DE1695364B1

DE1695364B1 - Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazolen

Info

Publication number: DE1695364B1
Application number: DE19671695364
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Lancini; Piero Sensi
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1966-05-18
Filing date: 1967-05-17
Publication date: 1972-02-03
Also published as: AT269873B; NL6706501A; JPS4824277B1; GB1177084A; US3620920A; CH464942A

Description

in der R und η die oben angegebene Bedeutung haben, zu dem Medium, in dem Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 die Oxydation von 2-Aminoimidazol zu 2-Nitroimidazol bewirkt, auch die entsprechenden substituierten 2-Nitroimidazole in hoher Ausbeute erzeugt werden. Dies ist ein sehr wertvoller Fortschritt, da 2-Nitroimidazoe und seine sub-

stituierten Derivate bekanntlich durch chemische Verfahren nicht leicht hergestellt werden können. Das Verfahren besteht in der Hauptsache darin, daß man die Ausgangsverbindung dem Kulturmedium nach etwa 48 Stunden zusetzt, wenn die Fermentation einen· geeigneten Grad erreicht hat, und die Fermentierung bei einer Temperatur von 25 bis 30⁰C für die Dauer von 12 bis 72 Stunden fortsetzt. Eine leichte Abwandlung dieser Methode kann vorgenommen werden, indem man das Mycel in einer geeigneten Stufe seines Wachstums isoliert und wäscht und es in einem frischen Medium suspendiert, dem dann die Ausgangsverbindung zugesetzt wird. Dieses Verfahren wird vorzugsweise angewendet, wenn alkylsubstituierte Imidazole hergestellt werden sollen, da es die Verringerung der gleichzeitigen Bildung von Azomycin gestattet und die endgültige Reinigung erleichtert.

Die Produkte werden dann nach üblichen Verfahren gewonnen; die Trennung und Reinigung erfolgt entweder chromatographisch oder vorteilhafter durch fraktionierte Kristallisation.

Die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten alkylierten 2-Nitroimidazole besitzen bekanntlich wie 2-Nitroimidazol selbst (Azomycin) eine hohe Wirksamkeit gegen Trichomonas vaginalis. Sie sind beispielsweise in Il Farmaco, Ed. Sei., 21 (1966), S. 278, beschrieben, wo auch von Derivaten berichtet wird, bei denen Alkylgruppen aus dem Stickstoffatom substituiert sind, das ein Wasserstoffatom trägt. Es liegt auf der Hand, daß die nach vorliegendem Verfahren hergestellten 2-Nitroimidazole auch als Zwischenprodukte für die Herstellung der N-alkylierten 2-Nitroimidazole nach üblichen Verfahren nützlich sein können.

Streptomyces euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 wird nachstehend beschrieben.

Allgemeine Eigenschaften von Streptomyces

euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551

bei mikroskopischer Untersuchung

Substralmycel fein, üppig verzweigt, gewöhnlich mit einem Durchmesser von 0,8 bis 1,0 μ Luftmycel gewöhnlich auf den Standardmedien gut entwickelt, anfänglich weiß, dann hellgrau. Sporophoren lang und wellig; keine Bildung von Spiralen.

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften von Streptomyces euroeidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 angegeben. Die verwendeten Kulturmedien wurden nach Waksman (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2, 1961, The Williams and Wilkins Co.), hergestellt. Die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungstests (P r i d h a m und Gottlieb, J. B act er iol., Bd. 56 [1948], S. 107 bis 114), sind in Tabelle II angegeben, und in Tabelle III sind schließlich die Ergebnisse einiger physiologischer Tests aufgeführt.

Tabelle I
Kultureigenschaften von Streptomyces eurocidius var. nitroxydans ATCC 19551

Medien	Vegetatives Mycel	Luftmycel	Lösliches Pigment
Hafermehlagar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Bennets Agar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung, schlechte	Hellbraun
	Oberfläche, hellbraun	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, aschgrau bis grau
Czapeck-Dox-Agar	kein Wachstum
Kartoffelagar	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Kartoffelpfropfen	gutes Wachstum, faltig, Hyalin	Spuren von grauweißem Luft	Braun
		mycel; keine Sporen
Glukoseasparagin	mäßiges Wachstum, glatte	gute Entwicklung und Sporen
	Oberfläche, Hyalin	bildung, wattige Oberfläche
		weiß
Glycerinasparagin	mäßiges Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	Blaßgelb bis
	Oberfläche, gelblich	Sporenbildung, wattige	bernstein
		Oberfläche, weiß	farben
Nähragar	mäßiges Wachstum, glatte	abwesend	Braun
	Oberfläche, braun bis rot
	braun mit violettem Ton
Stärkeagar	schlechtes Wachstum, glatte	abwesend	abwesend
	Oberfläche, Hyalin
Ca-Malat	kein Wachstum
Tyrosinagar	schlechtes Wachstum, glatte	abwesend	bernsteinfarben
	Oberfläche, Hyalin
Eialbumin "	schlechtes Wachstum, glatte	mäßige Entwicklung und	abwesend
	Oberfläche, Hyalin	Sporenbildung, wattige
		Oberfläche, weiß
Zelluloseagar	kein Wachstum

Tabelle II

Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch den Stamm Streptomyces eurocidicus

var. nitroxydans ATCC 19 551

Kohlenstoffquellen

Arabinose —

Xylose —

Glukose + + +

Galactose —

Fructose ±

Mannose ±

Rhamnose —

Lactose —

Maltose —

Sucrose —

Raffinose —

Glycerin + + +

Sorbit —

Mannit —

Dulcit -

Inosit + +

Dextrin + + +

Inulin —

Stärke + + +

Ribose + + +

Sorbose —

+ + + gutes Wachstum; + + mäßiges Wachstum; ± spärliches Wachstum; — kein Wachstum.

