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PERFECTIONNEMENTS APPORTES A LA PURIFICATION DE TERRAMYGINE.
L' invention est relative à la purification de l'antibiotique con- nu sous le nom de la marque de fabrique "Terramyoine".
Elle a pour but, surtout, de récupérer d'une manière plus efficace et plus économique ce produit de valeur à partir du milieu brut ou partiel- lement purifié dans lequel il est formé.
Dans le brevet belge n 495.401 déposé au même nom le 28 avril 1950 sous le titre "Perfectionnements apportés aux procédés pour la prépara- tion d'antibiotiques", on a décrit le composé dénommé Terramycine" et sa pré- parationo Plusieurs méthodes ont été décrites depuis lors pour la récupéra- tion et la purification de cet agent anti-microbien obtenu à partir des bouil- lons de fermentation de divers organismes qui servent à son élaboration.
L'extraction de l'antibiotique par des solvants, tels que le butanol, hors du bouillon filtré de Terramycine est indiqué dans la demande de brevet ci- tée plus haut,, On a également proposé (demande de brevet U.S.A. n 153.760) d'effectuer la précipitation de la Terramycine, sous la forme d'un composé insoluble, par des sels colorants acides Dans la demande de brevet U.S.A. n 165.588, l'antibiotique est séparé de sa solution diluée sous la forme de sels complexes légèrement solubles 'de certains ions métalliques polyvalents.
Pour l'extraction par solvant;, indiquée dans la demande de brevet antérieure n 495.401 citée en premier lieu; le bouillon de Terramycine obte- nu à partir d'un milieu de culture de micro-organismes tel que décrit dans cette demande, est d'abord clarifié, le mycélium et toute autre matière conta- minante et insoluble étant enlevée spécifiquement par simple filtration-à un pH abaisséo On a constatée lorsque le pH est ensuite accru pour permettre l'extraction, qu'il existe une tendance à la formation de matières addition-. nelles solides qui gênent cette extraction et nécessitent une deuxième sépa- ration.
Cette matière solide comprend généralement des sels complexes de Terramycine avec les ions métalliques polyvalents, ces sels se formant natu- rellement dans le milieu nutritif dans lequel les micro-organismes producteurs
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de Terramycine ont poussé. Après la deuxième séparation, la solution basique est finalement-extraite par un solvant tel que le butanol, l'alcool amylique ou le phénylcellosolve. Après séparation des phases obtenues du solvant et du bouillon résiduel, la couche du solvant est extraite à nouveau par de l'a- cide dilué et la phase aqueuse séparée est rendue neutre ou légèrement basi- que pour précipiter une Terramycine amorphe. Par des méthodes comprenant plusieurs opérations additionnelles on peut obtenir de la Terramycine cris- tallisée à partir de ce produit.
On a trouvé maintenant que la récupération de la Terramycine par un procédé d'extraction par solvant peut être fortement améliorée et simplifiée en ajoutant au bouillon de fermentation clarifié et acide, qui contient la Terramycine et qui est obtenu par la croissance de divers micro- organismes sur ou dans le milieu nutritif usuel, au moins un agent séques- trateur pour des ions métalliques polyvalents après quoi on extrait la Ter- ramycine hors dudit bouillon. La pureté du produit extrait et la facilité d'ex- traction sont considérablement augmentées par ce procédé. Il n'existe, en substanceaucune tendance à la formation de précipités indésirables quand le bouillon de fermentation filtré est ensuite rendu basique avant l'extrac- tion comme c'est le cas quand aucune addition d'un agent séquestrateur n'est faite.
La fonction de cet agent est apparemment de lier les ions métalliques polyvalents qui existent normalement dans le bouillon de fermentation et, par conséquent, d'éviter la précipitation de sels métalliques complexes de la Terramycine quand la solution filtrée est rendue basique. Cet effet de liaison semble également réduire au minimum l'extraction de Terramycine sous la forme de composés métalliques complexes. Un autre effet est de réduire l'émulsification pendant l'extraction ce qui aide fortement à l'obtention d'un fonctionnement rapide et sur une grande échelle.
