BREVET PRINCIPAL
La présente invention concerne un procédé perfectionné de préparation des esters d'alcoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (dénommé ci-après a
APE). L'a-APE possède des propriétés édulcorantes semblables à celles du sucre de canne qui le font considérer comme un nouvel agent édulcorant (brevet belge No 717373).
Antérieurement à l'invention, on produisait l'a-APE par mise en contact d'un dérivé de l'acide aspartique dans lequel des groupes protecteurs ont été fixés au groupe amino et B-carboxyle et dans lequel le groupe a-carboxyle a été transformé en un groupe réactif, avec un ester de la L-phénylalanine, et élimination séparée de deux groupes protecteurs (brevet des Pays-Bas O.P.I.
No 6800870).
Le procédé sus-mentionné ne peut pas être appliqué sur une grande échelle puisqu'il comporte de nombreuses opérations et nécessite de nombreuses matières premières, et, de plus, le rendement total est très faible.
L'invention concerne un procédé avantageux et industriel de préparation d'une a-APE ne possédant pas ces défauts et qui est caractérisé par la réaction d'un anhydride L-aspartique protégé à l'azote, dans lequel un groupe protecteur estun groupeformyle, carbobenzoxy ou paraméthoxycarbobenzoxy, sur un ester alcoylique inférieur de la L-phénylalanine dans un solvant organique et par l'élimination du groupe protecteur par des moyens appropriés.
II est connu qu'on obtient un dérivé a-aspartylique du type amide en faisant réagir un anhydre aspartique protégé à l'azote sur une amine.
La réaction sus-mentionnée fournit un mélange de dérivés d'a et B-aspartyle. Le rapport de formation des dérivés a et ,8 protégés à l'azote dépend non seulement du groupe protecteur à l'azote et de l'amine particulière employée, mais aussi des solvants utilisés. Un dérivé du p-aspartyle se forme très fréquemment en quantité beaucoup plus importante. Dans le cas où l'on obtient une plus forte proportion de dérivé d'-aspartyle, le rendement est faible si l'on utilise comme amine un ester alcoylique d'amino-acide. Par exemple, un dérivé ,8 se forme en plus grande quantité qu'un dérivé a dans la réaction de l'anhydride N-acétyl-L-aspartique sur l'aniline (J. Chem. Soc., 1953, 453).
Dans la réaction de l'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique sur l'ester éthylique de la glycine, L'ester éthylique de la p-N-car- bobenzoxy-L-aspartylglycine est obtenu avec un rendement de 21 % tandis que le rendement en dérivé a est seulement de 19 %. Si l'on utilise un ester éthylique de la L-tyrosine à la place de l'ester éthylique de la glycine, il se forme cependant 15 % d'un ester éthylique de la p-N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-tyrosine et 40 % du dérivé a correspondant (J. Chem., Soc., 1952, 24).
La réaction selon l'invention fournit, également en même temps, des esters a et t3 d'alcoyle protégés à l'azote de la L-aspartyl-L-phénylalanine. Circonstance favorable, le dérivé a protégé à l'azote se forme de préférence avec un rendement élevé tandis que la quantité de dérivé , formée est très faible. L'a-APE a un pouvoir édulcorant très fort, au contraire les esters alcoyliques inférieurs de la ,8-L-aspartyl-L-phénylalanine (dénommés É3-APE) préparés par élimination du groupe protecteur du dérivé 0- protégé à l'azote ont un goût légèrement amer. Par conséquent, la ss-APE doit être éliminée dans une proportion suffisante du produit envisagé, l'a-APE.
On sait en général que la séparation des dérivés a et 0 de l'aspartyle est difficile (J. Chem. Soc., 1959, 3868).
Cependant, un procédé de séparation facile des APE a et p ou bien des dérivés a et , protégés à l'azote est décrit dans l'invention.
L'anhydride N-formyl-L-aspartique, l'anhydride Ncarbobenzoxy-L-aspartique et l'anhydride N-p-méthoxy carbobenzoxy-L-aspartique, qui sont employés comme réactifs, peuvent être facilement obtenus à partir de l'acide L-aspartique avec un rendement élevé. Ledit anhydride L-aspartique protégé à l'azote est avantageusement préparé par synthèse en traitant par l'anhydride acétique un acide L-aspartique protégé à l'azote. Il suffit d'employer l'anhydride acétique dans une proportion comprise entde 1 à 1,2 mole par mole d'un acide Laspartique protégé à l'azote. Ladite réaction est en général mise en oeuvre dans un solvant organique à une température comprise entre 0 et 600 C.
