Procédé de préparation de la procaïne-pénicilline. La présente invention a pour objet. un procédé de préparation de la procaïne-péni- cilline.
La. procaïne-pénicilline est l'un des déri vés de la pénicilline les plus avantageux pour l'emploi thérapeutique, présentant l'avantage d'être peu douloureuse quand elle est admi nistrée par injection, et de se maintenir dans le courant sanguin à une concentration favo rable. La préparation de procaïne-pénicilline a déjà été décrite en rapport avec des pro cédés de stabilisation d'antibiotiques, tels que la pénicilline, la streptomycine et la. tyrothri- cine, avec des amines.
Ces procédés compren nent la combinaison des différentes substances désignées sous le nom de pénicilline soit sépa rément, soit en mélange entre elles, à deux ou plus, et d'autres antibiotiques avec certains alcaloïdes comme la procaïne et l'atropine.
On sait que les préparations de pénicilline (et sous ce nom il faut comprendre soit une péni cilline spéciale, soit un mélange de pénicil lines) et d'un alcaloïde présentent le grand avantage de donner des solutions auto- stabilisantes, et qu'on obtient des résultats particulièrement satisfaisants avec la pr ocaïne, la solubilité- de cette dernière étant en outre favorisée par l'union avec un antibiotique.
On a décrit la préparation d'une solution aqueuse de procaïne-pénicilline, consistant à ajouter de l'ascorbate de procaïne au sel de calcium de la pénicilline, la solution jaune vif obtenue pouvant être stabilisée par adjonction de sor- bose. Une autre méthode consiste à faire réagir la pénicilline sous forme acide avec la pro- eaïne-base. Une telle solution de procaïne- pénicilline est maintenue de préférence à une température de 2 C avant son emploi.
On a trouvé maintenant que si la pro- caïne-pénicilline est. préparée par réaction entre la procaïne ou un sel de procaïne et la pénicilline ou un sel de pénicilline dans un milieu solvant dans lequel la solubilité de la procaïne-pénicilline est d'au plus 5%, la pro- caïne étant présente au moins en proportion équimoléculaire par rapport à la pénicilline, la procaïne-pénicilline peut être pratiquement précipitée par défaut de solubilité et peut être séparée, par filtration ou par tout autre moyen.
On a trouvé, en outre, qu'une pro- caïne-pénicilline d'une pureté relativement élevée et propre à l'usage thérapeutique peut être précipitée de cette manière à partir de solutions de pénicilline ou de ses sels d'une faible pureté, et qu'il n'est donc pas néces saire, pour préparer la procaïne-pénicilline, d'utiliser une pénicilline ou un sel de péni cilline fortement purifié. On peut ainsi éviter les opérations de purification habituellement effectuées dans la préparation. de la pénicil line et les pertes en pénicilline que ces opéra tions entraînent,
tout en obtenant une pro- caïne-pénicilline de la pureté voulue pour l'emploi thérapeutique. Le procédé de préparation de la procaïne- pénicilline selon l'invention est caractérisé en ce qu'on traite de la pénicilline ou un sel de pénicilline d'une pureté comprise entre 10 et 70 % en poids,
avec de la procaïne ou Lin sel de procaïne, en solution de réaction dans un solvant dans lequel la solubilité de la pro- caïne-pénicilline est d'au plus 5 0/0, la procaïne étant présente au moins en proportion équi moléculaire relativement à la pénicilline, et en ce que l'on sépare la procaïne-pénicilline par précipitation par manque de solubilité,
à partir d'au moins un milieu formé au moins partiellement par le ou les solvants consti tuant le milieu dans lequel s'est effectuée la réaction. De préférence, la teneur en pénicil line est telle qu'il se forme plus de procaïne- pénicilline que le-milieu de réaction n'en peut dissoudre, et on isole la procaïne-pénicilline ainsi précipitée.
