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La présente invention concerne les substances produites par les moi- sissures productrices de pénicillineo
Il est bien connu que l'on peut obtenir des substances ayant une ac- tivité antibiotique en oultivant certaines moisissures, par exemple les moisissu- res du genre Penicillium telles que le Penicillium carysogenum en présence d'un milieu nutritif approprié. L'un des groupes de ces substances antibiotiques est connu sous le nom de pénicillines et ont la formule générale : R-Pn-COOH (I), où Pn est un groupement moléculaire C8H10O2N2S pour lequel on est d'accord aujour- d'hui de lui prêter la formule suivante:
EMI1.1
Les travaux antérieurs sur les pénicillines ont montré que la quan- tité de matière antibiotique obtenue comme métabolite ou moisissure productrice de pénicilline n'était qu'une faible partie des produits totaux obtenus.
Plus tard, il a été trouvé que le rendement de pénicillines pouvait être considérable- ment augmenté en élevant la moisissure en présence de certains composés chimiques qui étaient désignés sous le nom de "précurseurs". Ces composés paraissent fonc- tionner en facilitant l'introduction du groupe R de la formule I dans la molécu- le de pénicilline et toutes les pénicillines qui sont à présent produites à l'é- chelle industrielle sont préparées en employant de cette manière un précurseur.
Il a été maintenant trouvé selon la présente invention que l'on peut obtenir des substances à activité antibiotique en faisant réagir avec un réac- tif approprié, la liqueur de fermentation obtenue en cultivant une moisissure productrice de pénicilline, de préférence en l'absence d'une addition de précur- seur.
,L'expression "liqueur" de fermentation" employée ici signifie la sub- stance liquide obtenue d'une fermentation.
Il a été maintenant trouvé que ce liquide renferme un composé ayant la formule de structure :
EMI1.2
qui sera dénommé "acide 6-aminopénicillanique" d'après la nomenclature adoptée par d'autres chercheurs dans des domaines analogueso
La présente invention fournit par conséquent l'acide -6-aminopénicil- lanique ayant la formule de structure :
EMI1.3
'- lequel est capable de réagir avec le'chlorure de phénylacétyle pour produire la benzylpénicilline, et qui donne un test négatif Bratten-Marshall et un texte négatif ninhydrine, et ses sels.
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L'acide 6-aminopénicillanique est un composé non-hygroscopique le- quel à l'état pratiquement pur possède un point de fusion de 209 à 210 C et l'a- nalyse suivante : (Trouvé: C, 44,6 ; H, 5,7 ; N, 13,1 ; S, 14,1 C8H12O3N2S demande : C, 44,4 ; H, 5,6; N, 13,0; S,14,8%).
La présente invention couvre également un procédé pour la préparation de l'acide 6-aminopénicillanique ou de ses sels, dans lequel une moisissure pro- ductrice de pénicilline est élevée dans un milieu nutritif et l'acide 6-aminopé- nicillanique ou un sel de cet acide est isolé de la liqueur de fermentation ob- tenue. Cet isolement peut être effectué en concentrant d'abord la liqueur et en la traitant ensuite avec une résine échangeuse d'ions, l'éluat de la résine étant concentré et l'acide 6-aminopénicillanique sous forme cristalline en étant préci- pité par l'addition d'un acide, par exemple l'acide chlorhydrique.
Selon un mo- de de réalisation de l'invention, l'éluat de la résine échangeuse d'ions est purifié par chromatographie sur une colonne de cellulose avant d'en précipiter l'acide 6-aminopénicillanique. Si on le désire, toutes pénicillines peuvent être enlevées de la liqueur de fermentation avant le traitement de celle-ci avec la résine échangeuse d'ions.
La résine échangeuse d'ions employée peut être une résine échangeuse d'anions fortement basique, par exemple une résine du type polystyrène à liaison croisée avec des groupes fonctionnels ammonium quaternaires, vendue sous les marques de fabrique "Dowex 1", et "DeAcidite FF". Alternativement, la résine échangeuse d'ions peut être une résine échangeuse de cations dont un exemple est constitué par une résine du type polystyrène à liaison croisée avec des groupes d'acide sulfonique, vendue sous la marque de fabrique "Amberlite IR 120".
