Procédé pour la purification de la pénicilline. La. présente invention se rapporte à un procédé pour la. purification de la pénicilline, clans le but d'obtenir une pénicilline d'un haut degré de pureté.
Ides procédés de préparation de sels de la pénicilline sous forme pure sont bien connus. Ils comprennent, par exemple, le traitement au charbon du bouillon de culture acidifié et des traitements d'extraction successifs au moyen d'un solvant organique et d'eau, des méthodes chromatographiques, la formation de dérivés cristallisables de la pénicilline, par exemple des sels de métaux alcalins ou des sels d'amines de la pénicilline, et la purifi cation de ces sels par cristallisation, la subs tance pure obtenue étant finalement transfor mée, si nécessaire, en le sel désiré pour un usage thérapeutique.
L'invention a pour but la production de pénicilline d'un haut degré de pureté, par un procédé comprenant un petit nombre d'opé rations et conduisant à un rendement total élevé en pénicilline. La pénicilline purifiée ainsi obtenue peut ensuite être transformée en un sel pur de pénicilline.
On a trouvé qu'en employant l'oxycaïne- pénicilline comme produit intermédiaire dans la purification de la pénicilline et en utilisant la propriété de l'oxycaïne-pénicilline d'être pratiquement insoluble dans la plupart des solvants usuels, la purification de la pénicil line peut être effectuée simplement et avec peu d'opérations, et qu'on peut obtenir des rendements supérieurs à ceux obtenus par les procédés antérieurs.
Le procédé selon l'invention pour la pari fication de la pénicilline est caractérisé en ce qu'on transforme de la pénicilline impure libre en son sel oxycaïne-pénicilline à l'aide d'oxycaïne ou d'un sel de celle-ci, en opérant dans un solvant dans lequel la solubilité du sel oxycdïne-pénicilline est d'au plus 51/o, en ce qu'on sépare l'oxycaïne-pénicilline ainsi précipitée, en ce qu'on suspend cette dernière dans un mélange d'eau et d'un solvant orga nique pratiquement non miscible à l'eau,
en ce qu'on décompose l'oxycaïne-pénicilline en traitant cette suspension à l'aide d'un agent hydrolysant non neutre, en ce qu'on sépare la phase aqueuse de la phase formée par le solvant organique et en ce qu'on recueille la pénicilline purifiée à l'état libre de celle des, phases qui la contient.
La décomposition de l'oxycaïne-pénicilline peut avoir lieu en milieu acide ou alcalin.
Par le terme oxycaine , on entend ici l'ortho-hydroxy-paxa-amino-benzoate de di- éthyl-amino-éthyle, de formule
EMI0001.0023
Le terme oxycaïne est utilisé ci-après pour dénommer la base libre de la formule ci-dessus, et le terme sels d'oxycaïne est utilisé pour dénommer les sels de cette basé libre tels que le chlorhydrate, ces sels étant formés par addition d'un acide à l'atome d'azote tertiaire qui devient ensuite pentava- lent;
l'oxycaïne-pénicilline est un sel de ce genre dans lequel une molécule do pénicilline est liée à cet atome d'azote de façon simi laire. Bien que le sel d'oxycaine utilisé habi tuellement dans la préparation de l'oxycaïne- pénicilline soit le chlorhydrate d'oxycaïne, il est. bien entendu qu'on peut aussi -utiliser d'autres sels d'oxycaïne, tels que le phosphate, le sulfate, etc. d'oxycaïne.
L'oxycaïne-pénicilline formée interm6diai- renient peut être obtenue à partir de pénicil line impure sous forme acide et d'oxycaïne sous forme de base libre, ou par double dé composition d'iin sel d'oxy caïne et d'un sel de pénicilline préparé d'abord, à partir de la pé nicilline impure libre.
Par exemple, le chlor- hydrate d'oxycaïne et le sel de sodium de pénicilline peuvent réagir pour donner de l'oxycaïne-pénicilline, et du chlorure de so- ditun. Bien qu'on puisse obtenir l'oxy caïne- pénicilline par réaction, soit entre un tseel d'oxycaïne et la pénicilline sous forme acide, soit entre l'oxycaïne et un sel de pénicilline, une telle réaction ne se fait pas d'une manière satisfaisante ou ne s'achève pas complètement.
Le procédé selon l'invention peut comprendre la formation in situ dans le mélange réac tionnel de l'oxycaïne sous forme de base libre, par adjonction d'une base.