Si l'on a effectué la réaction en solution très diluée, de sorte qu'il n'y a pas eu préci pitation de proeaïne-pénicilline, ou qu'il ne s'en est précipité qu'une partie, l'adjonction, après réaction, d'un liquide diminuant le pou voir Bolvant du milieu assure la. précipitation voulue de ladite substance.
La pureté de la pénicilline utilisée est avantageusement comprise entre 35 et 70 %, et de préférence entre 60 et 70 % en poids. La pénicilline utilisée peut être, par exemple, sous forme d'un extrait aqueux d'un sel de pénicilline,
d'un extrait de pénicilline dans un solvant organique, ou d'une substance solide obtenue par précipitation d'une solution de pénicilline ou par congélation et dessiccation d'une telle solution. La pénicilline utilisée peut être soumise préalablement à un petit nombre d'opérations de purification, pour qu'elle présente la pureté indiquée ci-dessus.
Il n'est pas avantageux, en général, d'utiliser comme matière première un bouillon de cul ture contenant de la pénicilline, un tel bouil lon étant trop pauvre en pénicilline pour per mettre la précipitation de la procaïne-péni- cilline. En outre, un tel bouillon contient en général des matières d'une structure organi- que complexe qui peuvent gêner la précipi tation.
On peut. utiliser avantageusement, par contre, dans le procédé selon l'invention, un bouillon de culture filtré et concentré, par exemple par extraction avec un volume rela tivement faible d'un solvant organique, ou une solution aqueuse obtenue par extraction de ce solvant organique au moyen d'eau et à un pli alcalin.
La solution de pénicilline ou d'un sel de pénicilline peut être soumise à un traitement avec une petite quantité de charbon actif, 1 à 5 % par exemple, avant de faire réagir la pénicilline avec la procaïne. Ce traitement peut se faire par agitation de la solution avec le charbon, et ce dernier peut être séparé en suite par filtration. Bien qu'un tel traitement ne produise aucune augmentation notable de la pureté de la pénicilline, il améliore consi dérablement la couleur de cette dernière.
Pour obtenir -une précipitation satisfai sante de la procaïne-pénicilline sans adjonc tion d'un liquide diminuant le pouvoir sol vant du milieu, la concentration en pénicilline du solvant dans lequel se fait la réaction doit être en excès sur la concentration correspon dant à la solubilité de la procaïne-pénicilline dans ce solvant.
Ainsi, par exemple, la solu bilité de la procaïne-pénicilline dans l'eau étant de 0,5 % en poids, ce qui correspond à une solution aqueuse contenant environ 5000 unités de pénicilline par millilitre, on utili sera de préférence un excès de 25 000 unités de pénicilline par millilitre pour obtenir une bonne précipitation.
Il en est. de même avec d'autres solvants réactionnels appropriés, la concentration minimum admissible en péni cilline dans le mélange réactionnel dépendant de la solubilité de la procaïne-pénicilline dans le solvant utilisé. On utilise de préférence un solvant dans lequel la solubilité de la procaïne- pénicilline est inférieure à 2 % oui pratique- ment nulle.
Une précipitation satisfaisante de la procaïne-pénicilline dépend non seulement de la concentration en pénicilline du mélange réactionnel, mais aussi de la pureté de la pé- iiieilline, exprimée en unités internationales par milligramme clé substances solides totales. La procaïne ou procaïne-base est le p-aminobenzoyl-p-diéthylamino-éthanol dont le chlorhydrate, de formule p-NH2. C6H,i. CO. 0.
CH. CI32 . N(C2H5) 2 . 1-ICI, est connu comme anesthésique local. Par sels de procaïne , on entend les sels de cette base libre, comme le chlorhydrate, le sulfate, le nitrate, le formiate, le benzoate, etc., dans les quels 1-'acide se fixe à l'atome d'azote trivalent de la base, qui devient ainsi pentavalent. La procaïne-pénicilline est un sel de ce type, dans lequel une molécule de pénicilline est attachée à l'azote trivalent de la procaïne base.
