Nouveaux composés d'addition d'un dérivé de dipeptide et d'un dérive; d'amino-acide, et leur procédé de préparation et de décomposition.
La présente invention concerne de nouveaux composes d'addition d'un dérivé de dipeptide et d'un dérivé d'amino-acide ainsi qu'un procédé de prépa-
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ration de ces composes d'addition. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux composés d'addition de dipeptides constitués de résidus d'ester de N-substitué monoamino-acide dicarboxylique et de résidus d'ester d'amino-acide carboxylique, avec des esters d'amino-acide carboxylique ainsi que les procédés de préparation de ces composés d'addition en utilisant une réaction enzymatique et de décomposition de ces composés d'addition.
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utiliséespour former des liaisons peptides comme réaction inverse de la décomposition des protéines. Par exemple, Bergman a préparé des anilides en utilisant la papaïne et les synthèses de peptide utilisant des monoamino-acides monocarboxyliques tels que la leucine possédant un groupe benzoyl protecteur du N-terminal et la leucine et la glycine ensemble possédant un groupe anilide ou amide protecteur du C-terminal ont été obtenuespar Fruton avec la papaïne et la chymotrypsine. (Advances in Protein Chemistry Vol. 5, page 33 (1949). Académie Press Inc. New York, N.Y.)
Récemment, quelques inventeurs ont rapporté des synthèses de peptides
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Dans ces procédés, les produits sont déposés dans un milieu aqueux comme produits insolubles dans l'eau obtenus par la perte des groupes solubles dans l'eau (ceci est nécessaire pour forcer la réaction réversible vers la formation des peptides). En conséquence, quand un groupe soluble dans l'eau doit être maintenu dans le produit de réaction, par exemple, comme dans le cas où les amino acidespossédant un second groupe carboxylique sur la chaîne latérale
(par exemple, acide aspartique et acide glutamique) sont utilisés comme produits de départ, on a admis qu'il était souhaitable que le groupe soluble dans l'eau du produit de départ soit masqué avec un groupe protecteur moins hydrophile.
La demanderesse a poursuivi ses études sur ces systèmes et a trouvé que, lorsque l'on utilise comme produits de départ des monoamino-acides carboxyliques tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique qui possèdent un groupe protecteur N-terminal, les peptides résultants ne sont pas eux-mêmes déposés, et que lorsque l'on choisit comme produits de départ pour la contrepartie des amino-acides spécifiques possédant un groupe ester C-terminal (ester d'amino acide carboxylique), les composés d'addition des dipeptides qui sont les produits de la réaction enzymatique et les esters d'amino-acide sont déposés.
On sait que les dérivés de peptides possèdent diverses activités physiologiques, et que ces dérivés de peptides peuvent être préparés par diverses méthodes. Les peptides possédant un résidu amino-acide de caractère acide tel
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composé d'adoucissement, peuvent être obtenus à partir d'un précurseur possédât un.groupe benzyloxycarbonyle comme groupe protecteur du N-terminal en éliminant le groupe protecteur.
Les peptides possédant un groupe protecteur N-terminal tel que
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sont facilement hydrolysés, ce qui conduit à des peptides possédant un simple groupe carboxyle C-terminal et ces peptides hydrolyses ont été utilisés comme substrats pour mesurer l'activité enzymatique d'une carboxypeptidase.
Les esters de dipeptide N-protégés ou non protégés peuvent être obtenus par réaction d'un anhydride d'amino-acide de caractère acide possédant un groupe amino protégé ou non protégé avec un alkyle ester d'amino-acide (Japanese Patent Publication No. 14217/1974 and Japanese Unexamined Patent Publication Nos.
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Cependant, des esters de dipeptides souhaités ne sont pas facilement obtenus par les procédés classiques, puisque selon ces procédés, les esters de dipeptide possédant des liaisons peptides sur les groupes carboxylesde la chaîne latérale des amino-acides de caractère acide sont inévitablement produits avec ceux que l'on désire.
La présente invention a pour but de fournir des composés d'addition répondant à la formule :
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dans laquelle R.. représente un groupe aliphatique oxycarbonyle, benzyloxycarbonyle qui peut posséder des substituants sur le noyau ou un groupe benzoyle, aromatique sulfonyle ou aromatique sulfinyle ; R2 représente un groupe méthyle, isopropyle, isobutyle, isoamile ou benzyle ; R3 représente un groupe alcoxyle inférieur, benzyloxy, benzhydryloxy et n représente 1 ou 2.
Les composés d'addition répondant à la formule (I) comprennent les unités fragmentaires de formule :
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qui peuvent être sous forme LL, ainsi que de formule :
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dans les formules (II) et (III) possédant la même signification que dans la formule (I).
La présente invention a également pour but de fournir un procédé de préparation de ces composés d'addition. Les composés d'addition sont préparés
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formule :
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avec un ester d'un amino-acide carboxylique répondant à la formule :
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dans lesquelles R., R2 et R3 ont la même signification que dans la formule (I), dans un milieu aqueux en présence d'une protéase, en faisant réagir l'ester de dipeptide résultant avec l'amino-acide carboxylique et en séparant le composé d'addition. Le N-substitué monoamino acide dicarboxylique répondant à la formule (IV) et les esteis domino-acides répondant à la formule (V) sont sous forme L ou DL.
En outre, la présente invention a pour but de fournir un procédé pour effectuer le dédoublement optique des N-substitués monoamino acides diearboxyliques de formule (IV) et de l'ester d'amino-acide de formule (V).
La présente invention a encore pour but de fournir un procédé de décomposition des composés d'addition. Les composés d'addition sont traités avec une solution de caractère acide.afin de séparer le constituant solide pour <EMI ID=14.1>
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méthoxybenzyloxycarbonyle sont dissous dans un milieu liquide et traités avec un acide pour préparer des esters de dipeptide ayant un simple groupe amino de formule :
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phényl alanine qui possèdent un goût sucré comme le sucre. Le méthyl ester de
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celui du sucre dans un de ses objectifs spécifiques.
Dans la formule (I) des composés d'addition selon la présente invention, le squelette de l'acide aspartique est donne dans le cas où n = 1 et le squelette de l'acide glutamique est donné dans le cas où n = 2.
Dans la formule (I) des composés d'addition selon la présente invention, R. comprend les groupes aliphatiques oxycarbonylestels que le groupe
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o-nitrosulfinyle.
Dans la formule (I), le squelette alanine est donné dans le cas où R2 = un groupe méthyle ; le squelette valine est donné dans le cas où R2 = un
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butyle et le squelette isoleucine est donné dans le cas où R2= un groupe isoamyle
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<EMI ID=25.1> inférieur comme les groupes méthoxy (CH30-) ; éthoxy (C2H50-) ; propoxy (C3H70-);
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R ; benzyloxycarbonyle et p-méthoxybenzyloxycarbonyle,
R2 : benzyle,
R3 : méthoxy et éthoxy.
Les composés d'addition selon la présente invention présentent les caractéristiques raisonnablement attendues de la formule sI). Par exemple, un composé d'addition typique obtenu par la réaction de l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et du méthyl ester de la L-phénylalanine, présente les absorp-
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Spectre infrarouge
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monosubstitué vibration hors du plan).
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Les données de l'analyse élémentaire du composé d'addition sont prati-
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benzyle et méthyle et n est égal à 1.
Quand le composé d'addition est traité avec un acide fort tel que l'acide chlorhydrique et que le produit est extrait avec un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle, on obtient un composé de caractère acide de la couche organique. Quand le composé d'addition.typique indiqué ci-dessus est ainsi traité, le composé de caractère acide résultant présente les caractéristiques et les propriétés attendues comme le composé représenté dans la formule
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d'addition typique mentionné ci-dessus.
<EMI ID=35.1> d'addition typique mentionné ci-dessus est réduit catalytiquement avec de l'hydrogène, le produit est le méthyl ester de la LL-aspartyl-phénylalanine.
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Les résultats correspondants identiques sont également obtenus dans
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Quand les composés d'addition selon la présente invention sont traités
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le produit est extrait avec un solvant organique, on peut obtenir les composés répondant à la formule (VI). D'autre part, l'ester de l'amino-acide carboxylique sous la forme L, D ou principalement D, peut être récupéré de la phase aqueuse, et ainsi l'isomérie optique des esters récupérés dépend de celle des unités fragmentaires montrées dans la formule (III) des composés d'addition.
Dans ce cas, la quantité du composé possédant la formule (VI) est équivalente à l'ester de l'amino-acide carboxylique résultant possédant la formule
(III), et ainsi il est clair que le composé original est le composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique (1:1) qui
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Les composés d'addition selon la présente invention peuvent avoir de l'eau de cristallisation. Les composés d'addition selon la présente invention sont remarquablement utiles en tant qu'intermédiaires dans les synthèses de peptides.
Comme indiqué ci-dessus, quand le composé d'addition selon la présente invention est traité avec un acide fort tel que l'acide chlorhydrique, et que le produit est extrait avec un solvant organique, on peut obtenir le dipeptide possédant un groupe protecteur pour le groupe amino. Quand le groupe protecteur
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l'hydrogénation catalytique, on peut obtenir l'ester du dipeptide possédant
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le groupe benzyle et R3 est un groupe alcoxy inférieur, particulièrement le groupe méthoxy, peuvent être utilisés comme matière sucrante.
Le peptide possédant un groupe protecteur N-terminal et un simple groupe carboxyle C-terminal, qui peut dériver de l'ester du dipeptide possédant un groupe protecteur pour le groupe amino selon une technique d'hydrolyse classique,est également utile.
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utilisée comme substrat pour mesurer l'activité enzymatique d'une carboxypepti- <EMI ID=44.1>
La présente invention fournit également des composés d'addition par réaction d'un N-substitué monoamino-acide dicarboxylique avec un ester d'un aminc-acide carboxylique en présence d'une protéase et liaison de l'ester de dipeptide résultant à l'ester de l'amino-acide carboxylique et récupération du composé d'addition.
Ceci étant, l'un des procédés de la présente invention est de préparer le composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique de formule (I) par réaction d'un N-substitué monoamino-acide dicarboxylique de formule (IV) avec un ester d'amino-acide de formule (V) dans un milieu aqueux en présence d'une protéase dans un domaine de pH ou la protéase exerce une activité enzymatique, par liaison de l'ester de dipeptide résultant à l'ester de l'amino-acide carboxylique et séparation du composé d'addition.
Les composés de départ, lies N-substitués monoamino-acides dicarboxyliques sont l'acide N-substitué aspartique dans le cas où n = 1 et l'acide N-substitué glutamique dans le cas où n = 2.
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groupe amino dans la réaction selon la présente invention. Il est nécessaire
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après la réaction, il est nécessaire que R soit éliminé sans affecter le squelette du produit.
aqueux
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un groupe empêchant le dépôt tel qu'un groupe acide sulfonique qui accroît fortement la solubilité dans l'eau du produit.
Les N-substitués monoamino-acides carboxyliques utilisés dans la présente invention peuvent facilement être obtenus en introduisant le groupe protecteur R sur le monoamino-acide dicarboxylique par des procédés classiques.
Les esters d'amino-acides carboxyliques utilisés comme autres composés de départ sont des esters d'amino-acides possédant un groupe hydrophobe sur la
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méthyle ; des esters de la valine dans le cas où R2 = groupe isopropyle ; des
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qui donne les esters de la phénylalanine en tant qu'ester amino-acide est le
cas le plus typique.
Les protéases utilisées dans la présente invention sont de préférence des métalloprotéases qui possèdent un ion métallique dans le centre actif. Des métalloprotéases convenables sont des enzymes provenant de micro-organismes, tels que des protéases neutres de ray fungus, Prolisine,Thermolycine,Collagénase, Cortulus atrox protéase, etc... Il est également possible d'utiliser des enzymes bruts tels que Thermoase, Tacynase-N, Pronase, etc... Afin d'empêcher l'action de l'estérase contenue dans les enzymes bruts, il est préférable d'utiliser un inhibiteur d'enzyme tel qu'un inhibiteur de pomme de terre avec les enzymes bruts. Il est possible d'utiliser des thiol protéases telles que
la papaïne, ou des sérine protéases telles que la trypsine, cependant elles possèdent une activité d'estérase. C'est pourquoi, -cn doit faire attention lorsque l'on effectue la réaction en utilisant un tel enzyme d'empêcher l'hydrolyse des esters.
Dans les synthèses selon la présente invention, la réaction de formation de liaison peptide est réalisée dans un milieu aqueux, de préférence des solutions aqueuses, dans des conditions de pH où la protéase exerce son activité enzymatique.
La réaction pour former le composé d'addition du peptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique est également fonction du pH. Il est préférable
de réaliser les réactions selon la présente invention dans un domaine de pH d'environ 4 à 9, particulièrement d'environ 5 à 8. En conséquence, les composés de départ, à savoir les N-substitués monoamino-acides dicarboxyliques et les esters de l'amino-acide carboxylique peuvent être sous forme libre ou sous forme de sel, cependant, lorsqu'ils sont tous les deux dissous dans le milieu aqueux, il est nécessaire d'ajuster le pH dans ledit domaine.
Des agents convenables pour ajuster le pH comprennent des acides minéraux ou organiques et des bases tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide acétique ; les hydroxydes de métal alcalin tels que l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium :les carbonates de métal alcalin tels
que le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de potassium et le bicarbonate de potassium ; des amines organiques et inorganiques telles que l'ammoniac, la triméthylamine, la triéthyl amine, l'éthanol amine, etc...
Les quantités d'ions d'hydrogène et d'ions hydroxy libérais dans la réaction sont équivalentes et ainsi la variation du pH-dans la réaction n'et pas élevée. Aussi, afin d'empêcher la variation du pH, il est possible d'utiliser un agent tampon. Dans le procédé industriel, il convient de contrôler le pH '
en utilisant un appareil de réglage du pH en réponse à un appareil de détection du pH.
Le milieu aqueux est généralement une solution aqueuse. Il est possible d'ajouter un solvant organique miscible à l'eau au milieu aqueux dans la mesure où le solvant n'empêche pas le dépôt du produit.