La présente invention fournit encore un procédé pour la préparation de dérivés de l'acide pénicillanique, dans lequel on fait réagir la liqùeur de fermentation obtenue en cultivant une moisissure productrice de pénicilline dans un agent nutritif avec ou sans purification partielle subséquente, ou bien l'a- cide 6-aminopénicillanique isolé d'une telle liqueur, avec un chlorure ou bromure d'acide carboxylique, un chlorure d'acide sulfonique, un ester d'acide chloro- carbonique, un anhydride acide d'un acide carboxylique et un anhydride d'acide mixte dérivant d'un acide carboxylique.
Des moisissures appropriées productrices de pénicilline comprennent des espèces de Penicillium, par exemple le Penicillium chrysogenum 5120C. La moisissure est cultivée de préférence dans des conditions de culture aérobique submergée.
Puisque certaines substances antibiotiques obtenues par le procédé selon la présente invention sont des composés relativement instables qui subissent facilement des changements physiques ayant-pour résultat la perte de l'activité antibiotique, il est désirable de choisir des conditions de réaction suffisamment modérées pour éviter leur décomposition. Les conditions de réaction choisies dépendront évidemment dans une large mesure de la réactivité du réactif chimique employé. Dans la plupart des cas, un compromis doit être fait entre l'emploi de conditions très faciles pour une-période assez longue, et l'emploi de conditions plus sévères pour une durée plus courte, avec la possibilité de décomposer une partie de la substance antibiotique.
La température choisie pour le procédé de préparation des dérivés de l'acide pénieillanique ne doivent en général pas dépasser 30 C et dans de nombreux cas une température appropriée est la température ambiante. Puisque l'on doit éviter l'emploi de conditions fortement acides ou alcalines dans le procédé se- lon l'invention, il a été trouvé préférable de réaliser le procédé avec un pH compris entre 6 et 9, et cela peut se faire d'une manière appropriée en employant un tampon, par exemple une solution de bicarbonate sodique, ou un tampon au phos- phate, sodique.
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Le milieu de culture employé pour obtenir la liqueur de fermentation utilisée dans le procédé selon la présente invention peut être l'un des milieux généralement acceptés, couramment employés pour la préparation des pénicillines.
Le milieu de culture consiste essentiellement en général en une matière nutriti- ve carbohydratée, par exemple glucose ou lactose; carbonate de calcium, sulfate de sodium, et une substance azotée capable de fournir l'azote nécessaire-pour la culture de la moisissure. La matière azotée peut être soit une substance natu- relle, par exemple de la farine de cacahuètes, ou bien l'un ou plusieurs compo- sés chimiques renfermant de l'azote, par exemple des sels ammoniques tels que le lactate ammonique ou acétate ammonique.
Lorsqu'on emploie un ou plusieurs com- posés chimiques comme substances azotées, il est usuel d'incorporer dans le mi- lieu de culture de très petites quantités d'un certain nombre de métaux tels que le calcium, fer, zinc, cuivre, magnésium et manganèse qui sont normalement intro- duits sous forme de solutions aqueuses de leurs sels. Un milieu de culture appro- prié renfermant des sels ammoniques comme substance azotée est décrit par Jarvis et Johnson, J. A.C.S. 69,/3010, (1947), et J.Bact.59, 51,(1950). Des substan- ces azotées naturelles telles que de la farine de cacahuètes renferment en géné- ral des quantités suffisantes de sels anorganiques appropriés et ainsi lorsque ces matières sont employées dans le milieu de culture il n'est en général pas nécessaire de faire une addition séparée de sels anorganiques.
Les conditions de fermentation employées dans la préparation de la liqueur de fermentation utilisée selon la présente invention, peuvent varier entre de grandes limites, mais il a été trouvé préférable d'employer des condi- tions similaires à celles ordinairement employées pour la préparation de la Pé- nicilline G. La température employée est de préférence comprise entre 20 et 35 C et des résultats très satisfaisants ont été obtenus avec une température de 25-27 C. La durée requise pour la fermentation dépend du milieu de culture et de la moisissure employée et de la température à laquelle la fermentation est ef- fectuée. Les durées normales pour la fermentation sont comprises entre 48 et 120 heures. Le progrès de la fermentation peut être suivi au moyen d'essais pé- riodiques.
