CH446615A

CH446615A - Procédé de préparation d'un antibiotique

Info

Publication number: CH446615A
Application number: CH1249564A
Authority: CH
Inventors: Sawada Jiro; Nakayoshi Hiroshi; Okumura Kazuo; Omura Sadafumi
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1964-09-25
Filing date: 1964-09-25
Publication date: 1967-11-15

Description


  Procédé de     préparation    d'un     antibiotique       La présente invention concerne la préparation d'un  nouvel antibiotique antifongique appelé     polcilline.     



  La     polcilline    est un produit de biosynthèse obtenu à  partir du bouillon de culture de la spore     productrice    de  bacilles :     Bacillus        subtilis    TPR-2201     (ATCC    No 15549).  



  C'est un composé acide, ayant la propriété de con  trarier la croissance de divers champignons et levures et  qui peut être     utilisé    en combinaison avec d'autres agents  antifongiques pour empêcher le développement de di  vers champignons et levures. Il peut être utilisé comme  agent antifongique contre les maladies des plantes.  



  Ce nouvel antibiotique, la     polcilline,    est chimique  ment et     biologiquement        différent    de tous les autres anti  biotiques connus. C'est un polypeptide contenant des       aminoacides    tels que     l'acide    aspartique, l'acide glutami  que, la     proline,    la     sérine    et la     tyrosine.     



  Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de la     pol-          cilline    dans le méthanol présente un maximum d'absorp  tion caractéristique entre 275 et 278     mtt    (E 1     /o=    13,8)  comme le montre la     fig.    1. Le spectre d'absorption dans  l'infrarouge de la     polcilline    dans le     KBr    est représenté  sur la     fig.    2 dans laquelle on porte la longueur d'onde  en     m#t    en abscisses et E     i    amen ordonnées. La concentra  tion en méthanol est 0,326 mg/ml.

   Le tracé du spectre  d'absorption dans l'infrarouge de la     polcilline    se carac  térise par des pics d'absorption dont les fréquences expri  mées en     cm-'    sont les suivantes : 3350, 2940, 2860,  <B>1</B>660, 1530, 1440, 1230 et 1065.  



  Si l'on considère sa solubilité dans les solvants orga  niques, ses réactions colorées, ses propriétés physiques et  son spectre     antimicrobien,    cet antibiotique (la     polcilline)    est  différent de la     fungistatine,    de l'antibiotique B 456, de la       bacillocine,    de la     mycosubtiline    et de la     mycobacilline     qui sont les antibiotiques les plus proches.

      Pour avoir plus de détails concernant ces antibioti  ques connus, se reporter à       Fungistatine   <I>(Antibiotique</I>     XG)     Hobby,     Gladys    L., p. p.     Regna,    N.     Dougherty     &   W. E.     Stieg    : The     antifungal        activity    of     Antibiotic          XG.    J.  



  Clin.     Invest.    28 : 927-933, 1949.  <I>Antibiotique B 456</I>       Yuzuru        Tanaka    :     Studies    on an     antifungal        antibiotic          produced        by    B.     subtilis,    The Journal of     Antibiotics,     séries B, 9 : 1-8, 1956.  



       Bacillocine     Brevet japonais     NI,    280185 déposé le       Mycosubtiline          Walton,    R. B.  &  H. B.     Woodruff    :     Mycosubtilin,     a     crystalline        antifungal    agent,     isolated        from        subtilin          broth.     



  J. Clin.     Invest.    28 :     924-926,    1949.       Mycobacilline          Majumdar,    S.. K., et S. K. Bose (1955a) :     Unter-          suchungen    über     das        Pilzwachstum        hemmende        Anti-          biotika.    1.

       Mitt.        Pilzwaschstum        hemmende        Mikro-          organismen        in        indischen        Fruchten    und     Pflanzen    : J.       Sci.        Tnd.        res.    (New-Delhi).     Sect.    C 14. 126-128     (en-          glisch).    Ref. in: Che.     Zbl.    128, 9416, 1957.  



