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La présente invention est relative au nouvel antibiotique que constitue la novobiocine et, plus parti- culièrement, à un nouveau procédé perfectionné pour prépa rer le sel monosodique de novobiocine.
L'antibiotique novobiocine, qui est également connu sous le nom de "cathomycine". une marque de la so- ciété MERCK Co., Inc., est formé par culture, dans des conditions contrôlées, d'une nouvelle espèce demicroorga- nisme, qui a été désignée dans la collection de cultures de MERCK & Co., Inc.,à Rahway, New Jersey, U.S.A. sous le nom de Streptomyces sphéroïdes MA-319.
Une culture de cet organisme été déposée à la section de fermentation de la "Korthern Utilisation Research Branch" de L'united States Department of Agriculture à Peoria, Illinois, U.S.. et ajouté--'CI sa collection permanente sous le numéro d'iden tification NRRL 2448,
La production de novobiocine par fermentation aérobie de milieux aqueux appropriés par des souches de Streptomyces spheroides et la préparation de sels de novo- biocine est une substance acide comportant deux groupes de liaison basiques.
La première liaison pour former un sel monosodique se présente à un pH d'environ 7, 0 et a un pK d'environ 3,8, La seconde liaison se présente à un pH d'environ 11,0 et a un Ph d'environ 9,4. ke sel monosodique de novobiocine est particu- lièrement actif' contre les staphylocoques résistant à la pénicilline, ainsi que contre les streptocoques et pneumo- coques, tous organismes qui sont la cause de la plupart des infections bactériennes des voies respiratoires. En theope humaine, le sel sodique de novobiocine peut être administré par la bouche sens la forme de capsules conte- nant, par exemple'-environ 100 à 500 mg d'antibiotioue à
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une dose quotidienne de 1 à 2 grammes.
Ainsi, une forme appropriée est celle d'une capsule de gélatine molle No.1 contenant 250 mg du sel monosodique de novobiocine. On peut aussi préparer des tablettes en mélangeant le sel mo nosodique en poudre à une petite quantité d'une solution à 5 % de phtalate d'hydrogène et d'acétate de cellulose dans un mélange de méthanol et d'acétone (50 : 50), en granulant la matière sur un tamis n 8. en séchant les granules obtenus, en faisant passer les granules séchés à travers un tamis n 12, et en comprimant les granules ré- sultants après addition d'une petite quantité de stéarate de magnésium, de manière à former des tablettes contenant environ 250 mg de novobiocine sodique.
La novobiocine et, en particulier, son sel mo- nosodique sont également efficaces dans le traitement de certaines maladies de plantes. Ainsi, par exemple, une solution aqueuse contenant environ 100 parties par mil- lion (ppm) du sel monosodique en question peut être utili sée en pulvérisation pour combattre la "rouille" ou nielle du haricot due au Xanthomonas phaseoli. Ces produits de pulvérisation peuvent contenir divers agents de mouillage ou d'étalement et/ou d'autres agents actifs et peuvent être préparés par des méthodes bien connues dans la technique.
Ces applications ainsi que d'autres applica- tions du sel monosodique de novobiocine rendent extrême- ment souhaitable un procédé pratique et peu coûteux pour la préparation du sel monosodique de novobiocine.
La présente invention concerne un nouveau pro- cédé grâce auquel de la novobiocine acide relativement im- pure peut être convertie directement en sel monosodique cristallin de novobiocine.
Le nouveau procédé suivant la présente inven- .tion consiste à dissoudre de la novobiocine acide ayant
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une pureté de plus de 80 % environ dans un solvant orga- nique mixte contenant environ 2 à 4 parties en volume d'un alcool à 1 à 4 atomes de carbone pour 1 partie en volume d'un solvant aromatique choisi dans le groupe comprenant le benzène, le toluène et le xylène, à ajouter à,la solu- tion obtenue du méthoxyde de sodium en une quantité propre à donner un pH d'environ 7,2, de façon à précipiter direc- tement de la novobiocine monosodique cristalline.