> La liqueur de fermentation est obtenue de la façon la plus satisfai- sante lorsque la fermentation est réalisée dans les conditions fortement aérobi- ques. Dans les opérations à petite échelle mentionnées dans les exemples de la présente spécification, on a obtenu les conditions aérobiques en secouant le mé- lange de fermentation sur une machine rotative à secousses. En travaillant à grande échelle, on peut de manière appropriée obtenir les conditions aérobiques, soit en faisant barboter de l'air ou de l'oxygène dans le mélange de fermenta- tion, soit en agitant rapidement le mélange de fermentation. Si on le désire, on peut employer une combinaison d'agitation et de barbotage d'air ou d'oxygène.
Il est parfois-préférable de préparer les substances antibiotiques par l'emploi de l'acide 6-aminopénicillanique isolé ou par l'un des concentrés intermédiaires obtenus pendant son isolement. Une solution concentrée de l'aci- de 6-aminopénicillanique peut être préparée en évaporant le moût de culture à la température et pression réduites jusqu'à obtenir un faible volume. Si on le dé- sire, les pénicillines présentes dans le moût peuvent être enlevées dans une lar- ge mesure par extraction avec un solvant organique, tel que l'acétate de butyle avec un pH acide. Après neutralisation du liquide on peut précipiter des quan- tités appréciables d'impuretés par l'addition de solvants tel que l'acétone, le méthanol ou l'éthanol.
Après séparation de ces impuretés, la liqueur claire peut ensuite être concentrée plus loin pour donner une préparation concentrée.
La production par le procédé selon la présente invention d'une matiè- re antibiotique en partant d'une liqueur de fermentation n'ayant pas d'activité antibiotique ou n'ayant qu'une faible activité anti-biotique, est clairement in- diquée si, avant l'addition de l'un des réactifs chimiques spécifiés ci-dessus à la liqueur de fermentation, on a enlevé les pénicillines déjà présentes comme ré- sultat de la réaction de fermentation par laquelle la liqueur de fermentation a
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été obtenue. Cet enlèvement peut facilement être obtenu comme indiqué ci-dessus par une extraction des pénicillines de la liqueur de fermentation acidifiée au moyen d'un solvant organique, par exemple l'acétate de butyle, dans lequel les pénicillines sont solubles.
Des exemples ci-dessous on verra que dans certains cas, on a obtenu une augmentation très considérable de l'activité antibiotique comme résultat de la modification chimique de la liqueur de fermentation par le procédé selon la présente invention. Lorsqu'on a employé le chlorure de phényl acétyle comme réactif chimique, par exemple, l'activité antibiotique obtenue après la réaction était 23 fois plus grande que celle avant la réaction.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1.
Cet exemple décrit la préparation et l'isolement d'acide 6-amino- pénicillanique. a/ Une souche de Pénicillium chrysogenum 5120C (obtenue du Profes- seur E.B. Chain, Istituto Superiore di Sanita, à Rome) a été d'abord cultivée sur une pente de glycérol-mélasses agar pendant 7 jours à 26 C. On a alors ajou- té de l'eau distillée stérile et les spores ont été enlevés par lavage de la sur- face de la culture pour produire une suspension de spores. On a employé environ 10 mls. de cette suspension pour inoculer 5 litres de milieu de semence dans un fermenteur en acier inoxydable de 10 litres, soumis à l'agitation. Le milieu de semence contenait 8% en poids par volume de liqueur de grains trempés, 6% en poids par volume de dextrine et eau du robinet, le pH étant réglé à une valeur 6,1 avant de stériliser le fermenteur et son contenu.
Le réservoir fut agité à 500 tours par minute avec courant d'air de 1 vol/vol/minute et maintenu à 27 C pendant 48 heures. Un volume de 3,2 litres du contenu de ce fermenteur fut en- suite aseptiquement transféré dans un fermenteur en acier inoxydable de 90 litres contenant 50 litres d'agent de fermentation consistant en farine de cacahuètes 3,0 poids par volume, lactose 4,0% p/v, Na2S04 0,1% p/v, CaC03 1,0% p/v et eau du robinet, Le pH fut réglé à 7,2 en amont du fermenteur et son contenu fut stéri- lisé. Après inoculation, le réservoir fut maintenu à 26-28 C pendant 4 jours et soumis à l'agitation à 600 t. p.m. au moyen d'une aube de turbine de 12,5 cm/ diamètre. L'air barbotait à travers le réservoir au taux de 1 vol/vol/min.
