BREVET PRINCIPAL
La présente invention concerne un procédé perfectionné de préparation des esters d'alcoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (dénommé ci-après a
APE). L'a-APE possède des propriétés édulcorantes semblables à celles du sucre de canne qui le font considérer comme un nouvel agent édulcorant (brevet belge No 717373).
Antérieurement à l'invention, on produisait l'a-APE par mise en contact d'un dérivé de l'acide aspartique dans lequel des groupes protecteurs ont été fixés au groupe amino et B-carboxyle et dans lequel le groupe a-carboxyle a été transformé en un groupe réactif, avec un ester de la L-phénylalanine, et élimination séparée de deux groupes protecteurs (brevet des Pays-Bas O.P.I.
No 6800870).
Le procédé sus-mentionné ne peut pas être appliqué sur une grande échelle puisqu'il comporte de nombreuses opérations et nécessite de nombreuses matières premières, et, de plus, le rendement total est très faible.
L'invention concerne un procédé avantageux et industriel de préparation d'une a-APE ne possédant pas ces défauts et qui est caractérisé par la réaction d'un anhydride L-aspartique protégé à l'azote, dans lequel un groupe protecteur estun groupeformyle, carbobenzoxy ou paraméthoxycarbobenzoxy, sur un ester alcoylique inférieur de la L-phénylalanine dans un solvant organique et par l'élimination du groupe protecteur par des moyens appropriés.
II est connu qu'on obtient un dérivé a-aspartylique du type amide en faisant réagir un anhydre aspartique protégé à l'azote sur une amine.
La réaction sus-mentionnée fournit un mélange de dérivés d'a et B-aspartyle. Le rapport de formation des dérivés a et ,8 protégés à l'azote dépend non seulement du groupe protecteur à l'azote et de l'amine particulière employée, mais aussi des solvants utilisés. Un dérivé du p-aspartyle se forme très fréquemment en quantité beaucoup plus importante. Dans le cas où l'on obtient une plus forte proportion de dérivé d'-aspartyle, le rendement est faible si l'on utilise comme amine un ester alcoylique d'amino-acide. Par exemple, un dérivé ,8 se forme en plus grande quantité qu'un dérivé a dans la réaction de l'anhydride N-acétyl-L-aspartique sur l'aniline (J. Chem. Soc., 1953, 453).
Dans la réaction de l'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique sur l'ester éthylique de la glycine, L'ester éthylique de la p-N-car- bobenzoxy-L-aspartylglycine est obtenu avec un rendement de 21 % tandis que le rendement en dérivé a est seulement de 19 %. Si l'on utilise un ester éthylique de la L-tyrosine à la place de l'ester éthylique de la glycine, il se forme cependant 15 % d'un ester éthylique de la p-N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-tyrosine et 40 % du dérivé a correspondant (J. Chem., Soc., 1952, 24).
La réaction selon l'invention fournit, également en même temps, des esters a et t3 d'alcoyle protégés à l'azote de la L-aspartyl-L-phénylalanine. Circonstance favorable, le dérivé a protégé à l'azote se forme de préférence avec un rendement élevé tandis que la quantité de dérivé , formée est très faible. L'a-APE a un pouvoir édulcorant très fort, au contraire les esters alcoyliques inférieurs de la ,8-L-aspartyl-L-phénylalanine (dénommés É3-APE) préparés par élimination du groupe protecteur du dérivé 0- protégé à l'azote ont un goût légèrement amer. Par conséquent, la ss-APE doit être éliminée dans une proportion suffisante du produit envisagé, l'a-APE.
On sait en général que la séparation des dérivés a et 0 de l'aspartyle est difficile (J. Chem. Soc., 1959, 3868).
Cependant, un procédé de séparation facile des APE a et p ou bien des dérivés a et , protégés à l'azote est décrit dans l'invention.
L'anhydride N-formyl-L-aspartique, l'anhydride Ncarbobenzoxy-L-aspartique et l'anhydride N-p-méthoxy carbobenzoxy-L-aspartique, qui sont employés comme réactifs, peuvent être facilement obtenus à partir de l'acide L-aspartique avec un rendement élevé. Ledit anhydride L-aspartique protégé à l'azote est avantageusement préparé par synthèse en traitant par l'anhydride acétique un acide L-aspartique protégé à l'azote. Il suffit d'employer l'anhydride acétique dans une proportion comprise entde 1 à 1,2 mole par mole d'un acide Laspartique protégé à l'azote. Ladite réaction est en général mise en oeuvre dans un solvant organique à une température comprise entre 0 et 600 C.
On fait réagir dans un solvant organique l'anhydride L-aspartique protégé à l'azote ainsi obtenu sur un ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine, dans lequel le groupe al- coyle est un radical méthyle, éthyle ou propyle.
On obtient ainsi un ester d'alcoyle inférieur protégé à l'azote de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine qui est le produit intermédiaire cherché. L'ester de la L-phénylalanine est en général employé dans la proportion de 1 à 2 moles d'anhydride L-aspartique protégé à l'azote, dans tout solvant organique capable de dissoudre les réactifs et inertes envers ceux-ci.
Des solvants appropriés incluent des esters tels que l'acétate d'éthyle et le propionate de méthyle; des éthers acycliques ou cycliques tels que l'éthyl-ester, le tétrahydrofuranne et le dioxanne: des hydrocarbures halogénés tels que le chloroforme et le dichlorure d'éthylène; des cétones telles que l'acétone, la méthyléthylcétone et la diéthylcétone; des amides tel sque le N,N-diméthylformamide et l'hexa- méthylphosphorylamide; des hydrocarbures tels que le benzène et le toluène; des acides carboxyliques organiques tels que l'acide acétique et l'acide propionique; le sulfoxyde de diméthyle; le nitrométhane et la y-butyrolactone. Bien que cette réaction de condensation se produise sans à-coups à la température ambiante, la vitesse de réaction peut être accrue par chauffage du mélange réactionnel.