On fait réagir dans un solvant organique l'anhydride L-aspartique protégé à l'azote ainsi obtenu sur un ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine, dans lequel le groupe al- coyle est un radical méthyle, éthyle ou propyle.
On obtient ainsi un ester d'alcoyle inférieur protégé à l'azote de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine qui est le produit intermédiaire cherché. L'ester de la L-phénylalanine est en général employé dans la proportion de 1 à 2 moles d'anhydride L-aspartique protégé à l'azote, dans tout solvant organique capable de dissoudre les réactifs et inertes envers ceux-ci.
Des solvants appropriés incluent des esters tels que l'acétate d'éthyle et le propionate de méthyle; des éthers acycliques ou cycliques tels que l'éthyl-ester, le tétrahydrofuranne et le dioxanne: des hydrocarbures halogénés tels que le chloroforme et le dichlorure d'éthylène; des cétones telles que l'acétone, la méthyléthylcétone et la diéthylcétone; des amides tel sque le N,N-diméthylformamide et l'hexa- méthylphosphorylamide; des hydrocarbures tels que le benzène et le toluène; des acides carboxyliques organiques tels que l'acide acétique et l'acide propionique; le sulfoxyde de diméthyle; le nitrométhane et la y-butyrolactone. Bien que cette réaction de condensation se produise sans à-coups à la température ambiante, la vitesse de réaction peut être accrue par chauffage du mélange réactionnel.
Cependant, si la température de réaction est trop élevée, une réaction secondaire telle que la racémisation tend à se produire. Par conséquent, ladite réaction de condensation est en général mise en oeuvre à une température inférieure à 600 C, de préférence à une température inférieure à 300 C.
En ce qui concerne le dérivé N-protégé obtenu par la réaction de condensation, on élimine le groupe protecteur par des procédés appropriés fonction de sa nature particulière, tels que l'hydrogénation catalytique et le traitement par l'acide bromhydrique ou l'acide chlorhydrique. On obtient ainsi un ester de la L-aspartyl-Lphénylalanine.
L'ester de la L-aspartyl-L-phénylalanine ainsi obtenu contient une faible proportion de ss-APE si le dérivé ss-N protégé n'est pas séparé des dérivés a N-protégés par les procédés mentionnés ci-après. Après recristallisation dans l'eau ou dans de l'eau mélangée à un solvant organique soluble dans l'eau tel que le méthanol et l'éthanol, on sépare de la solution par cristallisation uniquement I'a-APE. I1 est donc facile de séparer les mélanges de l'a- et ss-APE et leurs constituants.
La séparation est également effectuée avant d'éliminer les groupes protecteurs des dérivés a et f3 N-protégés.
Les solubilités des dérivés a et ss N-protégés varient suivant le solvant, mais la différence entre celles des deux dérivés dans un même solvant n'est pas très grande. Par conséquent, on considérait comme difficile la séparation à ce stade. A la suite de l'étude de la demanderesse, on a observé que la différence des solubilités entre les dérivés a et ss N-protégés augmente par leur mise en contact avec une amine telle qu'une trialcoylamine, I'aniline, la pyridine et les esters d'aminoacide pour former les sels correspondants.
Par conséquent, la séparation peut aussi être effectuée facilement à ce stade. Par exemple, quand un ester d'alcoyle inférieur de la phénylalanine est employé à raison de 2 moles par mole d'anhydride L-aspartique
N-protégé, des dérivés a et ss N-protégés existent dans la solution obtenue sous forme de leurs sels d'ester d'alcoyle inférieur de la L-phénylalanine. La solubilité du sel d'un dérivé ss dans divers solvants organiques tels que l'acétate d'éthyle est bien inférieure à celle du sel du dérivé a correspondant, par conséquent, le dérivé ss est facilement séparé du mélange réactionnel.
