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La présente invention a pour objet l'extraction de la chloro- tétracycline et/ou de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation qui les contiennento
Il a été proposé antérieurement d'extraire la clorotéracycline des liqueurs de fermentation par un procédé qui consiste à acidifier le bouillon pour solubiliser la chloretétracycline, puis à séparer les solides de mycélium par filtration, et à extraire la chlorotétracycline du filtrat à l'aide d'un solvant organique et d'un agent tensio-actif. Le procédé d'extraction utilisant des solvants organiques n'a donc été appliqué, an- térieurement, qu'aux filtrats contenant le prinacipe actif, et non aux mélanges de fermentation eux-mêmes.
Jusqu'à présent, on pensait qu'il n'était pas possible, d'extraire directement la chlorotétracycline du mélange de fermentation, car on sup- posait que, les solides de mycélium agissent d'une certaine façon pour retenir la chlorotétracycline et emchent ainsi l'extraction facile de celle-ci au moyen de solvants. En conséquence, dans tous les procédas de la technique antérieure on filtrait invariablement le mélange pour obtenir un filtrat contenant le principe actif, avant toute extraction de la chlorotétracyline.
Des considérations similaires s'appliquent à l'extraction de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation qui la contiennent, et aussi à l'extraction des deux antibiotiques à la fois à partir d'un même mélange, car on sait que la chlorotétracycline et la tétracycline se for- ment toutes deux dans la fermentation par le S. aureofaciens.
La présente invention a pour objet une simplification des pro- cédés de la technique antérieure, reposant sur la découverte d'après la- quelle, dans certaines conditions, il est possible d'extraire directement la chlorotétracycline et/ou la tétracycline du mélange de fermentation sans qu'il soit nécessaire de filtrer le mélange pour éliminer les solides de mycélium comme on croyait devoir le faire antérieuremento
Suivant 1 invention,¯ on fournit un procédé pour l'extraction de la chlorotétracycline et/ou de'la tétracyline à partir d'un mélange de fermentation qui les contient, procédé qui consiste :
1) à acidifier le mélange à un pH compris ente 0,5 et 2,5 environ pour solubiliser les antibiotiques qu'il contient ;
2) à ajuster la teneur du mélange en ions calcium et magnésium à environ 10-45 mg par gramme d'antibiotique que contient le mélange ;
3) à y ajouter un composé d'ammonium quaternaire répondant à la formule :
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dans laquelle R1 est un radical alkyle inférieur ou benzyle, R2 est une chaîne grasse longue, R et R sont des radicaux alkyle inférieurs, et R1 et R considérés ensemble, représentent une chaîne carbonée divalente de " 2 à 4 atomes de carbone ;
4) à ajuster le pH du mélange entre 5,5 et 11 environ, et 5 à ajouter un solvant organique polaire non miscible à l'eau pour extraire les antibiotiques du mélange traité.
Outre l'extraction directe des antibiotiques à partir du mélange de fermentation, un autre avantage de l'invention est que l'on peut ob- tenir des rendements accrus, représentant une augmentation de 10% ou davantage, par rapport au rendement de l'extraction de la chlorotétracycli- ne et/ou de la tétracycline à partir du filtrat contenant le principe actif. Cette augmentation de rendement est due en partie au fait que l'on supprime le traitement du gâteau-filtre par un acide chaud, qui était nécessaire dans le procédé de la technique antérieure pour retirer le principe actif du gâteau-filtre, et qui aboutissait toujours à détruire cette activité dans une certaine mesure.
Donc, non seulement la présente invention est avantageuse économiquement, parce qu'elle supprime une étape du procédé antérieur que l'on croyait essentielle, mais encore elle est facile à réaliser et aboutit à des rendements élevés en matière pure, rendements qui sont meilleurs encore que ceux couramment obtenus lorsqu'on extrait la chlorotétracycline ou la tétracycline à partir du filtrat acidifié.