Toute fois, i1 est évident que, lorsqu'on parle de sels de procaine utilisés comme produits de départ, ceci exclut la procaïne-pénicilline.
La procaïne-pénicilline peut être préparée soit par réaction entre la forme acide de la pénicilline et la procaïne-base, soit par double décomposition d'un sel de procaïne et d'un sel, de pénicilline. Par exemple, le chlorhydrate de procaïne et le sel sodique de pénicilline peuvent réagir pour former de la procaïne- pénicilline et. du chlorure de sodium.
Bien (lue la formation de procaïne-pénicilline puisse se produire par réaction entre -Lin sel de pro caïne et la pénicilline sous forme acide, ou entre la procaïne et un sel de pénicilline, la réaction ne se fait pas d'une manière satis faisante et n'est, pas complète. Le procédé selon l'invention peut comprendre cependant la formation in situ dans le mélange réaction nel de la procaïne-base ou de la forme acide (le la pénicilline, selon le cas, par addition d'une base ou d'un acide, respectivement.
La procaïne et la pénicilline peuvent être utilisées en proportions équimoléculaires, mais on utilise de préférence un excès de procaïne relativement à, la quantité équimoléculaire, dans le but d'éviter toute perte de pénicilline.
La réaction entre la procaïne et la péni- eilline, ou entre leurs sels, se fait en solution, et elle peut être effectuée le plus avantageuse ment en mélangeant des solutions clés deux composants, ou en ajoutant. l'un des compo sants â. une solution de l'autre composant (fans laquelle il est soluble. Le solvant utilisé doit donc alors dissoudre la pénicilline, et la procaïne, ou leurs sels, utilisés comme réactifs, mais la solubilité de la procaïne-pénicilline dans ce solvant doit être d'au plus 5%.
Parmi les solvants appropriés pour le pro cédé selon l'invention, on peut citer: les esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, tels que l'acétate d'amyle et l'acétate de bu tyle; les alcools aliphatiques, tels que l'éthanol, le propanol, le butanol et l'acool amylique; les hydrocarbures halogénés, tels que le chloro forme;
les éthers, tels que l'éther éthylique, l'éther diisopropylique, l'éther méthyl-éthyli- que et l'éther isopropyl-éthylique; les cétones aliphatiques inférieures, telles que la méthyl- isobutyl-cétone et la- méthyl-éthy 1-cétone; des mélanges de solvants organiques, tels que acétone-acétate de butyle, butanol-acétate de butyle, etc.;
et des mélanges d'eau et de sol vants organiques tels que l'acétone, la méthyl- éthyl-cétone, le butanol, etc.
On a vu que la concentration des réactifs est de préférence telle que la procaïne-péni- cilline précipite facilement, mais dans les cas où l'on utilise des solutions très diluées, ou lorsqu'il reste de la procaïne-pénicilline rési duelle en solution après que la majeure par tie de ce corps a été précipitée, on peut ajou ter à la solution un liquide dans lequel la procdïne-pénicilline n'est pas soluble, et qui diminue le pouvoir solvant du milieu, afin de faciliter la précipitation de la procaïne-péni- cilline.
La pénicilline ou le sel de pénicilline em ployé peut être constitué par la matière obte nue à un stade quelconque d'un procédé de purification d'un premier extrait, effectué avec un solvant organique, d'un bouillon aci difié contenant de la pénicilline amorphe brute, quand la pureté de la pénicilline dans cet extrait est comprise enÉre 10 et 70%.
On peut, par exemple, ajouter de la procaïne en solution dans de l'acétate d'amy le à un extrait par l'acétate d'amyle de la pénicilline contenue dans un bouillon de culture filtré et acidifié, la quantité de procaïne ajoutée cor respondant approximativement à la quantité de pénicilline présente ou étant en excès rela tivement à cette quantité, et on peut séparer par filtration la procaïne-pénicilline préci pitée et la laver avec un solvant organique ou avec de l'eau.