Le procédé selon l'invention présente ces avantages parce qu'il comporte moins d'opérations que le procédé antérieurement connu, sa mise en oeuvre est facile et le produit envisagé est obtenu avec un rendement éleve à partir de l'acide aspartique. Bien qu'une ss-APE se forme aussi en même temps qu'une a-APE par la réaction selon l'invention la quantité de ss-APE est bien inférieure à celle d'a-APE. Le rapport de l'a-APE à la ss-APE est supérieur à 4,5/1. De plus, la séparation du mélange des a- et f3-APE, ou des dérivés a et ss peut être réalisée facilement. Par conséquent, I'invention concerne un excellent procédé industriel de préparation d'esters d'alcoyle inférieurs de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine (a-APE).
Les exemples ci-après expliquent la mise en oeuvre de l'invention.
Exemple I
9 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine sont mis en suspension dans 80ml de chloroforme et ensuite on neutralise cette suspension en ajoutant 4,4 g de triéthylamine pour dissoudre l'ester. On ajoute 100ml d'éther à la solution obtenue et on refroidit le tout dans un bain de glace pendant 10 mn. Ensuite, on sépare par filtration, puis lave à l'éther, le chlorhydrate de triéthylamine formé. On concentre le filtrat et les liqueurs de lavage sous pression réduite pour obtenir un ester méthylique de la L-phénylalanine.
L'ester méthylique de la L-phénylalanine obtenu et S g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique sont dissous dans 100ml d'acétate d'éthyle et on agite à la température ambiante pendant 5h puis on laisse reposer une nuit. Les cristaux séparés se dissolvent rapidement par chauffage et l'on refroidit la solution à la température ambiante en agitant à nouveau. Les 2,2 g de cristaux séparés sont recueillis par filtration.
Après addition de 50 ml d'acétate d'éthyle au filtrat, la solution obtenue est lavée à l'acide chlorhydrique 1N et ensuite à l'eau. Les liqueurs de lavage sont concentrées sous pression réduite. On fait recristalliser le résidu à partir d'un mélange de méthanol et d'éther pour obtenir 3,5 g de chlorhydrate d'ester méthylique de Nphénylalanine.
La couche d'acétate d'éthyle est desséchée par du sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 150ml d'acide acétique à 75 % et est hydrogéné catalytiquement, en présence de 1 g de charbon palladié à 5 %, à la température ambiante, en agitant. Après avoir séparé par filtration le catalyseur et concentré le filtrat sous pression réduite on fait recristalliser le résidu dans reau pour obtenir 4g d'aiguilles d'un ester méthylique de ra-L- aspartyl-L-phénylanine fondant à 234-2350 C (avec décomposition). Les produits obtenus sont identiques en ce qui concerne leur spectre infrarouge, leur chromatogramme sur papier, leur point de fusion et leur composition élémentaire à un échantillon authentique préparé par un autre procédé de synthèse.
Analyse élémentaire:
C H N(%) calculé pour C14H10O5N2. 1/2 H2O: 55,44 6,31 9,24 observé: 55,45 6,10 9,39
Les 2,2 g de cristaux qui se séparent d'abord du mélange susmentionné obtenu par une réaction de condensation sont recristallisés dans une solution d'acétate d'éthyle de manière à obtenir 1,3 g d'aiguilles ayant une température de fusion entre 138 et 138,50 C. Ces aiguilles sont identifiées comme le sel de L-phénylalaninate de méthyle du N-carbobenzoxy-ss-L-aspartyl-L-phénylalani- nate de méthyle, par leur spectre infrarouge, leur composition élémentaire et le produit de leur hydrogénation.
Les résultats de l'analyse élémentaire sont:
C H N(%) calculé pour CS3H3909N3: 63,25 6,14 6,92 observe: 63,35 6,21 6,63
On dissout les 1,3 g de cristaux obtenus dans 100 ml d'acide acétique à 75 % et on ajoute à la solution 0,2 g de charbon palladié à 5 %. Le mélange est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 4 h.
Après cristallisation d'un mélange d'eau et d'éthanol, on obtient 0,6 g d'aiguilles d'ester méthylique de la f3-L- aspartyl-L-phénylalanine fondant entre 188 et 1890 C (avec décomposition). Sa composition élémentaire est: N (%) observé: 9,32 calculé pour C14H18O5N2 .1/2 H,O : 9,24
Exemple 2
On met en suspension 4,8 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine dans 40ml de chloroforme. On neutralise la suspension puis la dissout en ajoutant 2,3 g de triéthylamine. La solution obtenue est refroidie dans un bain de glace et on y ajoute 50ml d'éther. Au bout de 10 mon, on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé et le lave à l'éther.