Un autre avantage de la présente invention réside dans le fait qu'elle supprime la nécessité de manipuler de grands volumes d'eau qui étaient nécessaires dans les procédés de la technique antérieureo Pour extraire le maximum de principe actif dans un filtrat aqueux, il est né- cessaire d'utiliser 2,5 volumes d'eau pour un volume de mélange de fermen- tation, et même ainsi l'extraction n'est pas complète. Pour des fermentations à grande échelle, on peut voir qu'il est extrêmement onéreux de récupérer la chlorotétracycline ou la tétracycline à partir d'un tel filtrat aqueux.
Un autre avantage encore de la présente invention est qu'elle donne des rendements élevés en matière pratiquement pure de qualité pharmaceutique, c'est-à-dire pure à 95-97%. La pureté accrue peut être le résultat du traitement par un réducteur, expliqué plus en détail ci-après.
La chlorotétracycline et la tétracycline obtenues par les procédés de la technique antérieure nécessitent habituellement deux recristallisations par le butanol acidifié pour les amener à satisfaire aux normes pharma- ceutiqueso
Un autre avantage de la chlorotétracycline pure obtenue par la présente invention réside dans le fait que l'on peut la réduire directement en tétracycline sans autres opérations de recristallisation ni de purifi- cation.
Quand on réalise l'invention en l'appliquant à l'extraction de la chlorotétracycline à partir d'un mélange de fermentation qui en contient, la-première étape consiste à acidifier le mélange pour solubiliser la chlorotétracycline qu'il contient. On acidifie le mélange à un pH de 0,5 - 2,5 environ, et de préférence à un pH de 1,3 - 1,4, à l'aide d'un acide minéral fort tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. On conduit ce traitement à l'acide à la température ambiante. On agite pendant peu de temps le mélange acidifié, pour solu- biliser la chlorotétracycline, puis on ajoute une quantité définie'd'acide oxalique ou d'oxalate d'ammonium, de manière à ajuster à un niveau pré-
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déterminé la teneur du mélange en ions calcium et magnésium.
A ce propos, on a trouvé que le procédé d'extraction décrit ci-après ne marche pas bien lorsqu'on extrait la chlorotétracycline du mélange sans avoir ajusté à un niveau bien défini la teneur du mélange en ions calcium et magnésium.
On a trouvé quesi la ',eneur du mélange en ions calcium et magnésium est ajustée entre 10 et 45 mg environ par gramme de chlorotétracycline présent dans le mélange, on peut obtenir une extraction satisfaisante du principe actif du mélange. Si l'on laisse dans le mélange des quantités de ces ions très supérieures ou très inférieures à ces chiffres, on obtient une extraction insuffisante du principe actif.
La cause exacte de ce fait n'est pas absolument éclaircie, mais on a observé que la chlorotétracycline pure ne peut pas être extraite par le solvant organique si les ions calcium sont absents, et que, s'il y a trop d'ions calcium dans le mélange, il se formera pendant l'étape d' extraction un précipité volumineux de chlorotétracycline qui n'est pas facilement dissous par le solvant organique. Mais comme on l'a dit cidessus, lorsque l'on ajuste la teneur du mélange en ions calcium et magnésium entre les limites indiquées plus haut, l'extraction de la chlorotétracyline par le solvant organique se déroule régulièrement et aboutit à de bons rendements en matière pure.
Lorsqu'on a achevé la précipitation de la quantité d'ion désirée, de manière ajuster la teneur du mélange en ions calcium et magnésium au niveau voulu, on ajoute au mélange décalcifié une quantité appropriée d'un composé d'ammonium quaternaire, ainsi qu'il est expliqué plus précisément ci-après. En général, la quantité de composé d'ammonium quaternaire peut varier d'environ 1/2 à 3 moles de composé quaternaire par mole de chlorotétracycline. On agite alors le mélange et on ajuste le pH du mélange entre 5,5 et 11, et de préférence entre 8,4 et 8,6, avec de la soude. On ajoute alors au mélange, en agitant, un solvant organique, de préférence à raison d'environ 10 % du volume du mélange, ou davantage.