L'expression agent séquestrateur" est utilisée en chimie pour dé- signer un groupe de composés analogues à ceux décrits dans le Journal of Che- mical Education, Vol 25 page 482 (1948). Plusieurs de ces agents sont des composés d'acides polybasiques et faiblement ionisés ou des acides organiques, carboxyliques et hydroxylés. Parmi les substances utiles on peut citer, par exemple, l'acide citrique, l'acide glyconique, des polyphosphates solubles dans l'eau, par exemple le tétraphosphate de sodium, certains acides amino tels que l'acide éthylènediamine tétra- ou triacétique des mélanges de ces composés et tout agent qui convient à sequestrer et à lier des ions métalli- ques tels que le calcium, le magnésium, le fer, etc...
qui se trouvent dans les bouillons de fermentation usuels des micro-organismes. Plusieurs autres agents de ce groupe se trouvent sur le marché et leur valeur pour la présente invention doit être évidente peur les hommes du métier.
La valeur de deux des agents indiqués plus haut peut être obser- vée en comparant les coefficients de distribution de l'antibiotique quand ces agents sont ajoutés au bouillon acidifié et filtré. L'examen a été fait avec des parties de la même charge de Terramycine à laquelle on a ajouté 0,5 % des composés avant de régler le pH à la valeur de 10. Un tiers en volume de butanol est utilisé et les extractions individuelles sont faites dans des entonnoirs séparateurs.
Les couches séparées sont soumises à un es- sai pour déterminer leur teneur en Terramycine par une méthode normalisée et les coefficients de distribution (le rapport de la concentration de Terramy- cine dans la phase du solvant à celle dans la phase aqueuse) ont été calculés
EMI2.1
<tb> Réactif <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> Effet <SEP> de <SEP> réglage
<tb>
<tb>
<tb> distribution <SEP> au <SEP> pH <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aucun <SEP> 11,5 <SEP> précipité <SEP> lourd
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> citrique <SEP> 26,5 <SEP> aucun
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<tb>
<tb>
<tb> glycono-delta-lactone <SEP> 18,5 <SEP> précipité <SEP> léger
<tb>
(la glucono-delta-lactone est une source appropriée d'acide glyconique à l'état sec aisément manipulable).
Conformément à un mode de réalisation spécifique du nouveau pro-
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cédé., on ajoute lagent séquestrateur au bouillon de fermentation filtré.
Le pH est alors rendu basique et la Terramycine est extraite avec un solvant tel qu'un alcool non-miscible au bouillon (ou à l'eau). Les solvants qu'on préfère généralement comprennent le butanol normal, le butanol secondaire, les alcools amyliques$ le cyclohexanol., le phénylcellosolve, les mélanges de ces produits mais on peut utiliser n'importe quel solvant qui extrait préférentiellement la Terramycine hors du bouillon ou milieu particulier dans lequel elle se trouve. L'extraction est efficace quand elle a lieu dans des conditions relativement alcalines et, de préférence, avec un pH d'environ 8,5 à environ 11,5 alors qu'un pH voisin de 10 est généralement le plus pra- tique.
Bien que l'on puisse utiliser aisément des bouillons ayant, une acti- vité moindre, on préfère souvent ceux qui ont une activité d'au moins 800 mcg/ ml en Terramycine afin que les résultats les plus favorables puissent être obtenus. Le solvant d'extraction peut être utilisé dans une charge ordinai- re, sous forme d'un contre-courant continu ou par tout autre procédé d'ex- traction approprié.
Le volume total du solvant peut varier entre des limites écartées mais il est peutêtre le meilleur quand il correspond d'environ 1/10 à environ 1/2 du volume du bouillon ou de tout autre milieu contenant de la Terramycine brute. Les traitements discontinus ou par charges peuvent se fai- re dans des cuves appropriées équipées avec des agitateurs convenables alors que l'extraction continue peut avoir lieu dans un extracteur bien connu de Podbielniak ou dans une colonne ou tour garnie et, en principe, dans tout appareil dont on se sert généralement dans le métier pour un procédé de ce genre.