  Cette nouvelle souche, le     Bacillus        Subtilis        TPR-2201,     qui peut être cultivée sur     milieu    solide, par exemple,  possède les propriétés     microbiologiques    suivantes  1. Sur un     bouillon    de culture, contenant de     l'agar-          agar    et du glucose, maintenu à     30()    C pendant 24 heures,  les cellules végétatives mesurent de 0,7 à 0,9 sur     1J     à 3,4 microns, possèdent une extrémité arrondie, et on  les rencontre isolées ou en chaînes.  



  2. Dans la phase logarithmique, les bâtonnets sont  doués de mouvement grâce à leur flagelle, mais     immo-          biles    dans la phase stationnaire. Après une     incubation         de 48 heures, les spores se détachent du sporange, les  spores en forme d'ellipsoïde. centrales ou proches de  l'extrémité, mesurent de 0,17 à 0,9 sur 1,3 à 1,7 microns.  3. Gram positif. rarement     gram    négatif.  



  4. Sur bouillon à base de     gelose    ou contenant de     l'agar-          a-ar    et du glucose, les colonies sont blanc jaunâtre, ter  nes. opaques. rugueuses, plates et ridées. En vieillissant,  elles deviennent couleur crème: on ne note aucune dif  fusion de pigments.  



  5.     Siries    sur     aelose    : développement disséminé sur  l'agar-agar, avec formation de     rhizoïdes    dans les stries  de la     gelose.     



  6. Sur     gelose    à la pomme de terre: développement  abondant, ridé et même grossièrement plissé, gluant, dis  séminé, blanc jaunâtre. absence de pigment.  



  7. Sur     gelose    au soja : développement abondant.  8. Sur     gelose    au lait: développement abondant.  



  9. Sur     gelose    contenant du glucose et de l'aspara  gine, ou du glucose et un nitrate ou encore de la       tyrosine    : développement abondant.  



  10. Sur plaque de gélatine striée : large zone  d'hydrolyse.  



  11. Repiquage sur gélatine : développement abon  dant en     surface,    blanc jaunâtre, sous     forme    de membra  nes. liquéfaction     stratiforme.    absence de pigment et de  précipitation.  



  12. Lait avec tournesol : le pH du lait s'abaisse jus  qu'à 5.0 et le milieu devient transparent après la pro  duction de peptone ; ceci entraîne une modification du  pH qui devient alcalin, le tournesol est décoloré, absen  ce de gaz et de pigment.  



  13. Bouillon : trouble au début. il devient     clair    et se  recouvre d'une membrane épaisse, ridée, cireuse, résis  tante. Production d'ammoniac.  



  14. Bouillon avec chlorure de sodium: bonne crois  sance pour une concentration en     NaCI    allant jusqu'à  8     %.        Développement        dans        quelques        cas        pour        une        con-          centration    de 10 Ù /o.  



  15. Nitrite : formé à partir de nitrates et aucune  formation de gaz à partir du bouillon contenant un  nitrate. dans des conditions anaérobies.  



  16. Formation d'acide: produit à partir du glucose,  du lactose, du     sucrose,    du glycérol et de dextrines par  culture en présence de sels d'ammonium ou de peptone  comme sources d'azote. Légère formation d'acide à par  tir du     xvlose    et de     l'arabinose.    On peut voir dans le  tableau I la comparaison avec d'autres souches.

    
EMI0002.0031     
  
    Tableau <SEP> I
<tb>  <I>Formation <SEP> d'acide</I>
<tb>  Hydroxy-3
<tb>  Xylose <SEP> Arabinose <SEP> buta-none-2
<tb>  Bacillus <SEP> subtilis <SEP> TPR-2201 <SEP> (-I-) <SEP> (-f-) <SEP>   Bacillus <SEP> subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> (-i-) <SEP> (-f-)
<tb>  Bacilus <SEP> subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> -@- <SEP> (-I-) <SEP> -f  Bacilus <SEP> subtilis <SEP> Tory-1 <SEP> -f-       Remarque :     +,        (-f-)    et - signifient positif, légère  ment positif et négatif, respectivement.  