Cependant, si la température de réaction est trop élevée, une réaction secondaire telle que la racémisation tend à se produire. Par conséquent, ladite réaction de condensation est en général mise en oeuvre à une température inférieure à 600 C, de préférence à une température inférieure à 300 C.
En ce qui concerne le dérivé N-protégé obtenu par la réaction de condensation, on élimine le groupe protecteur par des procédés appropriés fonction de sa nature particulière, tels que l'hydrogénation catalytique et le traitement par l'acide bromhydrique ou l'acide chlorhydrique. On obtient ainsi un ester de la L-aspartyl-Lphénylalanine.
L'ester de la L-aspartyl-L-phénylalanine ainsi obtenu contient une faible proportion de ss-APE si le dérivé ss-N protégé n'est pas séparé des dérivés a N-protégés par les procédés mentionnés ci-après. Après recristallisation dans l'eau ou dans de l'eau mélangée à un solvant organique soluble dans l'eau tel que le méthanol et l'éthanol, on sépare de la solution par cristallisation uniquement I'a-APE. I1 est donc facile de séparer les mélanges de l'a- et ss-APE et leurs constituants.
La séparation est également effectuée avant d'éliminer les groupes protecteurs des dérivés a et f3 N-protégés.
Les solubilités des dérivés a et ss N-protégés varient suivant le solvant, mais la différence entre celles des deux dérivés dans un même solvant n'est pas très grande. Par conséquent, on considérait comme difficile la séparation à ce stade. A la suite de l'étude de la demanderesse, on a observé que la différence des solubilités entre les dérivés a et ss N-protégés augmente par leur mise en contact avec une amine telle qu'une trialcoylamine, I'aniline, la pyridine et les esters d'aminoacide pour former les sels correspondants.
Par conséquent, la séparation peut aussi être effectuée facilement à ce stade. Par exemple, quand un ester d'alcoyle inférieur de la phénylalanine est employé à raison de 2 moles par mole d'anhydride L-aspartique
N-protégé, des dérivés a et ss N-protégés existent dans la solution obtenue sous forme de leurs sels d'ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine. La solubilité du sel d'un dérivé ss dans divers solvants organiques tels que l'acétate d'éthyle est bien inférieure à celle du sel du dérivé a correspondant, par conséquent, le dérivé ss est facilement séparé du mélange réactionnel.
Le procédé selon l'invention présente ces avantages parce qu'il comporte moins d'opérations que le procédé antérieurement connu, sa mise en oeuvre est facile et le produit envisagé est obtenu avec un rendement éleve à partir de l'acide aspartique. Bien qu'une ss-APE se forme aussi en même temps qu'une a-APE par la réaction selon l'invention la quantité de ss-APE est bien inférieure à celle d'a-APE. Le rapport de l'a-APE à la ss-APE est supérieur à 4,5/1. De plus, la séparation du mélange des a- et f3-APE, ou des dérivés a et ss peut être réalisée facilement. Par conséquent, I'invention concerne un excellent procédé industriel de préparation d'esters d'alcoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (a-APE).
Les exemples ci-après expliquent la mise en oeuvre de l'invention.
Exemple I
9 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine sont mis en suspension dans 80ml de chloroforme et ensuite on neutralise cette suspension en ajoutant 4,4 g de triéthylamine pour dissoudre l'ester. On ajoute 100ml d'éther à la solution obtenue et on refroidit le tout dans un bain de glace pendant 10 mn. Ensuite, on sépare par filtration, puis lave à l'éther, le chlorhydrate de triéthylamine formé. On concentre le filtrat et les liqueurs de lavage sous pression réduite pour obtenir un ester méthylique de la L-phénylalanine.
L'ester méthylique de la L-phénylalanine obtenu et S g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique sont dissous dans 100ml d'acétate d'éthyle et on agite à la température ambiante pendant 5h puis on laisse reposer une nuit. Les cristaux séparés se dissolvent rapidement par chauffage et l'on refroidit la solution à la température ambiante en agitant à nouveau. Les 2,2 g de cristaux séparés sont recueillis par filtration.
Après addition de 50 ml d'acétate d'éthyle au filtrat, la solution obtenue est lavée à l'acide chlorhydrique 1N et ensuite à l'eau. Les liqueurs de lavage sont concentrées sous pression réduite. On fait recristalliser le résidu à partir d'un mélange de méthanol et d'éther pour obtenir 3,5 g de chlorhydrate d'ester méthylique de Nphénylalanine.
La couche d'acétate d'éthyle est desséchée par du sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 150ml d'acide acétique à 75 % et est hydrogéné catalytiquement, en présence de 1 g de charbon palladié à 5 %, à la température ambiante, en agitant. Après avoir séparé par filtration le catalyseur et concentré le filtrat sous pression réduite on fait recristalliser le résidu dans reau pour obtenir 4g d'aiguilles d'un ester méthylique de ra-L- aspartyl-L-phénylanine fondant à 234-2350 C (avec décomposition). Les produits obtenus sont identiques en ce qui concerne leur spectre infrarouge, leur chromatogramme sur papier, leur point de fusion et leur composition élémentaire à un échantillon authentique préparé par un autre procédé de synthèse.