Dans ce procédé, le mélange préféré de solvants organiques est un mélange 2:1 de méthanol et de benzène, étant donné que ce mélange de solvants procure un très bon rendement (ce rendement est couramment de plus de 80 % par rapport à la théorie), tandis qu'il permet aussi d'obtenir directement un produit de teinte convenable et de haute pureté.
Pour Inexécution du procédé, le méthoxyde de sodium est, de préférence, ajouté en solution méthanoli- que. Après l'addition de méthoxyde de sodium, our assu- rer la formation de cristaux, un supplément de solvant aromatique est, de préférence ajouté, tout en agitant, pour obtenir le sel monosodique cristallin. La quantité de solvant aromatique ainsi ajouté est avantageusement d'environ 5 à 8 fois la quantité de solvant aromatique présente dans le mélange initial de solvants. L'emploi de moins de 5 volumes environ de solvant aromatique supplé- mentaire ne produit pas l'augmentation désirée du rende- ment en produit cristallin, tandis que l'emploi de plus de
8 volumes environ du solvant aromatique supplémentaire tend à altérer la teinte du produit.
L'emploi d'un mélange 2:1 de méthanol et de benzène pendant la cristallisation paraît unique au point de vue de son efficacité à retenir les impuretés colorées, de manière à former un sel monosodique de novobiocine :cristallih blanc sensiblement pur. L'emploi d'un autre
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alcool, tel que l'éthanol oa le propanol, au lieu de métha nol pose déjà une partie du problème dû à la solubilité réduite de la novobiocine acide dans des mélanges de sol- vants contenant des alcools à plus de 4 atomes de carbone.
Bien que cette réduction de la solubilité puisse être com- pensée en utilisant de plus grandes quantités du mélange d' solvants, il est évident qu'il est préférable d'employer un mélange de solvants avec lequel le volume de solvant à manipuler peut être maintenu à un minimum.
L'emploi d'autres solvants aromatiques, tels que le toluène et le xylène, au lieu de benzène dans le mélange préféré de solvants est satisfaisait au point de vue du rendement, mais le produit isolé présente une tein- te quelque peu moins bonne.
En ce qui concerne le mélange préféré de sol- vants (méthanol-benzène 2:1), l'addition d'un supplément d'alcool jusqu'à un rapport d'environ 4;1 n'a pas d'effet défavorable sur le produit, mais n'a pas non plus d'effet bénéfique sur celui-ci, en sorte que cette addition est préférablement évitée, parce qu'elle augmente inutilement le volume de solvant à manipuler. Par ailleurs, une ré- duction de la proportion de méthanol jusqu'à un rapport sensiblement inférieur à 2:1 affecte défavorablement le procédé et doit être évitée.
Le procédé est avantageusement exécuté à tem- pérature ambiante, par exemple à environ 25 - 30 C. Après dissolution de la novobiocine acide libre dans le mélange de solvants, la solution est, de préférence, filtrée, par exemple sur du papier-filtre recouvert de terre à diato- mées comme adjuvant de filtration, pour éliminer toute ma tière non dissoute. Le méthoxyde de sodium fraîchement préparé dans du méthanol est également soumis, de préfé- rence, à une filtration, tout en étant maintenu à l'abri
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de l'air.
La solution de héchoxyde de sodium est grauuer- lement ajoutée à la solution de novobiocine acide, en agis tant, jusqu'à atteindre un pH d'environ 7,1, après quoi les quantités supplémentaires de solution de méthoxyde de sodium sont ajoutées avec précaution, tout en agitant, jus. qu'à obtention d'un pH de 7,2- 7,3,auquel la cristalli- sation commence. La bouillie de novobiocine monosodique cristalline est agitée pendant une heure environ.
On ajoute ensuite du benzène en quantité correspondant à en- viron 5 à 8,de préférence d'environ 7,5 fois le volume présent dans le mélange de solvants initial et on poursuit l'agitation pendant 1 heure environ. Le produit cristal- lin est alors séparé par filtration, lavé avec du benzène et débarrassé sensiblement du solvant résiduel;, tout en veillant à exclure l'humiDITé atmosphérique après quoi le gâteau de filtration est séché dans un four à vide à envi= ron 50 Co
La novobiocine monosodique cristalline résul- tante est soluble dans l'eau et présente une teinte presque purement blanche et une pureté de plus de 90 %.