  17.     Hydroxy-3        butanone-2    : ne se forme pas comme  le montre le tableau 1 ci-dessus.  



  18.     Indole    : non produit dans le bouillon à base de  peptone.    19. Le pH de développement du bouillon au glu  cose est compris entre 5,5 et 8,0. Le pH optimum pour  le développement est compris entre 6,0 et 7,0. La tem  pérature de croissance est de     45     C ou inférieure, et de  préférence comprise entre 32 et 37  C.  



  20. La durée de survie des spores à 100  C est de  30 minutes.  



  La comparaison de ces données     microbiologiques     caractéristiques de la souche TPR-2201 avec celles des  souches décrites dans le livre de     Bergey          Manual    of  Déterminative     Bacteriology      (7F édition), montre des  propriétés communes au     Bacillus        subtilis    à l'exception  de la légère formation d'acide à partir du     xylose    et de       l'arabinose    et de l'absence de production     d'hydroxy-3          butanone-2.     



  Le milieu de culture de cette souche, le     Bacillus          subtilis        TPR-2201,    contient des hydrates de carbone  pouvant fermenter. des composés azotés organiques ou  minéraux et quelques sels comme les sels présents au  cours d'une     fermentation    concernant d'autres spores  aérobies génératrices de     Bacillus.     



  La nouvelle souche produit la     polcilline    sur milieu  solide ou liquide, et l'activité maximum est obtenue au  bout de 48 à 72 heures.  



  Pour obtenir le nouvel antibiotique, la     polcilline,    à  partir du bouillon de culture, on peut utiliser, par exem  ple, des échangeurs d'ions à base de cellulose ou des       dextranes    ramifiés (par exemple: le     Sephadex    qui est  vendu comme absorbant sous cette marque par la Socié  té dite     Aktiebolaget        Pharmacia).    A titre de variante, on  peut utiliser un solvant organique tel que les alcools  ou de l'acétone humide pour extraire la     polcilline    à par  tir du filtrat de culture ou à partir du milieu de culture  solide.  



  On précipite les extraits à l'aide d'un solvant orga  nique tel que l'éther, etc., dans lequel la     polcilline    est  insoluble ou très légèrement soluble. On peut également  précipiter la     polcilline    en ajustant la valeur du pH de sa  solution aqueuse avec un acide ou une base, ou bien on  peut la précipiter par le sulfate d'ammonium. On     peut     ainsi récupérer le nouvel antibiotique, dit     polcilline.     



  La     polcilline    est une poudre amorphe blanche, qui  perd son activité vers 120  C et fond à 1480 C avec  décomposition.  



  Solubilité de la     polcilline    : soluble dans les alcools,  l'acétone humide et la     pyridine    ; insoluble dans l'éther,  l'acétone anhydre, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle,  le tétrachlorure de carbone, le chloroforme, le benzène,  le     dioxane    et l'éther de pétrole.  



  Réactions colorées : positives dans le cas de la réaction  du     biuret,    l'essai de     Millon,    la réaction     xanthoprotéique,     la réaction du     diazoïque    et la réaction du       Folin-          phénol      ; négatives par les essais d'Ehrlich, au chlorure  ferrique, de     Molisch,    de     Nylander,    à la     ninhydrine,    de       Benedict    et de Fehling.  



  Les résultats de la chromatographie sur papier cor  respondent à des valeurs du     Rf    égales à 0,84 et 0,85       lorsque        l'on        utilise        de        l'acétone    à     50%        et        de        l'éthanol     à 75 0/0, respectivement.

   La     polcilline    n'est pas désacti  vée par les enzymes protéolytiques telles que la pepsine,  la trypsine, la     chymotrysine,    la papaïne, la     pancréatine,     la       nagarse          (protéinase    produite par le     Bacillus        subti-          lis),    la     prozyme        (protéinase    fongique) et la     vernase        (pro-          téinase    fongique).  