On peut faire réagir l'oxycaïne et la, péni cilline en proportions pratiquement équimolé culaires, mais il est préférable d'utiliser un excès d'oxycaïne pour éviter toute perte de pénicilline. On a trouvé qu'il est approprié d'utiliser de 1,5 à 2,0 équivalents d'oxycaïne (ou d'un sel d'oxycane) pour un équivalent de pénicilline (ou d'un sel de celle-ci formé intermédiairement).
La pénicilline peut être employée directe ment sous forme acide, mais elle peut égale ment d'abord être transformée en un sel de pénicilline, avant de la faire réagir avec l'oxy- caïne ou un sel de celle-ci. La pénicilline ou son sel peut se trouver en solution dans <B>de</B> l'eau ou dans un solvant organique. L'oxycaïne-péilieilline peut, être préparée à partir d'une pénicilline partiellement purifiée.
Il est à noter qu'il n'est pas avantageux d'uti liser un bouillon de culture brut contenant de la pénicilline, pour la préparation de 1'oxy- caïne-pénicilline, car un tel bouillon contient trop d'impuretés complexes qui peuvent em pêcher une précipitation satisfaisante de l'oxycaïne-pénicilline et., surtout, la pénicilline est trop diluée dans un bouillon de culture brut pour permettre sa précipitation.
Il est avantageux de traiter la solution de péni cilline ou de ses sels avec une petite quantité, par exemple 1 à 5 0/0, de charbon activé, avant la réaction avec l'oxycaïne. Ce traitement au charbon peut se faire en agitant la solution avec le charbon et en séparant ce dernier par filtration. Bien qu'un tel traitement ne con duise à aucune amélioration notable de la pu reté de la pénicilline, il améliore considérable ment la couleur du sel oxycaïne-pénicilline obtenu subséquemment.
Parmi les solvants dans lesquels la solu bilité de l'oxycaïne-pénicilline est d'au plus 5 % et qui peuvent être utilisés avec avantage dans le procédé selon l'invention, on peut ci ter l'eau, les esters d'acides carboxyliques ali phatiques inférieurs tels que l'acétate d'amyle et l'acétate de butyle, les alcools aliphatiques, tels que l'éthanol, le propanol, le butanol et l'alcool amylique, les hydrocarbures chlorés, les éthers, tels que l'éther éthylique,
l'éther méthyl-éthylique et l'éther éthyl-isopropyli- que, les cétones aliphatiques inférieures, telles que la méthyl-isobutyl-cétone et la. méthyl- éthyl-cétone, les mélanges de ces solvants organiques tels que le mélange acétone- acétate de butyle ou butanol-acétate de butyle, etc., et les mélanges d'eau et de solvants orga niques tels que l'acétone, la méthyl-éthyl- cétone, le butanol, etc. en mélange avec de l'eau.
On a trouvé qu'un mélange comprenant en volume 30 % d'acétone et 70 % d'acétate de butyle est particulièrement avantageux.
Pour assurer une précipitation satisfai sante de l'oxycaïne pénicilline, il faut évidem ment que la concentration en pénicilline du solvant réactionnel soit supérieure à la con- centration correspondant à la solubilité de l'oxycaïne-pénicilline dans ce solvant.
Par exemple, la solubilité dans l'eau de l'oxycaïne- pénicilline étant de 0,7 % en poids environ, ce (lui correspond à une solution aqueuse conte- iiaut environ 6800 unités de pénicilline par eni,, la solution devra contenir, lorsqu'on utilise de l'eau comme solvant réactionnel, plus de 6800 unités de pénicilline par em3,
et de préférence 25 000 unités par cm3. Il en et clé même avec d'autres solvants réaction nels appropriés, la concentration minimum admissible de la pénicilline dans le mélange réactionnel dépendant de la solubilité de l'oxycaïne-pénicilline dans le solvant utilisé.
La solubilité de l'oxycaïne-pénicilline dans de l'acétate de butyle est environ de 0,
15 % en poids et la solubilité de l'oxycaïne-pénicilline dans de l'acétone est d'environ 4 % en poids. La solubilité de l'oxycaïne-pénicilline dans le solvant employé ne doit pas dépasser 5 % <RTI
ID="0003.0047"> et sera avantageusement inférieure à 2 %,.
La. séparation de l'oxycaïne-pénicilline pré citée peut se faire, par exemple, par filtration, par centrifugation ou par tout autre moyen, avant d'être convertie en pénicilline. Il est préférable de laver l'oxycaïne-pénicilline pré cipitée avec de l'eau etiou avec un solvant organique, par exemple un des solvants indi qués plus haut dans lesquels l'oxycaïne-péni- eilline est pratiquement insoluble.
