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PROCEDEAMELIOREPOURLAPREPARATIONDETRIPEPTIOE ALDEHYDES
La présente invention est relative à un procédé amélioré pour la préparation de tripeptide aldéhydes de formule 1 :
P-D-Phe-Pro-Arg-H. H2S04 1 dans laquelle :
R est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle.
Phe est un groupe phénylalanines
Pro est un groupe L-proline et
Arg est un groupe L-arglnine, ayant une pureté convenable pour une utilisation pharmaceutique.
[Les abréviations de la L-proline et de la L-arginine sont Pro et Arg selon l'art antérieur, voir par exemple Biochem. 7, 126, 773 (1972),Biochemistry14,449(1975)].
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On sait que les sels de D-phényialanul-L-prolyl-Larginine aldéhyde (H-D-Phe-Pro-Arg-Hj présentent une activité antithrombine. Cependant, l'acétate décrit dans le brevet hongrois Ho 169. 870 ne convient pas pour une utilisation thérapeutique parce qu'il perd très rapidement son activité, soit sous forme solide soit sous forme d'une solution aqueuse. Le même phénomène peut être observé dans le cas du chlorhydrate, du citrate, du tartrate, du tosylate et du dérivé NG-carboxy du tripeptide aldéhyde. Cependant, le sulfate de H-D-Phe-Pro-Arg-H et le dérivé N-méthyle de celui-ci sont extrêmement stables, même sous forme de solution aqueuse (brevet britannique No 2. 091. 270 et demande publiée de brevet européen No 185. 390) et peuvent donc être utilisés dans le domaine thérapeutique.
Les sulfates ci-dessus peuvent être préparés de la façon suivante :
1. Le sulfate de H-D-Phe-Pro-Arg-H peut être préparé selon le brevet britannique No 2. 091. 270 à partir de l'hémisulfate de
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t-butoxycarbonyl-D-phènylalanul-L-prolyi-L-arginine aldèhyde ou . partir du t-butoxycarbonyl-D-phényialanyi-L-prolyl-NOcarboxu-L-argtntne afdehude en présence de 1 à 12 équivalents d'acide sulfurique aqueux 1 à 12 N à une température de 40 à 50. C.
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La préparation de la première matière de départ est décrite dans l'exemple 1 du brevet cité plus haut, tandis que la préparation du
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dérivé N'--carboxu-protégé est décrite dans ! e brevet belge No. e 880. 844.
2. Le sulfate de H-O-Phe-Pro-Arg-H peut être également préparé selon la description indiquée plus haut, par hydrogénolyse du benzutoxucarbonut-D-phénuiatanut-L-protut-NS-benzutoxucarboxy-L-arginine aldéhyde (Z-D-Phe-Pro-ArgtZJ-Hj en présence d'une quantité molaire équivalente d'acide sulfurique. La préparation du tripeptide aldéhyde doublement protégé utilisé comme matière de départ, est décrite dans le brevet hongrois No.
169. 870.
3. Selon la demande publiée de brevet européen No 1 85. 390,
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le sulfate de N-méthut-D-phénutatanut-L-protut-L-argtntne atdéhude H-t-D-MePhe-Pro-Arg-H. HgSCJ est préparé selon une méthode analogue a celle du sulfate de tripeptide aldéhyde libre par élimination des groupes protecteurs du N-benzyloxycarbonyl-N- ¯41oxycarbonyi-Nméthut-Q-phénutatanut-L-protut-NO-benzutoxucarboxu-L-arginine aldéhyde au cours d'une hydrogénolyse en présence d'acide sulfurique. La préparation du tripeptide aldéhyde utilisé comme matière de départ est décrite dans la même demande.
Le principal inconvénient des procédés ci-dessus réside en ce que, si la production est conduite à grande échelle, ils ne fournissent pas un produit ayant une pureté appropriée.
Ainsi par exemple, le produit obtenu par le procédé No 1 comprend environ 4 à 6% de sulfate de calcium. Une analyse chromatographique en couche mince indique que le produit ainsi obtenu peut comprendre plus d'environ 10% d'autres impuretés (par exemple, tripeptide alcool, -acide, -acétal) en plus du sel de calcium,, ceci signifie que la quantité totale de substances contannnantes peut dépasser 20%. Il y a un autre inconvénient en ce que la neutralisation de l'excès d'acide sulfurique et la filtration du 3ulfate de calcium précipité soulèvent d'autres difficultés.
Le sulfate de tripeptide aldéhyde préparé par le procédé No 2 (hudrogénotuse) comprend en plus des 5 à 10% de
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contaminant détectables par analyse chromatographique en couche mince, une teneur de 10 à 155% de sulfate de tripeptide atdéhude de configuration D-L-D déterminée pan analyse HPLC ; aidehyde de confi minee par ainsi, il peut y avoir un total de 15 a zu de contaminants.
Les 5 à 0% de contaminants indiqués pius haut sont composés des substances suivantes : tripeptide acide formé pendant la synthèse du tripeptide aldéhyde, tripeptide alcool, un produit de décomposition cyclique dont la structure est décrite dans la demande de brevet européen publiée No 185. 390 et une substance de structure inconnue formés en différentes quantités, dont la tache est située en-dessous de celle du composé cible sur le chromatogramme.
On a observé que la"surhydratation"joue un rôle important dans la production du dernier produit secondaire. A savoir, si l'hydrogénolyse est effectuée de façon connue en ellemême, c'est-à-dire en présence d'un équivalent molaire d'acide sulfurique à température ambiante et que le procédé est poursuivi après achèvement de l'hudrogénolyse, une tache supplémentaire (Rf = 0, 39 à 0, 44) correspondant à une contamination apparaît toujours en-dessous de la tache du produit (dans le cas de H-D- Phe-Pro-Arg-H.
H2S04, Rf = 0,52 à 0, 571 sur le chromatogramme en couche mince (adsorbant : Kiesetget S, étuant : mélange 26/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau ; révélateur : chlorotolidinej, cette contamination représentant dans certains cas la principale impureté.
Pour éliminer cette contamination, le point final de la réaction doit être détecté très exactement et la réaction doit être arrêtée lorsque le point final est atteint.
Cependant, comme le point final de la réaction est déterminé par analyse chromatographique en couche mince et que l'analyse demande 20 à 30 minutes, si le mélange éluant ci-dessus est mis en oeuvre, la réaction ne peut pas être stoppée au point final en particulier dans des conditions industrielles. Ainsi, le
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produit secondaire ayant la valeur Rf définie plus haut est généralement produit en une quantité d'environ 3 à 4% en raison
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d'une"surhudratation". Ce produit secondaire est plus toxique que le produit final et il dot donc être éliminé également pour cette raison.
Le produit risque fortement de subir une racémisation, si bien que les substances contaminantes formées pendant les procédés décrits ci-dessus ne peuvent pratiquement pas être enlevées. Comme le produit final ne peut pas être purifié, la production d'intermédiaires ayant une pureté convenable et la suppression de la formation du produit secondaire doivent être résolues pour fournir un produit final dont la pureté convient pour une utilisation pharmaceutique. Ceci signifie l'inhibition de la racémisation pendant te procédé.
Le but de la présente invention est de fournir un procédé qu ! permet de supprimer la formation des produits secondaires mentionnés ci-dessus et de préparer des sels de tripeptide aldéhydes de formule 1 ayant une pureté d'au moins 95%.
L'invention repose sur la constatation selon laquelle la formation du produit D-L-D, c'est-à-dire la racémisation, est
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fortement influencée par le pH. Dans un milieu ayant un pH alcalin et même dans un milieu ayant un pH neutre, le produit final et les intermédiaires subissent une racémisation. Dans un milieu ayant un pH acide (pH = 2), le produit final est stable pendant des mots. Il faut donc élaborer une technologie qui assure que le pH du mélange réactionnel ne devient pas neutre ou même basique en peu de temps.
Pour cela, l'arginine lactame est libéré à partir de son sel in situ pendant la condensation, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte, du chlorhydrate de NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame de formule tV :
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où Arg est tel que décrit plus haut et Z est un groupe benzyioxucapbonyle, et du dipeptide de formule V
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ou P. Phe. Pro et Z sont tels que définis plus haut, de telle sorte o u que la base est par la suite ajoutée au mélange réactionnel. Dans
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cas conditions.. i'ar'ginine iactame libéré in situ réagit tout de suite, in statu nascendi, avec l'anhl In statu nascendi, avec i'anhudride mixte en donnant le tripeptide lactame protégé correspondant de formule fi)
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où Z, P.
Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, si bien que la formation d'un milieu basique aboutissant à une racémisation peut être éliminée.
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De plus, la présente invention repose sur la constatation selon laquelle, si le complexe formé avec l'hydrure boroaluminique pendant la réduction du tripeptide lactame protégé de formule t ! ! obtenu de la façon décrite plus haut, est décomposé de telle manière que le milieu réactionnel est ajouté à la solution d'acide sulfurique froide (0-SOC) diluée, de préférence 1 N utilisée en excès, contrairement au procédé de la demande de brevet européen No 185. 390, dans lequel l'acide sulfurique est ajouté au mëlange réactionnel, le pH acide du mélange réactionnel peut être assuré. Ainsi, la racémisation du tripeptide aldéhyde protégé peut être évitée ou notablement réduite.
De plus, la présente invention repose sur la constatation selon laquelle l'hydrogenolyse du tripeptide aldéhyde de formule ! préparé de la façon décrite plus haut, doit être effectuée en présence d'un excès d'acide sulfurique à une faible température inférieure à 10. C, de préférence comprise entre 6 à 8 C.
Les données expérimentales de la Demanderesse ont montré que si l'hydrogénolyse de Z-D-Phe Pro-Arg (Z)-H était effectuée à différentes températures en présence d'un équivalent molaire d'acide sulfurique, les impuretés détectables par analyse chromatographique en couche mince du produit ainsi obtenu étaient les suivantes : 17% à 40 C, 10% à tenmpérature ambiante (20- 26 C), 4% à 6-10 C. Les teneurs en isomère D-L-D du produit détectables par HPLC étaient le suivantes : 12%, 5% et 2 à 3%, respectivement, c'est-à-dire que la teneur totale en impuretés du produit était de 29, 15 et 6-7, respectivement.