  On ne peut     relarguer    la     polcilline    à l'aide du  chlorure de sodium, mais on peut la     relarguer    à l'aide  du sulfate d'ammonium, en neutralisant avec de l'am-           moniac.    La     polcilline    est précipitée par l'acide     trichloro-          acétique,    le chlorure mercurique et l'acétate de plomb.  



  Elle possède un point isoélectrique pour un pH voi  sin de 3. Par chromatographie sur papier,     ionophorèse     de     Tiselius    et par la méthode utilisant l'ultracentrifuga  tion, on trouve qu'il s'agit d'un composé unique.  



  Par chromatographie sur papier à deux dimensions,  on montre que la     polcilline    est un peptide acide conte  nant l'acide aspartique, l'acide glutamique, la     sérine,    la       proline    et la tyrosine (et, en particulier, elle contient  une grande proportion d'acide aspartique).  



  En solution tamponnée par le     Véronal    (pH 8,0), cet  antibiotique ne présente qu'un seul pic par     ionophorèse     de     Tiselius,    et par la méthode utilisant     l'ultra-centrifu-          gation.     



  Cette substance semble avoir une masse moléculaire  d'environ 73 000, car on trouve 5,0 S de<B><U> & 0 ,</U></B> la toxicité  orale de la     polcilline    est faible. La     DL5o    est de 1200       mg/kg    pour la souris.  



  Les toxicités par injection     intrapéritonéale    et par  injection intraveineuse sont respectivement égales à  49     mg/kg    et 38     mg/kg        (LD3o    sur la souris). Elle possède  une action hémolytique élevée.  



  Ce nouvel antibiotique, la     polcilline,    possède un lar  ge spectre     antimicrobien.    comme le montre le tableau 2  suivant.  
EMI0003.0024     
  
    Tabl-cau <SEP> 2
<tb>  <I>Spectre <SEP> antimicrobien <SEP> de <SEP> la <SEP> polcilline</I>
<tb>  Concentration
<tb>  inhibitrice <SEP> minimum
<tb>  Organisme <SEP> essayé <SEP> (meg/ml)
<tb>  1. <SEP> Penicilium <SEP> chrysogenum <SEP> 9
<tb>  2. <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> > <SEP> 200
<tb>  3. <SEP> Aspergillus <SEP> niger <SEP> > <SEP> 200
<tb>  4. <SEP> Aspergillus <SEP> flavus <SEP> 25
<tb>  5. <SEP> Trichophyton <SEP> interdigital <SEP> 6,25
<tb>  6. <SEP> Trichophyton <SEP> astéroïdes <SEP> 12,5
<tb>  7. <SEP> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 12,5
<tb>  8. <SEP> Piricularia <SEP> oryzae <SEP> 3,125
<tb>  9.

   <SEP> Epidermophyton <SEP> flocosum <SEP> 6,25
<tb>  10. <SEP> Microsporum <SEP> canis <SEP> 6,25
<tb>  <B>Il.</B> <SEP> Microsporum <SEP> sudouini <SEP> 6,25
<tb>  12. <SEP> Sporotrichum <SEP> schenekii <SEP> 50
<tb>  13. <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 25
<tb>  14. <SEP> Candida <SEP> japonica <SEP> 50
<tb>  15. <SEP> Candida <SEP> utilis <SEP> 25
<tb>  16. <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevislae <SEP> 6,25
<tb>  17. <SEP> Saccharomyces <SEP> salve <SEP> 50
<tb>  18. <SEP> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 6,25
<tb>  19. <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> > <SEP> 200
<tb>  20. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 200
<tb>  21. <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 200
<tb>  22. <SEP> Serratia <SEP> marcescens <SEP> > <SEP> 200
<tb>  23. <SEP> Shigella <SEP> flexneri <SEP> komagome <SEP> B <SEP> I <SEP> > <SEP> 200
<tb>  24.

