Procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé. La. présente invention a. pour objet un procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé.
Le processus d'isolement de la pénicilline du bouillon de fermentation comprend habi- tuellement l'extraction du bouillon, acidifié et filtré, par un solvant, organique, ordinaire- ment de l'acétate d'amyle, le traitement au carbone du liquide d'extraction, la.
purifica iion de ce liquide, par exemple par extraction répétée avec de l'eau ou des solvants organi ques, par adsorption chroinatographique ou par d'autres moyens et l'évaporation à basse teni- pérature de la solution aqueuse finalement obtenue du sel potassique ou sodique de péni cilline pour obtenir ce sel sous forme amor phe. C'es sels amorphes obtenus par dessicca tion à basse température présentent l'inconvé nient d'être impurs, hygroscopiques et relati vement instables.
()n a trouvé qu'une cristallisation efficace du sel potassique de pénicilline, avec produc tion (le cristaux pratiquement purs et blancs, peut être obtenue seulement. par la. combinai son de certaines opérations dont l'importance n'a pas été comprise jusqu'ici, soit qu'on les envisage seules, soit. qu'on envisage leurs combinaisons, et que l'inclusion de ces opérations dans le processus de puri fication est d'une importance capitale pour obtenir de bons rendements.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on extrait la pénicilline d'un bouil- Ion de fermentation acidifié contenant de la pénicilline, par un solvant organique, en ce qu'on transforme la pénicilline contenue dans l'extrait en le sel potassique de pénicilline amorphe par adjonction d'un composé alca lin du potassium, en ce qu'on prépare une solution de ce sel potassique amorphe dans un mélange d'ea.ii et de butanol normal, le sel ayant une activité d'au moins 800 unités internationales de pénicilline par milli gramme,
en ce qu'on traite cette solution avec dn charbon activé en quantité au phis égale à 10 % du poids de la solution, en ce qu'on sépare ensuite le charbon de la solution, en ce qu'on ajuste le<B>pH</B> de la solution à une valeur com prise entre 5,0 et 7,5,
en ce qu'on évapore la solution ainsi obtenue en maintenant la te neur en eau de la solution à une valeur d'au moins 5 % en volume jusqu'à ce que la con centration en sel potassique de pénicilline soit au moins de 15 mg par millilitre, en ce qu'on poursuit ensuite l'évaporation de la solution sans adjonction d'eau jusqu'à. ce que la cris tallisation du sel potassique se produise, et en ce qu'on recueille le sel potassique de pénicil line cristallisé.
Il est nécessaire que le solvant organique utilisé pour dissoudre le sel potas sique amorphe de pénicilline soit une solution aqueuse de butanol normal,-et ensuite que le sel potassique de pénicilline amorphe soumis à la cristallisation ait une activité d'au moins 800 et de préférence d'au moins 1000 unités internationales de pénicilline par milli- gramme. On a trouvé, d'une part, qu'avec des solvants organiques autres que le butanol nor mal, les rendements obtenus en cristaux de sel potassique de pénicilline sont notablement ré duits, et, d'autre part, que si la pureté du sel amorphe soumis à la cristallisation est.
infé rieure à celle indiquée ci-dessus, l'efficacité du procédé de cristallisation est diminuée et le produit obtenu est moins pur. En outre, bien que le traitement au charbon n'ait pas une influence notable sur la _pureté du sel. potassi que de pénicilline cristallisé finalement obtenu, il permet d'éliminer des petites quantités de certaines impuretés qui peuvent agir comme des inhibiteurs de cristallisation et dont la présence doit être évitée pour avoir une cris tallisation satisfaisante du sel.
De plus, la solution doit être pratiquement neutre, son pH étant. compris entre 5,0 et 7,5, et de pré férence entre 6,4 et 6,6, car il peut. se pro duire une décomposition de la pénicilline à des pH phis acides ou phis alcalins en pré sence de butanol normal. Enfin, la concen tration en pénicilline dans la solution de bu- tanol normal doit être d'au moins 15 mg par millilitre, et. de préférence de 20 à 35 mg par millilitre avant de laisser cristalliser le sel potassique de pénicilline.
Le butanol normal humide est un solvant pour le sel potassique de pénicilline amorphe, tandis que le butanol normal anhydre ne dissout pratiquement pas ce sel. I1 est évident par conséquent qu'en évaporant une solution du sel potassique de pénicilline amorphe dans du butanol normal humide, l'eau s'élimine sous forme d'un mé lange azéotropique avec une partie du butanol normal, ce qui entraîne la cristallisation ou la précipitation du sel potassique de pénicilline du butanol normal anhydre résultant.