On peut utiliser jusqu'à 50% de solvant ou davantage, mais on n'a observé jusqu'à présent aucun avantage particulier avec des quantités supérieures, et aux niveaux supérieurs cela devient peu économique. On agite le mélange et on le filtre, de préférence avec l'aide d'un adjuvant de filtration tel que la terre d'infusoires. La chlorotétracycline passe dans la phase solvant, et on laisse reposer le filtrat jusqu'à ce que les deux phases se séparent, puis on décante la phase solvant. On délaie le gâteau-filtre avec du solvant frais et on le filtre à nouveau, et on réunit les deux extraits pour les traiter ultérieurement.
On peut utiliser, dans l'étape d'extraction, divers solvants organiques polaires non miscibles à l'eau. Parmi les solvants utilisables, on citera le butanol, etc.. Des solvants préférentiels sont les méthylalkylcétones, telles que la méthylbutylcétone, la méthylpropylcétone, etc.
On obtient des résultats particulièrement bons avec la méthylisobutylcétone,. parce que ce solvant est extrêmement sélectif quant à sa propriété d'extraire la chlorotétracycline du mélange et de laisser les impuretés.
Les composés d'ammonium quaternaire qui sont utiles comme véhicules dans le procédé d'extraction par solvant décrit ci-dessus peuvent être représentés par la formule générale suivante :
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dans laquelle R1 est un radical alkyle inférieur ou benzyle, R2 est une chaîne grasse longue d'au moins 8 atomes de carbone, R est un radical alkyle inférieur, R4 est un radical alkyle inférieur, et R et R , considérés ensemble, représentent une chaîne carbonée divalente de 4 2 à 5 atomes. Ainsi, l'azote peut faire partie du noyau hétérocyclique, comme dans les composés du type "Onamine RO", par exemple ceux qui répondent à la formule :
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dans laquelle R1, R2,R3 et R4 ont la même signification que ci-dessus.
Les composés d'ammonium quaterniare appelés "Arquad", sont des véhicules particulièrement efficaces pour le procédé d'extraction par solvant ici décrit. Ces composés sont principalement des chlorures d' alkyltriméthyl-ammonium et peuvent être représentés par la formule R-N(CH3)Cl, dams laquelle R est un groupe alkyle à longue chaîne d'au moins 8 atomes de carbone.
Ces composés d'ammonium quaternaire particuliers sont vendus par Armour and Company sous la marque commerciale "Arquad". On trouve divers composés de cette classe, qui varient quant à la longueur et au nombre des groupes alkyle à longue chaîne rattachés à l'atome d'azote. On cite ci-dessus quelques types d'"Arquada" qui se trouvent dans le commerce et qui peuvent avantageusement servir à la conduite de la présente invention.