Le moussage était contrôlé par l'addition périodique de graisse de porc contenant 2% de octadécanol.
Le moût obtenu fut clarifié et 40 litres de ce moût furent concen- trés dans le vide jusqu'à un volume de 4 litres. Le pH fut ensuite réglé à 3,0 et le précipité qui s'est formé fut enlevé par centrifugation et la liqueur lim- pide fut extraite une fois avec la moitié de son volume d'acétate de butyle. La phase aqueuse fut séparée et lé pH fut réglé à 7,5. On a ensuite ajouté 3 volumes d'acétone.avec agitation et le précipité fut enlevé par centrifugation.
La liqueur claire fut ensuite concentrée jusque 2,280 mls. et le pH réglé à 7,0. Il possédait une valeur potentielle de 54 Mu/mgr., vérifiée comme décrit ci-après. ¯ - '
L'acide 6-aminopénicillanique fut essayé en faisant réagir un échan- tillon avec le chlorure de phényle acétyle et en essayant la pénicilline trouvée, par la méthode à l'assiette décrite par N.G.Heatley dans Biochem J., 38, 61 (1944) en employant B. subtilis comme le bactérium. La pureté de la préparation peut alors être exprimée en unités par mgr/(Mu/mgr.) de substance sèche.
La valeur potentielle de l'acide 6-aminopénicillanique pur essayé par cette méthode est de 2750 Mu/mgr. b/ 1200 mls. du concentré de valeur potentielle 54 Mu/mgr. furent in- fusés à travers 200 gr. de résine Dowex I conditionnée avec de l'acide ohlorhy- drique. La colonne fut lavée avec de l'eau et cette eau de lavage fut ajoutée au percolat. L'essai de cette solution a prouvé qu'elle renfermait 15% de l'acide
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6-aminopénicillanique mis en oeuvre. La colonne fut ensuite éluée avec 0,05N d'acide chlorhydrique. Les fractions actives mises ensemble de l'éluat conte- naient 81% de l'acide 6-amino-pénicillanique initial,la solution donnant à l'essai 900 Mu/mgr.
L'éluat fut ensuite réglé à un pH = 6,0 et concentré à 25 mls. dans le vide, on ajouta de l'acide chlorhydrique concentré avec agitation pour ramener le pH à 4,3 et l'acide 6aminopénicillanique cristallin fut ensuite séparé par filtration et lavé avec de l'eau et puis avec l'acétone, et ensuite séché dans le vide. Le rendement était de 1,0 gr. donnant à l'essai 2200 Mu/mgr.
(pureté 80%). Une précipitation répétée de la matière cristalline hors de la solution aqueuse neutre par l'addition d'acide chlorhydrique donnait une matière solide cristalline blanche ayant un point de fusion de 209-210 C, donnant à l'es- sai 2740 Mu/mgr. et ayant la composition suivante : (Trouvé: C,44,6; H, 5,7; N, 13,1 ; S,14,1 %.
C8H1203N2S demande : C, 44,4 ; H, 5,6 ; N, 13,0 ; S, 14,8 %).
Exemple 2.
L'exemple 1(a) fut répété et on fit percoler 8 litres du concentré à travers une colonne de 700 grs. de résine DeAcidite FF conditionnée par de l'a- cide acétique. La colonne avait 5 cm x 37,5 cm. La colonne fut lavée avec de l'eau et on réunit le percolat et les eaux de lavage. La colonne fut éluée avec de l'acide N acétique et l'éluat fut recueilli en fractions. Les fractions ac- tives furent réunies, donnant 2710 mls de solution à 388 Mu/mgr. Ces 2710 mls de la solution furent évaporés dans le vide jusqu'à siccité et lavé avec 50 mls. d'eau. Cette évaporation à siccité et lavage avec l'eau furent répétés deux fois et après avoir finalement dissous dans 50 mls. d'eau, le pH fut réglé à 7,0 avec de l'ammoniac 4N pour donner un volume de 85 mis.
A cette solution on a ajouté 85 mls. d'acétone, d'isopropanol et 25 mls. d'eau et ensuite on fit la chromato- graphie sur une colonne de cellulose de 10 cm x 40 cm contenant 1,5 kg de cellu- lose et on a développé avec un mélange d'eau, acétone et isopropanol 1 (1:1:1).
