KR790001337B1 - 가디마이신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

가디마이신의 제조방법

제 1 도는 가디마이신(일나트륨염)의 U.V. 흡수스펙트럼을 나타낸 것이고,

제 2 도는 가디마이신(일나트륨염)의 IR 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 악티노플라네스 속에 속하는 균주를 발효시켜 얻은 새로운 과의 항생물질을 제조 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 이들 항생물질들은 차후 메타볼라이트 A, 메타볼라트 B 및 메타볼라이트 C로 명명되며 메타볼라이트 B는 또한 가디마이신으로 명명된다.

전술한 바와 같이 항생물질들은 악티노플라네스 속에 속하는 균주를 발효 배양시켜 제조한다. 이들 균주들은 이태리 테모시지방 및 인도의 카바디 브리지 지방에서 채취한 토양샘플로부터 분리한 균주의 채취번호는 A/10,889이며 이들은 각각 번호 31,038 및 31, 049로서 양도되어 ATCC의 스톡크컬쳐콜렉션의 일부가 되었다.

새로운 항생물질을 제조시 선택된 균은 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유하는 수용성 영양배지 중에서 호기성 조건하에서 배양시킨다. 통상으로는 기본량의 항생물질이 생길 때까지 진탕홀라스크 중에서 미리 균을 배양시킨 다음 이 배양액을 영양발효배지를 함유하는 발효물질에 접종시킨다. 호기성 조건하 25-35℃에서 충분히 배양시켜 기본량의 항생물질을 얻는다. 이때 한천분산법을 사용하여 미생물검정시험을 하여 생성된 항생물질의 농도를 조절한다. 시험균으로서는 사르시나루테아를 사용한다.

이렇게 얻은 항생물질은 항생물질이 녹을 수 있으며 수용성 배지와 혼화되지 않는 유기용매로 추출하는 것과 같은 방법으로 발효배양액으로부터 분리할 수 있다. 이때 유기용매는 C₃-C₆저급 알카놀 및 (C₁-C₄)-저급할로겐화 탄화수소를 사용하는 것이 유익하다.

수용성 배지로부터 유기층을 분리하고 소량으로 농축한 후 침전이 생성될 때까지 저온에서 10-15시간 방치한다.

여과하여 침전을 회수한 후 화트만페이퍼 No.1에서 페이퍼크로마토그라피 및 실리카겔상에서 박층크로마토그라피법을 수행하여 적어도 2개의 활성물질 즉 메타볼라이트 A 및 메타볼라이트 B가 존재하며 메타볼라이트 B가 더 많은 량 존재함을 측정할 수 있다. 이때 검정균으로서는 스타필로코쿠스 아우레우스를 사용하였다(니콜라우수 등, Ⅰl 파마코, Ed. Prat., 8, 350-370, 1961).

이들 두 성분은 용출용매계의 성질에 따라 R_f치가 달라진다. 메타볼라이트 A 및 B는 두가지 항생물질의 분배계수가 다른 용매계로 수호 역류추출하여 순수한 화합물로서 정제, 분리해도 좋다.

이때 메타볼라이트 B는 일나트륨염으로서 회수되며 알카리나 알카리토금속으로 처리하여 다른 염으로 전환시키거나 통상의 방법으로 대응하는 유리산으로 전환시킬 수 있다.

부타놀 추출액으로부터 얻은 모액은 예를 들면 휘발유같은 불활성, 비극성 용매에 넣어 침전시킨 다음 전술한 바와 같이 크로마토그라피법 및 미생물시험을 수행할 때 하나의 생성물, 즉 메타볼라이트 C로 이루어져 있음을 알 수 있다(같은 용출용매계를 사용시 R_f치가 다르므로, 메타볼라이트 A 및 B와 다른 물질임을 알 수 있다).

메타볼라이트 A, B 및 C의 크로마토그라피 패턴은 후술하겠다. 메타볼라이트 A, 메타볼라이트 B 뿐만 아니라 그들의 알카리금속 알카리토금속염 및 메타볼라이트 C는 생체내 및 시험관내 시험에서 탁월한 항생작용을 나타낸다.

특히 가디마이신은 다음 표에서 알 수 있는 바와 같이 여러가지 병원성 미생물의 성장을 저해하는 항생물질의 최소농도인 1-50㎍/ml에서 그람양성 박테리아에 대하여 특히 현저한 시험관내 항생작용을 나타낸다.

[표 1]

항생물질 가디마이신의 또 하나의 특징은 임상적으로 분리한 스트렙토코쿠스 균주에 대하여 활성이 있는 것이다.