La réaction selon la présente invention s'effectue dans un domaine de température allant d'environ 10 à 90[deg.] C, de préférence 20 à 50[deg.] C, et ceci dans l'optique de maintenir l'activité enzymatique. La réaction est généralement <EMI ID=52.1>
pas critique.
Les concentrations de l'ensemble des produits de départ dans le milieu de réaction ne sont pas critiques. Le procédé selon la présente invention
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sont de préférence plus élevées. Les solubilités des composés d'addition dans l'eau sont relativement faibles. Par exemple, la solubilité du composé d'addi-
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En conséquence, les concentrations peuvent être relativement faibles et géné-
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Le rapport des composés de départ utilisé n'est pas critique.
Cependant, la réaction selon la présente invention est de lier une molécule de ::-substitué monoamino-acide dicarboxylique à 2 molécules d'ester
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produits de départ est 1 : 2, et le rapport réellement utilisé se situe généralement dans un domaine de 100 : 1 à 1 : 100, de préférence 5 : 1 à 1 : 5, plus particulièrement 2 : 1 à 1 : 3.
Il n'est pas toujours nécessaire de dissoudre toutes les quantités des produits de départ dans le milieu aqueux, et il est possible de mettre en suspension des quantités partielles des composés de départ puisque les concentrations des produits de départ diminuent comme la réaction avance, et ainsi les produits de départ en suspension sont progressivement dissous.
Dans ce cas, il peut se produire une variation du pH et il est alors nécessaire d'ajuster le pH de la solution alors que la réaction se poursuit.
La quantité de protéase utilisée dans le procédé selon la présente invention n'est pas critique. Quand la concentration de l'enzyme est élevée, la réaction peut être achevée dans un temps court. Quand la concentration de l'enzyme est faible, le temps de la réaction est prolongé. Ainsi, elle se
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La réaction de formation de liaison peptide selon la présente invention se produit seulement sur les isomères L et non sur les isomères D. Par ailleurs, les esters d'amino-acides utilisés pour réaliser la réaction de l'addition afin de former les composés d'addition peuvent être soit sous forme L, ou sous forme D ou un de leursmélanges. Quand on utilise l'ester amino-acide carboxylique sous forme DL, l'isomère L de l'ester de l'amino-acide carboxylique dans la solution est consommé dans les synthèses de peptide et'ainsi l'ester d'amino-acide restant possédant la forme D prédominante est utilisé pour la <EMI ID=59.1> production du composé d'addition de l'ester de dipeptide et de l'ester de l'amino-acide carboxylique.
La réaction selon la présente invention se fait dans des rendements pratiquement quantitatifs lorsque les concentiations des produits de départ sont élevées.Quand deux moles des esters d'amino-acides carboxyliques sous forme DL sont utilisées pour une mole de N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme L, on peut obtenir le composé d'addition pratiquement composé de l'ester de dipeptide LL et de l'ester de l'amino-acide carboxylique D. Ainsi, le
composé d'addition résultant peut être facilement divisé en deux composés à savoir l'ester de dipeptide LL et l'ester de l'amino-acide D comme décrit cidessus.
En conséquence, la production de l'ester de dipeptide et le dédoublement optique de l'ester de l'amino-acide carboxylique DL peuvent être obtenus simultanément dans ce procédé.
L'ester de l'amino-acide sous la forme D séparée ou sous la forme D prédominante peut être racémisé selon un procédé classique et le procédé peut être utilisé comme produit de départ pour le procédé selon la présente invention.
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sous la forme DL et l'ester de l'amino-acide sous la forme L, l'isomère D du N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous la forme DL est inerte pour rester dans le milieu aqueux et ainsi on peut obtenir le composé d'addition de l'ester de dipeptide LL et de l'ester de l'amino-acide carboxylique L. En conséquence, quand le N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme D est récupéré du milieu aqueux, il est possible d'obtenir simultanément la production des composés d'addition et le dédoublement optique du N-substitué DL monoaminoacide dicarboxylique. Quand le N-substitué-D-monoamino-acide dicarboxyliquc récupéré est racémisé selon un procédé classique, on peut utiliser le produit comme produit de départ.
Quand on utilise le N-substitué monoamino-acide dicarboxylique sous forme DL et l'ester de l'amino-acide carboxylique sous la forme DL, on peut obtenir du milieu aqueux le N-substitué DL monoamino-acide dicarboxylique et
on peut obtenir le composé d'addition de l'ester dipeptide LL et de l'ester
du D-amino-acide carboxylique , lequel peut être divisé en composants tels qu'in-
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optique du N-substitué DL monoamino-acide dicarboxylique et de l'ester du DL amino-acide carboxylique peuvent être simultanément atteints.
Selon le procédé de la présente invention, il est possible d'éliminer les étapes d'introduction et d'élimination d'un groupe protecteur pour le groupe carboxyle dans la chaîne latérale qui avaient été considérées comme indispensables dans les procédés classiques. En conséquence la perte des produits de départ
peut être éliminée. Le rendement des produits peut être remarquablement élevé <EMI ID=62.1>
Dans le procédé selon la présente invention, on peut utiliser des composés de départ sous forme DL. Dans les procédés classiques utilisant un enzyme, l'isomère D des composés de départ sous forme DL ne sont pas utiles dans la réaction bien qu'ils n'affectent pas cette réaction, c'est pourquoi ils tendent à provoquer
la perte des produits de départ. Or, dans le procédé selon la présente invention, les composés de départ du type D peuvent être utilisés effectivement comme
agent pour déposer le dipeptide et il peut être récupéré ensuite.
Dans le procédé selon la présente invention, le dédoublement optique
du N-substitué DL amino-acide dicarboxylique et de l'ester DL amino-acide carboxylique peut être obtenu simultanément.
Cette invention fournit en outre des procédés pour décomposer les composés d'addition. Les composés d'additon répondant à la formule(I)sont mélangés avec une solution de caractère acide aqueuse et les esters de dipeptide de
formule (VI) sont ensuite récupérés par séparation sous forme de solide restant.
Les constituants de caractère acide de la solution aqueuse de caractère acide peuvent être des acides minéraux ou organiques. Les acides minéraux convenables comprennent l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. Les acides organiques convenables comprennent l'acide formique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide toluènesulfonique etc. Le concentration de l'acide n'est pas critique et peut être choisie
suivant les autres conditions.
Le constituant de caractère acide dans la solution aqueuse de caractère
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que ou plus à savoir de 1 à 100 eq. de préférence de 1 à 20 eq. plus particuliè-
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caractère acide est utilisé pour ioniserl'unité de l'ester de l'amino acide carboxylique pour donner une solution aqueuse de son sel.
Dans quelques cas, l'ester de dipeptide (VI) ne nécessite pas une pureté élevée. Dans un tel cas, il est possible d'utiliser une quantité du cons-
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il peut être, par exemple, d'environ 0,8 eq. pour une mole du composé d'addition
(I).
La proportion de la solution aqueuse de caractère acide auc produits
de départ peut se situer dans un domaine où l'ester.de dipeptide (VI) peut exister sous forme solide puisque l'ester de dipeptide résultant (VI) est séparé comme solide.
Cependant, les esters de dipeptide (VI) possèdent une faible solubilité dans l'eau ou dans la solution aqueuse de caractère acide, par exemple, c'est le
<EMI ID=66.1> dont la solubilité est de 0,028 g/100 g d'eau et de 0,017/100 g d'acide
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solution aqueuse de caractère acide peut être relativement élevée. Dans le
procédé selon la présente invention, par ailleurs, le composé d'addition
(I) est mis en contact avec la solution aqueuse de caractère acide afin
de se trouver dans une condition de séparation solide-liquide. En conséquence,
il n'est pas souhaitable d'utiliser des proportions trop faibles. Des quantités convenables de la solution aqueuse acide se situe dans le domaine de 1,5 à 50 parties en poids, de préférence de 2 à 10 parties en poids , pour 1 partie
en poids du composé d'addition (I).
La température pour faire réagir le composé d'addition (I) avec la solution aqueuse de caractère acide se situe généralement dans un domaine
allant de 0 à 100[deg.]C, de préférence de 5 à 80[deg.]C. Quand l'agitation du mélange
est suffisante, la décomposition du composé d'addition(I) est achevée au bout d'environ 10 minutes.
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de contrôler le temps de réaction et la température de réaction avec précausion afin d'éviter l'élimination de ce groupe.
Selon le procédé, le composé d'addition est décomposé pour produire l'ester de dipeptide (VI) et un sel de l'ester de l'amino acide (V) avec un consti- tuant acide de la solution acide aqueuse. Une partie substantielle de
l'ester de dipeptide (VI) est à l'état solide après la réaction de décomposition, puisqu'il possède une faible solubilité dans la solution acide aqueuse comme indiqué ci-dessus. Comme le sel est bien dissous dans la solution, le système
de réaction devient un mélange de l'ester de dipeptide solide et de la solution de sel qui peut contenir un excès du constituant acide. L'ester de dipeptide solide résultant 'peut être séparé d'une manière classique telle que filtration ou centrifugation. De la solution de sel séparé-, on peut récupérer l'ester de l'amino acide d'une manière conventionnelle telle que cristallisation ou extrac- tion par solvant après la libération de l'ester de l'amino acide.
Selon ce procédé, l'ester de dipeptide (VI) peut être facilement préparé et séparé en décomposant le composé d'addition (I) et ceci sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des étapes compliquées d'extraction et de traitement par une résine échangeur d'ion. Le rendement et la pureté de l'ester de dipeptide
(VI) peuvent être remarquablement élevés.
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utilisés comme matière sucrante sera illustrée.
L'autre procédé de décomposition du composé d'addition (VI) dans un
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ester de la phénylalanine (1 : 1) est dissous dans un milieu liquide et décomposé avec un acide dans le milieu liquide pour obtenir l'ester de dipeptide possédant un'simple groupe amino de formule (VII) .
Des milieux liquides convenables utilisés pour dissoudre le composé
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cétones telles que l'acétone ; des solvants organiques contenant de l'oxygène
tels que le dioxane et le tétrahydrofurane ; des hydrocarbures inférieurs chlorés tels que le chloroforme, le dichlorure de méthylène, le dichlorure d'éthylène ; des solvants organiques polaires non protoniques tels que le diméthyl formamide, le diméthyl sulfoxyde et des acides carboxyliques liquides tels
que l'acide acétique et l'acide formique. On peut utiliser un mélange de deux
ou plusieurs solvants.
Il est possible d'utiliser des esters tels que l'acétate d'éthyle -et des alcools tels que le méthanol, l'éthanol et le propanol. Quand on utilise
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secondaire indésirable telle que la réaction de transestérification ou l'estérification vis-à-vis du groupe carboxyle.
Le composé d'addition possède une faible solubilité dans l'eau.
En conséquence, l'eau elle-même n'est pas convenable comme milieu liquide
dans ce cas bien qu'il soit possible d'ajouter de l'eau au milieu liquide
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vis-à-vis du milieu liquide.
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liquide et de la faculté de dissolution vis-à-vis du composé d'addition et
elle est généralement supérieure à 10 parties en poids, et de préférence elle
se situe dans un domaine de 20 à 100 parties en poids pour une partie en poids du composé d'addition.
Les acides utilisés pour décomposer le composé d'addition sont des acides de Bronsted de préférence des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique,l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide perchlorique et des acides organiques tels que l'acide trifluoro acétique, l'acide p-toluène sulfonique, etc.
La proportion de l'acide par rapport au composé d'addition est de
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valents ou plus de l'acide pour une mole du composé d'addition.
La concentration de l'acide dans le milieu liquide se situe généralement dans un domaine de 0,1 à 10 N, de préférence de 1 à 5 N et il est souhaitable de décider-de la concentration réelle en considérant les autres conditions de réaction puisque la réaction peut également dépendre.du temps
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Cependant, des concentrations élevées excédant les domaines ci-dessus qui peuvent provoquer des réactions secondaires indésirables telles que l'hydrolyse des esters doivent être évitées.
L'acide peut être aqueux ou anhydre. Quand le milieu liquide non miscible à l'eau tel qu 'un hydrocarbure chloré est utilisé il est préférable d'utiliser un acide anhydre puisque si l'on utilise un acide aqueux il se forme
deux phases ce qui conduit à une réaction très lente.
La température et le temps de réaction ne sont pas critiques et généralement la réaction s'effectue de 20 à 100[deg.]C pendant 10 minutes à 6 heures.
Quand on utilise l'acide dans une concentration plus faible, le
temps de réaction peut être plus long ou la température de réaction plus élevée. Quand le concentration de l'acide est plus élevée, il est souhaitable de choisir un temps de réaction plus court ou une température de réaction plus faible.
Après décomposition du composé d'addition, l'ester de dipeptide résul-
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acide (V) peuvent être séparés par les procédés suivants. Par exemple, après la réaction, 1 'alcool d'anis est extrait dans une phase solvant formée en ajoutant à la solution de réaction des quantités convenables d'eau et d'un solvant susceptible de former une phase séparée avec l'eau tel que le chloroforme et
le diéthyl éther puis en mélangeant et en laissant reposer pour obtenir deux phases du solvant et de l'eau. Par ailleurs, le pH de la phase aqueuse est ajusté de 5 à 6 avec une base telle que NaOH, NaHCO , Na2C03, l'ammoniaque la triéthyl amine etc. et l'ester de dipeptide déposé possédant le groupe amino simple (VII) est séparé par filtration ou analogue.. Le pH du filtrat est ensuite ajusté de 8 à 10 avec la base et l'alkyl ester de phénylalanine libre résultant
<EMI ID=80.1>
etc. L'ester de dipeptide possédant le groupe amino simple et l'ester de l'amina :
acide peuvent également être facilement récupérés par des procédés classiques
en utilisant une résine échangeur de cation.
Les techniques de dédoublement optique discutées ci-dessus sont également appliquées dans ce cas.
<EMI ID=81.1>
alkyle inférieur, plus particulièrement méthyle ou éthyle et 1.
