BE526416A - - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1> PROCEDES DE FERMENTATION ET DE RECUPERATION DE FUMAGILLINE DE LA BIERE FERMENTEE, ET PRODUIT OBTENU PAR CES PROCEDES. La présente invention est relative à la fermentation et, en par- ticulier, à des procédés de récupération de la fumagilline de la bière fermentée au moyen de ferment de fumagilline, procédés selon lesquels la fumagilline précipite par acidification de la bière fermentée à un pH de 1 à 4, grâce à quoi un produit brut, duquel on peut facilement obtenir de la fumagilline raffinée, est aisément séparé de la bière fermentée. La fumagilline est un antibiotique obtenu par l'action du ferment de fumagilline Aspergillus fumigatus H-3 (NRRL 2319), sur un milieu de trem- page du mais contenant de la dextrine ou un milieu nutritif analogue, et on a constaté qu'elle avait une certaine utilité dans le traitement de di- vers états pathologiques, en particulier d'infections par l'Endamoeba his- tolytîca (Hanson and Eble, J. Bacteriology 58, 328 (1949) ; McCowen et al., Science 113, 202 (1951). C'est un solide cristallin blanc ayant une formule empirique, C27H36O7, un oint de fusion de 190-191 degrés centigrades, une rotation optique, [[alpha]]D25, de moins 26,6 degrés, un poids mo- léculaire d'environ 475-490 et un coefficient d'extinction spécifique (k) de 145-148 à 351 mu. Il forme un méthyl-ester fondant à 145-147 C., un orta- EMI1.1 bromure fondant à l18-122 C, et un 2,4-dinitrophényl-hydrazone fondant à 123-126 C. Dans la récupération d'antibiotiques de bières fermentées, il est habituel de soumettre la bière fermentée neutre à extraction au moyen d'un solvant non miscible à l'eau, tel que le chloroforme. Lorsqu'un tel procédé est appliqué à la récupération de la fumagilline d'une bière fermentée en contenant, le produit récupéré de l'extrait est contaminé par des matières <Desc/Clms Page number 2> étrangères également extraites de la bière fermentée. La présence de ces autres matières, malgré le pouvoir solvant élevé du choroforme pour la fumagilline; complique le traitement ultérieur de l'extrait de fumagilli- ne au point que la marche du procédé s'accompagne de difficultés et que le rendement total soit faible. L'inventeur a maintenant trouvé que la fumagilline, à la différence des autres antibiotiques, pouvait précipiter de solutions extrêmement diluées, ainsi qu'elles sont caractéristiques dans les bières fermentées, par acidification de la solution à un pH d'environ 1 à 4 et il tire parti de cette découverte pour fournir un procédé perfectionné de récupération de la fumagilline d'une bière fermentée en contenant, procédé selon lequel la bière fermentée est acidifiée à un pH de 1 à 4 pour précipiter la fumagilline. De cette manière, les agents de contamination solubles dans l'eau qui, autrement, si les procédés de la technique antérieure avaient été employés, auraient été extraits de la bière neutre, y sont laissas et une fumagilline brute, de laquelle on peut facilement récupérer de la fumagilline pure par des procédés convenables d'extraction et de cristallisation, est facilement séparée de la bière fermentée. On a en outre trouvé qu'on pouvait purifier la fumagilline brute séparée de la bière fermentée acidifiée en soumettant le produit brut mouillé à une extraction au moyen d'acétone ou d'un solvant hydrophile analogue, à bas point d'ébullition, tel ;que l'éthanol, le méthanol, le propanol, le butanol ou l'acétate d'éthyle ; en en séparant une seconde fumagilline brute ; en soumettant cette seconde fumagilline brute, mouillée, à une extraction au moyen de chloroforme ou d'une solvant analogue non miscible à l' eau, tel que le chlorure de méthylène, la méthylisobutylcétone ou le butanol; en séchant la solution ainsi obtenue, au moyen d'un agent déshydratant convenable, tel que le sulfate de sodium anhydre, le chlorure de