Un lavage de l'oxycaïne-pénicilline précipitée avec un mélange de solvants organiques contenant en volume 30 %. d'acétone et 70 % d'acétate de butyle a été trouvé particulièrement appro prié.
L'oxycaïne-pénicilline séparée est ensuite suspendue dans de l'eau, en présence d'un sol vant organique pratiquement non miscible à l'eau, et l'oxycaïne-pénicilline est décomposée à l'aide d'un agent hydrolysant acide ou alca lin. De préférence, le solvant non miscible à l'eau et l'eau elle-même sont présents en vo lumes pratiquement égaux. En milieu acide, l'oxycaïne-pénicilline est décomposée pour donner de la pénicilline libre qui passe dans le solvant organique, et un sel d'oxycaïne qui reste en solution dans la phase aqueuse.
Les deux phases sont ensuite séparées et la péni cilline libre est isolée à partir de la phase formée par le solvant organique, le sel d'oxy- caïne pouvant également être isolé à partir de la phase aqueuse. En milieu alcalin, il se forme d'abord un sel de pénicilline et de l'oxycaïne sous forme de base libre. Le sel de pénicilline reste dans la phase aqueuse et est. ensuite transformé en pénicilline libre par adjonction d'un acide. L'oxycaïne-base passe dans le solvant organique.
Parmi les solvants organiques pratique ment non miscibles à l'eau, on peut citer les alcools aliphatiques tels que le butanol et l'alcool amylique, les esters d'acides carboxy- liques tels que l'acétate de butyle et l'acétate d'amyle, les cétones telles que la méthyl-iso- butyl-cétone, les hydrocarbures aliphatiques chlorés, tels que le chloroforme et les éthers tels que l'éther diéthylique et l'éther diiso- propylique.
La décomposition de l'oxy caïne-pénicilline se fait de préférence en milieu acide. Dans ce but, on peut. suspendre l'oxycaïne-pénicilline dans de l'eau, en présence d'un solvant orga nique de la pénicilline, pratiquement non miscible à l'eau, et acidifier la suspension par adjonction d'une substance appropriée, telle qu'un acide minéral ou organique. La p6ni- cilline libérée passe dans le solvant organi que, d'où elle est isolée, tandis que le sel d'oxy- caïne formé reste dans la phase aqueuse.
De préférence, on hydrolyse l'oxycaine-pénicil- line en ajustant le pA de la suspension à une valeur comprise entre 1,5 et 2,5.
La pénicilline obtenue sous forme puri fiée peut servir à la préparation de différents sels purs de la pénicilline.
L'oxycaïne-pénicilline peut aussi être<B>dé-</B> composée dans la suspension en ajoutant un agent hydrolysant alcalin, à une température inférieure à la température ambiante, de pré férence comprise entre 0 et 5 C, dans le but. de minimiser la décomposition de la pénicil line par l'alcali. La pénicilline passe alors dans la phase aqueuse sous forme du sel cor respondant à l'alcali utilisé - par exemple le sel de sodium lorsqu'on utilise l'hydroxyde de sodium - et l'oxycaïne-base passe dans la phase formée par le solvant organique. Ensuite, la pénicilline est libérée de son sel, dans la phase aqueuse, par adjonction d'un acide.
On veillera. que l'addition d'alcali ne con duise, à aucun moment, à un excès d'alcali dans la suspension de l'oxycaïne-pénicilline a, décomposer. On utilise de préférence l'alcali sous forme de solution aqueuse diluée que l'on ajoute très lentement, en agitant, à la suspen- sion de l'oxycaïne-pénicilline. On a trouvé qu'en ajoutant à la suspension une solution de l'alcali d'une normalité d'environ 0,025, goutte à goutte et en agitant, on évite prati quement complètement une destruction de l'activité de la pénicilline par l'alcali.
On peut récupérer selon différentes mé thodes l'oxycaïne résiduelle ou le sel d'oxy- caïne. Si l'oxycaïne n'est pas présente en solu tion aqueuse, on l'amène en solution aqueuse. Lorsque l'oxycaïne-pénicilline a été préparée par réaction de l'oxycaine et de la pénicilline dans un solvant organique, on peut extraire les lessives mères du solvant contenant l'oxy- caïne avec de l'acide sulfurique dilué d'un pH d'environ 2,5, séparer et neutraliser la. couche aqueuse et éliminer le solvant y contenu par évaporation.