L'éluat fut recueilli par fractions et les fractions actives furent réunies et évaporées dans le vide jusque 15 mls. On a ajouté avec agitation de l'acide chlorhydrique concentré pour ramener le pH à 5,0 et l'acide 6-aminopénicillanique cristallin fut séparé par filtration. Les cristaux furent lavés une fois avec de l'eau et deux fois avec de l'acétone et séchés dans le vide. Le rendement était de 1,9 gr. à 2060 Mu/mgr. (pureté: 75%). Le produit fut purifié par recristalli- sation comme dans l'exemple 1, donnant un acide 6-aminopénicillanique pur ayant les mêmes propriétés que le produit final de l'exemple 1.
Les exemples 3 à 32 qui suivent montrent la préparation de substances antibiotiques en partant de l'acide 6-aminopénicillanique.
La méthode qui doit être suivie pour la préparation des substances antibiotiques en partant de l'acide 6-aminopénicillanique dépend largement de l'importance de la purification de la matière de départ elle-même. Ainsi, l'a- cide 6-aminopénicillanique peut être employé en trois phases différentes de pu- rification comme indiqué ci-dessous : (a) En partant de l'acide 6-aminopénicillanique isolé.
Lorsque l'acide 6-aminopénicillanique est disponible sous une forme relativement pure, il suffit d'employer un petit excès (environ 20 % de réactif et le'produit est à son tour obtenu assez pur (comme indiqué par l'essai manomé- trique utilisant le pénicillinase).
Les réactifs employé$ de cette manière comprennent quinze chlorures différents d'acide monocarboxylique ainsi que du chlorure adipylique, l'anhydride propionique, l'anhydride carbobenzoxyglycine éthoxy-formique, le chloroformate de benzyle et le chlorure p-toluènesulfonyle:.
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EMI6.1
(b) En partant des concentrats de l'acide 6aminopénicillanique.
La matière de départ était une liqueur de fermentation clarifiée qui avait été soumise à une méthode initiale de concentration et de laquelle on a en- levé pratiquement les pénicillines naturelles par extraction au moyen d'un sol- vant à un pH compris entre 2 et 3. La solution aqueuse neutralisée renfermait généralement 0,6-1,2 mg/ml d'acide 6-aminopénicillanique, ce qui représentait en- viron 1% de la teneur totale en solides présente.
Avec une telle matière il était nécessaire d'employer un excès beau- coup plus grand de réactif (10 à 50 fois la quantité théorique) parce que diver- ses impuretés (par exemple les acides aminés et les simples peptides) seraient également susceptibles d'acylation et-d'autres réactions similaires. Les pro- duits furent travaillés essentiellement de la même manière que sous (a), mais les sels sodiques résultant étaient évidemment beaucoup moins purs.
Les réactifs employés de cette manière comprennent le chlorure phénoxy-acétyle, le chlorure
EMI6.2
phénylacétylee le chlorure a-chlorophényl-acétyle le chlorure chloroacétyle, le chlorure diphénylacétyle, et le chlorure adipylique (tous ceux-ci ayant subi la réaction par la méthode (a)) et également le chlorure a-naphtylacétyle, le chlo- rure fi-naphtoxyaaétyle et le chlorure p-nitrophénoxyaoétyle.
(c) En partant d'un moût dilué.
La matière initiale était le moût original de fermentation clarifié dont on avait pratiquement enlevé les pénicillines naturelles par extraction du solvant à un pH de 2 à 3, mais qui n'avait pas été concentré. Elle était ainsi environ dix fois plus diluée que les solutions employées dans la méthode (b).
L'emploi d'un grand excès de réactif était à nouveau essentiel. Avec cette ma- tière très diluée, on n'a fait aucun essai d'isoler les produits de la réaction, mais la formation de la matière antibiotique fut démontrée par l'augmentation de l'activité bactérielle de la solution après la réaction et par chromatographie au papier, une nouvelle zone de substance biologiquement active étant détectée dans chacun des cas.