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COMPOSITION <SEP> MOYENNE <SEP> DES <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> INGREDIENTS <SEP> ACTIFS
<tb> Groupes <SEP> substituants <SEP> Longueur <SEP> de <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> chaîne <SEP> car- <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18
<tb> bonée
<tb> Octyle <SEP> 8- <SEP> - <SEP> Décyle <SEP> 10 <SEP> - <SEP> - <SEP> Dodécyle <SEP> 12 <SEP> 90% <SEP> - <SEP> Tétradécyle <SEP> 14 <SEP> 9% <SEP> Hexadécyle <SEP> 16 <SEP> - <SEP> 90% <SEP> 6%
<tb> Ootadécyle <SEP> 18- <SEP> 6% <SEP> 93%
<tb> Octadécécyle <SEP> 18 <SEP> 1% <SEP> 4% <SEP> 1%
<tb> Octadécadiényle <SEP> 18- <SEP> - <SEP> COMPOSITION <SEP> MOYENNE <SEP> DES <SEP> "ARQUADS" <SEP> EN <SEP> INGREDIENTS <SEP> ACTIFS
<tb> Groupe <SEP> Longueur <SEP> de <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad" <SEP> "Arquad"
<tb> substituants <SEP> chaîne <SEP> car- <SEP> C <SEP> S <SEP> 2C <SEP> 2HT
<tb> bouée
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Octyle <SEP> 8 <SEP> 8% <SEP> - <SEP> 8% <SEP> Décyle <SEP> 10 <SEP> 9% <SEP> - <SEP> 9% <SEP> Dodécyle <SEP> 12 <SEP> 47% <SEP> - <SEP> 47% <SEP> Tétradécyle <SEP> 14 <SEP> 18% <SEP> - <SEP> 18% <SEP> Hexadécyle <SEP> 16 <SEP> 8% <SEP> 10% <SEP> 8% <SEP> 30%
<tb> Octadécyle <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 10% <SEP> 10% <SEP> 70%
<tb> Octadécényle <SEP> 18 <SEP> 5% <SEP> 35% <SEP> - <SEP> Octadécadiényle <SEP> 18- <SEP> 45% <SEP> - <SEP> -
<tb>
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L'"Arquad" 16, qui est un chlorure d'alkyltriméthylammonium à longue chaîne dans lequel les groupes alkyle comprennent 90% de groupes hexadécyle, 6% de groupes octadécyle et 4% de groupes octadécényle, est particulièrement préférable car il semble être particulièrement sélectif pour donner un produit de chlorotétracycline plus pur.
Un autre composé d'ammonium quaternaire qui est un véhicule utile dans le présent procédé est le produit appelé "Onamine RO", vendu par Onyx Oil and Chemical Company. C'est un dérivé d'imidazoline substituée, soluble dans l'huile, contenant une chaîne grasse longue en combinaison avec des groupes amine et hydroxyle.
Après le procédé d'extraction décrit, on peut récupérer la chlorotétracycline à partir de l'extrait de plusieurs façons. Une méthode préférentielle comporte l'acidification directe pour récupérer la chlorotétracycline sous forme d'un sel d'acide minéral, par exemple de chlorhydrate. Pour réaliser cette opération d'isolement, on ajoute à l'extrait, préparé comme ci-dessus, environ 5 cm3 d'eau par gramme de chlorotétracycline présent dans le mélange de fermentation. Puis on acidifie le mélange avec de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à un pH d'environ 0,4 - 0,5.
Après avoir agité 18 à 24 heures pour favdriser la cristallisation, on filtre les cristaux de chlorhydrate de chlorotétracycline, on les lave à l'eau, on les lave avec un alcoxyalcanol inférieur tel que le 2-éthoxy- éthanol, puis avec un alcool inférieur tel que l'isopropanol, puis on'les sèche sous vide.
Les produits obtenus par le procédé d'extraction décrit ci-dessus sont généralement de qualité supérieure à tous égards, sauf l'apparence
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visuelle. Apparemment, certaines des impuretés colorées qui seraient normalement éliminées par filtration du mélange acidifié sont véhiculées dans ce procédé, et elles communiquent une apparence verdâtre ou brunâtre au produit cristallin. Ce seul inconvénient, qui se produit par suite de l'extraction directe du mélange de fermentation, peut.être facilement remédié si l'on traite l'extrait au solvant par un réducteur tel que l'hydrosulfite de sodium. Il est préférable de conduire ce traitement en milieu acide.