Analyse élémentaire:
C H N(%) calculé pour C14H10O5N2. 1/2 H2O: 55,44 6,31 9,24 observé: 55,45 6,10 9,39
Les 2,2 g de cristaux qui se séparent d'abord du mélange susmentionné obtenu par une réaction de condensation sont recristallisés dans une solution d'acétate d'éthyle de manière à obtenir 1,3 g d'aiguilles ayant une température de fusion entre 138 et 138,50 C. Ces aiguilles sont identifiées comme le sel de L-phénylalaninate de méthyle du N-carbobenzoxy-ss-L-aspartyl-L-phénylalani- nate de méthyle, par leur spectre infrarouge, leur composition élémentaire et le produit de leur hydrogénation.
Les résultats de l'analyse élémentaire sont:
C H N(%) calculé pour CS3H3909N3: 63,25 6,14 6,92 observe: 63,35 6,21 6,63
On dissout les 1,3 g de cristaux obtenus dans 100 ml d'acide acétique à 75 % et on ajoute à la solution 0,2 g de charbon palladié à 5 %. Le mélange est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 4 h.
Après cristallisation d'un mélange d'eau et d'éthanol, on obtient 0,6 g d'aiguilles d'ester méthylique de la f3-L- aspartyl-L-phénylalanine fondant entre 188 et 1890 C (avec décomposition). Sa composition élémentaire est: N (%) observé: 9,32 calculé pour C14H18O5N2 .1/2 H,O : 9,24
Exemple 2
On met en suspension 4,8 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine dans 40ml de chloroforme. On neutralise la suspension puis la dissout en ajoutant 2,3 g de triéthylamine. La solution obtenue est refroidie dans un bain de glace et on y ajoute 50ml d'éther. Au bout de 10 mon, on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé et le lave à l'éther.
Le filtrat et les eaux de lavage sont concentrés de ma nière à obtenir l'ester méthylique de la L-phénylalanine.
Cet ester est dissous dans 50 ml d'acétate d'éthyle et on y ajoute 5 g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 1 h et laisse au repos une nuit. La solution obtenue est lavée avec une solution normale d'acide chlorhydrique et ensuite à l'eau, puis séchée avec du sulfate anhydre de sodium.
Après concentration de la solution sous pression réduite on dissout le résidu dans 150 ml d'acide acétique à 75 % et on ajoute 0,8 g de carbone palladié à 5 % .
Le mélange réactionnel est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 5 h. Après élimination du catalyseur, on concentre le filtrat sous pression réduite. On fait cristalliser le résidu dans l'eau pour obtenir 3,2 g d'aiguilles fondant entre 234 et 2350 C (avec décomposition). Ces cristaux sont identifiés comme étant l'ester méthylique pur de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine par le spectre infrarouge, le point de fusion, par analyse par électrophorèse sur papier (I'électrophorèse est mise en oeuvre dans une solution aqueuse d'acide acétique de pH 2,77 sous 30 V/cm. Le chromatogramme présente une seule tache quand il est développé à la ninhydrine).
On obtient 1,1 g d'un mélange cristallisé d'esters méthyliques a- et f3- de la L-aspartyl-L-phénylalanine à partir de la liqueur-mère.
Exemple 3
On ajoute, à une solution de 2,67 g d'acide para-méthoxycarbobenzoxy-L-aspartique dans le tétrahydrofurane, 2,06 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 20 ml de tétrahydrofurane. On obtient ainsi une solution d'anhydride N-p-méthoxycarbobenzoxy-L-aspartique. Au bout d'une heure, on ajoute lentement à la solution ci-dessus d'anhydride 20ml d'une solution dans le chloroforme préparée par neutralisation de 2,63 g de chlorhydrate d'ester éthylique de L-phénylalanine par 1,68 ml de triéthylamine, et on agite pendant 2h. Ensuite, la dicyclohexylurée produite est séparée par filtration et le filtrat est concentré, le résidu est dissous dans 50ml de chloroforme puis lavé à l'acide chlorhydrique dilué et ensuite à l'eau.
La solution obtenue est séchée avec du sulfate de sodium anhydre et est ensuite concentrée de manière à obtenir des cristaux blancs. Les cristaux sont mis en suspension dans un mélange de 10 ml de méthanol et 15 ml d'acide acétique. La suspension est hydrogénée catalytiquement en présence de 0,8 g de charbon palladié à 5 % à la température ambiante pendant 4 h.
Après élimination du catalyseur, on concentre la solution obtenue sous pression réduite de manière à obtenir une poudre blanche. On fait cristalliser cette poudre dans l'eau chaude de manière à obtenir 1,96g d'ester éthylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. Ces cristaux fondent entre 246 et 2470 C (avec décomposition). Les résultats d'une analyse élémentaire sont les suivants:
C H N(%) observé: 56,57 6,60 8,80 calculé pour C15H20ODN2.1/2HaO: 56,77 6,67 8,87
Exemple 4
9 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la N-phénylalanine sont mis en suspension dans 80 mi de chloroforme. On neutralise et dissout la suspension par addition de 4,4 g de triéthylamine. On refroidit la solution obtenue dans un bain de glace auquel on ajoute 100 ml d'éther.
Au bout de 10 mon, on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé et le lave à l'éther.
On concentre le filtrat et les eaux de lavage et on dissout le résidu dans 50 ml de N,N.diméthylformamide.
Après addition de 2,9 g d'anhydride N-formyl-L-aspartique à la solution obtenue, on agite à la température ambiante pendant i h puis laisse reposer une nuit.
Après élimination du solvant sous pression réduite, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et le maintient pendant une nuit dans un réfrigérateur. Les cristaux séparés sont rassemblés par filtration et lavés à l'acétate d'éthyle. On obtient 6,4 g de cristaux fondant entre 131 et 1330 C. Après recristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient des cristaux fondant entre 134,5 et 135,50 C avec un rendement de 5,1 g. Ces cristaux sont identifiés comme constitués par le sel de L-phénylalaninate de méthyle du N-formyl-L-aspartyl-L-phénylalaninate de méthyle, par leur spectre infrarouge et leur composition élémentaire. Les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants.