Afin d'éviter le plus possible la destruction de la, pénicilline pendant le stade d'évaporation, il est avantageux d'effectuer cette évaporation par au moins deux passages dans un 6vapo- rat.eur à couche mince, en ajoutant de l'eau à la solution du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avant chaque passage dans l'évaporateur, de manière que la teneur en eau de cette solution ne tombe pas au-dessous de 5% en volume jusqu'à ce que la solution ait. été concentrée à. la valeur indiquée avant la cristallisation. Il est. avan tageux de recristalliser le sel potassique de pénicilline cristallisé obtenu en premier lieu.
Les plI de la solution sont déterminés en diluant tin échantillon de la solution avec dix fois son volume d'eau distillée, et en mesurant le pH de la solution obtenue.
L'ajustage du pH de la solution peut. se faire en ajoutant un. composé de potassium alcalin tel que l'hydroxyde, le carbonate ou le bicarbonate de potassium. , Le traitement au charbon de la solution peut. se faire, par exemple, en brassant la so lution avec 4 o!o en poids du produit marque Actibon C ou d'un autre charbon activé, en séparant le charbon par filtration et. en le lavant sur le filtre avec.
du butanol nornu 1, la première fraction de lavage étant ajoutée au filtrat, et les autres fractions étant utili sées pour le premier lavage et les lavages subséquents d'une autre charge de charbon.
Il faut noter que toutes les opérations de distillation et d'évaporation intervenant. dans le présent procédé et portant sur des solu tions eontenart de la pénicilline peuvent être effectuées à pression réduite, selon la prati que ordinaire, Pour éviter une décomposition de la pénicilline qui serait due aux tempéra tures élevées pendant. ces opérations. Une pression de moins de 50 mm Hg s'est montrée satisfaisante.
L'évaporateur à couche mince utilisable pour l'évaporation de la solution aqueuse dans le butanoi normal du sel potassique amorphe peut être un évaporateur à couche ascension nelle d'un type usuel, avant un débit suffi- samment élevé polir réduire, sinon supprimer, la destruction de la pénicilline due à de lon gues périodes (le contact avec le butanol nor mal à température élevée.
On poursuit l'éva poration de la solution jusqu'à atteindre une concentration en sel d'au moins 1:5 mg par millilitre (soit, par exemple, 2-1000 -unités par millilitre), et de préférence comprise entre 20 et 35 m@- par millilitre, et pendant cette concentration on ajoute, si nécessaire, une quantité déterminée d'eau à la solution aqueuse de butanol avant chaque passage dans l'évaporateur, de manière que la teneur en eau de la.
solution ne tombe pas au-dessous de 5 % en volume, pour.éviter qu'une cristal- lisation prématurée du sel potassique de péni- eilline ne se produise et pour réduire la dé composition du sel de pénicilline qui est beau coup plus lente en présence d'eau.
La concen tration en eau peut être avantageusement de ?0 % en volume avant chaque passage. Quand la concentration du sel de pénicilline dans la solution a atteint au moins 15 mg par milli litre pendant. le stade de concentration, la cristallisation peut. s'effectuer par un ou plu sieurs passages supplémentaires de la solution dans l'évaporateur et sans addition d'eau.
Ces passages finals de la solution concentrée à tra vers l'évaporateur peuvent être prévus par ré glage de la concentration de la solution, de la température et de la vitesse d'écoulement, de manière que la cristallisation du sel potassi que de pénicilline se produise dans un organe collecteur et non dans le tube d'évaporation. La liqueur-mère séparée peut être passée à nouveau dans l'évaporateur, afin d'augmenter le rendement en sel cristallisé.
I1 faut noter que la solution concentrée obtenue après plusieurs passages dans l'évapo rateur peut être évaporée plus avant par sim ple distillation ou évaporation sous pression réduite pour effectuer la cristallisation du sel potassique de pénicilline au lieu de passer clans l'évaporateur.
Le sel potassique cristallin et la liqueur- mère peuvent être séparés par filtration, et la liqueur-mère, qui a ordinairement une fai ble teneur en pénicilline G et une teneur rela- tivement haute en pénicilline F, peut être trai tée pour récupérer ces pénicillines.
Le sel cris tallisé séparé peut ensuite être recristallisé, par exemple par dissolution dans une solution aqueuse de butanolnormal etparadjonction de butanol normal sec à la solution, de préférence en deux fractions au moins et à la température de 0 C environ, pour amener la concentration ile l'alcool à. 95-99 % en vol-Lune environ, ce qui entraîne la cristallisation du sel.