Ceci signifie que si l'hydrogénolyse est réalisée à des températures inférieures. la
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quantité de sous-produits est notablement réduite tandis que le temps nécessaire à l'hydrogenolyse n'augmente pas remarquablement avec la réduction de température.
Si l'hydrogénolyse est réalisée à des températures inférieures en présence d'un excès d'acide sulfurique, on observe un grand avantage supplémentaire en ce que la formation du sousproduit ayant un Rf de 0. 39 à 0,44 peut être notablement réduite et que la détection exacte du point final de la réaction n'est ainsi pas nécessaire. Selon les expériences de la Demanderesse, si 'hydrogénolyse de Z-O-Phe-Pro-Arg (Z)-H est réalisée en présence de 1.5 à 1,7 équivalent molaire d'acide sulfurique dans du tétrahudrofuranne a une température de 6 à 8'C, le produit secondaire ayant la valeur Rf ci-dessus est formé qu'en traces même après une heure de "surhydratation".
De plus, il est préférable d'utiliser de l'acide sulfurique au cours de toutes les étapes du procédé parce que dans le cas où par exemple de l'acide chlorhydrique est utilisé, le sulfate peut être contaminé par des ions chlorure.
A la suite des réactions menées de la façon indiquée plus haut, la quantité d'isomère O-L-O dans le produit final de formule 1 est d'au plus 2 à 4%, tandis que les autres contaminants (tripeptide acide et-alcool) sont formes en une quantité inférieure à 1%.
A partir de ce qui précède, l'invention se rapporte à un procédé amélioré pour la préparation de tripeptide aldéhydes de formule 1.. dans laquelle R, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, sous une forme pure du point de vue pharmaceutique, par condensation d'un lactame de formule IV, dans laquelle Arg est tel que défini plus haut et Z est un groupe benzyloxycarbonule, avec un dipeptide de formule V, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Z sont tels que définis plus haut, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte, réduction du tripeptide lactame de formule ttt dans laquelle R, Z,
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Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, avec de l'hydrure aluminolithlque,
et hydrogénolyse du tripeptide aldéhyde protégé de formule Il ainsi obtenu, dans laquelle P., Z, Phe et Arg sont tels que
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définis plus haut, en présence d'acide sulfurique, qui comprend : al) la libération du L-arginine lactame NG-protégé in situ pendant la condensation du chlorhydrate de L-arginine tactame NG-protégé de formule IV, dans laquelle Z est tel que défini plus haut avec du dipeptide de formule V, dans laquelle R, Z, Phe et Pro sont tels que définis plus haut, par l'intermédiaire d'un anhydride mixte dans le mélange réactionnel, par addition ultérieure d'une base au mélange de ces composants réactionnels, puis la réduction du tripeptide lactame protégé ainsi obtenu de formule ttt,
dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, la décomposition du complexe ainsi formé par addition du mélange réactionnel à un excès d'acide sulfurique 1 N à une température de 0 à SOC, puis la réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut à une température inférieure à 1 O'C en présence de 1 à 2 équivalents molaires d'acide sulfurique ou a2) après réduction du tripeptide lactame protégé de formule ttt, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, la décomposition du complexe ainsi formé par addition du mélange réactionnel à un excès d'acide sulfurique 1 N à une température de 0 à 5'C,
puis la réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il ainsi obtenu, dans laquelle R, Z, PHe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, à une température inférieure à 1 onc en présence de 1 ou 2 équivalents molaires d'acide sulfurique ou a3) ta réalisation de l'hydrogénolyse du tripeptide protégé de formule Il, dans laquelle R, Z, Phe, Pro et Arg sont tels que définis plus haut, à une température inférieure à 10 C en présence de 1 ou 2 équivalents molaires d'acide sulfurique.
Selon la présente invention, la réaction est de préférence conduite de la façon suivante :
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Le groupe t-butoxycarbonyle protecteur du tbutoxycarbonyl-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame est éliminé de façon connue per se. Le chlorhydrate de Nom- benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame de formule IV ainsi obtenu
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est maintenu en solution dans du diméthulformamide à une température de-1 5'C a-20'C, puis la solution est ajoutée à l'anhydride mixte forme à partir du dipeptide de formule V
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t. benzutoxucarbonut-D-phénutatanut-L-protine ou N-méthut- benzyloxycarbonyl-O-phénylalanyl-L-proline) et de l'ester isobutylique d'acide chlorocarbonique. La base..
de préférence) la trièthylamane est ensuite ajoutée au mélange réactionnel. Dans ces conditions, le lactame libéré in situ sous faction de la base, réagit aussitôt avec l'anhydride mixte pour former un tripeptide lactame protégé et ainsi la formation du milieu basique provoquant la racémlsation peut être évitée. Si cela est désiré, le produit ainsi obtenu peut être purifié au cours d'une purification rapide à travers un lit de gel de silice. En choisissant la séquence
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d'opérations ci-dessus, qui diffère de celle de fart antérieur, il est inutile de procéder à une purification coûteuse du tripeptide lactame protégé par chromatographie sur cotonne.
Le tripeptide lactame protégé de formule tti ainsi obtenu est réduit par de l'hydrure aluminolithique dans du tétrahydrofuranne anhydre. Le complexe ainsi formé est décomposé, contrairement à ce que préconise la demande de brevet européen No 185.390, par addition du mélange réactionnel à une solution diluée de préférence 1 N d'acide sulfurique utilisée en excès avec refroidissement à une température de 2 à 4'C. Le pH final de 2-3 est ajuste par addition facultative d'acide sulfurique.
Le mélange réactionnel est ensuite traité de façon connue per se.
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Le tripeptide aldèht Le trtpeptide atdéhude protégé de formule Il ainsi obtenu est purifié par filtration à travers un lit de gel de silice.
L'hydrogenolyse est de préférence réalisée dans un solvant organique polaire, de préférence te tétrahudrofuranne ou un alcanol inférieur, par exemple le méthanol, l'éthanol, l'i-propanol, de préférence l'éthanol. Il est préféré de ne pas effectuer l'hydrogénolyse dans un système fermé, mais plutôt de faire barbotter de l'hydrogène dans le mélange réactionnel. En pratique,
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on fait barbotter de l'hydrogène gazeux à travers le système sous jstème : sous une forme finement divisée qui, par exemple, peut être assurée par
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passage du gaz à travers un filtre G2.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé, te tripeptide aldéhyde protégé de formule Il de pureté convenable ainsi préparé, est dissous dans du tétrahtjdrofuranne et la solution ainsi obtenue est ajoutée à une suspension aqueuse refroidie de catalyseur comprenant 1, 5 à 1, 7 équivalent molaire d'acide sulfurique 1 N. Le raport du solvant organique Åa la fraction aqueuse est de 70-50/30-50, de préférence de 60/40. En tant que catalyseur, on utilise de préférence de 10 à 30% en poids d'un catalyseur comprenant 1 0% de palladium sur du charbon ou du platine. L'hudrogénation est conduite sous refroidissement à une température de 6-8 C, par barbottage d'hydrogène gazeux finement divisé à travers le système.
Le déroulement de la réaction est suivi par analyse chromatographique en couche mince.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé, le tripeptide aldéhyde protégé utilisé comme matière de départ, est dissous dans du tétrahudrofuranne et un catalyseur comprenant ! ; en poids de palladium précipité sur un support de sulfate de baryum ou d'oxyde d'aluminium, de préférence de sulfate de baryum, est utilisé en tant que catalyseur.
L'hydrogénation est effectuée à une température de 6 à 8'C en présence de 1,5 équivalent molaire d'acide sulfurique 1N par barbottage d'hydrogène gazeux finement divisé dans le système. Le déroulement de la réaction est suivi par analyse chromatographique en couche mince.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé. le tripeptide protégé de départ est dissous dans de l'éthanol, puis la solution est ajoutée à une suspension refroidie aqueuse de catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon. L'hydrogénation est conduite à une température de 6 à
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8'G par barbotage d'hydrogène gazeux finement divisé dans le système. Le procédé est suivi par chromatographie en couche mince.
Le produit peut être simplement récupéré à partir du mélange réactionnel par filtration du catalyseur et évaporation du
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solvant organique du mélange solvant organo-aqueux à une température inférieure à 40. C. de préférence entre 25 et 30. C. puis lyophilisation de la solution aqueuse soit directement, sot après ajustement du pH à environ 4. Le pH est de préférence ajusté au moyen d'une résine échangeuse d'ions de phase hydroxy ou avec de l'acide sulfurique OJN.
Lorsque le procédé suivant l'invention est effectué dans une unité pilote, ta contamination maximum du produit ainsi obtenu (sulfate de O-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine-aldéhyde et sulfate de N-méthyl-O-phénylalanyl-L-p[rolul-L-argininealdéhyde), détectable par analyse chromatographique en couche mince, est d'au plus 1", *, tandis que sa teneur en isomère D-L-D est d'au plus 2 à 4%. Ainsi, la quantité totale d'impuretés peut être
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réduite à environ zu ce qui est en accord avec les conditions fixées pour les substances pharmaceutiques, alors que les procédés connus fournissent des teneurs en impuretés de 15 à 25%.
La présente invention est davantage ilustrée par les exemples non limitants suivants.
Les valeurs Rf ont été déterminées par chromatographie en couche mince sur gel de silice (Kieselgel G, Renal, Budapest) avec les mélanges étuants donnés dans tes exemples. Développement : les plaques chromatographiques chlorées ont été traitées avec une solution d'o-tolidine (2, 5 g d'otolidine et 10 ml d'acide acétique dissous dans 500 ml d'eau) après séchage.