Les réactifs employés avec succès de cette manière comprennent le chlorure phénoxyacétylique, le chlorure phénylacétylique, le chlorure a-naphtyl-
EMI6.3
acétylique, le chlorure a-naphtoxyacétylique, le chlorure fi-naphtoxyaeétylique, le chlorure p-nitrophénoxyaoétylique, le chlorure oc-chlorophénylaoétylique, le chlorure diphénylacétyliquee le chlorure chrotonylique, le chlorure chloroacétyli- que, le chlorure phtalimidoacétylique, le chlorure benzoylique, le chlorure hexa- hydrobenzoylique, le chlorure m-sulfobenzoylique, le chlorure-adipylique, l'an- hydride propisnique, et l'anhydride n-butyrique.
Exemple 3.
EMI6.4
Une souche de Pénicillium chrtsogenum (5120C obtenue du Professeur E.B.Chain, Istituto''<Superiore di Sanza, à Rome) fut cultivée sur pente de glycé- rol-mélasses agar pendant 7 jours à 26 C. Les spores obtenus furent enlevés par lavage avec de l'eau distillée stérile et la suspension de spores obtenue fut em- ployée pour inoculer 100 ml. d'un milieu de culture enfermé dans un flacon coni- que de 500 ml. Le flacon et son contenu avaient été auparavant stérilisés par de la vapeur sous pression, à l'autoclave.
Le milieu de culture employé avait la composition suivante :
EMI6.5
<tb> Parties <SEP> en <SEP> poids
<tb> Eau <SEP> 100
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> provenant <SEP> du <SEP> trempage <SEP> de <SEP> grains <SEP> 8
<tb>
<tb> "Glucose <SEP> liquide" <SEP> 6
<tb>
EMI6.6
et le pH du milieu avait été réglé à une valeur de 5,2 - 5è3 par l'addition d'une solution d'hydroxyde sodique. Le "glucose liquide" employé était un mélan- ge de carbohydrates consistant essentiellement en maltose, glucose et dextrines à bas poids moléculaires. Le flacon inoculé fut secoué pendant 48 heures à une
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température constante de 26 C sur une machine rotative à secousses ayant une portée de 3,4 cm et travaillant à 250 r.p.m.
A la fin de cette période de 48 heu- res, on a obtenu dans le flacon une culture appréciable de mycellium. La culture résultante fut ensuite utilisée pour inoculer un milieu synthétique de fermenta- tion sans l'addition d'un précurseur. Le milieu de fermentation employé avait la composition suivante:
EMI7.1
<tb> Parties <SEP> en <SEP> poids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> 100,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 4,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 2,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactate <SEP> ammonique <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acétate <SEP> ammonique <SEP> 0,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Na2S04 <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FeS04.7H20 <SEP> 0,01
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4.7H2O <SEP> 0,025
<tb>
EMI7.2
ZnSO4.7H2o 0,002
EMI7.3
<tb> MnS04 <SEP> 0,002
<tb>
EMI7.4
CaC12e2H20 0,005
EMI7.5
<tb> CuSO4.5H2O <SEP> 0,0005
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 1,0
<tb>
Le pH du milieu de fermentation était d'environ 6. La fermentation fut réalisée dans un flacon sur une machine à secousses à 26 C.
A la fin de la période de fermentation de 96 heures, le mycélium ob- tenu fut filtré du moût de fermentation et on a obtenu la liqueur de fermenta- tion en acidifiant le filtrat à un pH = 3 par de l'acide phosphorique et extrait une fois avec la moitié de son volume en acétate butylique à 5 C, ce qui enleva le plus grand nombre des pénicillines qu'il contenait.
La liqueur de fermentation extraits fut neutralisée avec une solution d'hydroxyde de sodium soumise à l'essai par la méthode à l'assiette décrite par N. G. Heatley dans Biochem J.38, 61 (1944), en employant le B, subtilis comme bactérium.
Une portion de 50 ml. de la liqueur de fermentation extraite fut ra- menée à un pH = 8 par l'addition de bicarbonate sodique solide et agitée à 0 C pendant qu'on ajoutait une solution de 0,5 gr. de chlorure phénoxyacétylique dans l'acétone pendant quelques minutes. Le mélange fut agité à 0 C pendant une heure, filtré et l'excès de réactif fut enlevé par extraction avec trois portions d'éther. Les extraits d'éther-furent lavés eux-mêmes avec de l'eau et les eaux de lavage furent ajoutées à la solution aqueuse-mère qui fut alors réglée à nouveau à un pH = 6 à 7 par l'addition d'acide chlorhydrique.