C H N(%) observé: 59,61 6,37 8,35 calculé pour C25H3tO8N8: 59,87 6,23 8,38
Les 5 g de cristaux sont dissous dans le chloroforme puis lavés à l'acide chlorhydrique dilué et à l'eau puis séchés avec du sulfate anhydre de sodium et concentrés.
On dissout le résidu dans 75 ml de méthanol aqueux à 75 % et on ajoute un mélange de i mi d'acide chlorhydrique concentré et 10ml de méthanol. On agite le mélange résultant pendant 24 heures à la température ambiante, et ensuite on neutralise un équivalent de solution de bicarbonate de sodium. Après conservation de la solution dans un réfrigérateur pendant une nuit, les 2,6 g de cristaux séparés sont rassemblés par filtration; ils fondent entre 233 et 2340 C en se décomposant.
L'analyse quantitative des cristaux est exécutée de la manière indiquée dans l'exemple 2. Elle confirme que les cristaux sont un ester méthylique de l'a-L-aspartyl
L-phénylalanine. La pureté des cristaux est supérieure ou égale à 95%.
Exemple 5
On met en suspension 16 g, soit 0,06 mole d'acide
N-carbobenzoxy-L-aspartique dans 24 ml d'acétate d'éthyle et on ajoute à la suspension 7,7 g soit 0,072 mole d'anhydride à 96 %. On agite la suspension à la température ambiante pendant six heures pour obtenir de l'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
Par ailleurs, on met en suspension 15,5 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine dans un mélange de 100ml d'eau et de 150ml d'acétate d'éthyle. On ajoute 7,3 g de carbonate acide de sodium à la suspension et on agite, puis on laisse se former deux couches distinctes.
La couche d'acétate d'éthyle est ajoutée à la solution ci-dessus d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique en agitant pendant 15 mn. Après cette addition, on continue à agiter pendant six heures à la température ambiante. Le solvant est séparé par distillation sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un mélange de 90 ml de méthanol et 45 ml d'eau et on y ajoute ensuite 2,2 g de carbonate acide de sodium. On ajoute 1 g de charbon palladié à 5 % à la solution, et on hydrogène l'ensemble pendant cinq heures à la température ambiante. Le catalyseur est séparé par filtration et le filtrat est concentré sous pression réduite On dissout le résidu dans 1,5 1 d'eau, dont 5 microlitres sont soumis à la même analyse par électrophorèse sur papier que dans l'exemple 2.
On forme sur le papier une tache avec de la ninhydrine associée à un sel de cadmium de la manière décrite par J. Heilmann et al. (Z. Physiol.
Chem., 309, 210 (1957). Les taches colorées correspondant à l'ester méthylique de l' -L-aspartyl-L-phényl- alanine et à l'ester méthylique de la ,ss-L-aspartyl-L- phénylalanine et à l'ester méthylique de la ,8-L-aspartyl-
L-phénylalanine sont séparées par découpage et éluées avec du méthanol et les coefficients d'absorption des éluats sont mesurés à 510 millimicrons. On apprend qu'il y a 14,8 g (rendement: 81 %) d'un ester méthylique de l'u-L-aspartyl-L-phénylalanine et 3,3 g (rendement: 18 %) d'un ester méthylique de la ,13-L-aspartyl-
L-phénylalanine dans la totalité de la solution. Cette solution est concentrée sous pression réduite.
Le résidu est recristallisé dans l'eau pour obtenir 11,4 g d'aiguilles (rendement 63 SO). Le fait que les cristaux sont uniquement de l'ester méthylique de l'a-L-aspartyl-L-phényl- alanine est confirmé par une électrophorèse sur papier.
Exemple 6
On met en suspension 13,6 g de chlorhydrate d'ester méthylique de L-phénylalanine dans un mélange de 100 mi d'eau et 75 mi de dichlorure d'éthylène, puis on neutralise avec 6,9 g de carbonate acide de sodium.
On sépare la couche de dichlorure d'éthylène tandis qu'on extrait la couche aqueuse avec 75 mi de dichlorure d'éthylène. On réunit les deux couches de dichlorure d'éthylène pour obtenir la solution d'ester.
On ajoute goutte à goutte, au cours de 15 minutes.
la solution d'ester à une solution d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique préparée par la réaction de 16g d'acide N-carbobenzoxy-L-aspartique avec 7g d'anhydride acétique à 96 % dans 24 ml de chlorure d'éthylène, en agitant à 400-45 C pendant 20 heures. Après avoir laissé reposer à la température ordinaire pendant 5 heures, on chasse le solvant par distillation. On dissout le résidu dans un mélange de 90 ml de méthanol et 45 ml d'eau, et l'hydrogène à la température ordinaire pendant 2 heures en présence de 1,0 g de catalyseur de charbon palladié à 5 %. On dissout les cristaux qui précipitent en chauffant la solution, et filtre le mélange hydrogéné pour séparer le catalyseur. On évapore le filtrat à sec sous vide.
Le résidu, après recristallisation dans l'eau, donne 11,8 g d'ester méthylique d'a-L-aspartyl-Lphénylalanine qu'on identifie comme dans l'exemple 2.
Exemple 7
On met en suspension 23,7 g de chlorhydrate d'ester méthylique de L-phénylalanine dans un mélange de 150 ml d'eau et 150 mi d'acétate d'éthyle, et ajoute 12 g de carbonate acide de sodium pour dissoudre l'ester et neutraliser la solution. On sépare la couche d'acétate d'éthyle, tandis qu'on extrait la couche aqueuse avec 150ml d'acétate d'éthyle. On sèche les couches d'acétate d'éthyle réunies sur du sulfate de sodium anhydre et les évapore sous vide pour isoler l'ester méthylique de la L-phénylalanine.