Selon le procédé, l'élimination de l'unité fragmentaire de l'amino-acide <EMI ID=82.1>
carbonyle.de l'ester de dipeptide peuvent être obtenus simultanément. L'alcool d'anis séparé peut être récupéré et transformé en un agent de p-méthoxybenzyloxycarbonylation en le faisant réagir avec du phosgène.
La présente invention sera illustrée par certains exemples qui sont seulement donnés à titre d'illustration.
Exemple 1
1 335 mg (5 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et
1 078 mg (5 m moles) de chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 20 ml d'eau sont ajoutés pour les
<EMI ID=83.1>
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine
<EMI ID=84.1>
méthyl ester de la L-phénylalanine (1:1) ; (Rendement : 75,5 % par rapport
au chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants.
<EMI ID=85.1>
Analyse élémentaire (C32H37N309)
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
téristiques que décrites ci-dessus.
<EMI ID=88.1>
extrait 3 fois avec 30 ml d'acétate d'éthyle.Les extraits sont mélangés
et lavés avec 20 ml d'eau (3 fois) et déshydratés avec du sulfate de magnésium anhydre. La solution est concentrée et la séparation à l'état de cristaux s'effec-
<EMI ID=89.1>
propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants.
Point de fusion : 115 à 125[deg.]C
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
Les spectres infrarouge et RMN présentent les caractéristiques attendues pour le méthyl ester de la N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine.
Les résultats coïncident avec ceux d'un composé obtenu par benzyloxycarbonylation du groupe amino du méthyl ester de la L-aspartyl-L-phénylalanine.
Le méthyl ester de la L-phénylalanine est récupéré à partir d'un mélange de la phase acide chlorhydrique et de la fraction d'eau de lavage séparée par l'extraction de la phase acétate d'éthyle..
En conséquence, il est confirmé que le composé obtenu par la réaction précédente est un composé d'addition du méthyl ester de la N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la L-phénylalanine. Il est
<EMI ID=93.1>
Exemple 2
<EMI ID=94.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 1 078 mg (5 m moles) du chlorhydrate du méthyl ester de la L-phénylalanine, on ajoute 10 ml d'eau pour les dissoudre et on ajuste le pH à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine
<EMI ID=95.1>
ester de la L-phénylalanine (1 : 1) (rendement-: 99, 1 % par rapport au chlorhy-
<EMI ID=96.1>
Exemple 3
Selon le procédé de l'exemple 2 mais en faisant varier les quantités de l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et du méthyl ester de la L-phénylalanine à 534 mg (2 m moles) et 863 mg (4 m moles) respectivement on effectue la réaction
<EMI ID=97.1>
de la N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la Lphénylalanine (1 : 1). (point de fusion : 116 à 119[deg.]C ; rendement : 70,4 %
par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Exemple 4
Dans un ballon de 30 ml on introduit 534 mg (2 m moles) d'acide N-
<EMI ID=98.1>
ester de L-phénylalanine, on ajoute 8 ml d'eau pour les dissoudre et on ajuste le pH à 6,2 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et
<EMI ID=99.1>
de la solution et séché pour obtenir 1 099 mg d'un composé d'addition du méthyl ester -de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de la L-phénylalanine (1 : 1) (rendement : 90,5 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Exemple 5
On dissout dans 5 ml d'une solution tampon de McIlvain (pH :7,0)
267,2 mg (1 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 537,6 mg
(3 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine.
<EMI ID=100.1>
d'inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant 20 heures. Le précipité est recueilli et lavé avec de l'eau et séché pour obtenir 580 mg d'un composé d'addition cristallin brut du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=101.1>
123 à 125[deg.]C ; rendement : 95,5 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-Laspartique.
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
acide sous forme H est ajoutée à la solution sous agitation vigoureuse puis la résine est séparée et le filtrat est concentré sous pression réduite. Le résidu est dissous dans du diméthyl formamide et l'eau est ajoutée à la solution pour
<EMI ID=104.1>
point de fusion 123 à 125[deg.]C).
Exemple 6
. 267,2 mg (1 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 358,4 mg (2 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine sont dissous-dans 5 ml
<EMI ID=105.1>
La solution résultante est mélangée avec 100 mg de Tacynase N et
100 mg d'inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant 6 heures.
Le précipité est recueilli et lavé avec de l'eau'et séché pour donner 120 mg du composé d'addition cristallin brut du méthyl ester de N-benzyloxycarbonylL-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine (1 : 1)
(point de fusion : 119 à 123[deg.]C ; rendement : 19,7 %).
Selon le procédé de l'exemple 5, on traite le produit avec une résine échangeur de cation de caractère fortement acide sous forme
H pour obtenir 50 mg de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartylL-phénylalanine (point de fusion : 95 à 105[deg.]C; rendement : Il,7 %).
\
Exemple 7
1'335 mg (5 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl -L-aspartique et
1 078 mg (5 m moles) de methyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un
<EMI ID=106.1>
ajusté à 6,8 avec de la triéthylamine.
La solution résultante est mélangée avec 20 mg de Thermolysine et
<EMI ID=107.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
point de fusion : 120 à 12�[deg.]C
<EMI ID=108.1>
Analyse élémentaire :
<EMI ID=109.1>
Exemple 8
Selon le procédé de l'exemple 7, mais en ajustant le pH à 5,2 , on effectue la réaction et le traitement ce qui conduit à l'obtention de 753 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=110.1>
par rapport au méthyl ester de L-phénylalanine).
Exemple 9
133,6 mg (0,5 m mole) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 89,6 mg (0,5 m mole) de méthyl ester de L-phénylalanine sont dissous dans 2,5ml d'une solution tampon de Mcllvain (pH: 7,0) avec 0,07 ml de triétbylamine.
<EMI ID=111.1>
Thermoase et 50 mg d'un inhibiteur de pomme de terre et agitée à 38[deg.]C pendant
20 heures. Le précipité est recueilli par filtration, lavé avec de l'eau ce
<EMI ID=112.1> <EMI ID=113.1>
global 70 % par rapport à l'utilisation de 50 % de la quantité du méthyl ester de L-phénylalanine de départ).
Exemple 10
Selon le procédé de l'exemple 9 mais en utilisant 0,05 ml de N-méthyl morpholine à la place de 0,07 ml de triéthylamine, on effectue la réaction à
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
Le produit est.traité avec une résine échangeur de cation de caractère fortement acide sous forme H selon le procédé de l'exemple 9 pour obtenir
<EMI ID=116.1>
Exemple 11
<EMI ID=117.1>
et en agitant pendant 1 heure,on effectue la réaction pour obtenir 920 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-Lphénylalanine et de méthyl ester de L-phénylalanine (l : 1) (rendement 75,8 %).
Exemple 12
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et 5,5 ml de NaOH-lN sont ajoutés pour ajuster le pH à 7.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=120.1>
lalanine (1 : 1) (point de fusion 106 à 118[deg.]C ; rendement 60,5 %).
Exemple 13
<EMI ID=121.1>
,dans un ballon de 30 ml, 7 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et. le pH est ajuste à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 100 mg de Thermoase et agitée
<EMI ID=122.1>
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
(2 m mole) de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 4 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à
<EMI ID=125.1>
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermoase et agitée de
<EMI ID=126.1>
ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et d'un méthyl ester de
<EMI ID=127.1>
Exemple 15
<EMI ID=128.1>
inhibiteur de pomme de terre dans la solution pour la réaction, on effectue la réaction ce qui donne 381 mg du même produit (point de fusion 105 à 117[deg.]C ; rendement 62,7 %).
Exemple 16
<EMI ID=129.1>
(4 m moles) de chlorhydrate de méthyl ester de DL-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30. ml, 7 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,2 avec de l'ammoniaque à 7 % .
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de T-hermolysine et agitée
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
% par rapport à l'acide N-benzoylcarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et nhexane ce qui conduit à l'obtention du produit possédant les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire suivants :
Point de fusion : 127 à 135[deg.]C
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
On admet que le produit est le composé d ' addition du méthyl ester
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
les mêmes caractéristiques que le produit de l'exemple 1.
<EMI ID=136.1>
de dichlorure de méthylène 3 fois, la phase de dichlorure de méthylène est lavée avec de l'eau et déshydratée avec du sulfate de magnésium anhydre, le dichlorure de méthylène est éliminé par distillation et le constituant solide est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce
<EMI ID=137.1>
résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 124 à 132[deg.]C
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
alanine.
La phase aqueuse résiduelle d'extraction par un dichlorure de méthylène est mélangée avec du bicarbonate de sodium pour ajuster le pH à 8,7 et le pro-
<EMI ID=141.1>
té avec du sulfate. de magnésium anhydre, le chlorure d'hydrogène est introduit dans l'extrait pendait ; environ 10 minutes, la solution de chlorure de méthylène est concentrée et l'êthyl éther est ajouté à la solution pour recristalliser le produit ce qui donne 29,0 mg de chlorydrate de méthyl ester de D-phênylalanine.
<EMI ID=142.1>
(le spectre infrarouge et le spectre RMN : coïncident avec ceux de.la forme L).
En conséquence l'hypotèse du composé d'addition-est correcte.
<EMI ID=143.1>
de D-phénylalanine (l : 1)
Exemple 17
<EMI ID=144.1>
(4 m moles) de chlorhydrate de methyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau sont ajoutes pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6 avec de l'ammoniaque à 7 %.
<EMI ID=145.1>
lavé avec 20 ml d'eau et séché ce qui donne 787 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl- L-phénylalanine
et de méthyl este.r de L-phénylalanine (l : 1) (point de fusion : 105 à 110[deg.]C ; rendement 64,8 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle
25
<EMI ID=146.1>
7,2 (C=l, méthanol).
Par ailleurs, on récupère l'acide N-benzyloxycarbonyl aspartique (principalement la forme D) de la solution de la réaction résiduelle.
Exemple 18
On répète l'exemple 17 mais en utilisant du méthyl ester de DL-phénylalanine à la place du methyl ester de L-phénylalanine pour obtenir 756 mg d'un composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phênylalanine et de méthyl ester de D-phénylalanine (1 : 1) (point de fusion : 105 à 111[deg.]C ; rendement 62, 3 % par rapport à l'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle
<EMI ID=147.1>
-6,5 (C=l, méthanol).
Par ailleurs, on récupère l'acide N-benzyloxycarbonyl aspartique (principalement la forme D) de la solution de réaction résiduelle.
Exemple 19
5,34 g (20 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 7,53 g
(42 m moles) de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 100 ml et 70 ml d'eau sont ajoutés pour le dissoudre. On obtient une solution possédant un pH de 6,2 à 6,3.
La solution résultante est mélangée avec 200 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=148.1>
lavé avec 70 ml d'eau et séché ce qui donne 10,11 g de cristaux (point de fusion :
117 à 120[deg.]C). Il se confirme que le produit est un composé d'addition
<EMI ID=149.1> ester de L-phénylalanine (1 : 1) puisque le produit est recristallisé dans un
<EMI ID=150.1>
et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
<EMI ID=151.1>
Analyse élémentaire : C32H37N309
<EMI ID=152.1>
Les spectres infrarouge et RMN présentent les mêmes caractéristiques
que mentionnées ci-dessus pour le composé d'addition 1 : 1 de méthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine avec le méthyl ester de Lphénylalanine. Le produit est également traité avec un acide fort et extrait avec un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle ce qui est suivi par l'élimination du solvant organique par distillation pour donner le méthyl ester
<EMI ID=153.1>
nine est introduit dans un ballon de 30 ml et 2 ml d'eau et 2,0 ml de
HC1-1N sont ajoutés en agitant à température ambiante pendant 10 minutes. La bouillie résultante est filtrée et le précipité est lavé avec 4 ml d'eau et séché ce qui donne 0,72 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxyearbonyl-Laspartyl-L-phénylalanine (rendement 98,8 %).
Les cristaux résultants sont dissous dans de l'acétate d'éthyle et du n-hexane est ajouté pour recristalliser le produit- Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit final sont les suivants :
Point de fusion : 121 à 1240 C
<EMI ID=154.1>
Analyse élémantaire : C22H24N207
<EMI ID=155.1>
Le spectre infrarouge du produit coïncide avec celui du composé standard.
L'identification du produit est également confirmée par comparaison
d'une solution aqueuse du produit avec celle du composé standard dans une chromatographie liquide à grande vitesse. La puretée est mesurée suivant cette méthode pour être 100 %. L'appareil et les conditions de l'analyse chromatographique liquide à grande vitesse sont les suivants. Cette méthode est utilisée
Pour l'estimation de la pureté des produits de décomposition des composés d'addition dans les exemples suivants sauf indication contraire.
Les mêmes appareils et conditions sont utilisés dans les exemples dans la mesure eu ce procédé est concerné.
Appareil de chromatographie liquide à grande vitesse :
(TSK-HLC 801 fabriqué par Toyo soda K.K.)
Colonne : diamètre intérieur 7,5 mm x longeur 30 cm ;
<EMI ID=156.1>
170 fabriqué par Toyo Soda K.K.).
Eluant : Solution aqueuse d'acétate de sodium à 0,5 %
Débit : 0,8 ml/mn.
Perte de charge : 20 Kg/cm
Température de mesure : température ambiante
Détecteur : réfractomètre différentiel.
Exemple 20
1,00 g (1,65 m mole) du composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxy-
<EMI ID=157.1>
dans l'exemple 19 est introduit dans un ballon de 30 ml, 2 ml d'eau et 1,32 ml de HC1-1N y sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante
<EMI ID=158.1>
0,70 g de cristaux prismatiques fins possédant un point de fusion de 100 à
126[deg.]C (teneur en méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine : 96,8 %).
Exemple 21
0,53� g (2 m moles) d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 0,863 g
<EMI ID=159.1>
dans un ballon de 30 ml, 10 ml d'eau sont ajoutés pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0 avec de l'ammoniaque à 7 %.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=160.1>
d'eau puis séché ce qui donne 0,90 g de cristaux possédant un point de fusion de 120 à 126[deg.]C.
Une partie des cristaux est recristallisée dans un mélange de solvant acétate d' éthyJe et n-hexane pour obtenir le produit qui possède un point
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L� phénylalanine et du méthyl ester de phénylalanine ( 1 : l).