Tabelle III

Physiologische Eigenschaften des Stammes Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans

ATCC 19 551

	Ergebnis
Stärke	hydrolysiert langsame und teilweise Hydrolyse nicht reduziert positiv keine Veränderungen
Gelatine
Nitrate
Melanin..
Lackmusmilch

35

40

45 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von 2-Nitroimidazol

Ein Volumen von 100 ecm Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung

Sojabohnenmehl 20 g

Kaseinhydrolysat 2 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat 5 g

Maltose 50 g

H₂O 1000 ecm

(durch Erhitzung bei 120⁰C für die Dauer von 20 Minuten sterilisiert; pH-Wert nach der Sterilisation 6,5)

wird mit 5 Volumprozent der Gärungsbrühe geimpft, die getrennt durch Kultivieren der Sporen von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 in einem geeigneten Kulturmedium hergestellt worden ist. Das Gefäß wird bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung (200 U/Minute) erhitzt, und nach 48 Stunden wird 2-Aminoimidazol in einer Menge von 100 y/ccm des Kulturmediums zugegeben. Die Fermentierung wird 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt; dann hört sie auf. Die Brühe wird mit n-NaOH-Lösung leicht alkalisch gestellt (pH = 8) und auf einem geeigneten Filter filtriert. Das Mycel wird wiederholt mit Wasser (pH-Wert 8) gewaschen, welches dem Filtrat zugesetzt, wird, das mit 10%iger wäßriger Salzsäure angesäuert wird. Die erhaltene Lösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert, und die erhaltene Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis ein Produkt auskristallisiert. Dieses ist 2-Nitroimidazol, das durch Umkristallisieren gereinigt werden kann. Der Schmelzpunkt ist 283⁰C.

Bei Zugabe von 100 y/ccm 2-Aminoimidazol wird eine Menge 2-Nitroimidazol gewonnen, die einer Konzentration von 170 y/ccm in der schließlich erhaltenen Fermentationsbrühe entspricht. Eine Kontrollkultur, der kein 2-Aminoimidazol zugesetzt wurde, ergab eine Konzentration von 68 y/ccm Azomycin, so daß die Ausbeute 74% beträgt.

Beispiel 2
Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol"

Zu 100 ecm eines Kulturmediums, das auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt und geimpft worden ist, wird nach 48stündigem Fermentieren bei 30° C 4(5)-Methyl-2-aminoimidazol in einer Menge zugesetzt, die 100 y/ccm entspricht. Nach 120 Stunden werden 118 y/ccm Nitroimidazole, d. h. sowohl 2-Nitroimidazol als auch 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol, aus der Brühe mit Äthylacetat extrahiert und mittels fraktionierter Kristallisation getrennt.

Es wird eine Menge erhalten, die 55 y/ccm 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol und 64 y/ccm 2-Nitroimidazol entspricht. Der Schmelzpunkt von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol ist 206⁰C.

Beispiel 3
Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol

Ein Standgefäß, das 401 Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung

MgSO₄ 0,5 g

NH₄NO₃ 10 g

KH₂PO₄

Na₂HPO₄ · 2H₂O

CaCO₃

Glukose

CuSO₄ · 5H₂O

FeSO₄ · 7H₂O

ZnSO₄ · 7H₂O

MnSO₄ · 4H₂O

CoCl₂ · 6H₂O

(ΝΗ₄)₆Μο₇Ο₂₄·4Η,Ο.

0,624 g
0,376 g

10 g

90 g
0,0033 g
0,01g
0,05 g
0,004 g
0,002 g
0,001 g

60

Dest. H₂O 1000 ecm

(sterilisiert durch 15 Minuten dauernde Erhitzung bei 120⁰C; pH-Wert nach der Sterilisation 6,2)

enthält, wird mit 5 Volumprozent Impfbrühe geimpft. Das Medium wird bei 25° C gehalten und mechanisch mit 500 U/Minute gerührt. Es wird belüftet, indem man sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 1 pro Liter Medium und pro Minute einbläst. Nach einer Fermentation von 48 Stunden wird das Mycel filtriert, mit einer Pufferlösung von Phosphaten gewaschen und in 401 der gleichen Lösung suspendiert.