On dissout l'ester dans 150 mi d'acide acétique, puis ajoute 25g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique en agitant à la température ordinaire. Après avoir laissé reposer une nuit, on évapore les solvants sous vide. On dissout le résidu dans un mélange de 170ml de méthanol et 80ml d'eau, puis l'hydrogène pendant 5 heures à la température ordinaire en présence de 2,0 g de catalyseur de charbon palladié à 5 %.
Après avoir séparé le catalyseur, on examine une partie du filtrat comme dans l'exemple 5. On trouve que le mélange contient 23,3 g d'ester méthylique d'a-
L-aspartyl-L-phénylalanine (rendement de 77 %) et 6,6 g de l'isomère p (rendement de 22 %).
On isole 18,8 g de cristaux de l'isomère a pur à partir du filtrat en évaporant celui-ci sous vide et en recristallisant le résidu dans l'eau.
Exemple 8
On dissout 16 g d'acide N-carbobenzoxy-L-aspartique dans 24 ml d'acétone et ajoute 7,7 g d'anhydride acétique à 96 %. On agite la solution pendant 20 heures à la température ordinaire pour obtenir la solution d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
On ajoute 11,8 g d'ester méthylique de L-phénylalanine dissous dans 100ml d'acétone à la solution d'an hydride en agitant puis laisse reposer une nuit. Après avoir séparé le solvant, on dissout le résidu dans un mélange de 90 mi de méthanol et 45 mi d'eau. On ajoute 1,0g de carbonate acide de sodium et 1,0g de catalyseur de charbon palladié à 5 %, puis hydrogène le produit intermédiaire formé par condensation à la température ordinaire pendant 6 heures.
Après avoir séparé le catalyseur, on évapore sous vide le mélange d'hydrogénation. On obtient 11,4g de cristaux de l'ester méthylique d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine pur par recristallisation du résidu dans l'eau.
MAIN PATENT
The present invention relates to an improved process for the preparation of lower alkyl esters of α-L-aspartyl-L-phenylalanine (hereinafter referred to as a
APE). A-APE has sweetening properties similar to those of cane sugar which make it considered as a new sweetening agent (Belgian patent No 717373).
Prior to the invention, α-APE was produced by contacting an aspartic acid derivative in which protecting groups have been attached to the amino and B-carboxyl group and in which the α-carboxyl group has been transformed into a reactive group, with an ester of L-phenylalanine, and separate removal of two protecting groups (Dutch patent OPI
No 6800870).
The above-mentioned process cannot be applied on a large scale since it involves many operations and requires many raw materials, and, moreover, the total yield is very low.
The invention relates to an advantageous and industrial process for the preparation of an α-APE lacking these defects and which is characterized by the reaction of a protected L-aspartic anhydride with nitrogen, in which a protecting group is a formyl group, carbobenzoxy or paramethoxycarbobenzoxy, on a lower alkyl ester of L-phenylalanine in an organic solvent and by removing the protecting group by suitable means.
It is known that an α-aspartyl derivative of the amide type is obtained by reacting a nitrogen-protected aspartic anhydrous with an amine.
The above-mentioned reaction provides a mixture of α and β-aspartyl derivatives. The formation ratio of the nitrogen protected α and 8 derivatives depends not only on the nitrogen protecting group and the particular amine employed, but also on the solvents employed. A derivative of p-aspartyl is formed very frequently in much larger quantities. In the case where a higher proportion of-aspartyl derivative is obtained, the yield is low if an amino acid alkyl ester is used as the amine. For example, a derivative, 8 is formed in greater quantity than an a derivative in the reaction of N-acetyl-L-aspartic anhydride with aniline (J. Chem. Soc., 1953, 453).
In the reaction of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride with the ethyl ester of glycine, the ethyl ester of pN-car-bobenzoxy-L-aspartylglycine is obtained in a yield of 21% while the yield in derivative a is only 19%. If an ethyl ester of L-tyrosine is used instead of the ethyl ester of glycine, however, 15% of an ethyl ester of pN-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-tyrosine is formed and 40% of the corresponding α derivative (J. Chem., Soc., 1952, 24).
The reaction according to the invention provides, also at the same time, nitrogen-protected α and t3 alkyl esters of L-aspartyl-L-phenylalanine. Favorable circumstance, the derivative protected with nitrogen is preferably formed with a high yield while the amount of derivative formed is very low. Α-APE has a very strong sweetening power, in contrast the lower alkyl esters of, 8-L-aspartyl-L-phenylalanine (referred to as E3-APE) prepared by removing the protective group of the O-protected derivative at the. nitrogen have a slightly bitter taste. Therefore, ss-APE must be removed in a sufficient proportion of the intended product, α-APE.
It is generally known that the separation of the α and β derivatives of aspartyl is difficult (J. Chem. Soc., 1959, 3868).
However, a process for easy separation of α and β APEs or α and α derivatives protected with nitrogen is described in the invention.
N-formyl-L-aspartic anhydride, Ncarbobenzoxy-L-aspartic anhydride and Np-methoxy carbobenzoxy-L-aspartic anhydride, which are used as reagents, can be easily obtained from L- acid. aspartic with high yield. Said nitrogen protected L-aspartic anhydride is advantageously prepared by synthesis by treating a nitrogen protected L-aspartic acid with acetic anhydride. It suffices to use acetic anhydride in a proportion of entde 1 to 1.2 moles per mole of a Laspartic acid protected with nitrogen. Said reaction is generally carried out in an organic solvent at a temperature between 0 and 600 C.