Après la séparation de la phase du solvant, contenant de la Terra- mycine, d'avec la phase du bouillon usé ou la phase aqueuse, l'extrait conte- nu dans le solvant est acidifié. A cet effet, on peut se servir de l'acide chlorhydrique, sulfurique,. phosphorique, etc..., ou dun acide organique fort ou analogue. Pour pouvoir séparer aisément la Terramycine d'avec le solvant à ce moment Inactivité de l'extrait devrait être au moins égale à environ 1500 mcg/ml de Terramycine et il est mêmepréférable de se servir d'extraits ayant une activité d'environ 4000 mcg/ml ou davantage.
On constate d'une manière surprenante que le degré d'a.cidification agit fortement sur la nature du pro- duit de Terramycine obtenu en finales De la Terramycine amphotérique cristal- lisée se sépare de ces extraits quand le pH est réglé à environ 5 ou moins.
Si le pH est réglé en-desous d'environ 3 le produit tend toutefois à se dis- soudre. Une matière cristallisée peut ne pas être obtenue si le solvant est complètement anhydre mais, en pratique., les solvants généralement utiles con- tiennent ordinairement un peu d'eau après séparation, d'avec la phase aqueuse épuisée. D'autre part, la Terramycine se sépare de l'extrait dans le solvant, à un pH supérieur à 5 jusqu'à environ 7,5, sous la forme d'une substance amor- pheo L'activité des deux produits est à peu près la même.
Si on le désire, l'extrait peut d'abord être concentrée de préférence sous vide, et la Terra- mycine amphotérique peut ensuite être séparée d'avec le concentrat par un ré- glage du pHo
Il est possible de préparer directement, à ce moment., un sel aci- de cristallisé de l'antibiotique, tel que du chlorhydrate (le Terramycine cristallisé. La terramycine cristallisée ou amorphe peut être dissoute dans le méthanol ou analogue avec addition de chlorure de calcium anhydre.
Du charbon décolorant peut être ajouté pour enlever diverses impuretés après quoi on filtre le mélange. Après addition d'acide chlorhydrique concentré au'filtrat clarifié, du chlorhydrate de Terramycine cristallisé et extrême- ment pur est précipitée
Quand l'extrait dans le solvant non-concentré est utilisé pour la préparation de Terramycine libre., l'antibiotique, après séchage, a généra- lement une activité d'environ 500 à environ 700 mcg/mg. La qualité varie quel- que peu avec l'acide utilisé pour le réglage du pH. Quand on se sert d'acide sulfurique, la teneur en cendres -du produit est un peu plus élevée que dans le cas où l'on utilise de l'acide chlorhydrique mais ce dernier a une tendance à diminuer légèrement le rendement.
Avant d'ajouter l'acide l'extrait dans le solvant peut être purifié en se servant d'agents décolorants- tels que des charbons activés Ceci donne un produit ayant une activité plus grande mais
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il se produit une légère perte de rendement.
Pour régler le pH de l'extrait, des solutions aqueuses concentrées d'acides sont généralement préférées. Par exemple, de l'acide phosphorique avec une concentration de 75 à 85 % convient très bien. L'acidification peut être effectuée en faisant couler simultanément un courant de solvant et un courant d'acide dans une cuve appropriée avec des agitateurs convenables.
En réglant les débits de ces deux courants, le pH choisi peut ainsi être con- servé constamment. Au lieu d'acidifier l'extrait de cette manière continue, l'acide peut être ajouté lentement au volume entier de l'extrait. Le pH est réglé en se servant d'un instrument de mesure du pH avec électrode en verre et toutes les valeurs du pH, indiquées dans les présentes, ont été détermi- nées directement de cette manière, la phase du solvant n'étant pas diluée par addition d'eau.
Le précipité final de Terramycine amphotérique cristallisée au amorphe peut être séparé d'avec le solvant organique d'une manière appropriée quelconque, par exemple par une filtration ordinaire. Si l'on désire utili- ser cette Terramycine purifiée directement en thérapie il vaut mieux ne pas procéder à la filtration. Sans cela il peut être utile d'accélérer la sé- paration. Dans.chaque cas:, le produit peut être lavé avec une substance-telle que le butanol'et séché à une température élevée, mais qui, de préférence, est inférieure à 55 et à la pression atmosphérique ou sous vide. Si le pro- duit doit être converti en chlorhydrate de Terramycine cristallisé ou en un sel analogue, cette opération de séchage peut être omise.