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Exemple 1 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde 201 g (0, 3 mole) de benzyloxucarbonyl-O-phénylalanyiL-prolyl-N6-benzi e L-protut-NS-benzutoxucarbonut-L-arginine atdéhude sont dissous dans 2 litres de tétrahydrofuranne à température ambiante. Simultanément, 60 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon en suspension dans 0,6 litre d'eau désionisée, puis
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900 mi d'acide sulfurique 1 N (0, 45 mole) sont ajoutés. La suspension comprenant le catalyseur est refroidie à une température de 2 à 5. C. puis additionnée de la solution tètrahudrofuranique du tripeptide aldéhyde protégé avec 0, 2 litre supptémentaire d'eau désionisée, sous agitation.
On fait ensuite barbotter de l'hydrogène gazeux à travers le mélange, en maintenant la température de celui-cl à 6-8 C et en l'agitant.
Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec un mélange 60/20/6/11d'acétated'éthyle/pyridine/acideacétique/eaucomme éluant. Les valeurs Rf de la matière de départ, de l'intermédiaire et du produit final sont de 0, 92-0, 96, 0,38-0,44 et 0,00-0,10, respectivement-
La réaction est achevée en 3-4 heures. A la fin de la
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réaction, le catalyseur est séparé par filtration et lavé avec 3xl00 ml d'eau désionisée. Le filtrat et la liqueur de lavage sont combinés, puis le tétrahudrofuranne est chassé par distillation dans un évaporateur rotatif sous vide à une. température de 25-30. C.
La solution aqueuse résiduelle est extraite avec 2x300 ml de dichlorométhane, puis le pH de la phase aqueuse est contrôlé.
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Si le pH est différent de 4, le pH est alors ajusté à 4 par de l'acide sulfurique OJN ou avec une résine d'échange d'ions à cycle OH- (par exemple AG 1x2).
Le volume de la solution est complétée à 1, 5 litre avec de l'eau désionisée, puis la solution est lyophilisée. Ainsi, on obtient 125 g (83,2%) du produit recherché.
Pf = 0.52 à 0,57 lacétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau =
25/20/6/11]
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[c < ,] 20r) =-t] 7'tc= Leau)
La teneur totale en impuretés déterminée par analyse chromatographique en couche mince est de 3 à 5%, tandis que la
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teneur en isomère D-L-D est d'environ 2 à 3% par HPLC.
Le benzutoxucarbonut-D-phénutatanui-L-protut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arglntne aldéhyde utilisé comme matière de départ, peut être préparé de la façon suivante.
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Etape ! Benzuioxucarbonuf-D-phénuiatanui-L-proiui-NBji ji benzu) oxucarbonut-L-arg) nine iactame 429, 5 g U, 1 mole) de t-butoxycarbonyl-N6benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame (demande de brevet européen publiée No. 185. 390) sont mis en suspension dans 1300 ml de chloroforme anhydre. Ensuite, on ajoute goutte-à-goutte 1300 ml d'acétate d'éthyle chlorhydrique (189 g/100 ml, environ 5N) sous agitation et refroidissement avec de l'eau glacée, de façon à éviter une augmentation de la température au-delà de 15 C. La dissolution et la précipitation d'une substance cristalline commence peu après. La suspension est agitée à la température ambiante pendant 3 heures, puis est diluée avec 3000 ml d'un mélange séché 1/1 d'éther et d'acétate d'éthyle.
La substance cristalline précipitée est séparée par filtration, lavée avec 2x 1000 ml d'acétone et 500 ml d'éther, puis séchée sur de l'hydroxyde de potassium solide et du pentoxyde de phosphore dans un dessiccateur à vide.
Après environ une heure de séchage, le chlorhydrate de NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactame est dissous dans 1000 ml de diméthylformamide anhydre, refroidi à une température de -15 C à -20 C et ajouté à un anhydride mixte préparé de la façon suivante :
396 g (1 mole) de N-benzuloxycarbonyi-D- phénylalanyl-L-proline (E. Nicolaides et coll. : J. Med. Chem. 11, 74 (1968) et la demande de brevet européen publiée No. 185. 396), sont dissous dans 1000 ml de diméthylformamide anhydre et additionnés de 111 ml (1 mole) de N-méthyl-morpholine. Le mélange est ensuite refroidi à une température de -15.
C et 132 ml ! M mote) d'ester isobutylique d'acide chforocarbontque sont ajoutés goutte-à- goutte à la même température sous agitation en 5 à 10 minutes.
L'anhydride mixte est refroidi à une température de -20 C à -25 C après 10 minutes d'agitation et combiné avec la solution dans le diméthylformamide du chlorhydrate de NO-benzyloxycarbonyi-L- arginin lactame obtenue plus haut. Ensuite, 308 mi (2, 2 moles) de
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triethylamine sont ajoutés goutte-à-goutte au mélange réactionnel à la même température en environ 30 minutes, puis la suspension est agitée pendant une heure supplémentaire à une température de-20'C à-15'C. Le pH de l'espace vapeur est contrôlé avec un papier pH humide : si te pH tombe en-dessous de 8, de la triéthylamine suppiémentaire est ajoutée.
Le mélange est ensuite dilué avec 2 litres de benzène, les sels précipités sont séparés par filtration et lavés avec 2x500 ml de benzène.
Le filtrat de benzène-diméthylformamide est additionné de 1, 5 litre d'eau et les phases sont séparées. La couche aqueuse inférieure de diméthylformamide est extraite avec 2x500 ml de benzène. Les solutions benzéniques combinées sont lavées avec 2xO, 5 litre d'eau, ! xO, 5 litre d'acide sulfurique 0, 1N et 3xO, 5 litre d'eau, séchées sur sulfate de sodium anhydre et évaporées à 2 litres sous vide à une température d'au maximum 40. C.
360 g de Kiegelgelz adsorbant sont mis en suspension dans du benzène et un lit filtrant est prepare avec un rapport du diamètre à la hauteur de 8/1 Åa 4/1. La solution benzénique est aspirée à travers le lit filtrant sous un léger vide, puis le lit filtrant est lavé avec 4, 8 litres de benzène de la même façon. Les solutions benzéniques combinées sont concentrées à
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environ 600 ml sous vide à une température d'au plus 40. C, puis 3 litres d'éther diisopropylique sont ajoutés sous vigoureuse agitation.
Le filtrat est séparé par filtration, lave avec 2x600 ml
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d'éther diisopropylique et séché dans un dessicateur à vide sur du pentoxyde de phosphore et des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 510 g (76 : ) du produit recherché. La teneur totale en contaminant du produit, telle que déterminée par chromatographie en couche mince, est de 1 à 2%.
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Rf = 0, 55 à 0, 65 {acétate d'éthyle}.
La valeur Rf du D-L-CI lactame est de 0, 45 à 0, 50 dans l'acétate d'éthule.
M20Q =-55,8 (c = 1, tétrahydrofuranne).
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Etage 2 Benzuioxucarbonut-D-phénutatanut-L-protut-NOBenzL benzyloxycarbonyl-L-arglnine aldéhyde
300 g (0, 45 mole) du tripeptide lactame protégé de l'exemple t, étape 1, sont dissous dans 2. 5 litres de tétrahjjdrofuranne anhydre refroidi à une température de -5. C. La solution est refroidie à une température de -20. C à -25. C dans un bain de neige carbonique/acétone et une solution d'hydrure aluminolithique et de tétrahydrofuranne ayant une concentration
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d'environ 0, 7 mole/litre.. correspondant à 0, 376 mole d'hydrure aluminolithique, est ajoutée sous vigoureuse agitation en 20 à 25 minutes.
Le déroulement de la réduction est suivi par chromatographie en couche mince avec un mélange 240/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme gluant En cas de besoin, une quantité supplémentaire d'hydrure aluminolithique est ajoutée jusqu'à disparition de la tache ayant une valeur Rf de 0,75 à 0,80, qui correspond au lactame.
Lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est versé peu-à-peu dans 3 litres de solution d'acide sulfurique 1 N à une température de 2-3 C sous agitation. Le pH final est ajusté par l'addition éventuelle d'une quantité supplémentaire d'acide sulfurique. De l'eau est ajoutée à la solution jusqu'à formation d'un trouble, puis celle-ci est extraite avec 3x0, 9 litre de n-hexane. Entre deux extractions, la matière se sépare sous forme de phase huileuse, elle est alors homogénéisée avec du tétrahydrofuranne, ensuite opalisée par addition d'un peu d'eau. La phase aqueuse est extraite avec 2x2 litres de dichlorométhane.
Les solutions dichlorométhaniques combinées sont lavées avec 2x0,2 litre d'une solution à 5% de carbonate acide de sodium à une température de 4 à 8'C, puis avec 2x0,5 litre d'eau distillée à une température de 4 à SOC. séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous vide à une température d'au plus 40 C. On obtient environ 300 g de substance huileuse.
Le résidu huileux est dissous dans un mélange 7/3 de dichlorométhane et d'acétone, envoyé à travers un lit filtrant
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(diamètre/hauteur = 5/1) préparé à partir de 900 g de Kieselgel-60 adsorbant avec un mélange 7/3 de dichiorométhane et d'acétone comme éluant sans aspiration, puis le lit filtrant est lavé avec 6 litres du même mélange éluant. Le procédé peut ne pas durer plus de 20 minutes. Les filtrats combinés sont évaporés à environ 600 ml à une température d'au plus 40'C, puis un litre de benzène est ajouté et la solution est à nouveau évaporée. le produit est ensuite précipité par addition de 1, 6 litre de cyclohexane sous agitation.
Le précipité est séparé par filtration, lavé avec 2x0,3 litre de
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cyclohexane et séché dans un dessicateur à vide à température ambiante sur des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 240 g (79,7%) du produit recherché.
Rf = 0,52 à 0,62 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau =
240/20/6/11).
La teneur en impuretés du. produit déterminée par
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chromatographie en couche mince est de 0, 5 à 2%. su =-0, 8" fic = !, tétrahydrofuranne).