   <SEP> Shigella <SEP> flexneri <SEP> komagone <SEP> B <SEP> II <SEP> > <SEP> 200
<tb>  25. <SEP> Salmonella <SEP> paratyphi-A <SEP> > <SEP> 200
<tb>  26. <SEP> Salmonella <SEP> paratyphi-B <SEP> > <SEP> 200
<tb>  27. <SEP> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> > <SEP> 200
<tb>  28. <SEP> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> HX-19 <SEP> > <SEP> 200
<tb>  29. <SEP> Sahnonella <SEP> typbi <SEP> H <SEP> 901 <SEP> 200
<tb>  30. <SEP> Sarcina <SEP> Lutea <SEP> 200
<tb>  31. <SEP> Klebsiella <SEP> pneumomae <SEP> 200     
EMI0003.0025     
  
    Concentration
<tb>  inhibitrice <SEP> minimum
<tb>  Organisme <SEP> essayé <SEP> (mcg/ml)
<tb>  32. <SEP> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 200
<tb>  33. <SEP> Gibberella <SEP> saubinettii <SEP> 25
<tb>  34. <SEP> Gloeosporium <SEP> lacticolor <SEP> 12,5
<tb>  35. <SEP> Cercospora <SEP> beticola <SEP> 25
<tb>  36.

   <SEP> Corticium <SEP> centrifugum <SEP> 6,25
<tb>  37. <SEP> Physalospora <SEP> sarcina <SEP> 50
<tb>  38. <SEP> Botrytis <SEP> fobae <SEP> 12,5
<tb>  39. <SEP> Phomopsis <SEP> sp. <SEP> 6,25
<tb>  40. <SEP> Cladosporium <SEP> colocasiae <SEP> 12,5
<tb>  41. <SEP> Ophiobolus <SEP> miyabeanus <SEP> 25
<tb>  42. <SEP> Fusarium <SEP> sp. <SEP> <B>115</B>
<tb>  43. <SEP> Hypochnus <SEP> sasakii <SEP> 12,5
<tb>  44. <SEP> Rhizoctonia <SEP> solani <SEP> 12,5
<tb>  45. <SEP> Alternaria <SEP> solani <SEP> 50       Ce spectre     antimicrobien    est déterminé par la mé  thode de dilution liquide.  



  La concentration inhibitrice minimum pour le     myco-          bactérium        tuberculosis    est étudiée après deux semaines  d'incubation, celle des autres bactéries après 24 heures  et celle des champignons et levures après 72 heures.  



  D'après les résultats concernant ces essais, la     pol-          cilline    se distingue nettement de toutes les autres sub  stances antifongiques et des autres antibiotiques connus.  



  Les exemples suivants sont des réalisations actuel  lement préférées de la présente invention :ils sont don  nés uniquement à titre d'illustration et ne doivent pas  être considérés comme limitant la présente invention.  



  Un échantillon de la souche     Bacillus        Subtilis    appe  lée TPR-2201 a été déposé dans la Collection Améri  caine de Types de Cultures, à Washington, et on a attri  bué, à la culture de ce micro-organisme, le No     ATCC     15549, le 30 juillet<B>1</B>965.  



       Exemple   <I>I</I>  Le     Bacillus        subtilis    TPR-2201 est soumis à la cul  ture pendant 72 heures à     30     C, sur un milieu de cul  ture solide contenant<B>100</B> grammes de son de blé et 200  grammes d'eau distillée<B>;</B> on obtient ainsi 0,5 gramme de  substance active pour 100 grammes de son de blé. Le son de  blé cultivé est extrait avec 900     cm3    d'acétone par agi  tation, suivie d'une filtration.  



  Le filtrat est concentré en vue d'éliminer l'acétone,  puis il est extrait avec 300     cm3    de     butanol.    Les extraits  dans le     butanol    sont concentrés sous vide et ramenés à  30     cm3.     