Donc, après addition d'eau l'extrait à la méthylisobutylcétone, on ajuste le pH entre 1 et 4 environ, et de préférence à 1,8 environ, à l'aide d'acide sulfurique. Il est essentiel que cette acidification soit opérée avec un acide qui ne provoque pas la cirstallisation prématurée du produit. On ajoute alors de l'hydrosulfite de sodium, à raison d'environ 0,3 à 0,6 g / 100 cm3. Cet intervalle est très critique, car tout excès tend à provoquer une coloration brune du produit final. On agite alors vigoureusement le mélange traité pendant un temps court avant de continuer le traitement. On effectue alors l'acidification à pH 0,5 environ, par addition d'acide chlorhydrique concentré.
On ajoute alors environ 0,5 g de chlorure de sodium par 100 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone, pour introduire les ions chlorure qui font défaut par suite de l'acidification préliminaire par l'acide sulfurique. On laisse alors vieillir le mélange et on récupère les cristaux comme on l'a décrit plus haut à propos de l'étape d'isolement.
L'invention n'est pas limitée à l'hydrosulfite de sodium comme réducteur, car on peut aussi utiliser d'autres réducteurs, par exemple l'anhydride sulfureux, le sulfite de sodium, etc.
Les méthodes d'extraction et d'isolement décrites ci-dessus à propos des mélanges contenant de la chlorotétracycline peuvent s'appliquer, pratiquement sans modification, à la récupération de la tétracycline à partir de mélanges de fermentation contenant de la tétracycline, ainsi qu' à la récupération des deux antibiotiques à partir du même mélange. On a trouvé que les conditions générales d'extraction, à savoir le pH, la proportion de solvant, les quantités de véhicules, etc., sont pratiquement similaires à celles décrites en détail à propos de l'extraction de la chlorotétracycline directement à partir du mélange de fermentation.
Mais, alors que la chlorotétracycline obtenue par extraction directe du mélange de fermentation nécessite un traitement par un réducteur pour donner un produit ayant une apparence satisfaisante, on a trouvé que ce traitement n'est pas nécessaire dans le cas de la tétracycline. Le procédé d'extraction directe de la tétracycline à partir du mélange de fermentation, lorsqu'on le conduit dans les conditions de travail préférentielles décrites ci-dessus, donne généralement un produit d'apparence visuellle satisfaisante en l'absence de tout traitement par un réducteur.
On a trouvé que cela était particulièrement vrai quand on traite le mélange peu de temps après la récolte et qu'on ne le laisse pas-reposer un temps considérable avant l'extraction.
On peut isoler la tétracycline de l'extrait par acidification directe pour récupérer le chlorhydrate de tétracycline, à peu près de la façon que l'on a décrite à propos de la méthode préférentielle de récupération de la chlorotétracycline à partir de l'extrait au solvant. En outre, on peut isoler la tétracycline sous forme de base libre en mettant l'extrait de tétracycline dans la méthylalkylcétone en contact avec de l'eau acidulée, à un pH compris entre 1,5 et 2,0, en séparant la phase aqueuse contenant la tétracycline d'avec la phase solvant, en ajustant le pH de la phase aqueuse entre 2 et 4, et en récupérant la tétracycline neutre
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par cristallisation dans la phase aqueuse.
Ce procédé, plus particulière- ment décrit dans la demande de brevet français du 22 juillet 1957, est particulièrement avantageux si l'on veut obtenir des produits d'une cou- leur supérieures
Un autre procédé qui peut servir avantageusement ici pour isoler la tétracycline de l'extrait au solvant, consiste à lettre l'extrait en contact avec de l'urée aqueuse, et à séparer la tétracycline sous forme de composé tétracycline-urée, à partir duquel on peut facilement régénérer la tétracycline pure.Le procédé, qui fait l'objet de le demande de brevet francais du 6 décembre 1956 fournit un excellent moyen pour isoler la tétracycline de l'extrait au solvant.