Exemple 2 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldéhyde 20, 1 g (0, 03 mole) de benzyloxycarbonyl-Dphényialanyl-L-prolyl-NS-benzyloxycarbonyl-L-arginine aidéhyde sont dissous dans 214 mi de tètrahydrofuranne et la solution est refroidie a une température de O. C. 4,3 g d'un catatuseur comprenant du palladium sur du charbon sont mis en suspension dans 70 ml d'eau désionisée, puis 102 ml d'acide sulfurique 1N (0, 051 mole) sont ajoutés. La suspension comprenant le catalyseur est refroidie à une température de 2 à 5 C et t'air est éliminé par un courant d'azote.
Ensuite, la solution tétrahydrofuranique du tripeptide aldéhyde protégé est ajoutée à la suspension sous
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agitation et de l'hydrogène gazeux finement divisé est envoyé à 4drogp travers le système, dont la température est maintenue à 6-8 C avec de la glace. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec le même
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mélange éluant que celui qui est décrit dans l'exemple. A la fin de la réaction (3-4 heures le mélange réactionnel est traité selon la procédure de l'exemple 1. Rendement: 12,5 g (83,2%).
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Rf = 0, 52 à 0, 57 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau = 25/20/6/1 1) [ =-n7' (c= Leau) La teneur en impuretés déterminée par analyse chromatographique en couche mince est de 3, 5%, tandis que la teneur en isomère 0-L-O est d'environ 1, 5% (HPLC).
Exemple 3 Préparation du sulfate de D-phénylalanyl-L-prolul-L-arginine aldéhyde 20 1 g (0.. 3 mole) de benzuioxucarbonui-D-phénutatanutL-prolyt-NB-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde sont dissous dans 2 litres d'éthanol à température ambiante. 60 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du sulfate de baryum comme support, sont mis en suspension dans 0, 6 litre d'eau désionisée, puis additionnés de 600 ml d'acide sulfurique IN (0, 3 mole). La suspension est refroidie à une température de 2 à 5 C et la solution éthanolique du tripeptide aldéhyde protégé est ajoutée.
De l'eau désionisée est ensuite ajoutée en une quantité qui correspond à un rapport 6/4 du solvant à la phase aqueuse.
On fait ensuite barbotter de t'hudrogenc gazeux à
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travers le mélange ag travers te mélange agité, en maintenant la température de celui-ci à 6-S. C. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince selon la procédure de l'exemple 1. A la fin de la réaction (environ 3 à 4 heures), le catalyseur est séparé par filtration et lavé plusieurs fois avec de l'eau désionisée. Les filtrats sont combinés et l'alcool est chassé dans un évaporateur rotatif à une température de 25-30 C. La solution aqueuse ayant un pH d'environ 3-4, est directement lyophilisée.
Ainsi, on obtient 1 0 1 g (65%) du produit recherché sous forme de monohydrate, ayant la même qualité que le produit obtenu dans l'exemple 1.
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Exemple 4 L 4 Préparation du sulfate de D-phényialanut-L-prolui-L-argtnine aldéhyde
La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que 43 g de catalyseur comprenant 1 0% de palladium sur du-charbon, prélablement lavè jusqu'à neutralité, sont utilisés en tant que
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catait cataiuseur. Ainsi, on obtient 125J g {83. 2%) du produit recherché ayant la même qualité que le produit obtenu dans l'exemple 1.
Exemple 5
Préparation du sulfate de N-méthyl-O-phénylalanyi-L-protyl-L- arginine atdéhude
20, 5 g t0, 03 mole] de N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-
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D-phénuiaianut-L-protut-NO-benzuioxucarbonut-L-argtnine aldéhyde sont dissous dans 2 M m) d'éthanot, puis additionnés de 110 mil d'eau désionisée, de 60 ml d'acide sulfurique 1N (0,03 mole) et de 3 g d'un catalyseur comprenant 10% de palladium sur du charbon. On fait ensuite barbotter de l'hydrogène gazeux finement divisé à travers le mélange, en maintenant la température de celui-
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ci à 6-88C. Le déroulement de la réaction est surveillé par analyse chromatographique en couche mince avec un mélange 25/20/6/1 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant.
Les valeurs Pf de la matière de départ, de l'intermédiaire et du produit final sont d'environ 0,9, 0,7 et 0,4 respectivement sur le chromatogramme. A la fin de la réaction (environ 2 heures), le
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catalyseur est séparé par filtration et lavé avec 3x30 mi d'eau désionisée. Le filtrat et la liqueur de lavage sont combinés et évapores dans un évaporateur rotatif jusqu'à environ 100 ml à une température d'au plus 25'C, puis le résidu est extrait avec 2x50 mi de dichlorométhane.
Les traces de solvant organique sont éliminées de la solution aqueuse par distillation et le résidu est dilué avec de l'eau désionisée à un volume d'environ 200 ml. On vérifie que le pH est à une valeur d'environ 4. En cas de besoin, le pH est ajusté par addition d'acide sulfurique OJN ou avec une résine échangeuse
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d'ions de phase OH- (par exemple AG 1 x8L puis la solution est gelée et lyophilisée. Ainsi, on obtient 12, 5 g (75} ;) du produit recherché.
Rf = 0,35 à 0, 45 (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau = 25/20/6/1) [α]20D=-126,0 ¯ 5 (c = L eau)
La teneur totale en impuretés déterminée par analyse chromatographlque en couche mince est de 2 à 5%, tandis que la teneur en impuretés par HPLC est d'environ 3-5%.
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Le N-benzylaxyoarbonyl-hl-methyl-O-phenylelanyl-LLe N-benzyloxi prolyi-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldéhyde utilisé comme matière de départ. peut être préparé de la façon suivante.
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Et-ap N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-O-phénylalanyl-L-prolyl-NGbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactame 42. 95 g (0, 11 mole) de t-butoxucarbonut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactame sont mis en suspension dans HO m) de chloroforme anhydre et additionnés de 275 mi d'acétate d'éthyle chlorhydrique (11-15 g/100 ml) sous agitation constante. Le mélange rédactionnel est agité à la température ambiante pendant 3 heures, le point final de la réaction est déterminé par chromatographie en couche mince avec un mélange 60/20/6/11d'acétated'éthyle/pyridine/acideacétique/eaucomme éluant. Les valeurs Rf de la matière de départ et du produit final
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sont d'environ 0, 9 et 0, 3 respectivement. A la fin de la réaction, le mélange est dilué avec 400 ml d'éther diéthylique.
La substance cristalline précipitée est séparée par filtration, lavée avec 2x] 00 ml d'éther diéthylique et 2x50 mi d'acétone, puis séchée sur du pentoxyde de phosphore et de l'hydroxyde de potassium dans un dessicateur a vide. Après environ 1-2 heures de séchage, le sel de lactame ainsi obtenu (environ 0, 1 mole), est dissous dans 100 mi de diméthylformamide anhydre et stocké à une température de - 15.
C jusqu'au moment de son utilisation par addition à un anhydride mixte préparé de la façon suivante :
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Libération de la N-benzyloxycarbonyl-N-méthyl-D-phénuialanyi-
L-prolin
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50. 9 g (0, 1 motel du sel de cyclohexyl ammonium de Nbenzuioxucarbonui-N-mèthui-D-phènuiaianui-L-proiine sont dissous dans 200 ml d'éther diéthylique et 120 ml (1 mole) d'acide sulfurique IN. La phase éthérée est lavée avec 2x50 mi d'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression réduite à une température d'au plus 35'C jusqu'à obtention d'une huile épaisse.
Le résidu (environ 0,1 mole) est dissous dans 170 mi de diméthylformamide anhydre, refroidi à une température de - 15. C et additionné de 11, 2 ml (0, 1 mole) de N-méthyimorpholine sous agitation. Ensuite, 13, 2 ml de chlorure d'i-butoxycarbonyle sont ajoutés goutte-à-goutte à la même température ent 3 à 5 minutes.
Après 5 à 10 minutes d'agitation, la suspension de diméthylformamide ci-dessus du composé amino est ajoutée à l'anhydride mixte ainsi obtenu, puis 35 ml de triéthylamine sont ajoutés au mélange réactionnel sous vigoureuse agitation à une température de -20 à -25. C. Le pH de l'espace vapeur est contrôlé (il doit être supérieur à environ 8) et en cas de besoin, de la triéthuiamine supplémentaire est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure à une température de - 15. C, pendant
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une heure Åa O'C. puis il est dilué avec 200 m) de benzène et 150 mi d'eau.
Les phases sont séparées et la phase aqueuse est extraite avec 3x30 m ! de benzène. Les solutions benzéniques combinées sont lavées avec 2x50 mi d'eau, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous pression réduite à une température d'au maximum 40. C jusqu'à obtention d'une huile épaisse. Le résidu huileux est dissous dans 75 mi d'un mélange 2/1 d'éther et de tétrahydrofuranne et filtré à travers un lit filtrant de la façon suivante :
300 g (quantité quintuple) de Kiegelgel-60 adsorbant sont mis en suspension dans de l'éther et un lit filtrant est préparé
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avec un rapport du diamètre à la hauteur de 3 à 1.
La tache
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supérieure contaminante est éluée avec un mélange 95/5 d'éther et de tétrahydrofuranne, tandis que le produit désiré est éfué avec du tétrahudrofuranne pur. La teneur en substance des fractions est contrôlée par chromatographie en couche mince avec un mélange 480/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant. La valeur Rf du produit désiré est de 0, 71 à 0, 75. Les fractions combinées sont évaporées sous vide à une température d'au plus 3S. C jusqu'à obtention d'une huile épaisse et le produit est utilisé tout de suite ou stocké dans de la neige carboniuque. Rendement: 58,8g (85%).
Rf = 0, 71 à 0,75 (acétate d'éthylelpyridinelacide acétique/eau = 480/20/6/11 J.
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[ = +13, 5' fc = 1, tétrahydrofurannel.