Elle peut être utilisée comme telle dans maintes applications, sans purification ultérieure.
Les exemples suivants serviront à montrer com- ment le procédé suivant la présente invention peut être mis en pratique. Il est cependant à noter que l'exemple 1,qui. concerne simplement la préparation de la novobioci- ne acide de départ, appartient à l'état de la technique et ne fait pas partie de l'invention. Il est également à noter que ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLE I
Un flacon de Blake contenant 25 ml d'un miliei aqueux stérile à base de gélose contenant :
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1 % extrait de levure, 1 % dextrose, 0,12 % NaHPO4, 0,075 5 KH2PO4,
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0,05 % NigS0,7H20,
2 % gélose (agar), dissous dans de l'eau a été inoculé à l'aide d'une cuillex de terre provenant d'une culture en terre de Streptomyces spheroides MA-319 (NRRL 2449) et incubé à 26 C pendant 4 à 5 jours jusqu'à obtention d'une bonne sporulation.
20 ml d'eau stérile ont alors été introduits dans le flacon de Blake et les spores ont été mis en sus- pension par grattage. Environ 5 ml de la suspension de spores ont été introduits dans un flacon d'Erlenmeyer à chicane d'une capacité de 2 litres, contenant 750 ml d'un milieu aqueux stérile contenant : 0,3 % extrait de boeuf,
1,0 % hydrolysat de caséine (NZ amine),
10% dextrose,
0,5 % chlorure de sodium, et ayant un pH d'environ 7,2. Le flacon est alors bouché à l'aide d'un tampon de coton et incubé à 26 C sur un agitateur rotatif, pendant 48 heures.
La culture végétative ainsi préparée a alors été introduite dans un fermentateur en acier inoxydable d'une capacité de 50 gallons, contenant environ 25 - 30 gallons d'un milieu stérile à base d'extrait de boeuf pré, sentant la composition indiquée plus haut. Après addition d'une petite quantité d'une solution à 1 % d'octadécanol dans de l'huile minérale, à titre d'agent ahti-mousse, le milieu a été incubé à 26 C pendant 48 heures. Pendant cette période d'incubation, le milieu a été agité et on a fait passer de l'air dans le milieu à raison d'environ 3
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pieds cubiques par minute.
Un fermentateur en acier inoxydable d'une capa- cité de 200 gallons a alors été chargé d'environ 100 gal- lons d'un milieu aqueux contenant les ingrédients suivants
3 % farine de graines de soja (farine de soja nutrk- tive spéciale de Staley 4-5),
2 % dextrose
0,75% solubles de distillateur
0,25% chlorure de sodium.
Ce milieu avait un pH d'environ 7,1. Après stérilisation du milieu à l'aide de vapeur d'eau à envi- ron 120 C pendant 30 minutes et refroidissement, le fer- mentateur a été inoculé à l'aide d'environ 8,4 % de l'ino- culwn végétatif préparé dans le fermentateur de 50 gallons décrit plus haut. La charge est alors incubée à 26 C, en agitant et en aérant par passage d'air à raison de 12 pieds cubique par minute. Après 96 heures, le bouillon fermenté contenant de la novobiocine avait une activité d'environ 82 mcg par ml.
Après filtration de tout le bouillon à pH : 9,0, 5 livres anglaises de terre à diatomées (adjuvant de filtration :Hyflo Supercel) par 200 gallons de bouil- lon filtré ont été ajoutées. Le bouillon a été lentement acidifié jusqu'à un pH de 2,0 à l'aide d'acide chlorhydri- que. Après 10 minutes d'agitation, la charge a été fil- trée et le gâteau de filtration a été lavé à l'eau. On. n'a pas détecté d'antibiotique dans le filtrat acide Les matières solides précipitées (à l'exclusion de l'adjuvant de filtration) avaient une pureté d'environ 0,2 - Os3 %.