Le filtrat et les eaux de lavage sont concentrés de ma nière à obtenir l'ester méthylique de la L-phénylalanine.
Cet ester est dissous dans 50 ml d'acétate d'éthyle et on y ajoute 5 g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
Le mélange réactionnel est agité à la température ambiante pendant 1 h et laisse au repos une nuit. La solution obtenue est lavée avec une solution normale d'acide chlorhydrique et ensuite à l'eau, puis séchée avec du sulfate anhydre de sodium.
Après concentration de la solution sous pression réduite on dissout le résidu dans 150 ml d'acide acétique à 75 % et on ajoute 0,8 g de carbone palladié à 5 % .
Le mélange réactionnel est hydrogéné catalytiquement à la température ambiante pendant 5 h. Après élimination du catalyseur, on concentre le filtrat sous pression réduite. On fait cristalliser le résidu dans l'eau pour obtenir 3,2 g d'aiguilles fondant entre 234 et 2350 C (avec décomposition). Ces cristaux sont identifiés comme étant l'ester méthylique pur de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine par le spectre infrarouge, le point de fusion, par analyse par électrophorèse sur papier (I'électrophorèse est mise en oeuvre dans une solution aqueuse d'acide acétique de pH 2,77 sous 30 V/cm. Le chromatogramme présente une seule tache quand il est développé à la ninhydrine).
On obtient 1,1 g d'un mélange cristallisé d'esters méthyliques a- et f3- de la L-aspartyl-L-phénylalanine à partir de la liqueur-mère.
Exemple 3
On ajoute, à une solution de 2,67 g d'acide para-méthoxycarbobenzoxy-L-aspartique dans le tétrahydrofurane, 2,06 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 20 ml de tétrahydrofurane. On obtient ainsi une solution d'anhydride N-p-méthoxycarbobenzoxy-L-aspartique. Au bout d'une heure, on ajoute lentement à la solution ci-dessus d'anhydride 20ml d'une solution dans le chloroforme préparée par neutralisation de 2,63 g de chlorhydrate d'ester éthylique de L-phénylalanine par 1,68 ml de triéthylamine, et on agite pendant 2h. Ensuite, la dicyclohexylurée produite est séparée par filtration et le filtrat est concentré, le résidu est dissous dans 50ml de chloroforme puis lavé à l'acide chlorhydrique dilué et ensuite à l'eau.
La solution obtenue est séchée avec du sulfate de sodium anhydre et est ensuite concentrée de manière à obtenir des cristaux blancs. Les cristaux sont mis en suspension dans un mélange de 10 ml de méthanol et 15 ml d'acide acétique. La suspension est hydrogénée catalytiquement en présence de 0,8 g de charbon palladié à 5 % à la température ambiante pendant 4 h.
Après élimination du catalyseur, on concentre la solution obtenue sous pression réduite de manière à obtenir une poudre blanche. On fait cristalliser cette poudre dans l'eau chaude de manière à obtenir 1,96g d'ester éthylique de l'a-L-aspartyl-L-phénylalanine. Ces cristaux fondent entre 246 et 2470 C (avec décomposition). Les résultats d'une analyse élémentaire sont les suivants:
C H N(%) observé: 56,57 6,60 8,80 calculé pour C15H20ODN2.1/2HaO: 56,77 6,67 8,87
Exemple 4
9 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la N-phénylalanine sont mis en suspension dans 80 mi de chloroforme. On neutralise et dissout la suspension par addition de 4,4 g de triéthylamine. On refroidit la solution obtenue dans un bain de glace auquel on ajoute 100 ml d'éther.
Au bout de 10 mon, on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine formé et le lave à l'éther.
On concentre le filtrat et les eaux de lavage et on dissout le résidu dans 50 ml de N,N.diméthylformamide.
Après addition de 2,9 g d'anhydride N-formyl-L-aspartique à la solution obtenue, on agite à la température ambiante pendant i h puis laisse reposer une nuit.