Etape 2 N-benzutoxucarbonut-N-méthut-D-phénutatanui-L-proiui-NSbenzyloxycarbonyl-L-arginine aidéhyde . y 1 34, 14 g (0, 05 mole) du N-benzyloxycarbonyl-Nméthui-D-phénuia ! anui-L-pro) ui-NB-bcnzu) oxucarbonui-Larginine lactame de l'exemple 5, étape 1, sont dissous dans 150 ml de tétrahydrofuranne anhydre refroidi à une température de O'C.
La solution est refroidie à une température de -20 C et 0, 0375 mole d'hydrure aluminolithique dissous dans du tétrahydrofuranne
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est ajoutée sous agitation en 5 à 10 minutes. Le déroulement de la est ajoutée sous ae réduction est suivi par chromatographie en couche mince avec un mélange 240/20/6/11 d'acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau comme éluant. Les valeurs Rf du lactame de départ et de l'aldéhyde sont de 0, 8 et 0, 5 respectivement
En cas de besoin, une quantité supplémentaire d'hydrure aluminolithique est ajoutée et lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est versé peu-à-peu dans 320 mi de solution 1 N d'acide sulfurique à une température de 2-4'C sous agitation constante.
Le pH final doit être compris entre 2 et 3, ce pH étant ajusté par l'addition éventuelle d'une quantité supplémentaire d'acide sulfurique. Si un précipité est formé, il est
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séparé par filtration, la solution est diluée avec de l'eau jusqu'à formation d'un trouble, puis celle-ci est extraite avec 3xl0 ml de n-hexane.
La phase tétrahudrofuranique est extraite avec 250 ml de dichiorométhane à deux ou trois reprises et les solutions
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dichiorométhaniques combinées sont lavées avec 2x50 ml d'eau.. 2x50 mi d'une solution froide à 5% de carbonate acide de sodium, puis avec 2x50 ml d'eau, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées sous vide à une température d'au plus 40. C.
Le résidu d'évaporation est dissous dans un mélange
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7/3 de dichlorométhane et d'acétone (120 miL envoyé sans aspiration à travers un ! it filtrant préparé à partir de 108 g de Kieselgel-60 adsorbant avec 200 ml d'un mélange ï/3 de dichlorométhane et d'acétone, puis le lit filtrant est lavé avec 600 ml du même mélange éluant. Le procédé peut ne pas durer plus de 20 minutes.
Les filtrats combinés sont évaporés à environ 50-60 mi sous pression réduite à une température d'au plus 40. C, puis cette operation est répétée après addition de 100 mi de benzène au résidu. Le produit est précipité à partir de la solution d'environ
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50-60 ml par addition de 100 ml de cyclohexane.
Le précipité ainsi obtenu est lavé avec 2x30 ml de cyclohexane et séché dans un dessicateur à vide à température ambiante sur des copeaux de paraffine. On obtient ainsi 18 g zu du produit recherché.
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Pf = 0, 55 à 0, 59 (acétate d'éthl Rf = 0, 55 à 0, 59 [acétate d'éthute/pyridine/acide acétique/eau =
240/20/6/11).
[α]20D = +14,1 (c = 1, tétrahydrofuranne).
La teneur totale en impuretés du produit est de 2-3% au maximum.
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IMPROVED PROCESS FOR THE PREPARATION OF ALDEHYDE DETIPEPTIOE
The present invention relates to an improved process for the preparation of tripeptide aldehydes of formula 1:
P-D-Phe-Pro-Arg-H. H2S04 1 in which:
R is a hydrogen atom or a methyl group.
Phe is a phenylalanine group
Pro is an L-proline group and
Arg is an L-arglnine group, having a purity suitable for pharmaceutical use.
[The abbreviations of L-proline and L-arginine are Pro and Arg according to the prior art, see for example Biochem. 7, 126, 773 (1972), Biochemistry 14,449 (1975)].
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It is known that the salts of D-phenyialanul-L-prolyl-Larginine aldehyde (HD-Phe-Pro-Arg-Hj exhibit antithrombin activity. However, the acetate described in the Hungarian patent Ho 169. 870 is not suitable for a therapeutic use because it very quickly loses its activity, either in solid form or in the form of an aqueous solution. The same phenomenon can be observed in the case of the hydrochloride, citrate, tartrate, tosylate and the derivative NG- carboxy of the tripeptide aldehyde, however, HD-Phe-Pro-Arg-H sulfate and the N-methyl derivative thereof are extremely stable, even in the form of an aqueous solution (British Patent No. 2,091,270 and application published in European patent No 185. 390) and can therefore be used in the therapeutic field.
The above sulfates can be prepared as follows:
1. H-D-Phe-Pro-Arg-H sulfate can be prepared according to British Patent No. 2,091,270 from hemi-sulfate
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t-butoxycarbonyl-D-phenylalanul-L-prolyi-L-arginine aldehyde or. from t-butoxycarbonyl-D-phenyialanyi-L-prolyl-NOcarboxu-L-argtntne afdehude in the presence of 1 to 12 equivalents of 1 to 12 N aqueous sulfuric acid at a temperature of 40 to 50. C.
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The preparation of the first starting material is described in Example 1 of the patent cited above, while the preparation of the
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N '- carboxu-protected derivative is described in! e Belgian Patent No. e 880. 844.
2. HO-Phe-Pro-Arg-H sulfate can also be prepared as described above, by hydrogenolysis of benzutoxucarbonut-D-phenuiatanut-L-protut-NS-benzutoxucarboxy-L-arginine aldehyde (ZD-Phe -Pro-ArgtZJ-Hj in the presence of an equivalent molar quantity of sulfuric acid The preparation of the doubly protected aldehyde tripeptide used as starting material, is described in Hungarian patent No.
169. 870.
3. According to published European patent application No. 1 85. 390,
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N-methut-D-phenutatanut-L-protut-L-argtntne sulphate atdehudes H-t-D-MePhe-Pro-Arg-H. HgSCJ is prepared according to a method analogous to that of free tripeptide aldehyde sulfate by elimination of the protecting groups of N-benzyloxycarbonyl-N- ¯41oxycarbonyi-Nmethut-Q-phenutatanut-L-protut-NO-benzutoxucarboxu-L-arginine aldehyde during hydrogenolysis in the presence of sulfuric acid. The preparation of the tripeptide aldehyde used as starting material is described in the same application.
The main disadvantage of the above processes is that, if the production is carried out on a large scale, they do not provide a product having an appropriate purity.
For example, the product obtained by process No 1 comprises approximately 4 to 6% of calcium sulphate. A thin layer chromatographic analysis indicates that the product thus obtained may comprise more than approximately 10% of other impurities (for example, tripeptide alcohol, -acid, -acetal) in addition to the calcium salt, this means that the quantity total of contaminating substances can exceed 20%. There is another drawback in that the neutralization of the excess sulfuric acid and the filtration of the precipitated calcium sulphate raise other difficulties.
Tripeptide aldehyde sulphate prepared by process No 2 (hudotenuse) additionally comprises 5 to 10% of
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contaminant detectable by thin layer chromatographic analysis, a content of 10 to 155% of ateptude tripeptide sulfate of D-L-D configuration determined by HPLC analysis; help confi mine so there may be a total of 15 to zu of contaminants.
The 5 to 0% of contaminants indicated above are composed of the following substances: acid tripeptide formed during the synthesis of the aldehyde tripeptide, tripeptide alcohol, a cyclic decomposition product whose structure is described in the published European patent application No. 185. 390 and a substance of unknown structure formed in different quantities, the spot of which is located below that of the target compound on the chromatogram.
It has been observed that "overhydration" plays an important role in the production of the last side product. Namely, if the hydrogenolysis is carried out in a manner known per se, that is to say in the presence of a molar equivalent of sulfuric acid at room temperature and that the process is continued after completion of the hydrogenolysis, a additional spot (Rf = 0.39 to 0.44) corresponding to a contamination always appears below the spot of the product (in the case of HD-Phe-Pro-Arg-H.
H2SO4, Rf = 0.52 to 0.571 on the thin layer chromatogram (adsorbent: Kiesetget S, etuant: mixture 26/20/6/11 of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water; developer: chlorotolidinej , this contamination representing in some cases the main impurity.
To eliminate this contamination, the end point of the reaction must be detected very precisely and the reaction must be stopped when the end point is reached.
However, since the end point of the reaction is determined by thin layer chromatographic analysis and the analysis requires 20 to 30 minutes, if the above eluent mixture is used, the reaction cannot be stopped at the end point especially in industrial conditions. So the
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secondary product with the Rf value defined above is generally produced in an amount of about 3 to 4% due
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of an "overhudratation". This secondary product is more toxic than the final product and therefore it should also be eliminated for this reason.
The product is very likely to undergo racemization, so that the contaminating substances formed during the processes described above can practically not be removed. Since the final product cannot be purified, the production of intermediates having a suitable purity and the suppression of the formation of the secondary product must be resolved to provide a final product whose purity is suitable for pharmaceutical use. This means inhibiting racemization during the process.
The object of the present invention is to provide a process which! makes it possible to suppress the formation of the secondary products mentioned above and to prepare tripeptide aldehyde salts of formula 1 having a purity of at least 95%.
The invention is based on the observation that the formation of the product D-L-D, that is to say the racemization, is
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strongly influenced by pH. In a medium having an alkaline pH and even in a medium having a neutral pH, the final product and the intermediates undergo racemization. In a medium with an acidic pH (pH = 2), the final product is stable for words. It is therefore necessary to develop a technology which ensures that the pH of the reaction mixture does not become neutral or even basic in a short time.
For this, the lactam arginine is released from its salt in situ during the condensation, via a mixed anhydride, of the NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactam hydrochloride of formula tV:
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where Arg is as described above and Z is a benzyioxucapbonyl group, and dipeptide of formula V
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or P. Phe. Pro and Z are as defined above, so that the base is subsequently added to the reaction mixture. In
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if conditions .. i'ar'ginine iactame released in situ reacts immediately, in statu nascendi, with anhl In statu nascendi, with i'anhudride by giving the corresponding protected lactam tripeptide of formula fi)
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where Z, P.