Le gâteau de filtration provenant de la préci- pitation acide a été extrait à deux reprises avec du mé- thanol aqueux à 85 % à un pH de 9,0, en utilisant environ 1/10é du volume du bouillon originel pour chaque extrac-
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tien. Cette extraction a permis de récupérer environ 80%
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de la bio-activité totale présente dans le bouillon. Les mât3Zre solides en solution avait une pureté de 1 à 1,5 %
La solution méthanolique aqueuse a été concen-
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trée jusqu'à obtention d'une solution aqueuse ayant envi- ron 1/lBè du volume de la solution méthanolique initiale.
Le ph'a-été ajusté à 9eO à l'aide de soude caustique et la solution a été extraite à deux reprises avec des volu- mes équivalents de n-butanol. Le rapport de distribution
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apareÙ-6- 'à pFi : 9eO est de 404#1 environ. Les matières sou lidos présentes dans l'extrait butanolique avaient une pureté le 4 à 6
3 L'extrait butanolique a été concentré jusqu'à 1/10é son volume originel at ajouté à 15 volumes d'eau
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.FI 0. On a ajouté environ 0,5 g/gallon de volume de bouillon originel d'adjuvant de filtration (Hyflo-Su- p,lercel)@et le pH a été lentement ramené à 2,0 par addition cy aeîde ,,c,41oxhydrique. Toite la bio-activité a été ainsi préétp4É$ée sur l'adjuvant de filtration et a été séparée par ixaâon.
La pureté des matières solides(à l'exclût jÀop dgr-liidjuyant de filtration) était d'environ 1 à 12%.
@ Le gâteau de filtration a été séché sous vide à 40 , c, broyé et trituré avec de l'éther de pétrole @
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(onvicop 180 - I00 ml pour les matières solides dérivées c,acs gallon de bouillon de fermentation) jusqu'à ce 19 soit incolore, Ceci élimine 20 à 25 po des e4terg so7...es présentes et élimine les produits de fer-- -N'entaf$n huileux inactifs qui restaient après le trait6;
' /µ%O% À4fµµç$ygf* Aucune bioactivité n'a été perdue par oettç fçttgration ot les matières solides restantes pré" ¯ 4#n%aS0iàù tx urté de 12 4 15 1> '.b.eau été extrait avec de l'éthanol onhy-
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dre jusqu'à ce que les extraits éthanoliques aient une . teinte jaune très claire. Ces extraits ont été combinés et concentrés jusqu'à obtenir une solution titrant 15 à 20 % de matières solides et présentant une activité d'en- viron 40.000 meg/cc. Cette matière solide avait une pure-* té de 20 à 30 % et titrait 200 à 300 mcg/mg de matière bioactive.
La solution éthanolique concentrée a été chro- matographiée sur de l'alumine lavée à l'acide. Un rapport d'alumine de 50 : 1, sur base du total de matières solides présent dans la solution de départ, doit être utilisé pour obtenir une purification satisfaisante. La matière active passe à travers la colonne, tandis qu'une grande quantité de la matièré solide étrangère présente reste sur la colonne. La colonne d'alumine a été lavée à l'aide d'éthanol, de manière à récupérer la novobiocine. Appro- ximativement 95 % de la bioactivité se trouvent dans
2,5 - 3 volumes de vides de la colonne.
TABLEAU I
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<tb> Volume <SEP> Bioassai
<tb> (cc) <SEP> (mcg/cc) <SEP> mg/cc <SEP> mcg./mg. <SEP> Tptal <SEP> unités
<tb>
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----- --------- ------ --------- ...¯..¯¯¯¯¯¯¯¯.
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<tb> Col. <SEP> Feed <SEP> 1000 <SEP> 44.000 <SEP> 265 <SEP> 166 <SEP> 220 <SEP> x <SEP> 106 <SEP>
<tb>
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Section 1 1000 92 2,5 37 0,46 x 106
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<tb> Section <SEP> II <SEP> 1000 <SEP> 8.400 <SEP> 19,6 <SEP> 428 <SEP> 42 <SEP> x <SEP> 106 <SEP>
<tb>
<tb> Section <SEP> III <SEP> 1000 <SEP> 15.