Après élimination du solvant sous pression réduite, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et le maintient pendant une nuit dans un réfrigérateur. Les cristaux séparés sont rassemblés par filtration et lavés à l'acétate d'éthyle. On obtient 6,4 g de cristaux fondant entre 131 et 1330 C. Après recristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient des cristaux fondant entre 134,5 et 135,50 C avec un rendement de 5,1 g. Ces cristaux sont identifiés comme constitués par le sel de L-phénylalaninate de méthyle du N-formyl-L-aspartyl-L-phénylalaninate de méthyle, par leur spectre infrarouge et leur composition élémentaire. Les résultats de l'analyse élémentaire sont les suivants.
C H N(%) observé: 59,61 6,37 8,35 calculé pour C25H3tO8N8: 59,87 6,23 8,38
Les 5 g de cristaux sont dissous dans le chloroforme puis lavés à l'acide chlorhydrique dilué et à l'eau puis séchés avec du sulfate anhydre de sodium et concentrés.
On dissout le résidu dans 75 ml de méthanol aqueux à 75 % et on ajoute un mélange de i mi d'acide chlorhydrique concentré et 10ml de méthanol. On agite le mélange résultant pendant 24 heures à la température ambiante, et ensuite on neutralise un équivalent de solution de bicarbonate de sodium. Après conservation de la solution dans un réfrigérateur pendant une nuit, les 2,6 g de cristaux séparés sont rassemblés par filtration; ils fondent entre 233 et 2340 C en se décomposant.
L'analyse quantitative des cristaux est exécutée de la manière indiquée dans l'exemple 2. Elle confirme que les cristaux sont un ester méthylique de l'a-L-aspartyl
L-phénylalanine. La pureté des cristaux est supérieure ou égale à 95%.
Exemple 5
On met en suspension 16 g, soit 0,06 mole d'acide
N-carbobenzoxy-L-aspartique dans 24 ml d'acétate d'éthyle et on ajoute à la suspension 7,7 g soit 0,072 mole d'anhydride à 96 %. On agite la suspension à la température ambiante pendant six heures pour obtenir de l'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
Par ailleurs, on met en suspension 15,5 g de chlorhydrate d'ester méthylique de la L-phénylalanine dans un mélange de 100ml d'eau et de 150ml d'acétate d'éthyle. On ajoute 7,3 g de carbonate acide de sodium à la suspension et on agite, puis on laisse se former deux couches distinctes.
La couche d'acétate d'éthyle est ajoutée à la solution ci-dessus d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique en agitant pendant 15 mn. Après cette addition, on continue à agiter pendant six heures à la température ambiante. Le solvant est séparé par distillation sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un mélange de 90 ml de méthanol et 45 ml d'eau et on y ajoute ensuite 2,2 g de carbonate acide de sodium. On ajoute 1 g de charbon palladié à 5 % à la solution, et on hydrogène l'ensemble pendant cinq heures à la température ambiante. Le catalyseur est séparé par filtration et le filtrat est concentré sous pression réduite On dissout le résidu dans 1,5 1 d'eau, dont 5 microlitres sont soumis à la même analyse par électrophorèse sur papier que dans l'exemple 2.
On forme sur le papier une tache avec de la ninhydrine associée à un sel de cadmium de la manière décrite par J. Heilmann et al. (Z. Physiol.
Chem., 309, 210 (1957). Les taches colorées correspondant à l'ester méthylique de l' -L-aspartyl-L-phényl- alanine et à l'ester méthylique de la ,ss-L-aspartyl-L- phénylalanine et à l'ester méthylique de la ,8-L-aspartyl-
L-phénylalanine sont séparées par découpage et éluées avec du méthanol et les coefficients d'absorption des éluats sont mesurés à 510 millimicrons. On apprend qu'il y a 14,8 g (rendement: 81 %) d'un ester méthylique de l'u-L-aspartyl-L-phénylalanine et 3,3 g (rendement: 18 %) d'un ester méthylique de la ,13-L-aspartyl-
L-phénylalanine dans la totalité de la solution. Cette solution est concentrée sous pression réduite.