[표 2]

더욱이 가디마이신은 디플로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 속의 병원성 박테리아에 의하여 일어나는 생쥐의 감염증에 대하여 매우 흥미있는 생체내 작용을 나타낸다. 다음 표는 스트렙토코쿠스 해몰리티쿠스 C 203 및 디플로코쿠스 뉴모니애 UC 41에 의하여 생긴 감염증에 대한 가디마이신의 ED₅₀값을 나타낸 것이다.

[표 3]

항생물질 가디마이신은 I.D₅₉값이 1,000mg/kg(복강내 주사) 및 2,000mg/kg(정맥내 주사)보다 더 높기 때문에 독성이 적다. 다음은 생성된 균주에 대해 설명한 것이다.

[균주 A/6353]

이 균은 여러가지 한천배지에서 잘 자란다. 오트밀한천 배지에서 직경 약 5mm인 콜로니는 가운데가 잘룩하게 들어간 형태로 자라며 호기성균사체는 항상 없다. 포자낭은 배지에 따라 모양 및 크기는 다르나 오트밀 한천, 글리세롤 아스파라긴 한천 및 챠펙크 글루코즈 한천배지에서 빽빽하게 자란다.

오트밀 한천배지에서 그들의 외형은 일정하며 형태는 구형내지 타원형이다. 포자낭의 크기는 15-25μ이며 포자는 운동성이 있으며 직경 1.5-2μ인 타원형이다. 황색 가용성 색소는 여러 배지에서 생성된다.

[악티노플라네스 A/10,889]

이 균은 여러가지 영양한천 배지에서 잘 자란다. 표면은 불투명하며 보통 거칠고 주름이 져 있다. 호기성 균사체는 보통 없으나 어떤 배지에서는 호기성 균사체의 흔적을 찾아볼 수 있다.

미량으로 조사할 때 식물성 균사체는 직경 1μ 이하로 약간 가지나 나와 있다.

포자낭은 보통 말레인산 칼슘한천 배지에서만 자라며 직경 7.2-12.0μ이며 표면이 불규칙한 구형이다. 포자낭벽이 파열된 후 포자낭이 분리되는 것을 관찰할 수 있다. 거의 구형인 포자들은 운동성이 있다(직경 1.0-1.5μ).

표 4는 두 균주의 형태학적 특성을 비교한 것이다.

[표 4]

표 5는 셜링 및 고트리브(Interm. I. Syst. Bad. 16, 313-340, 1966)가 제안한 여러가지 표준배지 및 왁스만이 제안한 다른 배지(더 악티노마이세테스, Vol. Ⅱ, 더 윌리암스 앤드윌킨스회사 1961)에서 배양시킬 때의 악티노플라네스 A/6353 및 악티노플라네스 A/10,889의 배양특성을 기록한 것이다. 배양특성은 30℃에서 6-14일간 배양시킨 후 측정한 것이다.

[표 5]

배양배지의 번호는 셜링 및 고트리브의 문헌을 참조한 것이다.

콜로니가 생성하는 가장 편리한 온도는 18-42℃이며 최적 온도는 28℃-37℃ 이다.

표 6은 피리담 및 고트리브의 방법에 따라 조사한 탄소원 이용도를 기록한 것이다.

[표 6]

표 7은 두 균주의 생리학적 특성을 나타낸 것이다.

[표 7]

두 균주 A/6353 및 A/10,889는 그들의 구형포자낭 운동성 포자 및 클로니 형태 때문에 악티노플라네스 속에 하기도 하나 그들은 여러가지 한천배지에서 생장, 가용성 색소의 생산 및 비생산, 탄소이용도 양상 및 생리학적인 특성들을 따져볼 때 명백하게 서로 다르다.

특히 A/6,353은 모든 악티노플라네스 층이 이용하는 서당을 비롯하여 배당체 결합을 가수분해하는 능력이 매우 제한되어 있다. 또한 A/10,889는 악티노플라네스 중에서는 찾아볼 수 없는 호기성 균사체 흔적을 생산한다. 이들 두 균주는 또한 기존의 모든 악티노플라네스와 쉽게 구별된다. 이러한 이유로 균주 A/6,353 및 균주 A/10,889는 새로운 종의 악티노플라네스로서 인식되며 각각 악티노플라네스 리구리에 ATCC 31,048 및 악티노플라네스 가바디넨시스 ATCC 31,049로서 명명된다.