<SEP> 200 <SEP> 31,3 <SEP> 484 <SEP> 76 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
<tb> Section <SEP> IV <SEP> 1000 <SEP> 12.400 <SEP> 22,3 <SEP> 556 <SEP> 62 <SEP> x <SEP> 106 <SEP>
<tb>
<tb> Section <SEP> V <SEP> 1000 <SEP> 7.400 <SEP> 13,4 <SEP> 552 <SEP> 37 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
<tb> Section <SEP> VI <SEP> 1000 <SEP> 2.600 <SEP> 4,5 <SEP> 604 <SEP> 13 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
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Section VII 1.000 00 ¯la 690 4 J 5 x 106
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<tb> Moyenne <SEP> de <SEP> sections <SEP> 7000 <SEP> 6.700 <SEP> 13,2 <SEP> 504
<tb>
Volume d'alumine - 8.000 cc.
Vol.vides colonne- 2.600 cc. x (1ère couleur)
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@ Les liqueurs de lavage éthanoliques provenant 4 -la colonne d'alumine ont été concentrées jusqu'à environ 5 % de matières solides. On a ajouté de l'eau jusqu'à apparition d'un trouble, ce qui a nécessité un peu plus d'un volume équivalent d'eau, et l'antibiotique a été ad- mis à cristalliser. La cristallisation s'est effectuée très lentement. Après 5 jours, il restait encore jusqu'à 15 % de la bioactivité originelle dans les liqueurs surna geantes, Une agitation et/ou une variation de la tempéra. ture n'ont, comme on l'a constaté, que peu d'effet sur la vitesse de cristallisation.
Cette novobiocine cristal/ line titrait environ 500 à 600 mcg/mg de manière bioactiv
Cette matière cristalline a été dissoute dans de l'acétone anhydre, de façon à former une solution à 30 5. Cette solution a été traitée avec une quantité de charbon de bois activé (Darco Q-60) égale à deux fois le poids de la matière cristalline dissoute. Le charbon de bois a été séparé par filtration, et lavé à plusieurs re prises avec de l'acétone, de façon à diluer la solution jusqu'à une concentration d'environ 5 % de matières soli- des.
On a ajouté de l'éther de pétrole jusqu'à appari- tion d'un trouble et la novobiocine a été admise à cris- talliser. 90 à 95% de la bioactivité ont été récupérés et la novobiocine cristalline obtenue titrait 900 - 1. 000 mcg/mg de matière active.
D'autres procédés sont connus pour récupérer de la novobiocine acide de bouillons de fermentation. Il va de soi que n'importe quel procédé de récupération four nissant de la novobiocine acide d'une pureté de plus de 80 % environ peut être utilisé pour la transformation di- recte en sel monosodique cristallin de novobiocine, comme décrit dans l'exemple suivant.
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EXEMPLE 11 2350 ml de méthanol et 1175 ml de benzène ont été mélangés dans un flacon d'une capacité de 5 gallons 1175 g de novobiocine acide-libre ayant une pureté de 88,5% ont été ajoutés au mélange, en agitant, à 25 - 3o C. La solution a été filtrée sur un entonnoir Buchner garni d'un papier filtre recouvert de 15 g de terre à d.ia tomées (adjuvant de filtration ;Supercel). Le flacon a été rincé avec 450 ml d'un mélange 2 : 1 de méthanol et de benzène. Cette solution a servi à laver le filtre.
120 g de méthoxyde de sodium frais ont été dis- sous dans 1200 ml de méthanol. La solution légèrement trouble a été clarifiée par filtration sur du verre fritté revêtu de terre à diatomées (Supercel). Le filtrat clair a été maintenu à l'abri de l'air. La solution de métho- xyde de sodium a été ajoutée lentement à la solution de novobiocine en l'espace d'une demi-heure en agitant, jus-' qu'à obtention d'un pH de 7,1 On a ensuite ajouté avec:. précaution un supplément de solution de méthoxyde de so- dium jusqu'à obtention d'un pH de 7,2 à 7,3. A ce pH, la cristallisation a commencé. Environ 1150 ml de solu- tion de méthoxyde de sodium ont été nécessaires pour at- teindre le pH voulu.