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
Alors le produit est traité avec un acide pour former du méthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méhtyl ester de D-phény:
alanine dans un rapport molaire de 1 : 1.
Il est confirmé, de ces résultats, que les cristaux résultants correspondent au composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-
<EMI ID=165.1>
0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition sont mélangés avec 4 ml
d'eau et 0,26 g d'acide citrique et le mélange est agité à température ambiante pendant 10 minutes et traité d'une manière similaire à celle de l'exemple 19
ce qui donne 0,35 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-Laspartyl-L-phénylalanine (puretée : 100 % ; rendement : 99,3 %).
Exemple 22
<EMI ID=166.1>
carbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine obtenu:
dans l'exemple 19 sont introduits dans un ballon de 30 ml, 4 ml d'eau et 0,24 g
(1,2 m mole) d'acide p-toluenesulfonique monohydrate sont ajoutés et traités par le procédé de l'exemple 19 pour obtenir 0,33 g de cristaux de méthyl
<EMI ID=167.1>
ment : 93,6 %).
Exemple 23
0,45 g (8,2 m moles) d'acide formique à 85 % et 8 ml d'eau sont introduit:
dans un ballon de 30 ml, 0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et.de méthyl ester de L-phénylalanine obtenus dans l'exemple 19 sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant 20 minutes puis le produit est filtré et lavé avec 10 ml d'eau et séché ce qui donne 0,312 g de cristaux blancs
de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (pureté :
100 % ; rendement : 88,6 %).
Exemple 24
0,47 g (8,2 m moles.) d'acide acétique glacial et 8 ml d'eau sont introduit dans un ballon de 30 ml, 0,50 g (0,82 m mole) du composé d'addition du méthyl
<EMI ID=168.1>
de L-phénylalanine sont ajoutés et le mélange est agité à température ambiante pendant 30 minutes puis le produit est filtré et lavé avec 10 ml d'eau et séché
<EMI ID=169.1>
partyl-L-phénylalanine (pureté : 100 % ; rendement : 87,2 %).
Exemple 25
<EMI ID=170.1>
3 minutes puis traité d'une manière semblable à celle de l'exemple 19 pour obtenir 0,35 g de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-
<EMI ID=171.1>
Exemple 26
0,594 g ( 2 m moles) d'acide N-p-méthoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartique
<EMI ID=172.1>
sont introduits dans un ballon de 30 ml et NaOH-lN est ajouté pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et agitée
<EMI ID=173.1>
lavé avec 10 ml d'eau-et séché ce qui donne 0,928 g de cristaux possédant un
<EMI ID=174.1>
phénylalanine et du méthyl ester de L-phénylalanine (1 : 1).
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce qui. donne le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 72 à 76[deg.]C
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
Spectre infrarouge .
<EMI ID=177.1>
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
Ces résultats montrent que le produit est le compose d'addition de formule
<EMI ID=180.1>
3 minutes.
La bouillie résultante est filtrée.et lavée avec 6 ml d'eau puis séchée ce qui donne 0,38 g de cristaux.
H est confirmé des résultats suivants que le produit est le méthyl ester
<EMI ID=181.1>
ajouté pour recristalliser afin d'obtenir le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 128 à 130[deg.]C
<EMI ID=182.1>
<EMI ID=183.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
Ces résultats montrent que le produit final est .le composé.de formule
<EMI ID=186.1>
<EMI ID=187.1>
aspartyl-L-phénylalanine résultant sont dissous dans 2 parties en poids d'acétone et 1 partie en poids d'HCl-4N est ajoutée à la solution résultante, puis le mélange est chauffé au bain marie à reflux doux pendant 1,5 heures pour le décomposer complètement afin de former une solution contenant les principaux constituants, méthyl ester de L-aspartyl-L-phénylalanine, méthyl ester de L-phénylalanine et alcool d'anis,solution de laquelle on obtient
le méthyl ester de L-aspartyl-L-phénylalanine.
Exemple 27
0,562 g (2 m moles) d'acide N benzyloxycarbonyl-L-glutamique et 0,860 g
<EMI ID=188.1>
ballon de 30 ml, du NaOH-1N est ajouté pour les dissoudres et le pH est ajusté à 6,0.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et
<EMI ID=189.1>
avec 10 ml d'eau puis séché ce qui donne 0,510 g de cristaux possédant un point de fusion de 80[deg.]C à 85[deg.]C.
Les résultats suivants confirment que le produit est un composé d'addition du méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phénylalanine et du
<EMI ID=190.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane ce qui donne le produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 92 à 97[deg.]C
<EMI ID=191.1>
Analyse élémentaire : C33H39N309
<EMI ID=192.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=193.1>
<EMI ID=194.1>
Ces résultats montrent que le produit est le composé d'addition de formule
<EMI ID=195.1>
et le mélange est agité ensuite à température ambiante pendant 15 minutes.
Le précipité blanc résultant est filtré et lavé avec 3 ml d'eau puis séché ce qui donne 0,683 g de cristaux.
Les résultats suivants confirment que le produit est le méthyl ester
<EMI ID=196.1>
95,8 %).
Les cristaux sont dissous dans de l'acétate d'éthyleet du n-hexane est ajouté pour recristalliser et obtenir le produit.
Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 97 à 99[deg.]C
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=199.1>
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
Ces résultats montrent que le produit final est le composé de formule
<EMI ID=202.1>
peut être transformé par réduction avec de l'hydrogène en méthyl ester de Lglutamyl-L-phénylalanine et il peut également être transformé par hydrolyse
<EMI ID=203.1>
Exemple 28
Dans un ballon de 100 ml on introduit 0,686 g (3,12 m moles) de chlorhydrate
<EMI ID=204.1>
une solution aqueuse de NaOH-2N à la solution en : refroidissant avec de la glace et en agitant pour avoir un pH de 7,5, on ajoute graduellement 0,360 g
(1,44 m mole) d'anhydride d'acide N-benzyloxycarbonyl-L-aspartique à la solution en agitant et en maintenant le pH de7,0 à 7,5 en ajoutant une solution aqueuse de NaOH-2N. Après l'addition, on agite encore le mélange pendant 2 heures, et on ajoute au mélange de réaction une solution aqueuse de HC1-1N pour avoir un pH de 6. Le précipité résultant est recueilli par filtration, lavé avec 50 ml
<EMI ID=205.1>
ester de L-phénylalanine (1 : 1) (point de fusion 108 à 115[deg.]C). Au cours de la réaction, une quantité considérable de méthyl ester de N-benzyloxycarbo-
<EMI ID=206.1>
reste dans le filtrat et l'eau de lavage.
Dans un bécher de 12 ml, on ajoute 0,200 g (0,329 m mole) du composé d'addition résultant à savoir le méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspar-
<EMI ID=207.1>
<EMI ID=208.1>
le mélange à température ambiante pendant 15 minutes.
Le précipité blanc résultant est filtré, lavé avec 3 ml d'eau et séché ce qui donne 0,136 g (rendement-96,3 %) de cristaux de méthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (contenant 17 % de méthyl
<EMI ID=209.1>
fusion : 110[deg.]C à 118[deg.]C).
Exemple 29
Dans un ballon de 30 ml, on dissout dans 5 ml d'eau 0,543 g (2 m moles)
<EMI ID=210.1>
d'éthyl ester de N-phénylalanine, et on ajoute une solution aqueuse de NaOH- <EMI ID=211.1>
4N pour ajuster le pH à 6.
La solution résultante est mélangée avec 50 mg de Thermolysine et le
<EMI ID=212.1>
Il est confirmé que le produit est le composé d'addition de l'éthyl ester
de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et de l'éthyl ester de L-phényla
<EMI ID=213.1>
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate d'éthyle et n-hexane et les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 93 à 95[deg.]C
<EMI ID=214.1>
Analyse élémentaire : C34H41N309
<EMI ID=215.1>
Spectre infrarouge : 3 300 cm" (N-H vibration d'allongement) ;
<EMI ID=216.1>
<EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
et 1.
Dans un ballon de 30 ml, 0,125 g (0,197 m mole) du composé d'addition résultant d'éthyl ester de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine et
<EMI ID=221.1> <EMI ID=222.1>
bonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine (pureté : 100 % ; rendement 92, 6 %). Les cristaux sont recristallisés dans un mélange de solvant acétate d'éthyleet nhexane ce qui conduit au produit. Les propriétés physiques et les résultats de l'analyse élémentaire du produit sont les suivants :
Point de fusion : 128 à 135[deg.]C
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
Spectre infrarouge :
<EMI ID=225.1>
Exemple 30
5,00 g (16,82 m moles) d'acide N-p-méthoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartique et 7,26 g (33,64 m moles) dechlorhydrate de méthyl ester de L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 100 ml , une solution aqueuse de NaOH-lN est ajoutée pour les dissoudre et le pH est ajusté à 6,0.
<EMI ID=226.1>
Le précipité est recueilli par filtration , lavé avec 100 ml d'eau puis
séché ce qui donne 8,11 g de cristaux possédant un point de fusion de 88 à
92[deg.]C. (rendement : 75,6 % en tant que composé d'addition du méthyl ester de N-p-
<EMI ID=227.1>
et n-hexane et les cristaux résultants présentent les caractéristiques physiques et les résultats de l'analyse élémentaire pratiquement identiques à ceux du composé d'addition préparé dans l'exemple 26.
<EMI ID=228.1>
Une partie du mélange de réaction est mélangée avec de l'eau, une solution aqueuse de NaHC03 1,2N et du cyclohexane comme standard interne pour préparer l'échantillon et la transformation en méthyl ester c�-L-aspartylL-phénylalanine est confirmée par la chromatographie liquideà grande vitesse. Le rendement est de 72,7
Exemple 31
<EMI ID=229.1>
sont obtenus dans l'exemples 30 sont introduits dans un ballon de 20 ml.
Selon le procédé de l'exemple 30 mais en utilisant du dioxane à la
place de l'acétone, on effectue la décomposition du composé d'addition et l'analyse du produit.
<EMI ID=230.1>
Exemple 32
Le procédé de l'exemple 31 est répété mais en utilisant du méthanol à la place du dioxane. Le rendement du méthyl ester d'c� - L-aspartyl-L-phénylalanine est de 63,3 %.
Exemple 33
On répète le procédé de l'exemple 31 mais en utilisant du N,N-dimêthylfor�
<EMI ID=231.1>
Exemple 34
<EMI ID=232.1>
<EMI ID=233.1>
Exemple 35
<EMI ID=234.1>
90[deg.]C pendant 20 minutes au lieu de 60[deg.]C pendant 1 heure. Le rendement de
<EMI ID=235.1>
Exemple 36
On répète le procédé de l'exemple 34 mais en utilisant 4,5 ml de dioxane et 0,5 ml-d'une solution HCl-dioxane (5,3 N) à la place de 4 ml et de 1 ml respectivement de ces composés ainsi qu'en effectuant la réaction à 90[deg.]C
<EMI ID=236.1>
<EMI ID=237.1>
Exemple 37
On répète le procédé de l'exemple 34 mais en utilisant 3 ml de dioxane <EMI ID=238.1> L-phénylalanine est de 98,6 %.. ;'
<EMI ID=239.1>
<EMI ID=240.1>
<EMI ID=241.1>
d'une solution dioxane-HCl (5,3N) respectivement. Le rendement du méthyl ester
<EMI ID=242.1>
Exemple 39
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
<EMI ID=245.1>
<EMI ID=246.1>
L-aspartyl-L-phénylalanine et du méthyl ester de L-phênylalanine (1 : 1)
qui sont obtenus dans l'exemple 30 sont dissous dans 2 ml de dioxane, puis
3 ml d'acide trifluoroacétique sont ajoutés pour les faire réagir à 60[deg.]C pendant
1 heure.
Le mélange de réaction est soumis à évaporation sous pression réduite
puis de l'eau de la triéthylamine et de la cyclohéxanone en tant que standard
<EMI ID=247.1>
<EMI ID=248.1>
dioxane-HCl (5,3 N) sont introduits dans un ballon de 50 ml , et le mélange est agité à 60[deg.]C pendant 1 heure pour les faire réagir. Le dioxane est éliminé par distillation du mélange de réaction sous pression réduite, 6 ml d'eau et
<EMI ID=249.1>
en agitant puis les deux phases sont séparées. 10 ml.de diéthyl éther sont encore ajoutés à la-phase aqueuse pour extraire le produit d'une manière sembla- ble à ce qui est décrit ci-dessus. La dernière extraction est répétée 3 fois.
Les phases de diéthyl éther sont reçue illies et lavées avec 5 ml d'une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium.pendant 2 fois, et- déshydratées avec du sulfate de magnésium anhydre. Le diéthyl éther est éliminé par distillation sous pression réduite ce qui conduit à l'obtention de 0,1T6 g (rendement
81,2 %) d'alcool d'anis brut.
La phaqe aqueuse est neutralisée avec une solution aqueuse à 7 % d'hydro-
<EMI ID=250.1> toute la nuit. Les cristaux précipités résultants sont filtrés et lavés avec
2 ml d'eau puis séchés ce qui donne 0,316 g (rendement 68,5 %) de méthyl ester
"J
de L-aspartyl-L-phénylalanine brut.
<EMI ID=251.1>
<EMI ID=252.1>
<EMI ID=253.1>
<EMI ID=254.1>
de magnésium anhydre.
<EMI ID=255.1>
<EMI ID=256.1>
introduits dans un ballon de 30 ml puis dissous avec addition d'une solution
<EMI ID=257.1>
<EMI ID=258.1>
<EMI ID=259.1>
de méthyl ester de L-phénylalanine (l :1). Ceci est confirmé par les' analyses ci-dessous.
Le produit est recristallisé dans un mélange de solvant méthanol et
<EMI ID=260.1>
<EMI ID=261.1>
Point de fusion : 82 à 87[deg.]C
<EMI ID=262.1>
<EMI ID=263.1>
<EMI ID=264.1>
suivantes : Spectre infrarouge :
<EMI ID=265.1>
<EMI ID=266.1>
<EMI ID=267.1>
Ces résultats montrent que le produit est le composé d'addition de formule
<EMI ID=268.1>
benzy�, étoxy et 1.