The nitrogen protected L-aspartic anhydride thus obtained is reacted in an organic solvent with a lower alkyl ester of L-phenylalanine, in which the alkyl group is methyl, ethyl or propyl.
There is thus obtained a nitrogen-protected lower alkyl ester of α-L-aspartyl-L-phenylalanine which is the desired intermediate product. The ester of L-phenylalanine is generally employed in the proportion of 1 to 2 moles of L-aspartic anhydride protected with nitrogen, in any organic solvent capable of dissolving the reactants and inert to them.
Suitable solvents include esters such as ethyl acetate and methyl propionate; acyclic or cyclic ethers such as ethyl ester, tetrahydrofuran and dioxane: halogenated hydrocarbons such as chloroform and ethylene dichloride; ketones such as acetone, methyl ethyl ketone and diethyl ketone; amides such as N, N-dimethylformamide and hexamethylphosphorylamide; hydrocarbons such as benzene and toluene; organic carboxylic acids such as acetic acid and propionic acid; dimethyl sulfoxide; nitromethane and γ-butyrolactone. Although this condensation reaction proceeds smoothly at room temperature, the reaction rate can be increased by heating the reaction mixture.
However, if the reaction temperature is too high, a side reaction such as racemization tends to occur. Therefore, said condensation reaction is generally carried out at a temperature below 600 C, preferably at a temperature below 300 C.
As regards the N-protected derivative obtained by the condensation reaction, the protecting group is removed by appropriate methods depending on its particular nature, such as catalytic hydrogenation and treatment with hydrobromic acid or hydrochloric acid. . An ester of L-aspartyl-Lphenylalanine is thus obtained.
The ester of L-aspartyl-L-phenylalanine thus obtained contains a small proportion of ss-APE if the protected ss-N derivative is not separated from the α N-protected derivatives by the methods mentioned below. After recrystallization from water or from water mixed with a water-soluble organic solvent such as methanol and ethanol, only α-APE is separated from the solution by crystallization. It is therefore easy to separate the mixtures of α- and ss-APE and their constituents.
The separation is also carried out before removing the protective groups of the N-protected a and f3 derivatives.
The solubilities of the N-protected α and ss derivatives vary depending on the solvent, but the difference between those of the two derivatives in the same solvent is not very great. Therefore, separation was considered difficult at this stage. As a result of the Applicant's study, it was observed that the difference in solubilities between the N-protected α and ss derivatives increases by bringing them into contact with an amine such as a trialkylamine, aniline, pyridine and amino acid esters to form the corresponding salts.
Therefore, the separation can also be carried out easily at this stage. For example, when a lower alkyl ester of phenylalanine is employed at a rate of 2 moles per mole of L-aspartic anhydride
N-protected, N-protected α and ss derivatives exist in the solution obtained in the form of their lower alkyl ester salts of L-phenylalanine. The solubility of the salt of an ss derivative in various organic solvents such as ethyl acetate is much lower than that of the salt of the corresponding α derivative, therefore, the ss derivative is easily separated from the reaction mixture.
The process according to the invention has these advantages because it comprises fewer operations than the previously known process, its implementation is easy and the envisaged product is obtained with a high yield from aspartic acid. Although an ss-APE is also formed at the same time as an α-APE by the reaction according to the invention, the amount of ss-APE is much less than that of α-APE. The ratio of a-APE to ss-APE is greater than 4.5 / 1. In addition, the separation of the mixture of α- and f3-APE, or α and ss derivatives can be carried out easily. Therefore, the invention relates to an excellent industrial process for the preparation of lower alkyl esters of α-L-aspartyl-L-phenylalanine (α-APE).
The examples below explain the implementation of the invention.
Example I
9 g of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride are suspended in 80 ml of chloroform and this suspension is then neutralized by adding 4.4 g of triethylamine to dissolve the ester. 100 ml of ether are added to the solution obtained and the whole is cooled in an ice bath for 10 min. Next, the triethylamine hydrochloride formed is separated by filtration and then washed with ether. The filtrate and the washings are concentrated under reduced pressure to obtain a methyl ester of L-phenylalanine.
The methyl ester of L-phenylalanine obtained and S g of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride are dissolved in 100 ml of ethyl acetate and the mixture is stirred at room temperature for 5 hours and then left to stand overnight. The separated crystals quickly dissolve on heating and the solution is cooled to room temperature with further stirring. The 2.2 g of crystals separated are collected by filtration.
After adding 50 ml of ethyl acetate to the filtrate, the solution obtained is washed with 1N hydrochloric acid and then with water. The washing liquors are concentrated under reduced pressure. The residue was recrystallized from a mixture of methanol and ether to obtain 3.5 g of Nphenylalanine methyl ester hydrochloride.
The ethyl acetate layer is dried with anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. The residue is dissolved in 150 ml of 75% acetic acid and is catalytically hydrogenated, in the presence of 1 g of 5% palladium on charcoal, at room temperature, with stirring. After filtering off the catalyst and concentrating the filtrate under reduced pressure, the residue is recrystallized from water to obtain 4 g of needles of a methyl ester of ra-L-aspartyl-L-phenylanine, melting at 234-2350 C (with decomposition). The products obtained are identical as regards their infrared spectrum, their chromatogram on paper, their melting point and their elemental composition to an authentic sample prepared by another synthesis process.
Elemental analysis:
C H N (%) calcd for C14H10O5N2. 1/2 H2O: 55.44 6.31 9.24 observed: 55.45 6.10 9.39
The 2.2 g of crystals which first separate from the above-mentioned mixture obtained by a condensation reaction are recrystallized from an ethyl acetate solution so as to obtain 1.3 g of needles having a melting temperature between 138 and 138.50 C. These needles are identified as the methyl L-phenylalaninate salt of methyl N-carbobenzoxy-ss-L-aspartyl-L-phenylalaninate, by their infrared spectrum, elemental composition and product. of their hydrogenation.