Lorsque l'oxycaïne-pénicilline a été préparée par réaction d'un sel d'oxycaïne avec un sel de pénicilline en solution aqueuse, le sel d'oxycaïne se trouve dans les lessives mères aqueuses. Si la décomposition de l'oxy - caïne-p6nicilline a été effectuée par un traite ment à l'aide d'un agent acide en faisant pas ser la pénicilline dans un solvant organique, c'est la couche aqueuse qui contient l'oxy- caïne résiduelle; cette couche est ensuite neu tralisée et évaporée polir éliminer le solvant organique.
Si la décomposition de l'oxycaïne- pénicilline a. été effectuée à l'aide d'iin agent alcalin en faisant passer l'oxycaïne dans un solvant organique, un sel de pénicilline reste dans la couche aqueuse et l'oxycaïne peut être extraite de la couche de solvant organique par de l'acide sulfurique dilué d'un pH d'environ 2,5, suivi de la séparation et de la neutralisa tion de la eouehe acide aque-se; ensuite, on élimine le solvant dissout dans cette couche par évaporation.
On ajoute par exemple de l'alcali aqueux à la solution aqueuse neutre contenant l'oxy- caïne, pour porter le pH à la valeur 9,0, après quoi l'oxyca:ine-base précipite sous forme d'une huile. On peut. aussi porter le pH à une valeur plus haute, par exemple d'environ 11,0, et extraire l'oxy caïne à l'aide d'un solvant orga nique, la solution ainsi obtenue pouvant être utilisée pour effectuer des précipitations sub séquentes de la pénicilline, et ceci avec ou sans concentration préalable de cette solution, par évaporation.
Quelle que soit. la méthode utilisée pour la récupération, il peut être avan tageux de faire disparaître la couleur par traitement des solutions aqueuses réunies avec une petite quantité de charbon activé, suivi de la séparation et du lavage du charbon avec une faible quantité d'un acide minéral dilué, et adjonction des eaux de lavage au filtrat principal.
Le procédé selon l'invention est illustré par les exemples suivants. Les parties en poids et les parties en volume auxquelles on se ré fère ci-après possèdent. la même relation les unes par rapport aux autres que si elles étaient exprimées en grammes et en cm3.
Exemple <I>1:</I> On ajoute lentement et sous agitation en viron 2 équivalents d'oxycaïne dissous dans 6 parties en vol-Lime d'acétate de butyle à 50 parties en volume d'une solution de péni cilline impure dans de l'acétate de butyle et contenant 30 000 unités de pénicilline par cm3. Après avoir laissé reposer ce mélange pendant une demi-heure, on sépare l'ox@ caïne- pénicilline précipitée, on la. lave avec deux parties en volume d'acétone et on la. sèche.
On suspend l'oxycaïne-pénicilline obtenue dans un mélange d'acétate de butyle et d'eau et on l'acidifie à l'aide d'acide chlorhydrique dilué jusqu'à l'obtention d'un pH de 2. La pénicil line libérée passe dans la couche d'acétate de butyle; cette couche est ensuite séparée et on en recueille la pénicilline par évaporation du solvant dans le vide. .
Bxemple <I>2:</I> On ajoute lentement et sous agitation en viron 2 équivalents d'oxycaïne dissous dans 270 parties en volume d'acétate de butyle, à 2000 parties en volume d'une solution de péni cilline impure dans de l'acétate de butyle et contenant 23 000 unités de pénicilline par em3. Après avoir laissé reposer ce mélange pen dant une demi-heure, on sépare l'oxycaïne- pénicilline précipitée, on la lave successive ment avec trois portions d'un mélange cons- titué, en volume,
par 30 % d'acétone et par 70 % d'acétate de butyle, chacune de ces por- tions comprenant 100 parties en volume de ce mélange, et on sèche ensuite à 40 C.
Le produit obtenu a une couleur crème et sa quantité correspond à 42,3 parties en poids ayant une activité de 995 unités par mg, ce qui correspond à un rendement de 92 %-.
On brasse 39 parties en poids de ce solide avec 200 parties en volume d'eau et 600 par ties en volume d'acétate de butyle et on re froidit à 5 C. On ajoute 1500 parties en vo lume d'un tampon phosphaté, à un pH 1,5, et on continue l'agitation pendant 30 minutes; après ce laps de temps, le pA de la couche aqueuse est de 2,1 et la majeure partie du corps solide est dissoute. La couche d'acétate de butyle est séparée et constitue 615 parties en volume d'une concentration de<B>61900</B> uni tés par cm3, ce qui correspond à un rende ment de 981/o pour cette opération.
On recueille ensuite la pénicilline libre purifiée de cette solution de pénicilline dans de l'acétate de butyle, par évaporation du solvant dans le vide.