calcium, le sulfate de magnésium ou le gel de silice ; en appliquant un autre procédé de ségrégation, par exemple un procédé de centrifugation, par lequel on élimine l'eau et la matière soluble dans l'eau y dissoute ; en récupérant-la fumagilline de la solution anhydre ainsi obtenue. Par "solvant à bas point d'ébullition", on entend ici un solvant ayant un point d'ébullition suffisamment bas pour qu'il puisse être enlevé, par distillation, de sa solution aqueuse. Soit son point d'ébullition, soit celui de son azéotrope avec l'eau, s'il en forme un, doit être inférieur au point d'ébullition de l'eau. Si on le désire, la fumagilline ainsi récupérée peut encore être purifiée par recristallisation à partir de méthanol ou d'un solvant analogue, tel que l'éthanol, l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone, auquel on peut ajouter de l'eau, en particulier si les solvants sont miscibles, c'est-à-dire s'ils sont du méthanol, de l'éthanol et de l'acétone, pour y faire débuter, la précipitation de la fumagilline. En appliquant les procédés faisant l'objet de l'invention, on a constaté qu'il était désirable de clarifier tout d'abord et parfois de dégraisser la bière de départ, par exemple par filtration, avec ou sans agent auxiliaire de filtrage, à un pH supérieur à 6 environ et inférieur à 8, pour enlever le mycélium introduit avec l'inpculum. Ceci a pour avantage que les impuretés huileuses indésirables du mycélium- ne sont pas entraînées dans les extraits subséquents.,.Si on le désire, la bière neutre (pH6 à 8) peut être soumise à l'extraction 'avec- le produit connu dans le commerce sous le nom de "Skellysolve B " (qui est un éther de pétrole raffiné) ou avec un autre solvant des hydrocarbures, en vue du dégraissage de la bière filtrée. Il est particulièrement avantageux d'utiliser de l'huile de lard, soit en une quantité excessive, comme agent empêchant la formation de mousse; lors de la fermentation. La bière ainsi clarifiée et dégraissée est ensuite traitée en vue de la récupération de la fumagilline. <Desc/Clms Page number 3> Ta bière neutre, ayant ou non subi les traitements précités de charification t de dégraissage mais avantageusement, toutefois, clarifiée, est acidifiée à un pH de 1 à 4. Il est souhaitable que l'acidité soit réglée au pH 2 environ, pour lequel la solubilité de la fumagilline est minimum . Du fait que la solubilité de la fumagilline est fonction du pH, la nature de l'acide n'a pas d'importance sauf si l'on tient compte des raisons d'ordre économique et, sous ce rapport, on peut utiliser des aci- des tels que les acides sulfurique, chlorhydrique, acétique, chloroacé- tique,et phosphorique. L'acidification au moyen de l'un quelconque de ces acides, à un pH compris entre 1 et 4 environ, avantageusement au pH 2, détermine la fumagilline à précipiter en une fine dispersion, de la quelle la fumagilline précipitée peut être récupérée par filtrage au moyen d'un filtre-presse ou d'un appareil centrifuge. Le filtrage de la fumagilline précipitée est avantageusement effec- tué en présence d'un agent auxiliaire de filtrage afin de favoriser la flo- culation du précipité finement dispersé. Ainsi, si la bière contenant la fumagilline dispersée est traitée au moyen d'une terre à diatomées finement divisée ou d'un agent auxiliaire de filtrage analogue, les particules fine- ment dispersées de fumagilline floculent sur les particules d'agent auxi- liaire de filtrage et sont, de ce fait, rendues plus facilement séparables de la bière. La précipitation et la récupération de la teneur de la bière fermentée en fumagilline est, dans ces conditions, si complète qu'il n'est ni nécessaire, ni désirable de récupérer la bière épuisée (filtrat) pour un autre usage dans le procédé. Le gâteau de filtrage mouillé est alors soumis à une extraction au moyen d'acétone. On peut à cet effet, laver le gâteau sur