<EMI ID=269.1>
résultant à la place du composé d'addition du méthyl ester de N-p-méthoxycar� bonyl-L-aspartyl-L-phénylalanine avec le méthyl ester de L-phénylalanine pour préparer l'éthyl ester de L-aspartyl -L-phénylalanine. Le rendement d'éthyl.-
<EMI ID=270.1>
1,725 g (8 m moles) de chlorhydrate de méthyl ester de D L-phénylalanine sont introduits dans un ballon de 30 ml et dissous avec l'addition d'une solution
<EMI ID=271.1>
tes.
Le précipité est recueilli par filtration et lavé avec 30 ml d'eau
puis séché ce qui donne 2, 109 g de cristaux possédant un point de fusion de
119 à 128[deg.]C et le produit est recristallisé dans un mélange de solvant acétate
<EMI ID=272.1>
de D-phénylalanine (1 : l) semi-hydrate et ceci grâce aux analyses indiquées ci-dessous.
Les caractéristiques physiques et les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants :
Point de fusion : 131 à 133[deg.]C
<EMI ID=273.1>
<EMI ID=274.1>
Les spectres infrarouge et RMN montrent les mêmes caractéristiques que
<EMI ID=275.1>
ppm du fait des perturbations provoquées par la présence de l'eau puisque le produit contient de l'eau de cristallisation comme expliqué ci-dessus.
Un échantillon de 1,5024 g du produit est chauffé par irradiation en micro-onde
<EMI ID=276.1>
L'analyse élémentaire de l'échantillon irradié donne les résultats suivants :
<EMI ID=277.1>
Les spectres infrarouge et RMN de l'échantillon irradié donnent les mêmes
<EMI ID=278.1>
26.
1,0 g de l'échantillon irradié est mélangé avec 4 ml d'eau et 2ml de HC1-lN puis le mélange résultant est agité à 60[deg.]C pendant 3 minutes. Après une séparation solide-liquide de la bouillie résultante, le méthyl ester de N-pméthoxycarbonyl-L-phénylalanine et le méthyl ester de D-phénylalanine sont récupérés dans un rapport molaire 1 : 1 de la phase solide et de .la phase liquide respectivement.
<EMI ID=279.1>
d'addition résultant (semi-hydrate au lieu du composé d'addition obtenu dans
<EMI ID=280.1>
<EMI ID=281.1>
Exemple 144
0,3 g du composé d'addition de méthyl ester de N-p-méthoxybenzyloxycarbo-
<EMI ID=282.1>
(0,31N).pour les faire réagir à 60[deg.]C pendant 2 heures. Le mélange de réaction est traité sous pression réduite pour éliminer par distillation les matières
<EMI ID=283.1>
internes sont ajoutés au résidu pour préparer un échantillon et. l'échantillon <EMI ID=284.1>
<EMI ID=285.1>
1. A titre de produits industriels nouveaux, les-composés d'addition de formule
<EMI ID=286.1>
<EMI ID=287.1>
benzyloxycarbonyle qui peut posséder des substituants nucléaire, un groupe
<EMI ID=288.1>
<EMI ID=289.1>
un groupe alcoxyle inférieur, benzyloxy ou benzhydryloxy et n représente 1 ou 2.
2. A titre de produits industriels nouveaux., les composés d'addition selon
New addition compounds of a dipeptide derivative and of a derivative; amino acid, and process for their preparation and decomposition.
The present invention relates to novel addition compounds of a dipeptide derivative and an amino acid derivative as well as to a process for the preparation.
<EMI ID = 1.1>
ration of these addition compounds. More particularly, it relates to novel dipeptide addition compounds consisting of N-substituted monoamino dicarboxylic acid ester residues and amino carboxylic acid ester residues, with amino carboxylic acid esters as well. as the processes for preparing these addition compounds using an enzymatic reaction and for decomposing these addition compounds.
<EMI ID = 2.1>
used to form peptide bonds as the reverse reaction of protein breakdown. For example, Bergman prepared anilides using papain and peptide syntheses using monoamino monocarboxylic acids such as leucine having an N-terminal protecting benzoyl group and leucine and glycine together having a protecting anilide or amide group. of the C-terminal were obtained by Fruton with papain and chymotrypsin. (Advances in Protein Chemistry Vol. 5, page 33 (1949). Academy Press Inc. New York, N.Y.)
Recently, a few inventors have reported syntheses of peptides
<EMI ID = 3.1>
In these methods, the products are deposited in an aqueous medium as the water insoluble products obtained by the loss of the water soluble groups (this is necessary to force the reaction reversible towards the formation of the peptides). Accordingly, when a water soluble group is to be maintained in the reaction product, for example, as in the case where amino acids possessing a second carboxylic group on the side chain
(eg, aspartic acid and glutamic acid) are used as starting materials, it has been recognized that it is desirable that the water soluble group of the starting material be masked with a less hydrophilic protecting group.
The Applicant has continued its studies on these systems and has found that, when monoamino carboxylic acids such as aspartic acid and glutamic acid which have an N-terminal protective group are used as starting products, the peptides results are not themselves deposited, and that when one chooses as starting materials for the counterpart specific amino acids having a C-terminal ester group (amino carboxylic acid ester), the addition compounds of the dipeptides which are the products of the enzymatic reaction and the amino acid esters are deposited.
It is known that peptide derivatives possess various physiological activities, and that such peptide derivatives can be prepared by various methods. Peptides having an amino acid residue of an acidic character such as
<EMI ID = 4.1>
softening compound, can be obtained from a precursor having a benzyloxycarbonyl group as a protecting group of the N-terminal by removing the protecting group.
Peptides possessing an N-terminal protecting group such as
<EMI ID = 5.1>
are easily hydrolyzed, resulting in peptides having a single C-terminal carboxyl group and these hydrolyzed peptides have been used as substrates to measure the enzymatic activity of a carboxypeptidase.
N-protected or unprotected dipeptide esters can be obtained by reacting an amino acid anhydride of acidic character having a protected or unprotected amino group with an amino acid alkyl ester (Japanese Patent Publication No. 14217/1974 and Japanese Unexamined Patent Publication Nos.
<EMI ID = 6.1>
However, desired dipeptide esters are not easily obtained by conventional methods, since according to these methods, dipeptide esters having peptide bonds on the carboxyl groups of the side chain of acidic amino acids are inevitably produced with those which one wishes.
The object of the present invention is to provide addition compounds corresponding to the formula:
<EMI ID = 7.1>
wherein R 1 represents an aliphatic oxycarbonyl, benzyloxycarbonyl group which may have substituents on the ring or a benzoyl, aromatic sulfonyl or aromatic sulfinyl group; R2 represents a methyl, isopropyl, isobutyl, isoamil or benzyl group; R3 represents lower alkoxyl, benzyloxy, benzhydryloxy and n represents 1 or 2.
The addition compounds of formula (I) comprise the fragmentary units of formula:
<EMI ID = 8.1>
which can be in LL form, as well as of formula:
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
in formulas (II) and (III) having the same meaning as in formula (I).
Another object of the present invention is to provide a process for preparing these addition compounds. Addition compounds are prepared
<EMI ID = 11.1>
formula :
<EMI ID = 12.1>
with an ester of an amino carboxylic acid corresponding to the formula:
<EMI ID = 13.1>
wherein R., R2 and R3 have the same meaning as in formula (I), in an aqueous medium in the presence of a protease, reacting the resulting dipeptide ester with the amino carboxylic acid and separating the addition compound. The N-substituted monoamino dicarboxylic acid corresponding to the formula (IV) and the esteis domino acids corresponding to the formula (V) are in L or DL form.
In addition, the object of the present invention is to provide a process for carrying out the optical resolution of the N-substituted monoamino diearboxylic acids of formula (IV) and of the amino acid ester of formula (V).
Another object of the present invention is to provide a process for the decomposition of the addition compounds. The addition compounds are treated with a solution of acidic character. In order to separate the solid component for <EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
methoxybenzyloxycarbonyl are dissolved in a liquid medium and treated with an acid to prepare dipeptide esters having a single amino group of the formula:
<EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
phenyl alanine which have a sweet taste like sugar. Methyl ester
<EMI ID = 21.1>
that of sugar in one of its specific objectives.
In the formula (I) of the addition compounds according to the present invention, the backbone of aspartic acid is given in the case where n = 1 and the backbone of glutamic acid is given in the case where n = 2.
In the formula (I) of the addition compounds according to the present invention, R. comprises the aliphatic oxycarbonyl groups such as the group
<EMI ID = 22.1>
o-nitrosulfinyl.
In formula (I), the alanine backbone is given in the case where R2 = a methyl group; the skeleton valine is given in the case where R2 = un
<EMI ID = 23.1>
butyl and the isoleucine backbone is given in the case where R2 = an isoamyl group
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1> lower like methoxy groups (CH30-); ethoxy (C2H50-); propoxy (C3H70-);
<EMI ID = 26.1>
R; benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl,
R2: benzyl,
R3: methoxy and ethoxy.
The adducts according to the present invention exhibit the reasonably expected characteristics of the formula sI). For example, a typical addition compound obtained by the reaction of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and the methyl ester of L-phenylalanine, exhibits the absorp-
<EMI ID = 27.1>
Infrared spectrum
<EMI ID = 28.1>
monosubstituted vibration out of the plane).
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
<EMI ID = 31.1>
The data from the elemental analysis of the addition compound are practical.
<EMI ID = 32.1>
<EMI ID = 33.1>
benzyl and methyl and n is equal to 1.
When the adduct is treated with a strong acid such as hydrochloric acid and the product is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate, a compound of acidic character of the organic layer is obtained. When the typical addition compound indicated above is so treated, the resulting acidic character compound exhibits the characteristics and properties expected as the compound shown in the formula.
<EMI ID = 34.1>
typical addition mentioned above.
Typical addition <EMI ID = 35.1> mentioned above is catalytically reduced with hydrogen, the product is the methyl ester of LL-aspartyl-phenylalanine.
<EMI ID = 36.1>
Identical corresponding results are also obtained in
<EMI ID = 37.1>
When the adducts according to the present invention are treated
<EMI ID = 38.1>
the product is extracted with an organic solvent, the compounds corresponding to formula (VI) can be obtained. On the other hand, the ester of the amino carboxylic acid in the form L, D or mainly D, can be recovered from the aqueous phase, and thus the optical isomerism of the esters recovered depends on that of the fragmentary units shown in the formula (III) of the addition compounds.
In this case, the amount of the compound having the formula (VI) is equivalent to the ester of the resulting amino carboxylic acid having the formula
(III), and so it is clear that the original compound is the addition compound of dipeptide ester and amino carboxylic acid ester (1: 1) which
<EMI ID = 39.1>
The adducts according to the present invention can have water of crystallization. The addition compounds according to the present invention are remarkably useful as intermediates in peptide syntheses.
As indicated above, when the adduct according to the present invention is treated with a strong acid such as hydrochloric acid, and the product is extracted with an organic solvent, the dipeptide having a protective group for the amino group. When the protective group
<EMI ID = 40.1>
catalytic hydrogenation, the ester of the dipeptide having
<EMI ID = 41.1>
<EMI ID = 42.1>
the benzyl group and R3 is a lower alkoxy group, particularly the methoxy group, can be used as a sweetener.
The peptide having an N-terminal protecting group and a single C-terminal carboxyl group, which can be derived from the ester of the dipeptide having a protecting group for the amino group according to a conventional hydrolysis technique, is also useful.
<EMI ID = 43.1>
used as a substrate to measure the enzymatic activity of a carboxypepti- <EMI ID = 44.1>
The present invention also provides addition compounds by reacting an N-substituted monoamino-dicarboxylic acid with an ester of an amino-carboxylic acid in the presence of a protease and binding the resulting dipeptide ester to it. ester of the amino carboxylic acid and recovery of the adduct.
However, one of the processes of the present invention is to prepare the adduct of the dipeptide ester and the amino carboxylic acid ester of formula (I) by reacting an N- substituted monoamino-dicarboxylic acid of formula (IV) with an amino acid ester of formula (V) in an aqueous medium in the presence of a protease in a pH range where the protease exerts an enzymatic activity, by binding of the resulting dipeptide ester to ester of the amino carboxylic acid and separation of the adduct.
The starting compounds, N-substituted monoamino-dicarboxylic acids, are N-substituted aspartic acid in the case where n = 1 and N-substituted glutamic acid in the case where n = 2.
<EMI ID = 45.1>
amino group in the reaction according to the present invention. It is necessary
<EMI ID = 46.1>
after the reaction, it is necessary that R be removed without affecting the backbone of the product.
aqueous
<EMI ID = 47.1>
a deposition inhibiting group such as a sulfonic acid group which greatly increases the water solubility of the product.
The N-substituted monoamino carboxylic acids used in the present invention can easily be obtained by introducing the protecting group R on the monoamino dicarboxylic acid by conventional methods.
The esters of carboxylic amino acids used as other starting compounds are esters of amino acids having a hydrophobic group on the
<EMI ID = 48.1>
methyl; esters of valine in the case where R2 = isopropyl group; of
<EMI ID = 49.1>
<EMI ID = 50.1>
<EMI ID = 51.1>
which gives the esters of phenylalanine as an amino acid ester is the
the most typical case.
The proteases used in the present invention are preferably metalloproteases which have a metal ion in the active center. Suitable metalloproteases are enzymes from microorganisms, such as neutral proteases from ray fungus, Prolisine, Thermolycine, Collagenase, Cortulus atrox protease, etc. It is also possible to use crude enzymes such as Thermoase, Tacynase -N, Pronase, etc ... In order to prevent the action of esterase contained in the crude enzymes, it is better to use an enzyme inhibitor such as potato inhibitor with the crude enzymes . It is possible to use thiol proteases such as
papain, or serine proteases such as trypsin, however they have esterase activity. Therefore, care must be taken when carrying out the reaction using such an enzyme to prevent hydrolysis of esters.
In the syntheses according to the present invention, the peptide bond formation reaction is carried out in an aqueous medium, preferably aqueous solutions, under pH conditions where the protease exerts its enzymatic activity.