Les cristaux d'antibiotique obtenus par le procédé d'isolement ci-dessus sont habituellement de la tétracycline neutre à 97 - 100 % de pureté, et peuvent être convertis en chlorhydrate de tétracycline de qualité pharmaceutique par un simple procédé en une seule étape consistant à délayer la tétracycline neutre dans du butanol, du 2-éthoxy-éthanol, et de l'acide chlorhydrique,
On décrira l'invention plus en détail à propos des exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1 Extraction directe de la chlorotétracycline à partir du mélange de fermentation.
On prend une portion de 3 kg de m é l a n g e .d e fermenta- tion de chlorotétracycline titrant 5800 gammas/cm3, on l'ajuste à pH 1,4 par addition d'acide sulfurique à 25 %. Après avoir agité pendant 30 mi- nutes, on ajoute 75 g d'oxalate d'ammonium monohydraté et on agite le mélange pendant 45 minutes. Au mélange, on ajoute 54 cm3 d'"Arquad 16", sous forme de solution à 50 % dans l'isopropanol, et on ajuste le pH à 8,5 avec de la soude à 25%. On extrait alors le mélange en agitant vigou- reusement pendant 20 minutes avec 600 cm3 de méthylisobutylcétone. On ajoute au mélange 120 g de "Hyflo", et on filtre le mélange. On laisse dé- poser le filtrat pendant 3 heures, après quoi on sépare la phase solvant.
On reprend le gâteau-filtre dans 450 cm3 de méthylisobutylcétone, on filtre et on rince avec 50 cm3 de méthylisobutylcétone. On réunit les extraits . a u solvant p o u r d o n n e r un volume total de 980 cm3, titrant 16 000 gammas/cm3, ce qui représente une récupération de 90,2 %.
EXEMPLE 2 Récupération du chlorhydrate de chlorotétracycline.
A 654 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 1, titrant 16 000 gammas/cm3, on ajoute 65 em3 d'eau, et on ajuste le pH à 0,5 en ajoutant 8 cm3 d'acide chlorhydrique concentré.
On agite le mélange à la température ante pendant 17 heures, après quoi on filtre les cristaux obtenus,on les lave avec 15 cm3 d'eau, 15 em3 de 2-éthoxyéthanol et 15 cm3 d'isopropanol, et on les sèche sous vide à 40 C pendant 16 heures. On obtient un rendement de 9,74 g de chlorhy- drate de chlorotétracycline titrant 987 gammas/mg, ce qui représente un rendement d'ensemble de 82% par rapport au mélange de fermentation. Le produit, qui est brun grisâtre clair, présente une valeur E 1% 1 cm de 0,13 à 460 millimicrons. 1 cm EXEMPLE 3 Traitement par un réducteur..
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A 100 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 1 et titrant 17 800 gammas/cm3, on ajoute 15 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 1,8 avec de l'acide sulfurique à 25%. Au mélange, on ajoute 0,3 g d'hydrosulfite de sodium et on agite vigoureusement le mélange pendant 10 minutes, après quoi on ajuste le pH à 0,5 avec de 1' acide chlorhydrique concentré. Pour fournir un supplément d'ion chlorure, on ajoute 0,5 g de chlorure de sodium. On agite le mélange pendant 20 heu- res, on filtre, on lave à l'eau, au 2-éthoxyéthanol et à l'isopropanol, et on sèche sous vide. On obtient un rendement de 1,68 g de chlorhydrate de chlorotétracycline, qui titre 973 gammas/mg, ce qui représente un rendement d'étape de 92 %. Le produit, qui est jaune vif, présente une valeur E 1% de 0,22 à 460 millimicrons.
EXEMPLE 4 Extraction directe de la tétracycline du mélange de fermentation.
A 2 litres de mélange de fermentation de tétracycline titrant 6 200 gammas/om3, on ajoute 40 g d'acide oxalique pour ajuster le pH à 1,5 et on agite le mélange pendant 30 minutes. Sur la base de la puissance du mélange, on ajoute 24 cm3 (1 équivalent) d' "Arquad 16" sous forme de solution à 50% dans l'isopropanolo Après 15 minutes d'agitation, on ajoute 400 cm3 de méthylisobutylcétone et on ajuste le pH à 9,5 avec de la soude.