The results of the elemental analysis are:
C H N (%) calculated for CS3H3909N3: 63.25 6.14 6.92 observed: 63.35 6.21 6.63
The 1.3 g of crystals obtained are dissolved in 100 ml of 75% acetic acid and 0.2 g of 5% palladium on carbon is added to the solution. The mixture is catalytically hydrogenated at room temperature for 4 h.
After crystallization of a mixture of water and ethanol, 0.6 g of needles of β-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester are obtained, melting between 188 and 1890 C (with decomposition). Its elemental composition is: N (%) observed: 9.32 calculated for C14H18O5N2 .1 / 2 H, O: 9.24
Example 2
4.8 g of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride is suspended in 40 ml of chloroform. The suspension is neutralized and then dissolved by adding 2.3 g of triethylamine. The solution obtained is cooled in an ice bath and 50 ml of ether are added thereto. After 10 ml, the triethylamine hydrochloride formed is separated by filtration and washed with ether.
The filtrate and the washing waters are concentrated so as to obtain the methyl ester of L-phenylalanine.
This ester is dissolved in 50 ml of ethyl acetate and 5 g of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride are added thereto.
The reaction mixture is stirred at room temperature for 1 hour and left to stand overnight. The resulting solution is washed with normal hydrochloric acid solution and then with water, then dried with anhydrous sodium sulfate.
After concentrating the solution under reduced pressure, the residue is dissolved in 150 ml of 75% acetic acid and 0.8 g of 5% palladium on carbon is added.
The reaction mixture is catalytically hydrogenated at room temperature for 5 h. After removal of the catalyst, the filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue is crystallized from water to give 3.2 g of needles melting between 234 and 2350 C (with decomposition). These crystals are identified as being the pure methyl ester of α-L-aspartyl-L-phenylalanine by the infrared spectrum, the melting point, by analysis by electrophoresis on paper (the electrophoresis is carried out in a solution. aqueous acetic acid of pH 2.77 under 30 V / cm. The chromatogram shows a single spot when it is developed with ninhydrin).
1.1 g of a crystallized mixture of α- and f3- methyl esters of L-aspartyl-L-phenylalanine are obtained from the mother liquor.
Example 3
To a solution of 2.67 g of para-methoxycarbobenzoxy-L-aspartic acid in tetrahydrofuran, 2.06 g of dicyclohexylcarbodiimide in 20 ml of tetrahydrofuran is added. A solution of N-p-methoxycarbobenzoxy-L-aspartic anhydride is thus obtained. After one hour, 20 ml of a solution in chloroform prepared by neutralizing 2.63 g of L-phenylalanine ethyl ester hydrochloride per 1.68 ml are slowly added to the above anhydride solution. triethylamine, and stirred for 2 h. Then, the produced dicyclohexylurea is separated by filtration and the filtrate is concentrated, the residue is dissolved in 50 ml of chloroform and then washed with dilute hydrochloric acid and then with water.
The solution obtained is dried with anhydrous sodium sulfate and is then concentrated so as to obtain white crystals. The crystals are suspended in a mixture of 10 ml of methanol and 15 ml of acetic acid. The suspension is catalytically hydrogenated in the presence of 0.8 g of 5% palladium on carbon at room temperature for 4 h.
After removal of the catalyst, the solution obtained is concentrated under reduced pressure so as to obtain a white powder. This powder is crystallized in hot water so as to obtain 1.96 g of α-L-aspartyl-L-phenylalanine ethyl ester. These crystals melt between 246 and 2470 C (with decomposition). The results of an elemental analysis are as follows:
C H N (%) observed: 56.57 6.60 8.80 calculated for C15H20ODN2.1 / 2HaO: 56.77 6.67 8.87
Example 4
9 g of N-phenylalanine methyl ester hydrochloride are suspended in 80 ml of chloroform. The suspension is neutralized and dissolved by adding 4.4 g of triethylamine. The resulting solution is cooled in an ice bath to which 100 ml of ether are added.
After 10 ml, the triethylamine hydrochloride formed is separated by filtration and washed with ether.
The filtrate and the washings are concentrated and the residue dissolved in 50 ml of N, N.dimethylformamide.
After adding 2.9 g of N-formyl-L-aspartic anhydride to the solution obtained, the mixture is stirred at room temperature for 1 h and then left to stand overnight.
After removing the solvent under reduced pressure, the residue is dissolved in ethyl acetate and kept overnight in a refrigerator. The crystals separated are collected by filtration and washed with ethyl acetate. 6.4 g of crystals are obtained, melting between 131 and 1330 C. After recrystallization from ethyl acetate, crystals are obtained which melt between 134.5 and 135.50 C with a yield of 5.1 g. These crystals are identified as constituted by the methyl L-phenylalaninate salt of methyl N-formyl-L-aspartyl-L-phenylalaninate, by their infrared spectrum and their elemental composition. The results of the elemental analysis are as follows.
C H N (%) observed: 59.61 6.37 8.35 calculated for C25H3tO8N8: 59.87 6.23 8.38
The 5 g of crystals are dissolved in chloroform then washed with dilute hydrochloric acid and with water then dried with anhydrous sodium sulfate and concentrated.
The residue is dissolved in 75 ml of 75% aqueous methanol and a mixture of 1 ml of concentrated hydrochloric acid and 10 ml of methanol is added. The resulting mixture was stirred for 24 hours at room temperature, and then one equivalent of sodium bicarbonate solution was neutralized. After keeping the solution in a refrigerator overnight, the 2.6 g of crystals separated are collected by filtration; they melt between 233 and 2340 C when decomposing.