The reaction to form the peptide and amino carboxylic acid ester addition compound is also pH dependent. It is better to
to carry out the reactions according to the present invention in a pH range of about 4 to 9, particularly of about 5 to 8. Accordingly, the starting compounds, namely the N-substituted monoamino-dicarboxylic acids and the esters of the amino carboxylic acid can be in free form or in salt form, however, when they are both dissolved in the aqueous medium, it is necessary to adjust the pH in said range.
Suitable agents for adjusting the pH include inorganic or organic acids and bases such as hydrochloric acid, sulfuric acid and acetic acid; alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide: alkali metal carbonates such as
as sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate and potassium bicarbonate; organic and inorganic amines such as ammonia, trimethylamine, triethyl amine, ethanol amine, etc.
The amounts of hydrogen ions and hydroxy ions released in the reaction are equivalent and so the change in pH in the reaction is not high. Also, in order to prevent the variation of the pH, it is possible to use a buffering agent. In the industrial process, the pH should be controlled '
using a pH adjustment device in response to a pH detection device.
The aqueous medium is generally an aqueous solution. It is possible to add an organic solvent miscible with water to the aqueous medium as long as the solvent does not prevent the deposition of the product.
The reaction according to the present invention is carried out in a temperature range ranging from approximately 10 to 90 [deg.] C, preferably 20 to 50 [deg.] C, and this with a view to maintaining the enzymatic activity. . The reaction is usually <EMI ID = 52.1>
not critical.
The concentrations of all of the starting products in the reaction medium are not critical. The method according to the present invention
<EMI ID = 53.1>
are preferably higher. The solubilities of the addition compounds in water are relatively low. For example, the solubility of the additive compound
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
As a result, the concentrations can be relatively low and general.
<EMI ID = 56.1>
The ratio of the starting compounds used is not critical.
However, the reaction according to the present invention is to bind one molecule of :: - substituted monoamino-dicarboxylic acid to 2 ester molecules.
<EMI ID = 57.1>
starting materials is 1: 2, and the ratio actually used is generally in the range of 100: 1 to 1: 100, preferably 5: 1 to 1: 5, more particularly 2: 1 to 1: 3.
It is not always necessary to dissolve all the amounts of the starting materials in the aqueous medium, and it is possible to suspend partial amounts of the starting compounds since the concentrations of the starting materials decrease as the reaction progresses, and thus the starting products in suspension are gradually dissolved.
In this case, a change in pH may occur and it is then necessary to adjust the pH of the solution as the reaction continues.
The amount of protease used in the process according to the present invention is not critical. When the concentration of the enzyme is high, the reaction can be completed in a short time. When the concentration of the enzyme is low, the reaction time is prolonged. So she
<EMI ID = 58.1>
The peptide bond forming reaction according to the present invention occurs only on the L isomers and not on the D isomers. On the other hand, the amino acid esters used to carry out the addition reaction to form the compounds d The addition can be either in L form, or in D form or a mixture thereof. When using the amino carboxylic acid ester in DL form, the L isomer of the amino carboxylic acid ester in solution is consumed in peptide syntheses and thus the amino acid ester. The remainder having the predominant D form is used for the <EMI ID = 59.1> production of the adduct of the dipeptide ester and the amino carboxylic acid ester.
The reaction according to the present invention takes place in substantially quantitative yields when the concentrations of the starting materials are high. When two moles of the amino-carboxylic acid esters in DL form are used for one mole of N-substituted monoamino-dicarboxylic acid as L, the adduct substantially composed of the dipeptide ester LL and the amino carboxylic acid ester D can be obtained. Thus, the
The resulting adduct can be easily divided into two compounds namely the dipeptide ester LL and the amino acid ester D as described above.
Accordingly, the production of the dipeptide ester and the optical resolution of the DL amino carboxylic acid ester can be achieved simultaneously in this process.
The ester of the amino acid in the separate D form or in the predominant D form can be racemized according to a conventional method and the method can be used as a starting material for the method according to the present invention.
<EMI ID = 60.1>
in the DL form and the amino acid ester in the L form, the D isomer of the N-substituted monoamino dicarboxylic acid in the DL form is inert to remain in the aqueous medium and thus the compound can be obtained addition of the dipeptide ester LL and the amino carboxylic acid ester L. Accordingly, when the N-substituted monoamino dicarboxylic acid in D form is recovered from the aqueous medium, it is possible to simultaneously obtain the production of the addition compounds and the optical resolution of the N-substituted DL monoaminoacid dicarboxylic. When the recovered N-substituted-D-monoamino-dicarboxylic acid is racemized according to a conventional method, the product can be used as a starting material.
When using the N-substituted monoamino dicarboxylic acid in DL form and the amino carboxylic acid ester in DL form, the N-substituted DL monoamino dicarboxylic acid can be obtained from the aqueous medium and
the adduct of the dipeptide ester LL and the ester can be obtained
D-amino carboxylic acid, which can be divided into components such as in-
<EMI ID = 61.1>
Optics of the N-substituted DL monoamino dicarboxylic acid and the ester of the DL amino carboxylic acid can be simultaneously achieved.
According to the method of the present invention, it is possible to eliminate the steps of introducing and removing a protective group for the carboxyl group in the side chain which had been considered indispensable in the conventional methods. Consequently, the loss of the starting materials
can be eliminated. Product yield can be remarkably high <EMI ID = 62.1>
In the process according to the present invention, it is possible to use starting compounds in the DL form. In conventional processes using an enzyme, the D-isomer of the starting compounds in the DL form are not useful in the reaction although they do not affect this reaction, therefore they tend to cause
loss of starting materials. However, in the process according to the present invention, the starting compounds of type D can actually be used as
agent to deposit the dipeptide and it can be recovered afterwards.
In the method according to the present invention, the optical doubling
N-substituted DL amino dicarboxylic acid and DL amino carboxylic acid ester can be obtained simultaneously.
This invention further provides methods for decomposing the addition compounds. The additon compounds of formula (I) are mixed with an aqueous acidic solution and the dipeptide esters of
formula (VI) are then recovered by separation in the form of the remaining solid.
The acidic constituents of the acidic aqueous solution can be mineral or organic acids. Suitable mineral acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. Suitable organic acids include formic acid, acetic acid, citric acid, toluenesulfonic acid, etc. The concentration of the acid is not critical and can be chosen
according to the other conditions.
The component of acidic character in the aqueous solution of character
<EMI ID = 63.1>
that or more namely from 1 to 100 eq. preferably from 1 to 20 eq. more particular
<EMI ID = 64.1>
acidic character is used to ionize the ester unit of the amino carboxylic acid to give an aqueous solution of its salt.
In a few cases, the dipeptide ester (VI) does not require high purity. In such a case, it is possible to use an amount of the cons-
<EMI ID = 65.1>
it can be, for example, about 0.8 eq. for one mole of the adduct
(I).
The proportion of the aqueous solution of acidic character to the products
The starting point can be in a range where the dipeptide ester (VI) can exist in solid form since the resulting dipeptide ester (VI) is separated as a solid.
However, esters of dipeptide (VI) have low solubility in water or in aqueous solution of acidic character, for example, it is the
<EMI ID = 66.1> whose solubility is 0.028 g / 100 g of water and 0.017 / 100 g of acid
<EMI ID = 67.1>
aqueous solution of acidic character can be relatively high. In the
process according to the present invention, moreover, the addition compound
(I) is contacted with the aqueous solution of acidic character in order
to be in a condition of solid-liquid separation. Consequently,
it is not desirable to use too low proportions. Suitable amounts of the acidic aqueous solution are in the range of 1.5 to 50 parts by weight, preferably 2 to 10 parts by weight, per 1 part.
by weight of the addition compound (I).
The temperature for reacting the addition compound (I) with the aqueous solution of acidic character is generally within a range of
ranging from 0 to 100 [deg.] C, preferably 5 to 80 [deg.] C. When the stirring of the mixture
is sufficient, the decomposition of the addition compound (I) is completed after about 10 minutes.
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
to control the reaction time and the reaction temperature with precausion in order to avoid the elimination of this group.
According to the process, the addition compound is decomposed to produce the dipeptide ester (VI) and a salt of the amino acid ester (V) with an acidic component of the aqueous acid solution. A substantial part of
the dipeptide ester (VI) is in the solid state after the decomposition reaction, since it has low solubility in aqueous acidic solution as indicated above. Since the salt is well dissolved in the solution, the system
reaction becomes a mixture of the solid dipeptide ester and the salt solution which may contain an excess of the acid component. The resulting solid dipeptide ester can be separated in a conventional manner such as filtration or centrifugation. From the separated salt solution, the ester of the amino acid can be recovered in a conventional manner such as crystallization or solvent extraction after release of the ester from the amino acid.
According to this method, the dipeptide ester (VI) can be easily prepared and separated by decomposing the addition compound (I) and this without the need to use complicated extraction and treatment steps. ion exchange resin. The yield and purity of the dipeptide ester
(VI) can be remarkably high.
<EMI ID = 70.1>
used as sweetening material will be illustrated.
The other method of decomposing the addition compound (VI) in a
<EMI ID = 71.1> <EMI ID = 72.1>
phenylalanine ester (1: 1) is dissolved in a liquid medium and decomposed with an acid in the liquid medium to obtain the dipeptide ester having a single amino group of formula (VII).
Suitable liquid media used to dissolve the compound
<EMI ID = 73.1>
ketones such as acetone; organic solvents containing oxygen
such as dioxane and tetrahydrofuran; chlorinated lower hydrocarbons such as chloroform, methylene dichloride, ethylene dichloride; polar non-protonic organic solvents such as dimethyl formamide, dimethyl sulfoxide and liquid carboxylic acids such
as acetic acid and formic acid. You can use a mixture of two
or more solvents.
It is possible to use esters such as ethyl acetate and alcohols such as methanol, ethanol and propanol. When we use
<EMI ID = 74.1>
unwanted side such as transesterification reaction or esterification against the carboxyl group.
The adduct has low solubility in water.
Consequently, water itself is not suitable as a liquid medium.
in this case although it is possible to add water to the liquid medium
<EMI ID = 75.1>
vis-à-vis the liquid medium.
<EMI ID = 76.1>
liquid and the ability to dissolve with respect to the addition compound and
it is generally greater than 10 parts by weight, and preferably it
is in a range of 20 to 100 parts by weight per part by weight of the adduct.
The acids used to decompose the addition compound are Bronsted acids preferably mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, perchloric acid and organic acids. such as trifluoro acetic acid, p-toluene sulfonic acid, etc.
The proportion of the acid relative to the addition compound is
<EMI ID = 77.1>
or more of the acid per one mole of the adduct.
The concentration of the acid in the liquid medium is generally in the range of 0.1 to 10 N, preferably 1 to 5 N and it is desirable to decide the actual concentration by considering the other reaction conditions since the reaction may also depend on the time
<EMI ID = 78.1>
However, high concentrations exceeding the above ranges which can cause unwanted side reactions such as ester hydrolysis should be avoided.
The acid can be aqueous or anhydrous. When the water-immiscible liquid medium such as a chlorinated hydrocarbon is used it is preferable to use an anhydrous acid since if an aqueous acid is used it is formed.
two phases which leads to a very slow reaction.
The reaction temperature and time are not critical and generally the reaction proceeds at 20 to 100 [deg.] C for 10 minutes to 6 hours.
When using the acid in a lower concentration, the
reaction time may be longer or the reaction temperature higher. When the concentration of the acid is higher, it is desirable to choose a shorter reaction time or a lower reaction temperature.
After decomposition of the adduct, the resulting dipeptide ester
<EMI ID = 79.1>
acid (V) can be separated by the following methods. For example, after the reaction, the anise alcohol is extracted into a solvent phase formed by adding to the reaction solution suitable amounts of water and a solvent capable of forming a separate phase with water such as chloroform and
diethyl ether followed by mixing and allowing to stand to obtain two phases of solvent and water. Furthermore, the pH of the aqueous phase is adjusted from 5 to 6 with a base such as NaOH, NaHCO, Na2CO3, ammonia, triethyl amine, etc. and the deposited dipeptide ester having the single amino group (VII) is separated by filtration or the like. The pH of the filtrate is then adjusted from 8 to 10 with the base and the resulting free phenylalanine alkyl ester.
<EMI ID = 80.1>
etc. The dipeptide ester having the single amino group and the amina ester:
acid can also be easily recovered by conventional methods
using a cation exchange resin.
The optical doubling techniques discussed above are also applied in this case.
<EMI ID = 81.1>
lower alkyl, more particularly methyl or ethyl and 1.
Depending on the method, the removal of the fragmentary unit of the amino acid <EMI ID = 82.1>
carbonyl. of the dipeptide ester can be obtained simultaneously. The separated anise alcohol can be recovered and made into a p-methoxybenzyloxycarbonylation agent by reacting it with phosgene.
The present invention will be illustrated by certain examples which are given by way of illustration only.
Example 1
1335 mg (5 moles) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and
1,078 mg (5 moles) of hydrochloride of the methyl ester of L-phenylalanine are introduced into a 30 ml flask, 20 ml of water are added for the
<EMI ID = 83.1>
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin
<EMI ID = 84.1>
methyl ester of L-phenylalanine (1: 1); (Yield: 75.5% of
L-phenylalanine methyl ester hydrochloride).
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows.
<EMI ID = 85.1>
Elemental analysis (C32H37N309)
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
characteristics as described above.
<EMI ID = 88.1>
extracted 3 times with 30 ml of ethyl acetate The extracts are mixed
and washed with 20 ml of water (3 times) and dried with anhydrous magnesium sulfate. The solution is concentrated and the separation in the state of crystals takes place.
<EMI ID = 89.1>
physical properties and elemental analysis results of the product are as follows.
Melting point: 115 to 125 [deg.] C
<EMI ID = 90.1>
<EMI ID = 91.1>
<EMI ID = 92.1>
The infrared and NMR spectra show the characteristics expected for the methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine.
The results coincide with those of a compound obtained by benzyloxycarbonylation of the amino group of the methyl ester of L-aspartyl-L-phenylalanine.