On agite le mélange vigoureusement pendant 20 minutes9 après quoi on ajoute 80 g de "Hyflo", et on filtre le mélange. On sépare ensuite l'extrait de la phase aqueuse épliséeo On reprend le gâteau-filtre dans la phase aqueuse épuisée et on y ajoute 200 cm3 de méthylisobutylcétone fraîche. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le mélange et on sépare l'extrait.
Les extraits réunis, qui représentent au total 575 cm3, titrent 18 600 gammas/cm3,ce qui représente un rendement de 87,8 %.
EXEMPLE Lavage à l'eau de l'extrait à la méthylisobutylcétone.
On prend une portion de 555 cm3 d'extrait à la méthylisobutylcé- tone préparé comme dans l'exemple 4, on le lave avec 272 cm3 d'eau préala- blement ajustée à pH 9,5 avec de la soude, en agitant pendant 20 minutes, et on sépare. L'extrait lavé, représentant 520 cm3, titre 19 450 gammas/ cm3, soit un rendement d'étape de 98,3 %.
EXEMPLE 6 Nouvelle extraction par l'eau de l'extrait au solvant lavé.
A 500 cm3 de l'extrait à la méthylisobutylcétone préparé comme dans l'exemple 5, on ajoute 150 cm3 d'eau et on ajuste - le pH à 1,2 par addition d'acide sulfurique. Après avoir agité pendant 30 minutes, on sépare les phases. L'extrait aqueux de 165 cm3 ainsi obtenu titre 56 000 gammas/cm3 ce qui représente un rendement d'étape de 95 %.
EXEMPLE 7 Récupération de la tétracycline neutre.
On prend une portion de 145 cm3 de l'extrait aqueux obtenu comme dans l'exemple 6, et on l'ajuste successivement à pH 1,6, 2,0, 2,6, 3,0 et finalement à 3,6 par addition de soude à 15 %; en agitant le mélange pendant 15 à 20 minutes à chaque niveau. Après vieillissement avec agita- tion à pH 3,6 pendant 16 heures à la température ambiante, on filtre le produit cristallin, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 40 C.
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On obtient un rendement de 7,4 g de tétracycline neutre titrant 1003 gam- mas/mg soit un rendement d'étape de 92,1 %. Le produit ainsi obtenu a une apparence jaune vif.
EXEMPLE 8 Extraction directe de la chlorotétracycline du mélange de fermentation.
On prend 1500 cm3 de mélange de fermentation de chlorotétracy- cline titrant 6600 gammas/cm3, on l'ajuste à pH 1,5 avec de l'acide sulfuri- que à 25 %. On ajoute-36 g d'oxalate d'ammonium et on agite le mélange pen- dant 45 minutes. On ajoute au mélange 26 cm3 d'"Onamine RO". On ajoute 600 cm3 de méthylisobutyloétone et on ajuste le pH à 8,5 avec de la soude à 25 %. On agite le mélange pendant 20 minutes. On ajoute au mélange 45 g de "Hyflo" et on filtre le mélange. On laisse déposer le filtrat et on sépare la phase solvant. On délaie le gâteau-filtre avec 300 cm3 de méthylisobutylcétone et on filtre. On réunit les filtrats et on sépare les extraits au solvant de la phase aqueuse pour donner un volume total de 780 cm3, titrant 10 250 gammas/cm3, ce qui représente un rendement de 77,8 %.
N.B.- L'"Onamine RO" est vendue par Onyx Oil and Chemical Company, c'est un dérivé d'imidazoline substituée soluble dans l'huile contenant une chaîne grasse longue en combinaison avec des groupes amine et hydroxyle.
EXEMPLE 9 Récupération du chlorhydrate de chlorotétracycline.
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