[실시예 1]

항생물질의 제조 및 여러가지 대사물질의 분리

항생물질을 제조하기 위하여 기본량의 항생물질이 생성될 때까지 영양배지 중에서 균주 악티노플라네스 가바디넨시스 ATCC 31,049를 호기건조하 미리 배양시킨다. 진탕 훌라스크 배양배지는 예를들면 다음과 같은 조성물로 구성된다(g/ℓ).

약 28-30℃에서 약 24시간 훌라스크를 진탕한 다음 미리 배양시킨 것(1리터)을 각각 다음과 같은 영양배지 10ℓ를 함유하는 쟈포멘터에 접종시킨다.

발효시킨 물질들을 호기성 조건하 28-30℃에서 교반하여 배양시킨다.

일정한 간격을 두고 시험균으로서 사르시나 루테아를 사용하여 한천확산법으로 항생물질의 함량을 미생물학적으로 검정한다. 발효시킨지 96-120시간 후에 항생물질이 가장 많이 생긴다.

발효배양액을 pH 8.0으로 맞춘 다음 여과 보조제로서 하이플로 슈퍼-셀을 사용하여 여과한다. 균사체를 버리고 여액을 약 1/2량에 해당하는 부타놀로 추출한다. 유기층을 수층과 분리하고 산성수(pH 4.0)로 세척한 후 약 1/10량으로 농축시킨다. 3-6℃에서 10-12시간 방치하여 생긴 조침전을 여지상에서 모으고 부타놀로 세척 후 실온, 진공에서 건조시킨다.

수율 : 3.0g

이 조 침전을 실리카겔에서나 화트만페이퍼 No.1에서 크로마토그라프시키고 계속해서 검정균으로서 스타필로코쿠스 아우레우스를 사용하여 스포트를 미생물학적으로 전개시켜 검정한다. 메타볼라이트 A 및 메타볼라이트 B(가디마이신)인 두 성분이 함유되어 있음을 알 수 있다. 이들의 R_f치는 사용한 용출용매계의 성질에 따라 다르다.

조 혼합물은 약 30ml의 물에 녹여 더 정제한다.

생성된 용액을 증류수로 약 16시간 동안 투석시킨 다음 진공에서 소량으로 농축시킨다. 여전히 메타볼라이트 A 및 가디마이신과의 혼합물인 항생물질 1.5g을 수득한다. 두가지 항생물질들은 사용된 용매계내에서 성분 A 및 가디마이신의 분배계수가 다른 것을 이용하여 여러가지 역류추출법으로 분리정제한다. 사용된 용매계는 부타놀 : 인산나트륨-인산칼륨 완충액(1/15몰, pH 7.2) : 헥산(1 : 1 : 0.1)으로 이루어지며 메타볼라이트 A 및 가디마이신의 분배계수는 각각 0.3 및 0.8이다.

100번 추출한 후 0.450g의 가디마이신을 일나트륨으로서 수득한다.

메타볼라이트 A 및 B의 혼합물을 침전시킨 후 부타놀추출액으로부터 모액을 분리하여 소량으로 더 농축시키고 과량의 휘발유에 쏟아 놓는다.

쉽게 침전이 생성되며 이것을 여과하여 회수한다. 전술한 바와 같은 조건하에서 크로마토그라피법을 수행하여 같은 용출용매계에서 매타볼라이트 A 및 B와는 다른 R_f치를 갖는 하나의 생성물로 이루어져 있음을 알 수 있다. 이것을 메타볼라이트 C라 명명한다.

다음 표는 여러가지 용출용매계 중에서 3메타볼라이트의 크로마토그라피 패턴이 다른 것을 기록한 것이다.

메타볼라이트 A, 메타볼라이트 B(가디마이신) 및 메타볼라이트 C의 크로마토그라피 패턴

실리카겔상에서의 층크로마토그라피

황산 및 바닐린으로 스폿트를 발색시키고

스타필로코쿠스 아우레우스상에서 미생물학적으로 전개

[실시예 2]

실시예 1에서와 같이 조작하여 균주 악티노플라네스 리구리에 ATCC 31,048을 호기조건하 약 28-30℃에서 130-170시간 배양시킨다.

메타볼라이트 A 및 메타볼라이트 B(가디마이신)의 혼합물인 항생물질 1.4g을 수득한다. 실시예 1에서와 같은 크로마토그라피 검정법으로 두가지 메타볼라이트가 있음을 알 수 있다. 실시예 1에서와 같이 생성된 항생물질을 분리 및 정제한다. 0.2그람의 가디마이신을 일나트륨염으로서 수득한다.

[가디마이신(일나트륨염)의 물리-화학적 성질]

가디마이신(일나트륨염)은 양성백색 비결정성분이다. 등전점은 4.2이다.

