Procédé de préparation d'un 2-nitroimidazole
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de production de substances antibiotiques, à savoir l'azomycine et ses dérivés substitués par des groupes alcoyles de formule générale:
EMI1.1
où R représente un groupe alcoyle inférieur et n est un nombre entier de 0 à 2 inclusivement.
L'un des premiers buts de l'invention consiste à procurer un procédé avantageux de préparation de la substance antibiotique connue, c'est-à-dire de l'azomycine et de ses homologues ayant des activités antiprotozoaires.
On sait que l'azomycine est produite par un microorganisme appartenant à l'espèce Nocardia, dont de nombreux caractères ressemblent à ceux de Nocardia mesenterica, bien que l'identité des deux micro-organismes ne puisse pas être prouvée. Les caractéristiques physiologiques et de culture de la souche produisant l'azomycine sont indiquées dans Journal of Antibiotics, 7A, 53 (1954).
On a trouvé ensuite un autre micro-organisme produisant l'azomycine : on l'a dénommé Streptomyces eurocidicus [Journal of Antibiotics, 8A, 105 (1955)].
On a maintenant isolé à partir d'un échantillon de terre recueillie près d'Ivrea (Italie) un Streptomyces qui a été déposé à l'American Type Culture Collection où il a reçu le No 19551. Les caractéristiques de cette souche décrite ci-dessous, sont tout à fait similaires à celles de Streptomyces eurocidicus. En outre, on a découvert de manière surprenante que l'activité enzymatique de la nouvelle souche qui a été dénommée Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551, peut produire l'oxydation du groupe amino de certains composés aminohétérocycliques avec obtention d'un groupe nitro.
Cet effet permet de produire l'azomycine avec un rendement élevé par culture de Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551 dans un milieu de culture approprié et par introduction subséquente dans ce milieu de 2-aminoimidazole comme composé de départ, lequel peut être aisément préparé par des procédés connus.
En outre, on a découvert qu'on peut non seulement préparer l'azomycine par ce procédé, étant donné que lorsqu'on introduit un 2-aminoimidazole substitué de formule
EMI1.2
où R et n ont la signification ci-dessus, dans le milieu dans lequel Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans
ATCC 19551 produit l'oxydation de 2-aminoimidazole avec obtention de 2-nitroimidazole, il y a également production avec un rendement élevé des 2-nitroimidazoles substitués correspondants. Ceci constitue une amélioration très importante, étant donné que l'on sait que l'azomycine et ses dérivés substitués ne sont pas aisément préparés par des procédés chimiques.
Le procédé consiste principalement à ajouter le composé de départ au milieu de culture lorsque la fermentation a atteint un degré approprié et à poursuivre la fermentation à une température de 25 à 300 C pendant 12 à 72 h. On peut effectuer une légère modification par isolement et lavage du mycélium à un stade approprié de sa croissance et mise en suspension de celui-ci dans un milieu frais, auquel on ajoute alors le composé de départ. On utilise de préférence ce procédé lorsqu'on désire préparer des imidazoles substitués par des alcoyles, étant donné qu'il permet de faire décroître la formation simultanée d'azomycine et qu'il rend la purification finale plus aisée.
Les produits sont alors récupérés par des procédés classiques; la séparation et la purification sont réalisées soit par chromatographie soit plus avantageusement au moyen d'une cristallisation fractionnée.
On sait que les 2-nitroimidazoles alcoylés préparés selon la présente description présentent comme l'azomycine, une activité élevée contre Trichomonas vaginalis. Ils sont décrits par exemple dans I1 Farmaco,
Ed. Sci. 21 278 (1966) où on mentionne également des dérivés dont l'azote comportant un atome d'hydrogène est substitué par des groupes alcoyles. Il est évident que les 2-nitroimidazoles préparés selon la présente description peuvent être utiles comme composés intermédiaires pour l'obtention de 2-nitroimidazoles N-alcoylés, par des procédés tout à fait courants.
On décrit ci-dessous Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551.
Caractéristiques générales de Streptonzyces
eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551
à l'examen microscopique
Mycélium du substrat fin, ramifié abondamment, habituellement d'un diamètre de 0,8 à 1,0 micron. Mycélium aérien habituellement bien développé sur les milieux types, initialement blanc et devenant légèrement gris. Sporophores longs et ondulés; pas de formation de spirales.