Pour cette conver- sion, le produit mouillé par le butanol peut être utilisé ou il peut être lavé avec du méthanol contenant un peu d'eau pour déplacer le butanol. Ce produit peut alors être converti en chlorhydrate cristallisé comme décrit plus haut.
Suivant une variante, pour la récupération de Terramycine à par- tir de l'extrait dans le solvant organique, la solution de l'antibiotique dans le solvant peut être extraite avec de l'acide dilué. La phase acide séparée peut ensuite être enlevée et neutralisée pour précipiter la Terramy- cine. Le produit précipité peut être converti en un produit cristallisé par les méthodes indiquées dans le brevet antérieur n 495.401 ou par des procédés similaires.
Les diverses liqueurs mères, obtenues par ces procédés, peu- vent être recyclées ce qui améliore davantage le rendement total de la Ter- ramycine purifiée obtenue à partir d'un bouillon de Terramycine donné. Par exemple, le solvant résiduel quisubsiste quand la Terramycine a été précipi- tée par acidification et séparée, a généralement une phase aqueuse allant jusqu'à 1% en volume. Cette phase aqueuse contient généralement de 20.000 à environ 65.000 mcg/ml d'antibiotique.
En permettant à la Terramycine de se déposer ou'en la soumettant à une centrifugation, une quantité apprécia- ble de Terramycine peut être récupérée et ajoutée à la charge suivante du bouillon de Terramyoine. Le solvant résiduel lui-même contient généralement d'environ 1000 à environ 1.500 mcg/ml d'antibiotique.
Une partie plus grande de ce produit peut être récupérée plus aisément en extrayant le sol- vant par charge (en discontinu) ou par une méthode par contre-courant avec u- ne solution aqueuse et diluée d'un acide à un pH d'environ 2. On utilise dans ce cas un rapport en solvant qui réduit l'activité du solvant à moins de 100 mcg/ml.. L'extrait aqueux, obtenu par ce traitement, est alors recy- clé pour le mélanger à du nouveau bouillon filtré de Terramycine et le sol- vant est récupéré par distillation.
Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on a trouvé qu'il est généralement satisfaisant et réalisable de la manière la plus éco- nomique quand on se sert d'environ 0,725 à 7,25 kg de l'agent séquestrateur particulier pour 378,5 1. de la phase aqueuse initiale telle que le bouillon.
Pour plusieurs de ces agents, une proportion qui se rapproche davantage de la limite inférieure sus-indiquée est souvent suffisante. Par exemple, 1,8 kg d'acide nitrique pour 378,5 1. constituent une quantité particulièrement utile et économique pour ce composé. Une quantité plus élevée de l'agent tend à améliorer le-coefficient de distribution pendant l'extraction du bouillon de Terramycine basique mais peut, d'autre part, ne pas être pratique.
Une pro-
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portion plus basse de l'agent n'est généralement pas suffisante pour empêcher la formation indésirabled'un. précipité quand le bouillon filtré de Terramy- cine est rendu basique. De plus., quand le rapport de l'agent'séquestrateur est abaissé encore davantage, une quantité plus grande d'ions métalliques po- lyvalents contamine généralement la Terramycine produite. Le rendement en
Terramycine amphotérique obtenu quand l'extrait dans le solvant est acidifié,, dépend de l'activité du bouillon original, du rapport en solvant. utilisé et de la proportion de l'agent séquestrateur ajouté.
Les métaux avec lesquels les agents séquestrateurs se combinent paraissent comporter le calcium, le magnésium, l'aluminium, le fer, le zinc, etc, ces métaux ou certains d'entre eux existant dans les différents bouillons de fermentation usuels.