le filtre presse ou dans l'appareil de contrifugation, en cas d'emploi d'un tel appareil, ou repulper le gâteau de filtrage dans de l'acétone et filtrer à nouveau en vue de l'élimination de l'agent auxiliaire de filtrage. L'acétone peut contenir d'importantes quantités d'eau, bien que, de préférence, elle ne doive pas en contenir plus de 50 % environ. Si l'on emploie un filtrepresse, il est avantageux d'utiliser de l'acétone anhydre ou de l'acétone aussi sèche qu'il est possible économiquement et, à cet effet, elle ne doit pas contenir, de préférence, plus d'environ 5 % d'eau. D'autres solvants missibles à l'eau peuvent contenir des quantités d'eau analogues. Si l'on emploie de l'alcool éthylique, la solution ordinaire à 95 % est avantageuse. Si l'on emploie des solvants non miscibles à l'eau, tels que le butanol, ils peuvent contenir de l'eau en une quantité allant jusqu'à leur limite de solubilité dans l'eau; La solution ainsi obtenue est alors concentrée par évaporation du solvant. Si on le désire, la solution peut tout d'abord être partiellement ou complètement neutralisée au moyen de soude caustique ou d'unebase soluble analogue pour empêcher le développement d'une acidité excessive dans le produit de la concentration. L'évaporation est avantageusement opérée in vacuo de façon que la température soit maintenue relativement basse. La distillation du solvant est avantageusement effectuée sous un vide aussi poussé que possible au moyen d'un condenseur barométrique et correspondant, de préférence, à une pression de moins de cinq pouces de mercure. Si, au lieu d'acétone, on emploie du butanol ou un solvant analogue formant un azéotrope avec l'eau, de l'eau peut être ajoutée pendant la distillation du solvant jusqu'à complète distillation de celui-ci. Lorsque le solvant a été élimi- né par distillation ; reste une pâte aqueuse de fumagilline. L'eau de cet- te pâte provient du gâteau de filtrage mouillé ainsi que de toute eau présente dans le solvant et de leau pouvant avoir été ajoutée pendant la. distillation. La formation de cette pâte aqueuse a pour avantage que les im- puretés solubles dans l'eau y sont retenues en solution et sont, par conséquent, facilement séparées lors du filtrage de la pâte. La fumagilline semi-raffinée ou seconde fumagilline brute ainsi obtenue est encore raffinée par extraction au moyen de chloroforme ou d'un <Desc/Clms Page number 4> solvant non miscible à l'eau du même genre. Ceci se fait avantageusement a- près élimination de l'eau, par filtrage, de la pâte aqueuse, si bien que les matières solubles dans l'eau ne sont pas, elles, soumises à l'extrac- tion. La gâteau de filtrage mouillé est donc avantageusement soumis à l' extraction soit sur le filtre-presse, soit dans l'appareil de centrifuga- tion, ou bien est repulpé dans le chloroforme ou un solvant non miscible à l'eau du même genre mais, si on le désire, la pâte aqueuse peut être di- rectement soumise à l'extraction au moyen du chloroforme dans un appareil convenable d'extraction, par exemple dans un appareil d'extraction Podbiel- niak.. On obtient ainsi une fumagilline plus raffinée encore en solu- tion dans du chloroforme ou dans un solvant non miscible à l'eau du même genre, duquel elle est récupérée d'abord par séchage de la solution en vue de l'élimination de l'eau enlevée du gâteau de filtrage mouille ou de la pâte aqueuse, et ensuite, par évaporation du solvant. Si le séchage est effectué par un procédé de ségrégation, par exemple par adsorption de l'eau ou centrifugation, une autre séparation encore des impuretés insolubles dans l'eau est effectuée. On peut ensuite poursuivre la purification de la fumagilline ainsi obtenue en la dissolvant dans un solvant duquel elle puis- se être facilement cristallisée et en la recristallisant de ce solvant une ou plusieurs fois. On a trouvé le méthanol anhydre particulièrement