On indique dans le tableau I les caractéristiques de culture de Streptotizyces eurocidicus var. nitroxydans
ATCC 19551. Les milieux de culture utilisés ont été préparés selon Waksman (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., 1961).
Les résultats des essais d'utilisation de carbone [Pridham et Gottlieb, J. Bacteriol., 56, 107-114 (1948)] sont indiqués dans le tableau II et on indique, enfin, dans le tableau III les résultats de quelques essais physiologiques.
Tableau I
Caractéristiques de culture de Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551
Pigment
Milieux Mycélium végétatif Mycélium aérien soluble agar de Croissance modérée, surface unie; Développement modéré et sporulation; absent
farine d'avoine transparent surface cotonneuse. blanche agar de Bennet Croissance modérée, surface unie; Développement modéré, brun clair
brun clair sporulation faible, surface cotonneuse;
gris cendre à gris agar de Czapeck-Dox Pas de croissance agar de Croissance modérée, surface unie; Développement modéré et sporulation; absent
pomme de terre hyalin surface cotonneuse, blanche tampon de Bonne croissance, plissé, hyalin Traces de mycélium, aérien blanc-gris: brun
pomme de terre pas de spores asparaginate Croissance modérée, surface unie;
Bon développement et sporulation;
de glucose hyalin surface cotonneuse, blanche asparaginate Croissance modérée, surface unie; Développement modéré et sporulation; jaune pâle
de glycérine jaunâtre surface cotonneuse, blanche à ambre agar nutritif Croissance modérée, surface unie; Absent brun
brun à rouge-brun avec nuance violet agar d'amidon Faible croissance, surface unie; hyalin Absent absent malate de Ca Pas de croissance absent agar de tyrosine Faible croissance, surface unie; hyalin Absent ambre albumine d'oeuf Faible croissance, surface unie; hyalin Développement modéré et sporulation; absent
surface cotonneuse. blanche agar de cellulose Pas de croissance
Tableau II
Utilisation des composés de carbone
par la souche Streptomyces eurocidicus var.
nitroxydans ATCC 19551
Sources de carbone
Arabinose .
Xylose
Glucose . + + + ttt
Galactose
Fructose . *
Mannose *
Rhamnose
Lactose
Maltose
Saccharose Raffinose
Glycérol . + + + : @ ttt
Sorbitol
Mannitol
Dulcitol
Insositol ++
Dextrine +++
Inuline
Amidon. ttt
Ribose +++
Sorbose
+++ bonne croissance
++ crosissance modérée
* faible croissance
- pas de croissance
Tableau 111
Caractéristiques physiologiques de la souche
Streptomyces euricidicus var. nitroxydans ATCC 19551
amidon hydrolysé
gélatine hydrolyse lente et partielle
nitrates non réduits
mélanine positif
lait de tournesol pas de modification
Les exemples non limitatifs suivants décrivent l'invention plus en détail.
Exemple 1
Préparation de 2-nitroimidazole
On inocule à un volume de 100 ml de milieu de culture de la composition suivante:
farine de soya 20 g
produit d'hydrolyse de caséine 2 g
chlorure de sodium 5 g
nitrate de sodium ... 5 g
maltose... 50 g
H2O . 1000 ml
(stérilisé par chauffage à 1200 C pendant 20 mn.;
pH après stérilisation 6,5); 5 % en volume d'un bouillon de fermentation préparé séparément par culture des spores de Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19551 dans un milieu de culture approprié. Le récipient est chauffé à 280 C sur un dispositif secoueur (200 tours/mn) et après 48 h, on ajoute du 2-aminoimidazole en une quantité de 100 γ/ml du milieu de culture.
On effectue la fermentation pendant 72 h dans les mêmes conditions, puis elle s'arrête; on rend le bouillon légèrement alcalin (pH = 8) avec de l'hydroxyde de sodium N et on le filtre sur un filtre approprié. On lave le mycélium de manière répétée à l'eau (pH = 8) qui est ajoutée au filtrat, qui est acidifié avec de l'acide chlorhydrique aqueux à 10%. On extrait trois fois la solution résultante avec le même volume d'acétate d'éthyle et on concentre la solution obtenue sous vide jusqu'à cristallisation d'un produit; il s'agit de l'azomycine, qui peut être purifiée par recristallisation ; le point est de 2830C.