The methyl ester of L-phenylalanine is recovered from a mixture of the hydrochloric acid phase and the washing water fraction separated by extraction of the ethyl acetate phase.
Accordingly, it is confirmed that the compound obtained by the foregoing reaction is an addition compound of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-L-phenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine. It is
<EMI ID = 93.1>
Example 2
<EMI ID = 94.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 1,078 mg (5 moles) of the hydrochloride of the methyl ester of L-phenylalanine, 10 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to 6 with aqueous ammonia. 7%.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin
<EMI ID = 95.1>
L-phenylalanine ester (1: 1) (yield: 99.1% based on chlorhy-
<EMI ID = 96.1>
Example 3
According to the process of Example 2 but by varying the amounts of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and of the methyl ester of L-phenylalanine to 534 mg (2 m moles) and 863 mg (4 m moles) respectively we perform the reaction
<EMI ID = 97.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and methyl ester of Lphenylalanine (1: 1). (melting point: 116-119 [deg.] C; yield: 70.4%
relative to N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid).
Example 4
534 mg (2 mol) of N- acid are introduced into a 30 ml flask.
<EMI ID = 98.1>
L-phenylalanine ester, 8 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.2 with 7% ammonia.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and
<EMI ID = 99.1>
from solution and dried to obtain 1099 mg of an addition compound of methyl ester -de N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine (1: 1) (yield: 90.5% based on N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid).
Example 5
It is dissolved in 5 ml of a McIlvain buffer solution (pH: 7.0)
267.2 mg (1 mole) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 537.6 mg
(3 moles) of L-phenylalanine methyl ester.
<EMI ID = 100.1>
of potato inhibitor and stirred at 38 [deg.] C for 20 hours. The precipitate is collected and washed with water and dried to obtain 580 mg of a crude crystalline adduct of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- methyl ester.
<EMI ID = 101.1>
123 to 125 [deg.] C; yield: 95.5% relative to N-benzyloxycarbonyl-Laspartic acid.
<EMI ID = 102.1>
<EMI ID = 103.1>
acid in H form is added to the solution with vigorous stirring, then the resin is separated and the filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue is dissolved in dimethyl formamide and water is added to the solution to
<EMI ID = 104.1>
melting point 123 to 125 [deg.] C).
Example 6
. 267.2 mg (1 m mole) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 358.4 mg (2 m moles) of methyl ester of L-phenylalanine are dissolved in 5 ml
<EMI ID = 105.1>
The resulting solution is mixed with 100 mg of Tacynase N and
100 mg of potato inhibitor and stirred at 38 [deg.] C for 6 hours.
The precipitate is collected and washed with water and dried to give 120 mg of the crude crystalline adduct of N-benzyloxycarbonyl L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester (1: 1). )
(melting point: 119-123 [deg.] C; yield: 19.7%).
According to the process of Example 5, the product is treated with a cation exchange resin of strongly acidic character in the form
H to obtain 50 mg of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartylL-phenylalanine methyl ester (melting point: 95 to 105 [deg.] C; yield: II, 7%).
\
Example 7
1,335 mg (5 mol) of N-benzyloxycarbonyl -L-aspartic acid and
1,078 mg (5 moles) of methyl ester of L-phenylalanine are introduced into a
<EMI ID = 106.1>
adjusted to 6.8 with triethylamine.
The resulting solution is mixed with 20 mg of Thermolysin and
<EMI ID = 107.1>
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
melting point: 120 to 12 [deg.] C
<EMI ID = 108.1>
Elemental analysis:
<EMI ID = 109.1>
Example 8
According to the process of Example 7, but adjusting the pH to 5.2, the reaction and the treatment are carried out which leads to the production of 753 mg of an addition compound of N-benzyloxycarbonyl methyl ester -L-aspartyl-L-
<EMI ID = 110.1>
relative to the methyl ester of L-phenylalanine).
Example 9
133.6 mg (0.5 mole) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 89.6 mg (0.5 mole) of L-phenylalanine methyl ester are dissolved in 2.5 ml of a solution Mcllvain buffer (pH: 7.0) with 0.07 ml of triethylamine.
<EMI ID = 111.1>
Thermoase and 50 mg of a potato inhibitor and stirred at 38 [deg.] C for
20 hours. The precipitate is collected by filtration, washed with water this
<EMI ID = 112.1> <EMI ID = 113.1>
overall 70% compared to the use of 50% of the amount of the starting methyl ester of L-phenylalanine).
Example 10
According to the process of Example 9 but using 0.05 ml of N-methyl morpholine instead of 0.07 ml of triethylamine, the reaction is carried out at
<EMI ID = 114.1>
<EMI ID = 115.1>
The product is treated with a cation exchange resin of strongly acidic character in H form according to the process of Example 9 to obtain
<EMI ID = 116.1>
Example 11
<EMI ID = 117.1>
and with stirring for 1 hour, the reaction was carried out to obtain 920 mg of an addition compound of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-Lphenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine (1: 1) (yield 75.8%).
Example 12
<EMI ID = 118.1>
<EMI ID = 119.1>
in a 30 ml flask, 2 ml of water are added to dissolve them and 5.5 ml of 1N NaOH are added to adjust the pH to 7.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and stirred
<EMI ID = 120.1>
lalanine (1: 1) (melting point 106-118 [deg.] C; yield 60.5%).
Example 13
<EMI ID = 121.1>
, in a 30 ml flask, 7 ml of water are added to dissolve them and. the pH is adjusted to 6 with 7% ammonia.
The resulting solution is mixed with 100 mg of Thermoase and stirred
<EMI ID = 122.1>
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
(2 mole) of methyl ester of L-phenylalanine are introduced into a 30 ml flask, 4 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to
<EMI ID = 125.1>
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermoase and stirred with
<EMI ID = 126.1>
ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and a methyl ester of
<EMI ID = 127.1>
Example 15
<EMI ID = 128.1>
potato inhibitor in the reaction solution, the reaction is carried out to give 381 mg of the same product (melting point 105 to 117 [deg.] C; yield 62.7%).
Example 16
<EMI ID = 129.1>
(4 moles) of DL-phenylalanine methyl ester hydrochloride are introduced into a 30 ml flask, 7 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.2 with ammonia at 7 %.
The resulting solution is mixed with 50 mg of T-hermolysin and stirred.
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
% relative to N-benzoylcarbonyl-L-aspartic acid).
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and nhexane solvent, which results in the product having the following physical properties and the results of elemental analysis:
Melting point: 127 to 135 [deg.] C
<EMI ID = 132.1>
<EMI ID = 133.1>
It is assumed that the product is the addition compound of the methyl ester.
<EMI ID = 134.1>
<EMI ID = 135.1>
the same characteristics as the product of Example 1.
<EMI ID = 136.1>
of methylene dichloride 3 times, the methylene dichloride phase is washed with water and dehydrated with anhydrous magnesium sulfate, the methylene dichloride is removed by distillation and the solid component is recrystallized from a mixture of solvent acetate d 'ethyl and n-hexane ce
<EMI ID = 137.1>
Elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 124 to 132 [deg.] C
<EMI ID = 138.1>
<EMI ID = 139.1>
<EMI ID = 140.1>
alanine.
The residual aqueous phase of extraction with methylene dichloride is mixed with sodium bicarbonate to adjust the pH to 8.7 and the product.
<EMI ID = 141.1>
tee with sulfate. anhydrous magnesium, hydrogen chloride is introduced into the hanging extract; About 10 minutes, the methylene chloride solution is concentrated and ethyl ether is added to the solution to recrystallize the product which gives 29.0 mg of methyl ester hydrochloride of D-phenylalanine.
<EMI ID = 142.1>
(the infrared spectrum and the NMR spectrum: coincide with those of the L form).
Therefore the hypothesis of the addition compound is correct.
<EMI ID = 143.1>
of D-phenylalanine (l: 1)
Example 17
<EMI ID = 144.1>
(4 moles) of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride are introduced into a 30 ml flask, 2 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to 6 with 7% ammonia.
<EMI ID = 145.1>
washed with 20 ml of water and dried to give 787 mg of an N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester adduct
and methyl ester of L-phenylalanine (1: 1) (melting point: 105 to 110 [deg.] C; yield 64.8% relative to N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid).
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate solvent.
25
<EMI ID = 146.1>
7.2 (C = 1, methanol).
Furthermore, N-benzyloxycarbonyl aspartic acid (mainly the D form) is recovered from the solution of the residual reaction.
Example 18
Example 17 is repeated but using methyl ester of DL-phenylalanine in place of methyl ester of L-phenylalanine to obtain 756 mg of an adduct of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L -phenylalanine and methyl ester of D-phenylalanine (1: 1) (melting point: 105 to 111 [deg.] C; yield 62.3% relative to N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid).
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate solvent.
<EMI ID = 147.1>
-6.5 (C = 1, methanol).
On the other hand, N-benzyloxycarbonyl aspartic acid (mainly the D form) is recovered from the residual reaction solution.
Example 19
5.34 g (20 moles) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 7.53 g
(42 moles) of methyl ester of L-phenylalanine are introduced into a 100 ml flask and 70 ml of water are added to dissolve it. A solution is obtained having a pH of 6.2 to 6.3.
The resulting solution is mixed with 200 mg of Thermolysin and stirred
<EMI ID = 148.1>
washed with 70 ml of water and dried to give 10.11 g of crystals (melting point:
117 to 120 [deg.] C). The product is confirmed to be an additive
<EMI ID = 149.1> L-phenylalanine ester (1: 1) since the product is recrystallized in a
<EMI ID = 150.1>
and the results of the elemental analysis of the product are as follows:
<EMI ID = 151.1>
Elemental analysis: C32H37N309
<EMI ID = 152.1>
Infrared and NMR spectra have the same characteristics
as mentioned above for the 1: 1 methyl ester addition compound
of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine with the methyl ester of Lphenylalanine. The product is also treated with a strong acid and extracted with an organic solvent such as ethyl acetate which is followed by the removal of the organic solvent by distillation to give the methyl ester.
<EMI ID = 153.1>
nine is introduced into a flask of 30 ml and 2 ml of water and 2.0 ml of
HC1-1N are added while stirring at room temperature for 10 minutes. The resulting slurry is filtered and the precipitate is washed with 4 ml of water and dried to give 0.72 g of crystals of N-benzyloxyearbonyl-Laspartyl-L-phenylalanine methyl ester (yield 98.8%).
The resulting crystals are dissolved in ethyl acetate and n-hexane is added to recrystallize the product - The physical properties and elemental analysis results of the final product are as follows:
Melting point: 121 to 1240 C
<EMI ID = 154.1>
Elementary analysis: C22H24N207
<EMI ID = 155.1>
The infrared spectrum of the product coincides with that of the standard compound.
Product identification is also confirmed by comparison
of an aqueous solution of the product with that of the standard compound in high speed liquid chromatography. The purity is measured according to this method to be 100%. The apparatus and conditions of high speed liquid chromatographic analysis are as follows. This method is used
For the estimation of the purity of the decomposition products of the adducts in the following examples unless otherwise indicated.
The same apparatus and conditions are used in the examples as far as this process is concerned.
High Speed Liquid Chromatography Apparatus:
(TSK-HLC 801 manufactured by Toyo soda K.K.)
Column: internal diameter 7.5 mm x length 30 cm;
<EMI ID = 156.1>
170 manufactured by Toyo Soda K.K.).
Eluent: 0.5% aqueous sodium acetate solution
Flow rate: 0.8 ml / min.
Pressure drop: 20 Kg / cm
Measuring temperature: ambient temperature
Detector: differential refractometer.
Example 20
1.00 g (1.65 mole) of the N-benzyloxy- methyl ester adduct
<EMI ID = 157.1>
in example 19 is introduced into a 30 ml flask, 2 ml of water and 1.32 ml of HCl-1N are added thereto and the mixture is stirred at room temperature
<EMI ID = 158.1>
0.70 g of fine prismatic crystals with a melting point of 100 to
126 [deg.] C (N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester content: 96.8%).
Example 21
0.53 � g (2 m moles) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 0.863 g
<EMI ID = 159.1>
in a 30 ml flask, 10 ml of water are added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.0 with 7% ammonia.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and stirred
<EMI ID = 160.1>
of water then dried, which gives 0.90 g of crystals having a melting point of 120 to 126 [deg.] C.
Part of the crystals are recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent to obtain the product which has a point
<EMI ID = 161.1>
<EMI ID = 162.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L methyl ester addition compound � phenylalanine and methyl ester of phenylalanine (1: 1).
<EMI ID = 163.1>
<EMI ID = 164.1>
Then the product is treated with an acid to form methyl ester
of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and of the methyl ester of D-pheny:
alanine in a molar ratio of 1: 1.
It is confirmed from these results that the resulting crystals correspond to the N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- methyl ester adduct.
<EMI ID = 165.1>
0.50 g (0.82 mole) of the adduct is mixed with 4 ml
of water and 0.26 g of citric acid and the mixture is stirred at room temperature for 10 minutes and treated in a manner similar to that of Example 19
which gives 0.35 g of crystals of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-Laspartyl-L-phenylalanine (purity: 100%; yield: 99.3%).
Example 22
<EMI ID = 166.1>
carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine obtained:
in example 19 are introduced into a 30 ml flask, 4 ml of water and 0.24 g
(1.2 mole) of p-toluenesulfonic acid monohydrate are added and treated by the process of Example 19 to obtain 0.33 g of methyl crystals
<EMI ID = 167.1>
ment: 93.6%).
Example 23
0.45 g (8.2 moles) of 85% formic acid and 8 ml of water are introduced:
in a 30 ml round-bottomed flask 0.50 g (0.82 mole) of the adduct of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and of methyl ester of L-phenylalanine obtained in l Example 19 are added and the mixture is stirred at room temperature for 20 minutes then the product is filtered and washed with 10 ml of water and dried to give 0.312 g of white crystals
of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine (purity:
100%; yield: 88.6%).
Example 24
0.47 g (8.2 moles) of glacial acetic acid and 8 ml of water are introduced into a 30 ml flask, 0.50 g (0.82 mole) of the methyl addition compound
<EMI ID = 168.1>
L-phenylalanine are added and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes then the product is filtered and washed with 10 ml of water and dried
<EMI ID = 169.1>
partyl-L-phenylalanine (purity: 100%; yield: 87.2%).