avan- tageux et, dans le but considéré, l'addition d'une faible quantité d'eau est souvent favorable pour faire débuter le cristallisation. On obtient une cristallisation efficace en reprenant, par exemple, l'extrait de fumagil- line dans du méthanol anhydre bouillant et en refroidissant à moins 40 de- grés centigrades environ, avec addition d'une quantité d'eau allant jusqu'à 50% environ ou sans addition d'eau. L'éthanol l'acétone, le butanol et la méthyléthylcétone sont d'autres solvants qui peuvent, de même, être effica- cement utilisés pour recristalliser la fumagilline raffinée. Le solvant de cristallisation peut avantageusement être ajouté à l'extrait au chloro- forme avant que tout le chloroforme n'en soit évaporé.Le méthanol peut donc être ajouté à la solution de chloroforme et le chloroforme, être élimi- né ensuite par distillation,laissant ainsi une solution de laquelle la fumagilline cristallise facilement lors du refroidissement. L'invention sera miux comprise si l'on se réfère aux exemples suivants, dans lesquels les parties sont données en poids, sauf spécifica- tion différente. Exemple 1. Seize cents gallons de bière ayant fermenté pendant quatre jours avec une culture d'Aspergillus fumigatus H-3 furent soumis à essai en pré- sence de S. aureus phage (essai sur plateau) montrant une activité équiva- lente à 95 micro grammes par millilitre ou à un total de 580 grammes de fu- magilline. La bière fut filtrée sans agent auxiliaire de filtrage et la bière clarifiée, titrant 345 grammes de fumagilline, fut dégraissée par ex- traction au moyen de 200 gallons de Skellysolve B. A la bière dégraissée, titrant 260 grammes de fumagilline, on ajoute 150 livres de l'agent auxili- aire de filtrage contenant des diatomées connu sous la dénomination "Super- cel" et du H2SO4 concentré, pour régler le pH à 3. La fumagilline précipitée et le Supereel furent éliminés par filtrage au moyen d'une presse à plateau et à châssis et le gâteau fut soumis trois fois à extraction avec de l'acétone à 100%. Les extraits à l'acétone combinés, soit 150 gallons , furent réglés au pH 6 avec une solution de soude caustique et concentrés in vacuo en une suspension aqueuse. Le vide, ici comme ailleurs dans les exemples, fut obtenu au moyen d'un condenseur barométrique, par exemple un aspirateur à jet de vapeur d'eau et un condenseur, travaillant pour créer un vide correspondant à une pression absolue de moins de cinq pouces de mercure. La suspension aqueuse fut soumise à extraction trois fois, de façon continue, avec du chloroforme. Les extraits au chloroforme, soit six <Desc/Clms Page number 5> gallons, contenaient, à l'essai biochimique, 253 grammes de fumagilline. La solution de chloroforme fut concentrée in vacuo en un résidu semi-solide,qui EMI5.1 fut msso da# du nBt#rrd..la lutio:u1e mé],de quatre litres, fut refroidie et main- tenue pendant une nuit à environ moins quarante degrés centigrades et un premier lot de 90 grammes de cristaux bruts fut recueilli. Un deuxième lot, de 69,5 grammes, et un troisième, de 12,1 grammes furent obtenus lors de la concentration des liqueurs mères. La recristallisation des cristaux bruts, à cet effet dissous dans du méthanol chaud, filtrés et refroidis, donna un produit final de 101,6 grammes de cristaux blancs. La bière fermentée utilisée dans cet exemple est préparée de la manière suivante. EMI5.2 A. Préoaration de cultures d'ensemenrement d'.speril1us fumi - gatus H-3 Une croissance végétative et des spores de A. fumigatus H-3, développées sur de la gélose, sont placées dans plusieurs flacons de 500 millilitres, contenant chacun 100 millilitres du milieu suivant : Dextrine 10 gr. Chlorure de sodium 5 gr. Mat. solides de trempage du mais 32 gr. Carbonate de calcium 1 gr. Eau de ville quantité suff. pour faire 1 litre Le milieu est réglé au pH 6,7 par addition de solution de soude