Phe, Pro and Arg are as defined above, so that the formation of a basic medium leading to racemization can be eliminated.
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In addition, the present invention is based on the observation that, if the complex formed with boroaluminic hydride during the reduction of the protected lactam tripeptide of formula t! ! obtained as described above, is decomposed in such a way that the reaction medium is added to the dilute cold sulfuric acid solution (0-SOC), preferably 1 N used in excess, unlike the process of the patent application European No 185. 390, in which sulfuric acid is added to the reaction mixture, the acid pH of the reaction mixture can be ensured. Thus, the racemization of the protected aldehyde tripeptide can be avoided or significantly reduced.
In addition, the present invention is based on the observation that the hydrogenolysis of the tripeptide aldehyde of formula! prepared as described above, must be carried out in the presence of an excess of sulfuric acid at a low temperature below 10. C, preferably between 6 to 8 C.
The Applicant's experimental data have shown that if the hydrogenolysis of ZD-Phe Pro-Arg (Z) -H was carried out at different temperatures in the presence of a molar equivalent of sulfuric acid, the impurities detectable by layer chromatographic analysis The product obtained was as follows: 17% at 40 ° C., 10% at ambient temperature (20-26 ° C.), 4% at 6-10 ° C. The contents of the product's DLD isomer detectable by HPLC were as follows: 12 %, 5% and 2 to 3%, respectively, i.e. the total content of impurities in the product was 29, 15 and 6-7, respectively.
This means that if the hydrogenolysis is carried out at lower temperatures. the
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quantity of by-products is markedly reduced while the time required for hydrogenolysis does not increase remarkably with the reduction in temperature.
If the hydrogenolysis is carried out at lower temperatures in the presence of an excess of sulfuric acid, there is a great additional advantage in that the formation of the by-product having an Rf of 0.39 to 0.44 can be significantly reduced and that the exact detection of the end point of the reaction is thus not necessary. According to the experiences of the Applicant, if 'hydrogenolysis of ZO-Phe-Pro-Arg (Z) -H is carried out in the presence of 1.5 to 1.7 molar equivalent of sulfuric acid in tetrahudrofuran at a temperature of 6 to 8' C, the secondary product having the value Rf above is formed only in traces even after one hour of "overhydration".
In addition, it is preferable to use sulfuric acid during all stages of the process because in the case where, for example, hydrochloric acid is used, the sulfate may be contaminated with chloride ions.
Following the reactions carried out as indicated above, the amount of OLO isomer in the final product of formula 1 is at most 2 to 4%, while the other contaminants (acid and alcohol tripeptide) are formed. in an amount less than 1%.
From the above, the invention relates to an improved process for the preparation of tripeptide aldehydes of formula 1 .. in which R, Phe, Pro and Arg are as defined above, in a pure form of the point of pharmaceutical view, by condensation of a lactam of formula IV, in which Arg is as defined above and Z is a benzyloxycarbonule group, with a dipeptide of formula V, in which R, Z, Phe, Pro and Z are such that defined above, via a mixed anhydride, reduction of the lactam tripeptide of formula ttt in which R, Z,
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Phe, Pro and Arg are as defined above, with aluminolithic hydride,
and hydrogenolysis of the protected aldehyde tripeptide of formula II thus obtained, in which P., Z, Phe and Arg are such that
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defined above, in the presence of sulfuric acid, which comprises: al) the release of L-arginine NG-protected lactam in situ during the condensation of L-arginine tactam NG-protected hydrochloride of formula IV, in which Z is such as defined above with dipeptide of formula V, in which R, Z, Phe and Pro are as defined above, via a mixed anhydride in the reaction mixture, by subsequent addition of a base to the mixture of these reaction components, then the reduction of the protected lactam tripeptide thus obtained of formula ttt,
in which R, Z, Phe, Pro and Arg are as defined above, the decomposition of the complex thus formed by adding the reaction mixture to an excess of 1 N sulfuric acid at a temperature of 0 to SOC, then carrying out the hydrogenolysis of the protected tripeptide of formula II, in which R, Z, Phe, Pro and Arg are as defined above at a temperature below 1 ° C. in the presence of 1 to 2 molar equivalents of sulfuric acid or a2 ) after reduction of the protected lactam tripeptide of formula ttt, in which R, Z, Phe, Pro and Arg are as defined above, the decomposition of the complex thus formed by addition of the reaction mixture to an excess of 1 N sulfuric acid to a temperature of 0 to 5'C,
then carrying out the hydrogenolysis of the protected tripeptide of formula II thus obtained, in which R, Z, PHe, Pro and Arg are as defined above, at a temperature below 1 onc in the presence of 1 or 2 molar equivalents d sulfuric acid or a3) your carrying out the hydrogenolysis of the protected tripeptide of formula II, in which R, Z, Phe, Pro and Arg are as defined above, at a temperature below 10 C in the presence of 1 or 2 molar equivalents of sulfuric acid.
According to the present invention, the reaction is preferably carried out as follows:
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The protective t-butoxycarbonyl group of tbutoxycarbonyl-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactam is eliminated in a manner known per se. Nom-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactam hydrochloride of formula IV thus obtained
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is kept in solution in dimethulformamide at a temperature of -15 ° C. to -20 ° C., then the solution is added to the mixed anhydride formed from the dipeptide of formula V
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t. benzutoxucarbonut-D-phenutatanut-L-protine or N-methut-benzyloxycarbonyl-O-phenylalanyl-L-proline) and isobutyl ester of chlorocarbonic acid. The base..
preferably) the triethylamane is then added to the reaction mixture. Under these conditions, the lactam released in situ under the faction of the base, reacts immediately with the mixed anhydride to form a protected lactam tripeptide and thus the formation of the basic medium causing racemlsation can be avoided. If desired, the product thus obtained can be purified during rapid purification through a bed of silica gel. By choosing the sequence
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above operations, which differs from that of the prior art, it is unnecessary to carry out an expensive purification of the lactam tripeptide protected by cotton chromatography.
The protected lactam tripeptide of formula tti thus obtained is reduced by aluminolithic hydride in anhydrous tetrahydrofuran. The complex thus formed is broken down, contrary to what is recommended in European patent application No 185.390, by adding the reaction mixture to a dilute solution preferably 1 N of sulfuric acid used in excess with cooling to a temperature of 2 to 4 ' vs. The final pH of 2-3 is adjusted by optional addition of sulfuric acid.
The reaction mixture is then treated in a manner known per se.
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The tripeptide aldèht The protected atdehude trtpeptide of formula II thus obtained is purified by filtration through a bed of silica gel.
Hydrogenolysis is preferably carried out in a polar organic solvent, preferably tetrahudrofuran or a lower alkanol, for example methanol, ethanol, i-propanol, preferably ethanol. It is preferred not to carry out the hydrogenolysis in a closed system, but rather to bubbled hydrogen through the reaction mixture. In practice,
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gaseous hydrogen is bubbled through the system under jsteme: in a finely divided form which, for example, can be ensured by
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passage of the gas through a G2 filter.
According to a preferred embodiment of the process, the protected tripeide aldehyde of formula II of suitable purity thus prepared, is dissolved in tetrahydrofuran and the solution thus obtained is added to a cooled aqueous suspension of catalyst comprising 1.5 to 1.7 equivalent 1 N sulfuric acid molar. The ratio of the organic solvent to the aqueous fraction is 70-50 / 30-50, preferably 60/40. As catalyst, preferably 10 to 30% by weight of a catalyst comprising 10% palladium on carbon or platinum is used. The hydrogenation is carried out under cooling at a temperature of 6-8 C, by bubbling finely divided hydrogen gas through the system.
The progress of the reaction is followed by thin layer chromatographic analysis.
According to another preferred embodiment of the process, the protected aldehyde tripeptide used as starting material, is dissolved in tetrahudrofuran and a catalyst comprising! ; by weight of palladium precipitated on a barium sulphate or aluminum oxide support, preferably barium sulphate, is used as catalyst.
The hydrogenation is carried out at a temperature of 6 to 8 ° C. in the presence of 1.5 molar equivalent of 1N sulfuric acid by bubbling finely divided hydrogen gas into the system. The progress of the reaction is followed by thin layer chromatographic analysis.
According to another preferred embodiment of the method. the protected starting tripeptide is dissolved in ethanol, then the solution is added to a cooled aqueous suspension of catalyst comprising 10% palladium on charcoal. The hydrogenation is carried out at a temperature of 6 to
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8'G by bubbling finely divided hydrogen gas into the system. The process is followed by thin layer chromatography.
The product can simply be recovered from the reaction mixture by filtration of the catalyst and evaporation of the
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organic solvent of the organo-aqueous solvent mixture at a temperature below 40. C. preferably between 25 and 30. C. then lyophilization of the aqueous solution either directly, after the pH has been adjusted to about 4. The pH is preferably adjusted using a hydroxy phase ion exchange resin or with OJN sulfuric acid.
When the process according to the invention is carried out in a pilot unit, the maximum contamination of the product thus obtained (O-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine-aldehyde sulfate and N-methyl-O-phenylalanyl-Lp sulfate [ rolul-L-argininealdehyde), detectable by thin layer chromatographic analysis, is at most 1 ", *, while its DLD isomer content is at most 2 to 4%. Thus, the total amount of impurities may be
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reduced to about zu which is in accordance with the conditions laid down for pharmaceutical substances, while known methods provide impurity contents of 15 to 25%.
The present invention is further illustrated by the following nonlimiting examples.
The Rf values were determined by thin layer chromatography on silica gel (Kieselgel G, Renal, Budapest) with the etching mixtures given in your examples. Development: the chlorinated chromatographic plates were treated with an o-tolidine solution (2.5 g of otolidine and 10 ml of acetic acid dissolved in 500 ml of water) after drying.