Es wird auf einen pH-Wert von 6,5 gepuffert. Dann werden 6,7 g 4(5)-Methyl-2-aminoimidazol zugesetzt, und die Fermentierung wird dann unter den gleichen Bedingungen wie zuvor durchgeführt. Nach 12 Stunden wird die Brühe mit Äthylacetat extrahiert, und die Abtrennung der Produkte erfolgt durch Chromatographie auf einer Kolonne aus Silikagel und unter Verwendung einer 1:1-Mischung von Diäthyläther und Petroläther als Entwicklungslösungsmittel. Es werden 4,5 g 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol (= 52% Ausbeute) erhalten; Schmelzpunkt 206⁰C.

Beispiel 4
Herstellung von 4,5-Dimethyl-2-nitroimidazol

Diese Verbindung wird im wesentlichen nach dem vorstehend im Beispiel 2 für die Herstellung von 4(5)-Methyl-2-nitroimidazol beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 4,5-Dimethyl-2-aminoimidazol als Ausgangsverbindung hergestellt. Der Schmelzpunkt ist 217°C. Ausbeute = 45%.

Beispiele 5 bis 7

Nach dem gleichen, in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren werden auch die folgenden substituierten 5-Nitroimidazole hergestellt:

5. 4(5)-Äthyl-2-nitroimidazol, Schmelzpunkt 152 bis 154⁰C; Ausbeute = 64%,

6. 4(5)-Propyl-2-nitroimidazol, Schmelzpunkt 140/ 141⁰C; Ausbeute = 39%,

7. 4(5) - Isopropyl - 2 - nitroimidazol, Schmelzpunkt 138/139°C; Ausbeute = 38%.

109 586/427

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazolen der allgemeinen Formel

NO,

in der R eine niedere Alkylgruppe bedeutet und η eine ganze Zahl von O bis 2 einschließlich bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 2-Aminoimidazol der allgemeinen Formel

NH,

in der R und η die vorstehende Bedeutung haben, 12 bis 120 Stunden bei 25 bis 30⁰C mit einer Fermentationslösung behandelt, die durch die Fermentierung von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das 2-Aminoimidazol dem Fermentationsmedium von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC19 551 nach 48 Stunden zusetzt und die Fermentierung 12 bis 72 Stunden bei 25 bis 30⁰C fortsetzt.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazolen der allgemeinen Formel I

NO,

in der R und η die vorstehende Bedeutung haben, 12 bis 120 Stunden bei 25 bis 30⁰C mit einer Fermentationslösung behandelt, die durch die Fermentierung von Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 erhalten worden ist. Azomycin und seine Homologen haben protozoenfeindliche Eigenschaften.

Wie aus Journal of the American Chemical Society Bd. 87 (1965), S. 389 bis 390, bekannt ist, wurden bereits mehrere chemische vollsynthetische Verfahren zur Herstellung von 2-Nitroimidazol entwickelt. Es konnte jedoch das 2-Nitroimidazol bestenfalls in 40%iger Rohausbeute erhalten werden, wenn man 2-Aminoimidazol mit Natriumnitrit in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat umsetzte, wobei das Reaktionsprodukt 16 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde. Demgegenüber werden nach dem beanspruchten Verfahren erheblich bessere Ausbeuten erzielt.

Es ist bekannt, daß Azomycin durch einen Mikroorganismus gebildet wird, der der Gattung Nocardia angehört, und daß viele seiner Eigenschaften denen von Nocardia mesenterica ähneln, obwohl die Identität der zwei Mikroorganismen nicht bewiesen werden konnte. Die physiologischen und kulturellen Eigenschaften des azomycinbildenden Stammes sind im Journal of Antibiotics, 7A (1954), S. 53, angegeben. Später wurde ein anderer azomycinbildender Mikroorganismus gefunden, der Streptomyces eurocidius benannt wurde (Journal of Antibiotics, 8A (1955), S. 105.

Aus einer nahe Ivrea (Italien) gewonnenen Bodenprobe wurde nun ein Streptomyces isoliert, der bei der American Type Culture Collection eingereicht wurde und die Nummer 19 551 erhalten hat. Die nachstehend beschriebenen Eigenschaften dieses Stammes sind denen von Streptomyces eurocidicus ziemlich ähnlich. Darüber hinaus wurde aber die überraschende Tatsache gefunden, daß die enzymatische Aktivität des neuen Stammes, der als Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 bezeichnet wurde, die Aminogruppe einiger heterocyclischer Aminoverbindungen zu einer Nitrogruppe oxydieren kann. Dieser Effekt gestattet die Herstellung von Azomycin in hohen Ausbeuten, indem man Streptomyces eurocidicus var. nitroxydans ATCC 19 551 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und in das Medium dann 2-Aminoimidazol als Ausgangsverbindung einführt, das nach bekannten Verfahren leicht hergestellt werden kann.
Weiterhin wurde gefunden, daß man nach diesem Verfahren nicht nur 2-Nitroimidazol selbst herstellen kann, da bei Zugabe eines substituierten 2-Aminoimidazols der allgemeinen Formel

in der R eine niedere Alkylgruppe bedeutet und η eine ganze Zahl von 0 bis 2 einschließlich bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein 2-Aminoimidazol der allgemeinen Formel

NH,