caustique, stérilisé et inoculé en partant de gélose. Il est secoué (culture aérée, submergée) pendant 48 heures à une température de 24 degrés centigrades. Cette culture de A. fumigatus H-3 peut être utilisée directement pour l'ensemencement de réservoirs de production de fumagilline (C) ou pour la production d'un plus grand volume d'inoculum (B). B. Préparation d'inoculum. A six litres d'un milieu contenant les constituants énumérés en A, dans un flacon de cinq gallons, équipé pour agitation et aération, on ajoute cinq pour cent en volume d'une culture,d'ensemencement obtenue comme EMI5.3 décrit en AJ.e miliàlensemen# est soumis àl':inc;;ati.d1 à une températurE! de 4r déés centigrades, avec aération, pendant une période de 48 heures. A la fin de ce temps, cette culture convient pour l'ensemencement de grands réservoirs. C. Préparation de la bière fermentée. Seize cents gallons du milieu de trempage à la dextrine décrit en A, contenus dans un réservoir de fermentation à revêtement interne en verre et d'une capacité de deux mille gallons, sont ensemencés de 75 gallons d'une culture végétative de 48 heures de A. fumigatus H-3, obtenue comme décrit en B. Le milieu ensemencé est soumis à l'incubation pendant 42 heures à une température de 24 degrés, avec aération à une allure d'environ 80 pieds cu- bes à la minute et avec agitation. Exemple 2. Seize cents gallons de bière fermentée, préparée comme il a été dit plus haut mais titrant 3. 040 grammes de fumagilline, furent filtrés sans agent auxiliaire de filtrage. La bière claire fut réglée au pH 2 avec du H2SO4, en présence de 100 livres de l'agent auxiliaire de filtrage connu sous la dénomination "Supercel". La partie active précipitée fut reti- rée par filtrage au moyen d'une presse à plateau et châssis et le gâteau fut soumis à extraction sur la presse, par remise en cycle d'acétone à 100 pour cent pour donner trois extraits. Les extraits à l'acétone rassemblés <Desc/Clms Page number 6> soit 145 gallons, furent concentrés in vacuo pour former une suspension aqueuse. La fumagilline en suspension fut éliminée par filtrage avec une faible quantité d'agent auxiliaire de filtrage et le gâteau de filtrage fut ensuite remué avec du chloroforme en vue de l'extraction de la partie active. L'extrait au chloroforme fut séché par mise en contact avec du surate de sodium anhydre et fut concentré in vacug, le chloroforme étant occasionnellement remplacé par du méthanol, pour donner enfin une solution de 15 litres environ, qui, lors du refroidissement comme dans le cas de 1' exemple 1, donna 550 grammes de fumagilline brute-cristallisée. Les cristaux bruts furent dissous dans 20 litres de méthanol chaud et la solution fut filtrée et refroidie. Les cristaux blancs formés furent retirés par filtrage et séchés sous vide. On obtient ainsi 472 grammes de cristaux fondant à 193 degrés centigrades et ayant une pureté, déterminée par ultra-violets, de 99,6 pour cent. Bien que l'invention ait été décrite et,illustrée dans des applications particulières, on comprendra qu'elle ne se limite pas à ces dernières et qu'elle pourrait admettre des variantes sans pour cela que l'on s' écarte de son esprit ou de son champ tels qu'ils sont exposés plus haut et revendiqués ci-dessous. REVENDICATIONS 1. Procédé de récupération de la fumagilline de la bière fermentée en contenant, caractérisé par le fait qu'on détermine la précipitation de la fumagilline par acidificat-ion de la bière fermentée à un pH compris entre 1 et 4 environ. 2. Procédé de récupération de la fumagilline de la bière fermentée en contenant, caractérisé par le fait qu'on détermine la précipitation de la fumagilline par acidification de la bière fermentée à un pH compris entre 1 et 4 environ, qu'on fait floculer la fumagilline précipitée sur un agent auxiliaire de filtrage et qu'on retire le produit de la précipitation par filtrage.