Le procédé selon l'invention améliore, en de nombreux points, les méthodes déjà connues pour la récupération et la purification de la
Terramycine. L'addition d'un agent séquestrateur au bouillon de Terramycine augmente, d'une manière inattendue, le.coefficient de distribution dans le solvant d'extraction d'une valeur allant jusqu'à 50 % et davantage. La quantité des impuretés colorées,.extraite avec la Terramycine, est également réduite et il existe un abaissement marqué dans la proportion des métaux polyvalents qui sont extraits sous la forme de sels complexes avec l'anti- biotique. Ces améliorations dans l'extraction rendent possible une augmenta- tion des rendements et l'obtention de Terramyoine amphotérique ayant une pureté plus grande.
De plusun simple réglage de l'acidité de l'extrait dans le solvant peut servir à l'obtention d'une Terramycine qui est cristal- lisée ou amorphe. Ainsi le nombre d'opérations nécessaires jusqu'ici pour préparer l'antibiotique cristallisé ou ses sels cristallisés est très forte- ment réduite
Les exemples ci-dessous ont un caractère purement illustratif et ne doivent pas être considères comme étant les seuls modes de réalisation possibles de l'invention. En effet plusieurs dispositions nettement diffé- rentes peuvent être adoptées sans sortir du domaine de protection de l'in- vention.
EXEMPLE I.
Une souche de Streptomyces rimosus est cultivée comme indiqué dans le brevet antérieur n 495.401 dont question plus haut en se servant d'un mi- lieu de culture neutralisé formé par de l'eau du robinet contenant par litre
5 g de carbonate de calcium et un mélange de 30 parties en poids de farine de soja, 5 parties d'amidon de blé, 3 parties de nitrate de sodium et 1 par- tie d'un digesteur enzymatique de caséine. Le pH du bouillon de fermenta- tion obtenucontenant la Terramycine,est réglé à 2,5 avec de l'acide sulfuri- que. La filtration est facilitée par 1-'addition connue de terres diatomées après quoi on enlève le mycelium par filtration.
Environ 1890 litres du bouil- lon filtré acidulé, qui a l'essai donnent une activité en Terramycine de 550 mcg/ml, sont mélangés à 75 1. d'un extrait acide en phase aqueuse diluée du solvant résiduaire au butanol récupéré à partir d'une extraction de Terramy- cine précédente. Ces 75 1. de l'extrait acide 'contiennent 190 millions de mcg de Terramycine.
Aux solutions aqueuses mélangées on ajoute 1135 1. de butanol pour saturer le mélange ce qui empêche les variations de volume pen- dant l'extraction et réduit au minimum l'émulsification pendant le traitement à contre-courant, ultérieur- On ajoute 9 kg d'acide citrique en tant qu'agent séquestrateur et le pH de la solution est réglé à la,1 avec 15,8 1 d'une so- lution de 40 % de soude caustique dans l'eau. Le volume de la solution cor- respond alors au total à environ 2120 litres et !-'activité de l'antibiotique est de 625 mcg/ml. Le bouillon alcalin est extrait dans un appareil Fodbiel- niak à contre-courant continu-en se servant de butanol saturé d'eau comme solvant extracteur.
Après la séparation de la phase organique et de la phase aqueuse on obtient 545 1 d'un extrait dans le butanol et 2140 1, de bouillon de Terramycine épuisé. Ce dernier contient seulement 65 mcg/ml de l'antibiotique'et est écarté. Le butanol contient 2.630 mcg/ml d'antibio- tique et le pH de cet extrait est réglé à environ 5,3 avec une solution de 75 % en poids diacide phosphorique da.ns l'eau. Apres agitation pendant une heure, la matière est filtrée avec une aide normalisée de filtration,, elle
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est lavée au butanol et séchée à 50 .
La petite quantité de phase aqueuse qui est séparée du filtrat de butanol, est retenue pour être recyclée avec une nouvelle charge d'un bouillon filtré de Terramycine. La Terramycine am- photérique séchée., ainsi obtenue, pèse 2.919 g. - A l'essai on trouve seu- lement 103 mcg/ml à cause de la grande proportion de l'aide de filtration qui est encore en présence. Une partie de cette matière séchée, pesant 200 g. est mise en suspension dans 500 ml de méthanol et 100 ml de méthanol saturé en chlorure de calcium sont ajoutés à la suspension. On introduit 25 g de charbon décolorant et on agite pendant une demi-heure après quoi on filtré la masse et on lave le gâteau recueilli sur le filtre cinq fois avec 100 ml de méthanol en tout.