On peut aussi dissoudre le sel sodique de pénicilline amorphe, séché par congélation, ou le sel sodique de pénicilline cristallisé, d'iuie faible pureté, dans un mé lange d'eau et d'acétone et ajouter à cette solution une solution de chlorhydrate de pr o- caïne dans un mélange d'eau et d'acétone, sé parer par filtration la procdïne-pénicilline précipitée, la laver avec de l'eau pour élimi ner le chlorure de sodium, et la sécher ensuite.
Quand on mélange ensemble des solutions des deux réactifs, il n'est pas nécessaire que le solvant soit le même, mais, si les solvants sont différents, i1. est avantageux qu'ils soient pratiquement complètement miscibles. Il est nécessaire dans certains cas d'utiliser des sol vants différents pour la procaïne et la péni- cilline, ces deux réactifs pouvant ne pas être solubles tous deux dans -Lin solvant déterminé.
Les exemples suivants illustrent la mise en pauvre du procédé selon l'invention. Les par ties en poids et les parties en volume ont entre elles le rapport qu'elles auraient si elles étaient exprimées respectivement en grammes et en millilitres.
<I>Exemple 2:</I> On mélange 2000 parties en volume d'une solution de pénicilline dans de l'acétate de butyle, contenant 12,2 millions d'unités de pénicilline, l'activité des substances solides étant de 900 unitésimg, dans 400 parties en volume d'une solution de procaïne dans de l'acétate de butyle, obtenue en dissolvant 9,26 parties en poids de chlorhydrate de pro- caïne dans de l'eau, en extrayant cette solu tion avec de l'acétate de butyle après alcalini- sation au moyen de soude caustique,
et on laisse reposer pendant une nuit, à la tempé rature de 5 C. La procaïne-pénicilline préci pitée est séparée par. filtration, lavée avec de l'acétone, séparée à nouveau par filtration, lavée avec de l'eau et de l'éther et séchée à 37 C.
On obtient 13,3 parties en poids de pro- caïne-pénicilline d'une activité de 901 uni tésimg et comprenant au total 11,98 millions d'unités de pénicilline, ce qui correspond à un rendement de 98,2 % en procaïne-péni- cilline.
<I>Exemple 2:</I> On filtre un bouillon contenant de la péni cilline, on acidifie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate d'amyle. On extrait la solu tion de pénicilline dans l'acétate d'amyle avec de l'eau, à un pH de 7, on acidifie l'extrait. aqueux et on l'extrait à nouveau avec de l'acétate d'amyle.
La solution résultante, con tenant 9041 unités de pénicilline par mille- litre, est agitée avec 1% en poids de charbon actif, et le charbon est séparé par filtration.
On traite 800 parties en volume de la solution résultante avec une solution de proçane dans de l'acétate de butyle, et on sépare la pro- caïne-pénieilline précipitée comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient 7,105 parties en poids de procaïne-pénicilline d'une activité de 975 iuiitésimg, ce qui représente un rendement de 96 % à partir de l'extrait à l'acétate d'amyle. Exemple <I>3:
</I> On mélange lentement, en brassant, une solution de 10 parties en poids de chlorhydrate de procaïne dans 90 parties en volume d'un mélange eau-acétone contenant 8011/o en vo lume d'acétone, avec une solution de 13,04 par ties en poids de sel sodique de pénicilline amorphe, d'une pureté d'environ 65 %, dans 50 parties en volume d'un mélange eau-acétone contenant 80 0/ô en volume d'acétone.
Quand le mélange des deux solutions est achevé, on y ajoute de l'acétate de butyle en quantité suffisante pour réduire la concentration en eau à 3 %. Cela provoque une nouvelle préci- pitation, sous forme cristalline, de procaïne- pénicilline par encore précipitée. On sépare les cristaux par filtration, on les lave avec de l'acétone, de l'eau et finalement de l'acétone, et on les sèche.