Le résidu est recristallisé dans l'eau pour obtenir 11,4 g d'aiguilles (rendement 63 SO). Le fait que les cristaux sont uniquement de l'ester méthylique de l'a-L-aspartyl-L-phényl- alanine est confirmé par une électrophorèse sur papier.
Exemple 6
On met en suspension 13,6 g de chlorhydrate d'ester méthylique de L-phénylalanine dans un mélange de 100 mi d'eau et 75 mi de dichlorure d'éthylène, puis on neutralise avec 6,9 g de carbonate acide de sodium.
On sépare la couche de dichlorure d'éthylène tandis qu'on extrait la couche aqueuse avec 75 mi de dichlorure d'éthylène. On réunit les deux couches de dichlorure d'éthylène pour obtenir la solution d'ester.
On ajoute goutte à goutte, au cours de 15 minutes.
la solution d'ester à une solution d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique préparée par la réaction de 16g d'acide N-carbobenzoxy-L-aspartique avec 7g d'anhydride acétique à 96 % dans 24 ml de chlorure d'éthylène, en agitant à 400-45 C pendant 20 heures. Après avoir laissé reposer à la température ordinaire pendant 5 heures, on chasse le solvant par distillation. On dissout le résidu dans un mélange de 90 ml de méthanol et 45 ml d'eau, et l'hydrogène à la température ordinaire pendant 2 heures en présence de 1,0 g de catalyseur de charbon palladié à 5 %. On dissout les cristaux qui précipitent en chauffant la solution, et filtre le mélange hydrogéné pour séparer le catalyseur. On évapore le filtrat à sec sous vide.
Le résidu, après recristallisation dans l'eau, donne 11,8 g d'ester méthylique d'a-L-aspartyl-Lphénylalanine qu'on identifie comme dans l'exemple 2.
Exemple 7
On met en suspension 23,7 g de chlorhydrate d'ester méthylique de L-phénylalanine dans un mélange de 150 ml d'eau et 150 mi d'acétate d'éthyle, et ajoute 12 g de carbonate acide de sodium pour dissoudre l'ester et neutraliser la solution. On sépare la couche d'acétate d'éthyle, tandis qu'on extrait la couche aqueuse avec 150ml d'acétate d'éthyle. On sèche les couches d'acétate d'éthyle réunies sur du sulfate de sodium anhydre et les évapore sous vide pour isoler l'ester méthylique de la L-phénylalanine.
On dissout l'ester dans 150 mi d'acide acétique, puis ajoute 25g d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique en agitant à la température ordinaire. Après avoir laissé reposer une nuit, on évapore les solvants sous vide. On dissout le résidu dans un mélange de 170ml de méthanol et 80ml d'eau, puis l'hydrogène pendant 5 heures à la température ordinaire en présence de 2,0 g de catalyseur de charbon palladié à 5 %.
Après avoir séparé le catalyseur, on examine une partie du filtrat comme dans l'exemple 5. On trouve que le mélange contient 23,3 g d'ester méthylique d'a-
L-aspartyl-L-phénylalanine (rendement de 77 %) et 6,6 g de l'isomère p (rendement de 22 %).
On isole 18,8 g de cristaux de l'isomère a pur à partir du filtrat en évaporant celui-ci sous vide et en recristallisant le résidu dans l'eau.
Exemple 8
On dissout 16 g d'acide N-carbobenzoxy-L-aspartique dans 24 ml d'acétone et ajoute 7,7 g d'anhydride acétique à 96 %. On agite la solution pendant 20 heures à la température ordinaire pour obtenir la solution d'anhydride N-carbobenzoxy-L-aspartique.
On ajoute 11,8 g d'ester méthylique de L-phénylalanine dissous dans 100ml d'acétone à la solution d'an hydride en agitant puis laisse reposer une nuit. Après avoir séparé le solvant, on dissout le résidu dans un mélange de 90 mi de méthanol et 45 mi d'eau. On ajoute 1,0g de carbonate acide de sodium et 1,0g de catalyseur de charbon palladié à 5 %, puis hydrogène le produit intermédiaire formé par condensation à la température ordinaire pendant 6 heures.
Après avoir séparé le catalyseur, on évapore sous vide le mélange d'hydrogénation. On obtient 11,4g de cristaux de l'ester méthylique d'a-L-aspartyl-L-phénylalanine pur par recristallisation du résidu dans l'eau.