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Example 1 Preparation of D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldehyde sulfate 201 g (0.3 mole) of benzyloxucarbonyl-O-phenylalanyiL-prolyl-N6-benzi e L-protut-NS-benzutoxucarbonut-L-arginine atdéhude are dissolved in 2 liters of tetrahydrofuran at room temperature. Simultaneously, 60 g of a catalyst comprising 10% palladium on carbon suspended in 0.6 liters of deionized water, then
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900 ml of 1 N sulfuric acid (0.45 mole) are added. The suspension comprising the catalyst is cooled to a temperature of 2 to 5 ° C. and then added with the tetrahudrofuranic solution of the protected aldehyde tripeptide with 0.2 additional liter of deionized water, with stirring.
Hydrogen gas is then bubbled through the mixture, maintaining the temperature of the latter at 6-8 C and stirring.
The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatographic analysis with a 60/20/6/11 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as eluent. The Rf values of the starting material, the intermediate and the final product are 0, 92-0, 96, 0.38-0.44 and 0.00-0.10, respectively-
The reaction is completed in 3-4 hours. At the end of the
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reaction, the catalyst is separated by filtration and washed with 3 × 100 ml of deionized water. The filtrate and the washing liquor are combined, then the tetrahudrofuran is distilled off in a rotary evaporator under vacuum. temperature of 25-30. vs.
The residual aqueous solution is extracted with 2x300 ml of dichloromethane, then the pH of the aqueous phase is checked.
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If the pH is different from 4, the pH is then adjusted to 4 by sulfuric acid OJN or with an ion exchange resin with OH- ring (for example AG 1x2).
The volume of the solution is made up to 1.5 liters with deionized water, then the solution is lyophilized. Thus, 125 g (83.2%) of the desired product are obtained.
Pf = 0.52 to 0.57 ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water =
25/20/6/11]
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[vs <,] 20r) = -t] 7'tc = Leau)
The total content of impurities determined by thin layer chromatographic analysis is 3 to 5%, while the
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D-L-D isomer content is approximately 2 to 3% by HPLC.
Benzutoxucarbonut-D-phenutatanui-L-protut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arglntne aldehyde used as starting material can be prepared as follows.
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Step! Benzuioxucarbonuf-D-phenuiatanui-L-proiui-NBji ji benzu) oxucarbonut-L-arg) nine iactame 429, 5 g U, 1 mole) of t-butoxycarbonyl-N6benzyloxycarbonyl-L-arginine lactam (published European patent application No. 185. 390) are suspended in 1300 ml of anhydrous chloroform. Then, 1300 ml of hydrochloric ethyl acetate (189 g / 100 ml, about 5N) are added dropwise with stirring and cooling with ice water, so as to avoid an increase in temperature. above 15 C. Dissolution and precipitation of a crystalline substance begins soon after. The suspension is stirred at room temperature for 3 hours, then is diluted with 3000 ml of a 1/1 dried mixture of ether and ethyl acetate.
The precipitated crystalline substance is separated by filtration, washed with 2x 1000 ml of acetone and 500 ml of ether, then dried over solid potassium hydroxide and phosphorus pentoxide in a vacuum desiccator.
After approximately one hour of drying, the hydrochloride of NG-benzyloxycarbonyl-L-arginine lactam is dissolved in 1000 ml of anhydrous dimethylformamide, cooled to a temperature of -15 C to -20 C and added to a mixed anhydride prepared as follows :
396 g (1 mole) of N-benzuloxycarbonyi-D-phenylalanyl-L-proline (E. Nicolaides et al.: J. Med. Chem. 11, 74 (1968) and the published European patent application No. 185. 396 ), are dissolved in 1000 ml of anhydrous dimethylformamide and added with 111 ml (1 mole) of N-methyl-morpholine. The mixture is then cooled to a temperature of -15.
C and 132 ml! M mote) of isofutyl ester of chforocarbontque acid are added dropwise at the same temperature with stirring in 5 to 10 minutes.
The mixed anhydride is cooled to a temperature of -20 C to -25 C after 10 minutes of stirring and combined with the solution in dimethylformamide of NO-benzyloxycarbonyi-L-arginin lactam hydrochloride obtained above. Then, 308 mi (2.2 moles) of
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triethylamine are added dropwise to the reaction mixture at the same temperature in about 30 minutes, then the suspension is stirred for an additional hour at a temperature of -20 ° C to -15 ° C. The pH of the vapor space is checked with a wet pH paper: if the pH drops below 8, additional triethylamine is added.
The mixture is then diluted with 2 liters of benzene, the precipitated salts are separated by filtration and washed with 2x500 ml of benzene.
Benzene-dimethylformamide filtrate is added with 1.5 liters of water and the phases are separated. The lower aqueous layer of dimethylformamide is extracted with 2x500 ml of benzene. The combined benzene solutions are washed with 2xO, 5 liters of water,! xO, 5 liters of 0.1N sulfuric acid and 3xO, 5 liters of water, dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated to 2 liters under vacuum at a temperature of maximum 40. C.
360 g of Kiegelgelz adsorbent are suspended in benzene and a filter bed is prepared with a ratio of diameter to height of 8/1 Å to 4/1. The benzene solution is sucked through the filter bed under a slight vacuum, then the filter bed is washed with 4.8 liters of benzene in the same way. The combined benzene solutions are concentrated at
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about 600 ml under vacuum at a temperature of at most 40 ° C., then 3 liters of diisopropyl ether are added with vigorous stirring.
The filtrate is separated by filtration, washed with 2x600 ml
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diisopropyl ether and dried in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide and paraffin shavings. 510 g (76:) of the sought product are thus obtained. The total contaminant content of the product, as determined by thin layer chromatography, is 1 to 2%.
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Rf = 0.55 to 0.65 {ethyl acetate}.
The Rf value of D-L-CI lactam is from 0.45 to 0.50 in ethet acetate.
M20Q = -55.8 (c = 1, tetrahydrofuran).
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Stage 2 Benzuioxucarbonut-D-phenutatanut-L-protut-NOBenzL benzyloxycarbonyl-L-arglnine aldehyde
300 g (0.45 mole) of the protected lactam tripeptide of example t, step 1, are dissolved in 2.5 liters of anhydrous tetrahydrofuran cooled to a temperature of -5. C. The solution is cooled to a temperature of -20. C to -25. C in a dry ice / acetone bath and a solution of aluminolithic hydride and tetrahydrofuran having a concentration
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about 0.7 mole / liter .. corresponding to 0.376 mole of aluminolithic hydride, is added with vigorous stirring in 20 to 25 minutes.
The progress of the reduction is followed by thin layer chromatography with a 240/20/6/11 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as sticky. If necessary, an additional quantity of aluminolithic hydride is added until disappearance of the spot having an Rf value of 0.75 to 0.80, which corresponds to the lactam.
When the reaction is complete, the reaction mixture is poured little by little into 3 liters of 1 N sulfuric acid solution at a temperature of 2-3 C with stirring. The final pH is adjusted by the optional addition of an additional quantity of sulfuric acid. Water is added to the solution until a haze is formed, then it is extracted with 3 × 0.9 liter of n-hexane. Between two extractions, the material separates in the form of an oily phase, it is then homogenized with tetrahydrofuran, then opalized by adding a little water. The aqueous phase is extracted with 2x2 liters of dichloromethane.
The combined dichloromethane solutions are washed with 2x0.2 liters of a 5% solution of sodium hydrogen carbonate at a temperature of 4 to 8 ° C., then with 2x0.5 liters of distilled water at a temperature of 4 to SOC . dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated in vacuo at a temperature of at most 40 C. About 300 g of oily substance are obtained.
The oily residue is dissolved in a 7/3 mixture of dichloromethane and acetone, sent through a filter bed
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(diameter / height = 5/1) prepared from 900 g of Kieselgel-60 adsorbent with a 7/3 mixture of dichioromethane and acetone as eluent without suction, then the filter bed is washed with 6 liters of the same eluent mixture . The process may not last more than 20 minutes. The combined filtrates are evaporated to approximately 600 ml at a temperature of not more than 40 ° C., then a liter of benzene is added and the solution is again evaporated. the product is then precipitated by adding 1.6 liters of cyclohexane with stirring.
The precipitate is separated by filtration, washed with 2 × 0.3 liters of
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cyclohexane and dried in a vacuum desiccator at room temperature on paraffin shavings. 240 g (79.7%) of the desired product are thus obtained.
Rf = 0.52 to 0.62 (ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water =
240/20/6/11).
The content of impurities in. product determined by
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thin layer chromatography is 0.5 to 2%. su = -0.8 "fic =!, tetrahydrofuran).
Example 2 Preparation of D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine aldehyde sulfate 20, 1 g (0.03 mole) of benzyloxycarbonyl-Dphenyialanyl-L-prolyl-NS-benzyloxycarbonyl-L-arginine aidehyde are dissolved in 214 ml of tetrahydrofuran and the solution is cooled to a temperature of OC 4.3 g of a catatuser comprising palladium on charcoal are suspended in 70 ml of deionized water, then 102 ml of 1N sulfuric acid (0.051 mole) are added. The suspension comprising the catalyst is cooled to a temperature of 2 to 5 ° C. and the air is removed by a stream of nitrogen.
Then, the tetrahydrofuran solution of the protected aldehyde tripeptide is added to the suspension under
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agitation and finely divided hydrogen gas is sent to 4drogp through the system, the temperature of which is maintained at 6-8 C with ice. The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatographic analysis with the same
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mixture eluting as that described in the example. At the end of the reaction (3-4 hours the reaction mixture is treated according to the procedure of Example 1. Yield: 12.5 g (83.2%).
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Rf = 0.52 to 0.57 (ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water = 25/20/6/1 1) [= -n7 '(c = Water) The content of impurities determined by chromatographic analysis in thin layer is 3.5%, while the content of 0-LO isomer is about 1.5% (HPLC).