Claims (1)
- 3 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que la bière fermentée,est clarifiée avant la précipitation de la fumagil- line, d'où le mycélium du ferment est retiré avant ladite précipitation.4. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé par le fait que la bière fermentée est clarifiée avant la précipitation de la fumagilline, d'où le mycélium du ferment est retiré avant ladite précipitation.5. Procédé de récupération de la fumagilline de la bière fermentée en contenant, caractérisé par le fait qu'on acidifie la bière fermentée à un pH compris entre 1 et 4 environ, qu'on retire par filtrage une fumagilline brute et qu'on extrait la fumagilline du produit brut ainsi obtenu.6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait que l'extraction consiste à soumettre tout d'abord la fumagilline brute mouillée à extraction au moyen d'un solvant hydrophile, à en séparer une seconde fumagilline brute, à soumettre ladite seconde fumagilline brute, mouillée, à extraction au moyen d'un solvant non miscible à l'eau, à sécher la solution ainsi obtenue et à en récupérer la fumagilline.7. Procédé suivant la revendication 6 caractérisé par le fait que l'opération de séchage est effectuée par un procédé de ségrégation.8. Procédé de récupération de la fumagilline de la bière fermentée en contenant, caractérisé par le fait qu'on détermine la précipitation de la fumagilline en acidifiant la bière à un pH compris entre 1 et 4, qu'on fait floculer la fumagilline précipitée sur un agent auxiliaire de filtrage, qu'on filtre la bière ainsi traitée, qu'on soumet le gâteau de-filtrage mouillé à extraction au moyen d'un solvant hydrophile à bas point d'ébullition, de la fumagilline' qu'on concentre l'extrait ainsi <Desc/Clms Page number 7> obtenu en une pâte aqueuse de fumagilline brute par évaporation dudit solvant, qu'on extrait la fumagilline dudit produit brut au moyen d'un solvant de la fumagilline pratiquement non miscible à l'eau, qu'on sèche la solution ainsi obtenue et qu'on en récupère la fumagilline.9. Procédé suivant la revendication 8 caractérisé par le fait que 1 pâte aqueuse de fumagilline brute est filtrée avant que le produit brut ne soit soumis à i'extraction au moyen du solvant non miscible à l'eau.10.- Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que l'opération de séchage est effectuée par un procédé de ségrégation.11. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé par le fait que le solvant hydrophile à bas point d'ébullition est de l'acétone.12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé par le fait que le solvant non miscible à l'eau est du chloroforme.13. Procédé de récupération de la fumagilline de la bière fermentée en contenant, caractérisé par le fait qu'on acidifie la bière à un pH compris entre 1 et 4 environ, qu'on y ajoute un agent auxiliaire de filtrage et qu'on filtre ; par le fait qu'on soumet le gâteau de filtrage à extraction au moyen d'un solvant hydrophile à bas point d'ébullition, qu'on évapore ledit solvant, ce qui laisse subsister une pâte aqueuse de fumagilline brute, et qu'on filtre ladite pâte ; enfin par le fait qu'on soumet le gâteau de filtrage ainsi obtenu à extraction au moyen d'un solvant de la fumagilline pratiquement non miscible à l'eau, qu'on sèche l'extrait ainsi obtenu et qu'on en récupère la fumagilline.14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé par le fait que le solvant hydrophile est de l'acétone.15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé par le fait que le solvant non miscible à l'eau est du chloroforme.16. Procédé suivant la revendication 15, caractérisé par le fait que l'opération de séchage est effectuée par un procédé de ségrégation.17. Fumagilline obtenue par les procédés faisant l'objet des revendications qui précèdent.
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