Le filtrat est finalement traité avec 50 ml d'acide chlorhydrique concentré, l'addition se faisant lentement et en agitant cons- tamment. Après avoir agité la masse pendant une heure, le précipité de chlor- hydrate cristallisé de Terramycine est filtré et lavé avec du méthanol. Le produit séché pèse 10,1 g et convient tout particulièrement à des usages thé- rapeutiques.
EXEMPLE II.
Environ 3025 1. de bouillon de Terramycine, fourni par la même source que celui de l'exemple I, sont acidifiés avec de l'acide sulfurique jusqu'à ce qu'on ait atteint un pH égal à 2,4. On ajoute 108 kg.d'un produit facilitant la filtration, on filtre le mélange et on lave plusieurs fois le gâteau, recueilli sur le filtre, avec de petites quantités d'eau. Le fil- trat a un volume d'environ 3220 1, et donne à l'essai 790 mcg/ml de Terra- mycine active. Il est mélangé à 123 1. de liqueurs mères aqueuses et per- dues provenant d'une extraction de Terramycine précédente, ces liqueurs con- tenant 310 millions de mcg de l'antibiotique.
Le mélange a donc une activi- té totale de 3.210 millions de mage On y ajoute 185 1. de butanol et 14,75 kg d'acide citrique. Le pH de la solution est réglé à 10,1 avec 24 1 d'une solution à 40 % de soude caustique dans l'eau et elle est extraite ensuite par du butanol, en contre-courant dans un appareil Podbielniak en se servant d'un rapport de 4,7 volumes de bouillon pour un volume de butanol saturé d'eau. L'extrait au butanol, ainsi obtenu, a un volume de 757 1, il donne à l'essai 3.880 mcg/ml et fournit au total 2.940 millions de mcg de Terra- mycine. Le raffinat aqueux, qui a un volume de 3570 1, donne à l'essai 65 mcg/ml, contient au total seulement 230 millions de mcg de Terramycine et est écarté.
A l'extrait au butanol on ajoute 1,2 1 d'une solution à 75 % en poids d'acide phosphorique dans l'eau. L'addition est faite lentement en remuant la masse et l'agitation est poursuivie, d'une manièreintermittente, pendant 6 heures. Le pH, déterminé directement avec une électrode en verre dans le butanol, est égalà 4. La Terramycine amphotérique, qui a précipité est filtrée avec encore un peu du produit facilitant la filtration et est sé- chée à 50 . Le filtrat au butanol a un volume de 865 1 et donne à l'essai .
1.180 mog/ml alors que la quantité réduite de phase aqueuse, qui est séparée de ce filtrat a un volume de 19 1 et contient 11.330 mcg/ml de l'antibiotique.
La Terramycine séchée pèse 2.618 g et donne à l'essai 233 mcg/mg. Une partie de ce produit (200 gr est mise en suspension dans 500 ml de méthanol et on ajoute à la suspension 100 ml de méthanol anhydre saturé de chlorure de cal- cium. On mélange 5 gr de charbon décolorant normalisé à la suspension et on les agite dans celle-ci pendant une heure. Après filtration et après la- vage du gâteau recueilli sur le filtre, avec du méthanol, on ajoute 50 ml d'a- cide chlorhydrique concentré au filtrat. Ce dernier est alors agité pendant une heure et le chlorhydrate de Terramycine cristallisé, qui est séparé, est enlevé par filtration, lavé sur le filtre avec du méthanol et séché à 50 .
Les cristaux obtenus pèsent 33,25 g et ont une activité de 890 mcg/ml. Les liqueurs mères au méthanol et le liquide de lavage ont un volume de 1.025 ml et donnent à l'essai 13.080 mcg/ml. Cette matière est récupérée mais ne peut pas avantageusement être ajoutée à un nouveau bouillon filtré de Terra- mycine pour une extraction subséquente à cause de sa teneur élevée en cal- cium.