Example 3 Preparation of D-phenylalanyl-L-prolul-L-arginine aldehyde sulfate 20 1 g (0 .. 3 mole) of benzuioxucarbonui-D-phenutatanutL-prolyt-NB-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldehyde are dissolved in 2 liters ethanol at room temperature. 60 g of a catalyst comprising 10% palladium on barium sulphate as support, are suspended in 0.6 liter of deionized water, then added with 600 ml of sulfuric acid IN (0.3 mole). The suspension is cooled to a temperature of 2 to 5 ° C. and the ethanolic solution of the protected aldehyde tripeptide is added.
Deionized water is then added in an amount which corresponds to a 6/4 ratio of the solvent to the aqueous phase.
Then bubbled gaseous hudrogenc to
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through the ag mixture through the agitated mixture, maintaining the temperature thereof at 6-S. C. The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatographic analysis according to the procedure of Example 1. At the end of the reaction (approximately 3 to 4 hours), the catalyst is separated by filtration and washed several times with deionized water. The filtrates are combined and the alcohol is removed in a rotary evaporator at a temperature of 25-30 C. The aqueous solution having a pH of about 3-4, is directly lyophilized.
Thus, 1 0 1 g (65%) of the desired product is obtained in the form of a monohydrate, having the same quality as the product obtained in Example 1.
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Example 4 L 4 Preparation of D-phenyialanut-L-prolui-L-argtnine aldehyde sulfate
The procedure of Example 3 is followed, except that 43 g of catalyst comprising 10% of palladium on carbon, washed beforehand until neutral, are used as
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catait cataiuseur. Thus, we obtain 125J g {83. 2%) of the desired product having the same quality as the product obtained in Example 1.
Example 5
Preparation of N-methyl-O-phenylalanyi-L-protyl-L-arginine sulphate atdehude
20.5 g t0.03 mole] of N-benzyloxycarbonyl-N-methyl-
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D-phenuiaianut-L-protut-NO-benzuioxucarbonut-L-argtnine aldehyde are dissolved in 2 M m) of ethanot, then added with 110 mil of deionized water, 60 ml of 1N sulfuric acid (0.03 mole ) and 3 g of a catalyst comprising 10% palladium on carbon. Then finely divided hydrogen gas is bubbled through the mixture, maintaining the temperature thereof.
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ci at 6-88C. The progress of the reaction is monitored by thin layer chromatographic analysis with a 25/20/6/1 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as eluent.
The Pf values of the starting material, the intermediate and the final product are approximately 0.9, 0.7 and 0.4 respectively on the chromatogram. At the end of the reaction (approximately 2 hours), the
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catalyst is separated by filtration and washed with 3 × 30 ml of deionized water. The filtrate and the washing liquor are combined and evaporated in a rotary evaporator to approximately 100 ml at a temperature of at most 25 ° C., then the residue is extracted with 2 × 50 ml of dichloromethane.
Traces of organic solvent are removed from the aqueous solution by distillation and the residue is diluted with deionized water to a volume of about 200 ml. It is checked that the pH is at a value of approximately 4. If necessary, the pH is adjusted by adding sulfuric acid OJN or with an exchange resin
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of OH- phase ions (for example AG 1 x 8L then the solution is frozen and lyophilized. Thus, 12.5 g (75%) are obtained of the desired product.
Rf = 0.35 to 0.45 (ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water = 25/20/6/1) [α] 20D = -126.0 ¯ 5 (c = L water)
The total content of impurities determined by thin layer chromatographic analysis is 2 to 5%, while the content of impurities by HPLC is about 3-5%.
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N-benzylaxyoarbonyl-hl-methyl-O-phenylelanyl-LN-benzyloxi prolyi-NO-benzyloxycarbonyl-L-arginine aldehyde used as starting material. can be prepared as follows.
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Et-ap N-benzyloxycarbonyl-N-methyl-O-phenylalanyl-L-prolyl-NGbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactam 42. 95 g (0.11 mole) of t-butoxucarbonut-NSbenzyloxycarbonyi-L-arginine lactam are suspended in HO m) of anhydrous chloroform and added with 275 ml of hydrochloric ethyl acetate (11-15 g / 100 ml) with constant stirring. The editorial mixture is stirred at room temperature for 3 hours, the end point of the reaction is determined by thin layer chromatography with a 60/20/6/11 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as eluent. The Rf values of the starting material and the final product
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are about 0.9 and 0.3 respectively. At the end of the reaction, the mixture is diluted with 400 ml of diethyl ether.
The precipitated crystalline substance is separated by filtration, washed with 2 × 100 ml of diethyl ether and 2 × 50 ml of acetone, then dried over phosphorus pentoxide and potassium hydroxide in a vacuum desiccator. After approximately 1-2 hours of drying, the lactam salt thus obtained (approximately 0.1 mole), is dissolved in 100 ml of anhydrous dimethylformamide and stored at a temperature of -15.
C until the time of its use by addition to a mixed anhydride prepared as follows:
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Release of N-benzyloxycarbonyl-N-methyl-D-phenuialanyi-
L-proline
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50. 9 g (0.1 motel of the cyclohexyl ammonium salt of Nbenzuioxucarbonui-N-methui-D-phenuiaianui-L-proiine are dissolved in 200 ml of diethyl ether and 120 ml (1 mole) of IN sulfuric acid. The ethereal phase is washed with 2 × 50 ml of water, dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated under reduced pressure at a temperature of at most 35 ° C. until a thick oil is obtained.
The residue (about 0.1 mole) is dissolved in 170 ml of anhydrous dimethylformamide, cooled to a temperature of - 15. C and added with 11.2 ml (0.1 mole) of N-methyimorpholine with stirring. Then, 13.2 ml of i-butoxycarbonyl chloride are added dropwise at the same temperature for 3-5 minutes.
After 5 to 10 minutes of stirring, the above dimethylformamide suspension of the amino compound is added to the mixed anhydride thus obtained, then 35 ml of triethylamine are added to the reaction mixture under vigorous stirring at a temperature of -20 to - 25. C. The pH of the vapor space is controlled (it must be higher than approximately 8) and if necessary, additional triethuiamine is added. The reaction mixture is stirred for one hour at a temperature of - 15. C, for
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an hour Åa O'C. then it is diluted with 200 m) of benzene and 150 ml of water.
The phases are separated and the aqueous phase is extracted with 3x30 m! benzene. The combined benzene solutions are washed with 2x50 ml of water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure at a temperature of at most 40. C until a thick oil is obtained. The oily residue is dissolved in 75 ml of a 2/1 mixture of ether and tetrahydrofuran and filtered through a filter bed as follows:
300 g (quintuple quantity) of Kiegelgel-60 adsorbent are suspended in ether and a filter bed is prepared
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with a ratio of diameter to height of 3 to 1.
Task
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contaminant is eluted with a 95/5 mixture of ether and tetrahydrofuran, while the desired product is eluted with pure tetrahudrofuran. The substance content of the fractions is checked by thin layer chromatography with a 480/20/6/11 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as eluent. The Rf value of the desired product is from 0.71 to 0.75. The combined fractions are evaporated under vacuum at a temperature of at most 3S. C until a thick oil is obtained and the product is used immediately or stored in dry ice. Yield: 58.8 g (85%).
Rf = 0.71 to 0.75 (ethyl acetyridinacetic acid / water = 480/20/6/11 J.
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[= +13.5 'fc = 1, tetrahydrofuranel.
Step 2 N-benzutoxucarbonut-N-methut-D-phenutatanui-L-proiui-NSbenzyloxycarbonyl-L-arginine aidehyde. y 1 34, 14 g (0.05 mole) of N-benzyloxycarbonyl-Nmethui-D-phenuia! anui-L-pro) ui-NB-bcnzu) oxucarbonui-Larginine lactam from Example 5, step 1, are dissolved in 150 ml of anhydrous tetrahydrofuran cooled to an O'C temperature.
The solution is cooled to a temperature of -20 ° C. and 0.0755 mole of aluminolithic hydride dissolved in tetrahydrofuran
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is added with stirring in 5 to 10 minutes. The course of the is added under reduction is followed by thin layer chromatography with a 240/20/6/11 mixture of ethyl acetate / pyridine / acetic acid / water as eluent. The Rf values of the starting lactam and of the aldehyde are 0, 8 and 0, 5 respectively
If necessary, an additional quantity of aluminolithic hydride is added and when the reaction is complete, the reaction mixture is poured little by little into 320 ml of 1 N solution of sulfuric acid at a temperature of 2-4 ' C under constant agitation.
The final pH must be between 2 and 3, this pH being adjusted by the optional addition of an additional quantity of sulfuric acid. If a precipitate is formed, it is
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separated by filtration, the solution is diluted with water until a haze is formed, then this is extracted with 3 × 10 ml of n-hexane.
The tetrahudrofuran phase is extracted with 250 ml of dichioromethane two or three times and the solutions
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combined dichioromethanics are washed with 2x50 ml of water. 2x50 ml of a cold 5% solution of sodium hydrogen carbonate, then with 2x50 ml of water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated in vacuo at a temperature not more than 40. C.
The evaporation residue is dissolved in a mixture
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7/3 of dichloromethane and acetone (120 ml sent without suction through a! Filter filter prepared from 108 g of Kieselgel-60 adsorbent with 200 ml of a 1/3 mixture of dichloromethane and acetone, then the filter bed is washed with 600 ml of the same eluent mixture, the process may not last more than 20 minutes.
The combined filtrates are evaporated at approximately 50-60 ml under reduced pressure at a temperature of at most 40 ° C., then this operation is repeated after the addition of 100 ml of benzene to the residue. The product is precipitated from the solution of approximately
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50-60 ml by addition of 100 ml of cyclohexane.
The precipitate thus obtained is washed with 2x30 ml of cyclohexane and dried in a vacuum desiccator at room temperature on paraffin shavings. 18 g of the desired product are thus obtained.
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Pf = 0.55-0.59 (ethyl acetate Rf = 0.55-0.59 [ethute acetate / pyridine / acetic acid / water =
240/20/6/11).
[α] 20D = +14.1 (c = 1, tetrahydrofuran).
The total content of impurities in the product is 2-3% maximum.