On obtient 11 parties en poids de procaïne-pénicilline d'une couleur crème très pâle et d'une activité de 960 unités/mg. Le rendement total en pénicilline, sous forme de procaïne-pénicilline, est. de 76 %.
<I>Exemple 4:</I> On filtre 36 300 litres d'un bouillon conte nant de la pénicilline, on acidifie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate - de butyle. L'ex trait est traité par de l'eau à un<B>pH</B> de 7, on acidifie l'extrait aqueux et on l'extrait avec 1640 litres d'acétate de butyle.
Cet extrait, qui contient 25 370 millions d'unités de péni cilline et dont les substances solides contien- nent 734 unités/mg (pureté de 41%), est traité avec 36,3<B>kg</B> de procaïne-base en solu tion dans 81,6 litres d'acétone.
On sépare, par filtration, la procaïne-pénicilline formée, on la lave avec 109 litres d'acétate de butyle et 6,8 litres d'acétone, on filtre et on sèche la procaïne-pénicilline. Cette dernière a une acti vité de 982 unités/mg (pureté de 94,5 0/0), et le rendement, à partir de l'extrait de l'acétate de butyle traité par la procaïne, est de 85 %. <I>Exemple 5:
</I> On filtre 36 300 litres d'un bouillon conte nant de la pénicilline, on acidifie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. L'extrait est traité par de l'eau à un pH de 7, on acidifie l'extrait aqueux et on l'extrait avec 1640 litres d'acétate . de butyle. Cet extrait, qui contient 18 000 millions d'unités de péni cilline et dont les substances solides contien nent 833 unités/mg (pureté de 470/0), est traité avee 36,3 kg de procaïne-base en solu tion dans 81,6 litres d'acétone.
On sépare par filtration la procaïne-pénicilline formée, on la lave avec 109 litres d'acétate de butyle et 6,8 litres d'acétone, on filtre et on sèche la procaïne-pénicilline. Cette dernière a une acti- vité de 942 unités/mg (pureté de 90,5%), et le rendement, à partir de l'extrait à l'acétate de butyle traité _avec la procaïne-base, est de 1001/0.
<I>Exemple 6:</I> On filtre 36 300 litres d'un bouillon conte nant de la pénicilline, on acidifie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. L'ex trait est traité avec de l'eau à un<B>pi,</B> de 7, on acidifie l'extrait aqueux et on l'extrait avec 1640 litres d'acétate de butyle. Cet extrait, qui contient 25 700 millions d'unités de péni cilline et dont les substances solides contien nent 1073 unités/mg (pureté de 60 0/0), est traité avec 36,3<B>kg</B> de procaïne-base en solu tion dans 81,6 litres d'acétone.
On sépare par filtration la procaïne-pénicilline formée, on la lave avec 109 litres d'acétate de butyle et 6,8 litres d'acétone, on filtre et on sèche la proeaïne-pénicilline. Cette dernière a une acti vité de 958 unités/mg (pureté dè 921/o), et le rendement, à partir de l'extrait à l'acétate de butyle traité .par la procaïne-base, est de 91,511/o.
<I>Exemple 7:</I> On dissout 2 parties en poids de sel sodi que de pénicilline amorphe, d'une activité de 618 unités/mg (pureté de 37 0/0), dans 8 par ties en volume d'eau distillée, et on ajoute à cette solution, en brassant, une solution de 3 parties en poids de chlorhydrate de procaïne dans 12 parties en volume d'eau distillée. On sépare par filtration la procaïne-pénicilline précipitée. On obtient 1,12 partie en poids de procaïne-pénicilline, d'une activité de 925 uni- tésjmg (pureté de 90(1/o).
Les puretés sont calculées sur la base d'une activité de 1780 unités/mg pour la péni cilline G pure, et d'une activité de 1667 uni t.ésimg pour le sel sodique pur de pénicilline G.