  Après refroidissement. la substance active est préci  pitée par addition de 300     cm3    d'éther anhydre refroidi à  la solution     butanolique    concentrée. Cette substance est  centrifugée, lavée à l'éther et séchée pour donner la     pol-          cilline    sous forme de poudre brute.  



  La solution de cette poudre dans 50     cm-'    de solution  tampon à 1/50 M de phosphate est passée sur une co  lonne de dextrine ramifié.  



  Le premier effluent brun est retenu sur l'échangeur  d'ion à base de cellulose. Pour éliminer les impuretés  brunes, la colonne est lavée de façon répétée avec des  portions de 200 cm- de solution tampon à base de phos  phate (pH 7,5) dont la concentration est progressive  ment amenée de 1/50 M à 1/5 M. La colonne est alors  lavée avec 300 ce d'eau distillée et la substance active           éluée    à l'aide de 100     crus    de méthanol.

   Après avoir con  centré les     éluats        méthanoliques    combinés contenant la  substance active, et avoir ajouté 50     cm3    d'eau distillée,  la solution aqueuse est extraite avec 50     cm3    de     butanol     et concentrée sous vide. La     polcilline    obtenue est préci  pitée par 10 volumes d'éther ; le précipité est centrifugé  et séché sous vide pour donner la     polcilline    solide  brune. Elle est alors broyée sous forme de poudre de       polcilline.    Le procédé donne 500 mg de     polcilline    puri  fiée pour 100 grammes de son de blé.  



  <I>Exemple 2</I>  Une goutte de la culture de     Bacillus        subtilis     TPR-2201 sert à ensemencer 100     cm3    d'un milieu de     cul-          ture        liquide        contenant    1     %        de        glucose        et    2     %        de        pep-          tone.    La culture est effectuée par agitation à 300 C  pendant 48 à 72 heures.

   Le pH du bouillon contenant  la     polcilline    est ajusté à une valeur de 3,0 à l'aide       d'HCI    N, ce qui la fait précipiter. Le précipité est filtré  avec de la terre d'infusoires (dit     Hyflo        Super-Cel    qui  est vendue comme agent de filtration par     Johns-Man-          ville    Co.), et le  gâteau   obtenu est lavé à l'eau distil  lée et séché. Le  gâteau   séché est réduit en poudre,  extrait avec 30 crus de méthanol pendant 24 heures à la  température ambiante (15 à     30     C) et filtré. Après con  centration du filtrat, on lui ajoute un petit volume  d'eau.  



  La solution aqueuse est extraite avec 20     cm3    de       butanol    et réduite à 5 crus. Le matériau concentré est  précipité par 10 volumes d'éther. Ce précipité est cen  trifugé et séché sous vide pour donner la poudre de       polcilline.    On effectue une chromatographie sur colonne  comme cela est décrit dans l'exemple No 1. Ce procédé    conduit à 48 mg de poudre blanche de     polcilline    avec       un        rendement        de        80        %.

Claims

REVENDICATION Procédé de préparation de la polcilline, caractérisé en ce qu'il comprend la culture du Bacillus subtilis TPR-2201 sur un milieu de culture solide ou liquide contenant des hydrates de carbone, un composé azoté minéral ou organique et des sels minéraux, à une tempé rature de 300 C pendant 48 à 72 heures, la récupération du mélange contenant la polcilline ainsi produit à partir du milieu et la séparation de la polcilline dudit mélange. SOUS-REVENDICATIONS 1.

Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le Bacillus subtilis TPR-2201 est cultivé sur un milieu de culture solide contenant du son de blé et de l'eau distillée, à une température de 30 C pendant 72 heures. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le milieu de culture solide contient 100 g de son de blé pour 200 g d'eau distillée. 3. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le Bacillus subtilis TPR-2201 est cultivé sur un milieu de culture liquide contenant du glucose et des peptones, à une température de 30 C pendant 48 à 72 heures. 4.

Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le milieu de culture liquide contient 1% de glucose et 2 % de peptones.