The quantitative analysis of the crystals is carried out as indicated in Example 2. It confirms that the crystals are α-L-aspartyl methyl ester.
L-phenylalanine. The purity of the crystals is greater than or equal to 95%.
Example 5
16 g, i.e. 0.06 mole of acid, are suspended
N-carbobenzoxy-L-aspartic in 24 ml of ethyl acetate and 7.7 g or 0.072 mole of 96% anhydride are added to the suspension. The suspension was stirred at room temperature for six hours to obtain N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride.
Furthermore, 15.5 g of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride is suspended in a mixture of 100 ml of water and 150 ml of ethyl acetate. 7.3 g of sodium hydrogen carbonate are added to the suspension and the mixture is stirred, then two distinct layers are allowed to form.
The ethyl acetate layer is added to the above solution of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride with stirring for 15 min. After this addition, stirring is continued for six hours at room temperature. The solvent is separated by distillation under reduced pressure. The residue is dissolved in a mixture of 90 ml of methanol and 45 ml of water and then 2.2 g of sodium hydrogen carbonate are added thereto. 1 g of 5% palladium on carbon is added to the solution, and the whole is hydrogenated for five hours at room temperature. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue is dissolved in 1.5 l of water, 5 microliters of which are subjected to the same analysis by electrophoresis on paper as in Example 2.
A stain is formed on the paper with ninhydrin associated with a cadmium salt as described by J. Heilmann et al. (Z. Physiol.
Chem., 309, 210 (1957). The colored spots corresponding to the methyl ester of -L-aspartyl-L-phenyl-alanine and to the methyl ester of la, ss-L-aspartyl-L-phenylalanine and to the methyl ester of la, 8 -L-aspartyl-
L-phenylalanine are separated by cutting and eluted with methanol and the absorption coefficients of the eluates are measured at 510 millimicrons. We learn that there are 14.8 g (yield: 81%) of a methyl ester of u-L-aspartyl-L-phenylalanine and 3.3 g (yield: 18%) of a methyl ester , 13-L-aspartyl-
L-phenylalanine in the entire solution. This solution is concentrated under reduced pressure.
The residue is recrystallized from water to obtain 11.4 g of needles (yield 63 SO). The fact that the crystals are only α-L-aspartyl-L-phenyl-alanine methyl ester is confirmed by paper electrophoresis.
Example 6
13.6 g of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride is suspended in a mixture of 100 ml of water and 75 ml of ethylene dichloride, then neutralized with 6.9 g of sodium hydrogen carbonate.
The ethylene dichloride layer was separated while the aqueous layer was extracted with 75 ml of ethylene dichloride. The two layers of ethylene dichloride are combined to obtain the ester solution.
Add dropwise over 15 minutes.
the ester solution to a solution of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride prepared by reacting 16 g of N-carbobenzoxy-L-aspartic acid with 7 g of 96% acetic anhydride in 24 ml of chloride ethylene, stirring at 400-45 C for 20 hours. After allowing to stand at room temperature for 5 hours, the solvent is distilled off. The residue was dissolved in a mixture of 90 ml of methanol and 45 ml of water, and hydrogen at room temperature for 2 hours in the presence of 1.0 g of 5% palladium-on-charcoal catalyst. The crystals which precipitate are dissolved on heating the solution, and the hydrogenated mixture is filtered to separate the catalyst. The filtrate is evaporated to dryness in vacuo.
The residue, after recrystallization from water, gives 11.8 g of α-L-aspartyl-Lphenylalanine methyl ester, which is identified as in Example 2.
Example 7
23.7 g of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride is suspended in a mixture of 150 ml of water and 150 ml of ethyl acetate, and 12 g of sodium hydrogen carbonate is added to dissolve the mixture. ester and neutralize the solution. The ethyl acetate layer is separated, while the aqueous layer is extracted with 150 ml of ethyl acetate. The combined ethyl acetate layers were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated in vacuo to isolate the methyl ester of L-phenylalanine.
The ester is dissolved in 150 ml of acetic acid, then 25 g of N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride is added while stirring at room temperature. After leaving to stand overnight, the solvents are evaporated off in vacuo. The residue is dissolved in a mixture of 170 ml of methanol and 80 ml of water, then hydrogen for 5 hours at room temperature in the presence of 2.0 g of 5% palladium-on-carbon catalyst.
After separating the catalyst, part of the filtrate was examined as in Example 5. The mixture was found to contain 23.3 g of α-methyl ester.
L-aspartyl-L-phenylalanine (yield 77%) and 6.6 g of the p-isomer (yield 22%).
18.8 g of crystals of the pure α-isomer are isolated from the filtrate by evaporating the latter in vacuo and recrystallizing the residue from water.
Example 8
16 g of N-carbobenzoxy-L-aspartic acid are dissolved in 24 ml of acetone and 7.7 g of 96% acetic anhydride are added. The solution was stirred for 20 hours at room temperature to obtain the N-carbobenzoxy-L-aspartic anhydride solution.
11.8 g of L-phenylalanine methyl ester dissolved in 100 ml of acetone are added to the anhydride solution with stirring and then left to stand overnight. After having separated the solvent, the residue is dissolved in a mixture of 90 ml of methanol and 45 ml of water. 1.0 g of sodium hydrogen carbonate and 1.0 g of 5% palladium-on-carbon catalyst are added, followed by hydrogenation of the intermediate product formed by condensation at room temperature for 6 hours.
After separating the catalyst, the hydrogenation mixture is evaporated in vacuo. 11.4 g of crystals of pure α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester are obtained by recrystallization of the residue from water.