la décomposition du composé d'addition et l'analyse du produit.
<EMI ID=230.1>
Exemple 32
Le procédé de l'exemple 31 est répété mais en utilisant du méthanol à la place du dioxane. Le rendement du méthyl ester d'c� - L-aspartyl-L-phénylalanine est de 63,3 %.
Exemple 33
On répète le procédé de l'exemple 31 mais en utilisant du N,N-dimêthylfor�
<EMI ID=231.1>
Exemple 34
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
Exemple 35
<EMI ID=234.1>
90[deg.]C pendant 20 minutes au lieu de 60[deg.]C pendant 1 heure. Le rendement de
<EMI ID=235.1>
Exemple 36
On répète le procédé de l'exemple 34 mais en utilisant 4,5 ml de dioxane et 0,5 ml-d'une solution HCl-dioxane (5,3 N) à la place de 4 ml et de 1 ml respectivement de ces composés ainsi qu'en effectuant la réaction à 90[deg.]C
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
Exemple 37
On répète le procédé de l'exemple 34 mais en utilisant 3 ml de dioxane <EMI ID=238.1> L-phénylalanine est de 98,6 %.. ;'
<EMI ID=239.1>
<EMI ID=240.1>
<EMI ID=241.1>
d'une solution dioxane-HCl (5,3N) respectivement. Le rendement du méthyl ester
<EMI ID=242.1>
Exemple 39
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
<EMI ID=246.1>
L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phênylalanine (1 : 1)
qui sont obtenus dans l'exemple 30 sont dissous dans 2 ml de dioxane, puis
3 ml d'acide trifluoroacétique sont ajoutés pour les faire réagir à 60[deg.]C pendant
1 heure.
Le mélange de réaction est soumis à évaporation sous pression réduite
puis de l'eau de la triéthylamine et de la cyclohéxanone en tant que standard
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
dioxane-HCl (5,3 N) sont introduits dans un ballon de 50 ml , et le mélange est agité à 60[deg.]C pendant 1 heure pour les faire réagir. Le dioxane est éliminé par distillation du mélange de réaction sous pression réduite, 6 ml d'eau et
<EMI ID=249.1>
en agitant puis les deux phases sont séparées. 10 ml.de diéthyl éther sont encore ajoutés à la-phase aqueuse pour extraire le produit d'une manière sembla- ble à ce qui est décrit ci-dessus. La dernière extraction est répétée 3 fois.
Les phases de diéthyl éther sont reçue illies et lavées avec 5 ml d'une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium.pendant 2 fois, et- déshydratées avec du sulfate de magnésium anhydre. Le diéthyl éther est éliminé par distillation sous pression réduite ce qui conduit à l'obtention de 0,1T6 g (rendement
81,2 %) d'alcool d'anis brut.
La phaqe aqueuse est neutralisée avec une solution aqueuse à 7 % d'hydro-
<EMI ID=250.1> toute la nuit. Les cristaux précipités résultants sont filtrés et lavés avec
2 ml d'eau puis séchés ce qui donne 0,316 g (rendement 68,5 %) de méthyl ester
"J
de L-aspartyl-L-phénylalanine brut.
<EMI ID=251.1>
<EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
<EMI ID=254.1>
de magnésium anhydre.
<EMI ID=255.1>
<EMI ID=256.1>
introduits dans un ballon de 30 ml puis dissous avec addition d'une solution
<EMI ID=257.1>
<EMI ID=258.1>
<EMI ID=259.1>
de méthyl ester de L-phénylalanine (l :1). Ceci est confirmé par les' analyses ci-dessous.
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant méthanol et
<EMI ID=260.1>
<EMI ID=261.1>
Point de fusion : 82 à 87[deg.]C
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1>
suivantes : Spectre infrarouge :
<EMI ID=265.1>
<EMI ID=266.1>
<EMI ID=267.1>
Ces résultats montrent que le produit est le composé d'addition de formule
<EMI ID=268.1>
benzy�, étoxy et 1.
<EMI ID=269.1>
résultant à la place du composé d'addition du méthyl ester de N-p-méthoxycar� bonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine avec le méthyl ester de L-phénylalanine pour préparer l'éthyl ester de L-aspartyl -L-phénylalanine. Le rendement d'éthyl.-
<EMI ID=270.1>
1,725 g (8 m moles) de chlorhydrate de méthyl ester de D L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml et dissous avec l'addition d'une solution
<EMI ID=271.1>
tes.
Le précipité est recueilli par filtration et lavé avec 30 ml d'eau
puis séché ce qui donne 2, 109 g de cristaux possédant un point de fusion de
119 à 128[deg.]C et le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate
<EMI ID=272.1>
de D-phénylalanine (1 : l) semi-hydrate et ceci grâce aux analyses indiquées ci-dessous.
Les caractéristiques physiques et les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants :
Point de fusion : 131 à 133[deg.]C
<EMI ID=273.1>
<EMI ID=274.1>
Les spectres infrarouge et RMN montrent les mêmes caractéristiques que
<EMI ID=275.1>
ppm du fait des perturbations provoquées par la présence de l'eau puisque le produit contient de l'eau de cristallisation comme expliqué ci-dessus.
Un échantillon de 1,5024 g du produit est chauffé par irradiation en micro-onde
<EMI ID=276.1>
L'analyse élémentaire de l'échantillon irradié donne les résultats suivants :
<EMI ID=277.1>
Les spectres infrarouge et RMN de l'échantillon irradié donnent les mêmes
<EMI ID=278.1>
26.
1,0 g de l'échantillon irradié est mélangé avec 4 ml d'eau et 2ml de HC1-lN puis le mélange résultant est agité à 60[deg.]C pendant 3 minutes. Après une séparation solide-liquide de la bouillie résultante, le méthyl ester de N-pméthoxycarbonyl-L-phénylalanine et le méthyl ester de D-phénylalanine sont récupérés dans un rapport molaire 1 : 1 de la phase solide et de .la phase liquide respectivement.
<EMI ID=279.1>
d'addition résultant (semi-hydrate au lieu du composé d'addition obtenu dans
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
Exemple 144
0,3 g du composé d'addition de méthyl ester de N-p-méthoxybenzyloxycarbo-
<EMI ID=282.1>
(0,31N).pour les faire réagir à 60[deg.]C pendant 2 heures. Le mélange de réaction est traité sous pression réduite pour éliminer par distillation les matières
<EMI ID=283.1>
internes sont ajoutés au résidu pour préparer un échantillon et. l'échantillon <EMI ID=284.1>
<EMI ID=285.1>
1. A titre de produits industriels nouveaux, les-composés d'addition de formule
<EMI ID=286.1>
<EMI ID=287.1>
benzyloxycarbonyle qui peut posséder des substituants nucléaire, un groupe
<EMI ID=288.1>
<EMI ID=289.1>
un groupe alcoxyle inférieur, benzyloxy ou benzhydryloxy et n représente 1 ou 2.
2. A titre de produits industriels nouveaux., les composés d'addition selon