La suspension de novobiocine sodi- que a été agitée pendant 1 heure à 25 - 30 C. 8.800 ml de benzène ont ensuite été ajoutés en l'espace de 10 minu- tes et l'agitation a été poursuivie pendant une seconde heure à 25 - 30 C.
La novobiocine monosodique cristalline a été séparée par filtration sur un filtre en porcelaine Lapp recouvert de papier. Le gâteau de filtration a été lavé avec 4 x 500 ml de benzène, en l'empâtant avant d'aspirer la liqueur de lavage et en maintenant à l'abri de l'humi- dité atmosphérique. Le gâteau a été séché dans un four à
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vide à 50 C.
E1%; 3070 a dans NaOH 0,1 N : 593
Rendement : 983 g (91,4 % de la théorie).
Dans le mode opératoire décrit ci-avant, on peut augmenter le rapport méthanol-benzène jusqu'à envi- ron 4;!, sans affecter le produit ou le rendement. Une diminution de la proportion de méthanol jusqu'à un rapport sensiblement inférieur à 2 :1 a, par contre, des effets préjudiciables et le rapport 2 : est considéré comme un rapport optimum pratique.
EXEMPLE III
On a suivi le mode opératoire de l'exemple II à petite échelle, en dissolvant initialement 5 g de novo- biocine acide dans des fractions de 15 cc de mélanges 2 : de méthanol-benzène, de méthanol-toluène et de méthanol- xylène. Chacune des solutions obtenues a été traitée avec du méthoxyde de sodium méthanolique, de manière à obtenir de la novobiocine moncsidique cristalline, de la manière décrite dans l'exemple II. Les rendements obtenus/dans ces essais comparatifs étaient respectivement de 3,15 g avec le benzène, de 2,95 g avec le toluène et de 3,60 g avec le xylène.
Le produit obtenu en utilisant du benzène était d'un blanc sensiblement pur, tandis que des impuretés co- lorées étaient présentes en quantités substantielles dans le produit obtenu en utilisant du toluène et que de plus grandes quantités encore d'impuretés colorées étament pré- sentes dans le produit obtenu en utilisant du xylène. Dans ces essais comparatifs les rendements étaient tous rela- tivement faibles par rapport aux rendements de 90 % ou davantage,obtenus lors de l'exécution du procédé à plus grande échelle.
EXEMPLE IV
En appliquant le mode opératoire de l'exemple
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II, mais en utilisant un mélange 2 si d'éthanol et de ben- zéne et unmélange 2 si d'isopropanol et de benzène, il a été impossible de dissoudre la même quantité de novobioci- ne acide que dans une quantité équivalente d'un mélange 2:1 de méthanol et de benzène. Il peut être -remédié à cet inconvénient, en employant une quantité plus grande du , acde mélange dolvants pour une quantité donnée/de novobiocine De même,en augmentant le rapport de l'alcool au benzène de 2;1 à environ 4;1, on peut augmenter quelque peu la so- lubilité de novobiocine acide.
Lorsque des solutions de novobiocine acide dans des mélanges éthanol-benzène et isopropanol-benzène sont traitées avec du méthoxyde de so- dium méthanolique,de la manière décrite dans l'exemple !! on obtient de la novobiocine monosidique cristalline de bonne couleur.
Bien que le mélange solvant de méthanol et de benzène (2:1) convienne le mieux dans le procédé suivant l'invention au point de vue de la pureté du produit et de l'efficacité dissolvante, il est à noter que les conditions optima d'un quelconque des mélanges de solvants décrits plus haut seront obtenues lorsque la proportion de novobiov cine acide par rapport aux solvants dans la solution de dé part est telle que l'on soit en présence d'une solution sensiblement saturée de novobiocine acide dans le mélange de solvants. Avec le mélange 2:1 de méthanol et de ben- zéne, une solution sensiblement saturée est obtenue en dissolvant de la novobiocine acide 4 raison d'environ 1 g dans 3 ml du mélange de solvants.
La quantité pré- cise de novobiocine anhydre à utiliser dans des cas parti- culiers sera influencée dans une-certaine mesure par la pureté de la novobiocine acide.
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