120℃ 밀폐된 훤넬내에서 6N 염산 중에서 16시간 가수분해시키고 가수분해 생성물을 크로마크라피법으로 검정할 때 다음과 같은 아미노산, 발린, 세린, 글라이신, 글루타민산, 이소러이신, 러이신 및 알라닌이 함유되어 있음을 알 수 있다. 110℃ 밀폐된 훤넬내에서 수산화바륨으로 15시간 알카리성 가수분해하고 이 가수분해물질을 크로마토그라피 검정한 후 트립토판이 있음을 알 수 있다.

전술한 아미노산들은 다음과 같은 비율로 존재한다.

더욱이, 산가수분해하여 얻은 생성물을 검정할 때 일부는 유황을 함유하며 구조가 불분명한 아미노산들이 함유되어 있음을 알 수 있다. 또한 가디마이신(일나트륨염)은 다음과 같은 성질로 인해 특징지워진다.

1) 융 점 : 260℃(분해)

2) 분 자 량 : 2,005-2,168

3) 원소분석 : C=48.7-48.6% : H 6.7-6.6% : N=11.8-12.2%

S=5.3-5.5% : Na=1.1% : H₂O=3.6-3.3%

4) U.V. 흡수밴드

다음과 같은 각각의 용매계에서의 가디마이신의 흡수밴드

스펙트럼의 완전한 양상은 제 1 도와 같다.

5) IR 스펙트럼 : 뉴올에서의 특징적인 흡수밴드

cm^-1): 3,280, 2,920-2,840(뉴올), 1,650, 1,520, 1,455(뉴올), 1,375(뉴올), 1,260, 1,045, 990, 720

스펙트럼의 완전한 양상은 제 2 도와 같다.

6) 비선광도

=-44°(C=0.5% 디메틸포름아마이드)

7) 용해도

물, 중탄산나트륨수용액, 수산화알카리의 묽은 수용액, 뜨거운 메타놀, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 빙초산에 녹음.

묽은 무기산, 벤젠, 아세톤, 클로로포름, 사염화탄소, (C_2-6)-지방족알카놀, 테트라하이드로후란에는 난용성임.

8) 특수한 반응

휄링반응 +

톨렌반응 +

KMnO₄+

진한황산 +

닌히드린 -

FeCl₃-

밀론 -

쉬프 -

말톨 -

9) 전리함수는 pka=7.1(물), pka=8.5(메틸셀로솔브 : 물 16 : 4)

10) 더욱이, 가디마이신의 일나트륨염으로부터 다음 유도체들을 제조할 수 있다.

가) 가디마이신유리산

1.0g의 가디마이신 인나트륨염을 150ml의 물에 녹이고 생성된 용액에 10% 염산수용액을 가하여 pH 2.5로 조절한 후 물로 포화시킨 부타놀 75ml로 추출한다. 부타놀추출액을 모으고 45℃ 진공에서 처음의 1/20량이 될 때까지 농축시킨다. 4℃에서 12시간 방치한 후 생성된 침전을 모으고 휘발유로 세척, 40-45℃, 진공에서 건조시켜, 0.950g의 생성물을 수득한다(250-300℃에서 분해).

나) 가디마이신 2나트륨염

1.0g의 가디마이신 일나트륨염을 150ml의 물에 녹이고 0.1N-수산화나트륨을 가하여 생성된 용액의 pH를 9.6으로 조절한 다음 동견건조시킨다.

융점 250℃인 생성물 0.900g을 수득한다.

다) 가디마이신칼슘염

0.3g의 가디마이신 일나트륨염을 20ml의 물에 녹이고 생성된 용액에 교반하며 완전히 침전이 생길 때까지 염화칼슘 포화용액을 여러번에 나누어 서서히 가한다. 생성된 고체를 여과, 진공에서 탈수 후 10ml의 아세톤에서 녹인다. 20ml의 디에틸에테르에 쏟아넣어 생성된 침전을 여과, 40-45℃, 진공에서 건조시킨다. 330-340℃에서 분해하는 생성물 0.2g을 수득한다.

Claims (1)

1. 악티노플라네스 가바디넨시스(ATCC 31,049), 악티노플라네스 리구리애(ATCC 31,048) 및 그들의 당량체로부터 선택한 하나의 균주를 호기성 조건하 탄소원, 질소원 및 무기염을 함유하는 수용성 영양배지 중에서 기본량의 항생물질이 배지중에 생성될 때까지 배양시키고 회수한 후 각각 분리하여 항생물질인 가디마이신을 제조하는 방법.

Images