Example 25
<EMI ID = 170.1>
3 minutes then treated in a manner similar to that of Example 19 to obtain 0.35 g of crystals of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-
<EMI ID = 171.1>
Example 26
0.594 g (2 m moles) of N-p-methoxybenzyloxycarbonyl-L-aspartic acid
<EMI ID = 172.1>
are introduced into a 30 ml flask and NaOH-1N is added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.0.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and stirred
<EMI ID = 173.1>
washed with 10 ml of water and dried to give 0.928 g of crystals having a
<EMI ID = 174.1>
phenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine (1: 1).
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent, which. gives the product. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 72 to 76 [deg.] C
<EMI ID = 175.1>
<EMI ID = 176.1>
Infrared spectrum.
<EMI ID = 177.1>
<EMI ID = 178.1>
<EMI ID = 179.1>
These results show that the product is the adduct of formula
<EMI ID = 180.1>
3 minutes.
The resulting slurry is filtered and washed with 6 ml of water and then dried to give 0.38 g of crystals.
It is confirmed from the following results that the product is the methyl ester
<EMI ID = 181.1>
added to recrystallize to obtain the product. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 128 to 130 [deg.] C
<EMI ID = 182.1>
<EMI ID = 183.1>
Infrared spectrum:
<EMI ID = 184.1>
<EMI ID = 185.1>
These results show that the final product is the compound of formula
<EMI ID = 186.1>
<EMI ID = 187.1>
The resulting aspartyl-L-phenylalanine are dissolved in 2 parts by weight of acetone and 1 part by weight of HCl-4N is added to the resulting solution, then the mixture is heated in a water bath at gentle reflux for 1.5 hours to decompose it completely in order to form a solution containing the main constituents, methyl ester of L-aspartyl-L-phenylalanine, methyl ester of L-phenylalanine and anise alcohol, solution from which we obtain
L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester.
Example 27
0.562 g (2 m moles) of N benzyloxycarbonyl-L-glutamic acid and 0.860 g
<EMI ID = 188.1>
30 ml flask, 1N NaOH is added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.0.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and
<EMI ID = 189.1>
with 10 ml of water and then dried, which gives 0.510 g of crystals having a melting point of 80 [deg.] C to 85 [deg.] C.
The following results confirm that the product is an addition compound of N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanine methyl ester and
<EMI ID = 190.1>
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent to give the product. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 92 to 97 [deg.] C
<EMI ID = 191.1>
Elemental analysis: C33H39N309
<EMI ID = 192.1>
Infrared spectrum:
<EMI ID = 193.1>
<EMI ID = 194.1>
These results show that the product is the adduct of formula
<EMI ID = 195.1>
and the mixture is then stirred at room temperature for 15 minutes.
The resulting white precipitate is filtered off and washed with 3 ml of water and then dried, which gives 0.683 g of crystals.
The following results confirm that the product is the methyl ester
<EMI ID = 196.1>
95.8%).
The crystals are dissolved in ethyl acetate and n-hexane is added to recrystallize and obtain the product.
The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 97 to 99 [deg.] C
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1>
Infrared spectrum:
<EMI ID = 199.1>
<EMI ID = 200.1>
<EMI ID = 201.1>
These results show that the final product is the compound of formula
<EMI ID = 202.1>
can be converted by reduction with hydrogen to Lglutamyl-L-phenylalanine methyl ester and it can also be transformed by hydrolysis
<EMI ID = 203.1>
Example 28
0.686 g (3.12 moles) of hydrochloride is introduced into a 100 ml flask.
<EMI ID = 204.1>
an aqueous solution of 2N NaOH to the solution by: cooling with ice and stirring to have a pH of 7.5, gradually add 0.360 g
(1.44 mole) N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid anhydride to the solution by stirring and maintaining the pH 7.0-7.5 by adding an aqueous solution of NaOH-2N. After the addition, the mixture is further stirred for 2 hours, and an aqueous solution of 1N HCl is added to the reaction mixture to have a pH of 6. The resulting precipitate is collected by filtration, washed with 50 ml.
<EMI ID = 205.1>
L-phenylalanine ester (1: 1) (melting point 108-115 [deg.] C). During the reaction, a considerable amount of N-benzyloxycarbo- methyl ester
<EMI ID = 206.1>
remains in the filtrate and the wash water.
In a 12 ml beaker, 0.200 g (0.329 mole) of the resulting adduct, namely the methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspar- is added.
<EMI ID = 207.1>
<EMI ID = 208.1>
mixing at room temperature for 15 minutes.
The resulting white precipitate is filtered, washed with 3 ml of water and dried to give 0.136 g (yield-96.3%) of crystals of methyl ester of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine (containing 17% methyl
<EMI ID = 209.1>
melting: 110 [deg.] C to 118 [deg.] C).
Example 29
In a 30 ml flask, dissolve in 5 ml of water 0.543 g (2 m moles)
<EMI ID = 210.1>
ethyl ester of N-phenylalanine, and an aqueous solution of NaOH- <EMI ID = 211.1> is added
4N to adjust the pH to 6.
The resulting solution is mixed with 50 mg of Thermolysin and the
<EMI ID = 212.1>
The product is confirmed to be the ethyl ester addition compound
N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine and ethyl ester of L-phenyla
<EMI ID = 213.1>
The product is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and n-hexane solvent and the physical properties and the results of elemental analysis of the product are as follows:
Melting point: 93 to 95 [deg.] C
<EMI ID = 214.1>
Elemental analysis: C34H41N309
<EMI ID = 215.1>
Infrared spectrum: 3300 cm "(N-H stretching vibration);
<EMI ID = 216.1>
<EMI ID = 217.1>
<EMI ID = 218.1>
<EMI ID = 219.1>
<EMI ID = 220.1>
and 1.
In a 30 ml flask, 0.125 g (0.197 mole) of the resulting addition compound of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine ethyl ester and
<EMI ID = 221.1> <EMI ID = 222.1>
bonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine (purity: 100%; yield 92.6%). The crystals are recrystallized from a mixture of ethyl acetate and nhexane solvent, which yields the product. The physical properties and elemental analysis results of the product are as follows:
Melting point: 128 to 135 [deg.] C
<EMI ID = 223.1>
<EMI ID = 224.1>
Infrared spectrum:
<EMI ID = 225.1>
Example 30
5.00 g (16.82 m moles) of Np-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 7.26 g (33.64 m moles) of methyl ester hydrochloride of L-phenylalanine are introduced into a flask of 100 ml, an aqueous solution of 1N NaOH is added to dissolve them and the pH is adjusted to 6.0.
<EMI ID = 226.1>
The precipitate is collected by filtration, washed with 100 ml of water and then
dried to give 8.11 g of crystals having a melting point of 88 to
92 [deg.] C. (yield: 75.6% as an adduct of the methyl ester of N-p-
<EMI ID = 227.1>
and n-hexane and the resulting crystals exhibit substantially the same physical characteristics and elemental analysis results as the adduct prepared in Example 26.
<EMI ID = 228.1>
A part of the reaction mixture is mixed with water, an aqueous solution of 1.2N NaHCO3 and cyclohexane as an internal standard to prepare the sample and the conversion to the methyl ester c � -L-aspartylL-phenylalanine is confirmed by high speed liquid chromatography. The yield is 72.7
Example 31
<EMI ID = 229.1>
are obtained in Example 30 are introduced into a 20 ml flask.
According to the process of Example 30 but using dioxane at the
Instead of acetone, decomposition of the adduct and analysis of the product is carried out.
<EMI ID = 230.1>
Example 32
The process of Example 31 is repeated but using methanol in place of dioxane. The yield of the methyl ester of C � - L-aspartyl-L-phenylalanine is 63.3%.
Example 33
The process of Example 31 is repeated but using N, N-dimethylfor �
<EMI ID = 231.1>
Example 34
<EMI ID = 232.1>
<EMI ID = 233.1>
Example 35
<EMI ID = 234.1>
90 [deg.] C for 20 minutes instead of 60 [deg.] C for 1 hour. The yield of
<EMI ID = 235.1>
Example 36
The process of Example 34 is repeated but using 4.5 ml of dioxane and 0.5 ml of an HCl-dioxane solution (5.3 N) instead of 4 ml and 1 ml respectively of these compounds as well as by carrying out the reaction at 90 [deg.] C
<EMI ID = 236.1>
<EMI ID = 237.1>
Example 37
The process of Example 34 is repeated but using 3 ml of dioxane <EMI ID = 238.1> L-phenylalanine is 98.6% ..; '
<EMI ID = 239.1>
<EMI ID = 240.1>
<EMI ID = 241.1>
of a dioxane-HCl solution (5.3N) respectively. The yield of methyl ester
<EMI ID = 242.1>
Example 39
<EMI ID = 243.1>
<EMI ID = 244.1>
<EMI ID = 245.1>
<EMI ID = 246.1>
L-aspartyl-L-phenylalanine and methyl ester of L-phenylalanine (1: 1)
which are obtained in Example 30 are dissolved in 2 ml of dioxane, then
3 ml of trifluoroacetic acid are added to make them react at 60 [deg.] C for
1 hour.
The reaction mixture is evaporated under reduced pressure.
then water triethylamine and cyclohexanone as standard
<EMI ID = 247.1>
<EMI ID = 248.1>
dioxane-HCl (5.3 N) are introduced into a 50 ml flask, and the mixture is stirred at 60 [deg.] C for 1 hour to make them react. The dioxane is removed by distillation of the reaction mixture under reduced pressure, 6 ml of water and
<EMI ID = 249.1>
stirring then the two phases are separated. Another 10 ml of diethyl ether is added to the aqueous phase to extract the product in a manner similar to that described above. The last extraction is repeated 3 times.
The diethyl ether phases are taken up and washed with 5 ml of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate for 2 times, and dehydrated with anhydrous magnesium sulfate. The diethyl ether is removed by distillation under reduced pressure which leads to the production of 0.1T6 g (yield
81.2%) of raw anise alcohol.
The aqueous phaqe is neutralized with a 7% aqueous solution of hydro-
<EMI ID = 250.1> all night long. The resulting precipitated crystals are filtered off and washed with
2 ml of water then dried, which gives 0.316 g (yield 68.5%) of methyl ester
"J
of crude L-aspartyl-L-phenylalanine.
<EMI ID = 251.1>
<EMI ID = 252.1>
<EMI ID = 253.1>
<EMI ID = 254.1>
of anhydrous magnesium.
<EMI ID = 255.1>
<EMI ID = 256.1>
introduced into a 30 ml flask then dissolved with the addition of a solution
<EMI ID = 257.1>
<EMI ID = 258.1>
<EMI ID = 259.1>
of methyl ester of L-phenylalanine (1: 1). This is confirmed by the analyzes below.
The product is recrystallized from a mixture of methanol solvent and
<EMI ID = 260.1>
<EMI ID = 261.1>
Melting point: 82 to 87 [deg.] C
<EMI ID = 262.1>
<EMI ID = 263.1>
<EMI ID = 264.1>
following: Infrared spectrum:
<EMI ID = 265.1>
<EMI ID = 266.1>
<EMI ID = 267.1>
These results show that the product is the adduct of formula
<EMI ID = 268.1>
benzy �, etoxy and 1.
<EMI ID = 269.1>
resulting in place of the methyl ester addition compound of N-p-methoxycar � bonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine with the methyl ester of L-phenylalanine to prepare the ethyl ester of L-aspartyl -L-phenylalanine. The yield of ethyl.-
<EMI ID = 270.1>
1.725 g (8 m mol) of methyl ester hydrochloride of D L-phenylalanine are introduced into a 30 ml flask and dissolved with the addition of a solution
<EMI ID = 271.1>
your.
The precipitate is collected by filtration and washed with 30 ml of water.
then dried to give 2, 109 g of crystals having a melting point of
119 to 128 [deg.] C and the product is recrystallized from a mixture of acetate solvent
<EMI ID = 272.1>
of D-phenylalanine (1: 1) hemihydrate and this by virtue of the analyzes indicated below.
The physical characteristics and the results of the elemental analysis are as follows:
Melting point: 131 to 133 [deg.] C
<EMI ID = 273.1>
<EMI ID = 274.1>
Infrared and NMR spectra show the same characteristics as
<EMI ID = 275.1>
ppm due to the disturbances caused by the presence of water since the product contains water of crystallization as explained above.
A sample of 1.5024 g of the product is heated by microwave irradiation
<EMI ID = 276.1>
Elemental analysis of the irradiated sample gives the following results:
<EMI ID = 277.1>
The infrared and NMR spectra of the irradiated sample give the same
<EMI ID = 278.1>
26.
1.0 g of the irradiated sample is mixed with 4 ml of water and 2 ml of HCl-1N then the resulting mixture is stirred at 60 [deg.] C for 3 minutes. After solid-liquid separation of the resulting slurry, the methyl ester of N-p-methoxycarbonyl-L-phenylalanine and the methyl ester of D-phenylalanine are recovered in a 1: 1 molar ratio of the solid phase and the liquid phase respectively. .
<EMI ID = 279.1>
resultant addition compound (hemihydrate instead of the addition compound obtained in
<EMI ID = 280.1>
<EMI ID = 281.1>
Example 144
0.3 g of N-p-methoxybenzyloxycarbo- methyl ester addition compound
<EMI ID = 282.1>
(0.31N). To react at 60 [deg.] C for 2 hours. The reaction mixture is worked up under reduced pressure to distill off the materials.
<EMI ID = 283.1>
internals are added to the residue to prepare a sample and. sample <EMI ID = 284.1>
<EMI ID = 285.1>
1. As new industrial products, the addition compounds of formula
<EMI ID = 286.1>
<EMI ID = 287.1>
benzyloxycarbonyl which may have nuclear substituents, a group
<EMI ID = 288.1>
<EMI ID = 289.1>
a lower alkoxyl, benzyloxy or benzhydryloxy group and n represents 1 or 2.
2. As new industrial products., Addition compounds according to