On a constaté que si l'addition de butanol normal sec se poursuit jusqu'à une concentration fi- nale en butanol normal de 971% en volume, en veillant à ce que la cristallisation com mence avec une teneur en eau aussi haute que possible, on obtient des cristaux blancs du sel potassique de pénicilline d'une pureté de 100 11/o pratiquement,
avec un rendement de 72 à 77 % clans ce dernier stade de recristal- lisation. Quand on poursuit l'addition de bu- tanol normal sec. jusqu'à tue concentration finale de 99 % en volume, le rendement en produit cristallisé peut être augmenté,
mais le produit est aussi phis coloré. Comme la liqueur-mère séparée à ce stade peut être uti lisée à nouveau à. un stade antérieur du pro cédé, par exemple en l'ajoutant à la solution traitée au charbon, il n'y a pas d'avantage à continuer l'addition de butanol normal sec au-delà d'une concentration de 97 0/0.
Il faut noter aussi que, bien que la solu tion du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal utilisée puisse être obtenue de différentes manières, il est avanta geux que cette solution provienne de l'extrac tion aqueuse d'une solution du sel potassique de pénicilline dans un solvant organique, telle qu'obtenue dans le procédé ordinaire de pré paration de la pénicilline, suivie d'une extrac tion de l'extrait aqueux par du butanol nor mal.
Ces extractions peuvent se faire avanta geusement en continu à contre-courant dans une tour ou dans un élément à plusieurs étages, la proportion dut solvant à l'eau dans chaque extraction étant choisie de manière à assurer une extraction optimum de la péni- eilline, tout en évitant une dilution inutile de la solution de pénicilline ainsi traitée.
On a observé que le traitement de la solu tion du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avec un charbon activé, particulièrement avec un charbon activé chimiquement, entraîne l'acidification de cette solution et nécessite, par conséquent, l'ajustement dit pH à une valeur comprise entre 5,0 et 7,5, et de préférence entre 6,4 et 6,6, avant de concentrer la solution. Cet ajus tement se fait de préférence en ajoutant à la solution une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium avant de commencer l'évaporation.
Si cependant la solution butylique est déjà saturée d'eau, il est impossible de neutraliser la. solution par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, et il est. nécessaire dans ce cas d'ajouter de l'hy droxyde de potassium aqueux après que la so lution a été partiellement concentrée et dés hydratée par un seul passage dans l'évapora teur.
L'exemple suivant expose une mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'activité de la pénicilline est donnée en unités inter nationales, et les pourcentages sont en poids, sauf indication contraire.
.Exemple: On agite une solution de sel potassique de pénicilline amorphe dans du butanol normal, obtenue comme indiqué plus haut à partir d'un bouillon acidifié, en présence d' Acti- bon C (charbon activé acide), à raison de 4 parties en poids de charbon pour 100 parties en volume de la solution,
on sépare le char bon par filtration et on lave le précipité de charbon sur le filtre avec 25 % du volume de la solution originale du butanol normal.
Le sel potassique de pénicilline récupéré dans le filtrat et dans la première fraction de la- vage représente les 97 % du sel original,
et la décoloration obtenue dans ce stade est de 80 %. La solution traitée au charbon est en- suite évaporée par plusieurs passages dans un évaporateur à couche mince ascensionnelle comprenant un tube d'évaporation en métal 1-lonel de 61 cm de long-Lieur et de 6 mm de diamètre intérieur,
et un système de con densation comportant une chemise en métal hlonel de 12,5 mm de diamètre intérieur.
Après le premier passage dans l'évapora teur, on neutralise la solution à un p_H de 6,2 au moyen d'une solution d'hydroxyde de po tassium. La teneur en eau de la solution est ajustée à une valeur d'environ ?0 % en vd- lume avant chaque passage. Le débit du liquide à travers l'évaporateur est d'environ 6,8 litres/heure.
Quand la. solution a été con- centrée jusqu'à. une valeur de 31,1 nig de sel potassique de pénicilline par millilitre, le sel est cristallisé par trois nouveaux passages de la solution dans l'évaporateur, la substance cristalline étant séparée dans le système col lecteur après chaque passage du liquide dans l'évaporateur.
La, substance cristalline est alors séparée par filtration de la. liqueur-mère, et consiste en sel potassique de pénicilline d'une pureté de 99 %, le rendement étant- de 791/o.
La. substance cristalline séparée est. dis soute dans deux fois son poids d'une solution aqueuse de butanol normal à<B>88</B> 0io en volume environ, et le sel potassique de pénicilline est recristallisé dans cette solution par addition, en plusieurs fractions, de butanol normal sec, à.
0 C, jusqu'à une concentration finale de 97 % en volume. La. substance cristalline obte- nue consiste en sel. potassique de pénicilline blanc d'une pureté (le 100 010, le rendement étant de 77 0/0.
Si l'on tient compte du sel potassique de pénicilline clans la. liqueur-mère, qui rentre dans le cycle au premier stade du procédé où on l'ajoute a la solution traitée au charbon, on obtient. un. rendement de 99 0io en substance cristalline dans ce stade de re- cristallisation.