Par addition de 100 y/ml de 2-aminoimidazole, on récupère une quantité de 2-nitroimidazole correspondant à une concentration de 170 γ/ml dans le bouillon de fermentation final. Une culture témoin à laquelle le 2aminoimidazole n'a pas été ajouté a conduit à une concentration de 68 γ/ml d'azomycine, de sorte que le rendement est de 74 /o.
Exemple 2
Préparation de 4(5)-méthyl-2 itrnimid'azole
A 100 ml du milieu de culture préparé et inoculé comme décrit dans l'exemple 1, on ajoute après 48 h de fermentation à 300 C une certaine quantité de 4(5)méthyl-2-aminoimidazole correspondant à 100 γ/ml.
Après 120 h, on extrait une quantité de 118 γ/ml de nitroimidazoles (c'est-à-dire comprenant à la fois du 2-nitroimidazole et du 4(5)-méthyl-2-nitroimidazole) du bouillon avec de l'acétate d'éthyle et on sépare au moyen d'une cristallisation fractionnée.
On obtient une quantité correspondant à 55 γ/ml de 4(5)-méthyl-2-nitroimidazole et de 64 'y/ml de 2-nitroimidazole. Le point de fusion du 4(5)-méthyl-2-nitroimidazole est de 2060 C.
Exemple 3
Préparation de 4(5)-méthyl-2 -nitroimidazole
On inocule à un récipient contenant 40 litres de milieu de culture de la composition suivante:
MgSO4 0,5 g
NH4NO3 10 g
KH2PO4 . . . . 0,624 g
Na2HPO4. 2H2O 0,376 g
CaCO3 10 g
glucose . . 90 g CuSO4 . SH2O 0,0033 g
FeSO4 . 7HO 0,01 g
ZnSO4. 7H2O 0,05 g
MnSO4. 4H2O 0,004 g
CoCl2 . 6H.2O . . . . . . 0,002 g
(NH4)6Mo7O24. 4H2O 0,001 g
H2O dist. . . . . 1000 ml
(stérilisée par chauffage à 1200 C pendant 15 mn;
pH après stérilisation: 6,2); 5 0/o en volume du bouillon d'inoculation. On maintient le milieu à 250 C et on l'agite mécaniquement à 500 tours/mn.
On produit l'aération en insufflant de l'air stérilisé à un débit de 0,5 litre de milieu par minute.
Après 48 h de fermentation, on filtre le mycélium, on le lave avec une solution tampon de phosphates et on le met en suspension dans 40 I de la même solution (elle
est tamponnée à pH 6,5). On ajoute alors une quantité de 6,7 g de 4(5)-méthyl-2-aminoimidazole et on effectue la fermentation dans les mêmes conditions que cidessus. Après 12 h, on extrait le bouillon à l'acétate d'éthyle et on effectue la séparation des produits par chromatographie sur une colonne à gel de silice et en utilisant un mélange de 1:1 d'éther diéthylique-éther de pétrole comme solvant d'élution.
On obtient une quantité de 4,5 g de 4(5)-méthyl-2nitroimidazole (52 /o), point de fusion 2060 C.
Exemple 4
Préparation de 4,5-diméthyl-2-nitrnimidazole
Ce composé est sensiblement préparé comme décrit ci-dessus dans l'exemple 2 pour le 4(5)-méthyl-2-nitroimidazole. Le point de fusion est de 2170 C.
Exemples 5 à 7
On prépare également par le même procédé que celui décrit dans les exemples ci-dessus, les 5-nitroimidazoles substitués suivants:
4(5)-éthyl-2-nitroimidazole, p. f. 152-154 C
4 (5)-propyl-2-nitroimidazole, p. f. 140-141 C 4(5)-isopropyl-2-nitroimidazole, p. f. 138-1390 C
On rappelle que lorsqu'un substituant unique est présent aux positions 4 et 5 du cycle de l'imidazole, il n'est pas possible d'indiquer sans ambiguïté cette position, étant donné qu'elles sont entièrement équivalentes.
Ceci est habituellement évité en indiquant que le substituant se trouve en position 4(5).