Un essai de la solution aqueuse obtenue (qui avait un volume de 60 ml. ) en utilisant la méthode mentionnée ci-dessus, a montré qu'elle contenait une substance ayant une activité antibiotique considérable qui était d'environ 11 fois plus grande pour tout le volume de liquide que oelle de la solution ini- tiale.
Les résultats obtenus par l'essai étaient comme suit :
EMI7.6
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 650
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> (volume <SEP> 65 <SEP> ml.) <SEP> 7.150
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
Au moyen de la chromatographie au papieril a été montré que la ma- tière antibiotique contenue dans la solution aqueuse avait une valeur Rf du même ordre que la pénicilline V et la stabilité de la solution aqueuse à un pH = 2 indiquait également une ressemblance avec celle de la pénicilline.
Exemple 4
L'exemple 3 fut répété en employant le chlorure phénylacétylique à la place du chlorure phénoxyacétylique.
Aussi bien la liqueur de fermentation extraite que la solution aqueu- se du produit de réaction furent essayés par la méthode décrite dans l'exemple 3 avec les résultats suivants:
EMI8.1
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb> -Liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb>
<tb>
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 350
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb>
<tb>
<tb> (volume <SEP> 65 <SEP> ml.) <SEP> 8125
<tb>
On verra que l'activité était jusque 23 fois plus grande après la réaction avec le chlorure phénylacétylique, qu'avant.
Au moyen de la chromatographie au papier il a été montré que la sub- stance antibiotique contenue dans la solution aqueuse avait une valeur Rf du même ordre que la pénicilline G et la stabilité de la solution aqueuse pour un pH = 2 indiquait également une ressemblance avec celle de la pénicilline G.
Exemple 5.
L'exemple 3 a été répété en employant du chlorure de benzoyle à la place du chlorure de phénoxyacétyle. Aussi bien la,liqueur de fermentation ex- traite que la solution aqueuse du produit de réaction furent soumis aux essais par la méthode décrite dans l'exemple 3, avec les résultats suivants:
EMI8.2
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb>
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 350
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb>
<tb> (volume <SEP> 70 <SEP> ml.) <SEP> 875
<tb>
On verra que l'activité était 2,5 fois plus grande après la réaction avec le chlorure de benzoyle, qu'avant.
Exemple 6.
L'exemple 4 fut répété en employant un milieu de fermentation basé sur la farine de cacahuètes au lieu de la substance synthétique.
Le milieu de fermentation employé avait la composition suivante :
EMI8.3
<tb> Parties <SEP> en <SEP> poids
<tb>
<tb> Eau <SEP> 100,0
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 4,0
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> cacahuètes <SEP> 3,0
<tb>
<tb>
<tb> Na2S04 <SEP> 0,1
<tb>
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 1,0
<tb>
Aussi bien la liqueur de fermentation extraite que la solution aqueu- se du produit de réaction ont été soumis aux essais par la méthode décrite dans
<Desc/Clms Page number 9>
l'exemple 3 avec les résultats suivants:
EMI9.1
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> extraite
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> fermentation
<tb>
<tb>
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 700
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb>
<tb>
<tb> (volume <SEP> 56 <SEP> ml.) <SEP> 7.840
<tb>
On verra que l'activité était après la réaction avec le chlorure de phénylacétyle 11 fois plus grande qu'avant cette réaction.
Exemple 7.
On a répété l'exemple 6 en employant le chlorure de a-naphtylacétyle à la place du chlorure de phénylacétyle.
Aussi bien la liqueur de fermentation extraite que la solution aqueu- se du produit de réaction furent soumis aux essais par la méthode décrite dans l'exemple 3 avec les résultats suivants;
EMI9.2
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 700
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb>
<tb> (volume <SEP> 56 <SEP> ml.) <SEP> 4032
<tb>
Les résultats montrent qu'après la réaction avec le chlorure de a- naphtylacétyle, l'activité était plus de 5 fois plus grande qu'avant la réaction.
Exemple 8.
On a répété l'exemple 6 en utilisant le chlorure de -naphtoxyacétyle à la place du chlorure de phénylacétyle.
Les résultats des essais par la méthode de l'exemple 3 montrent qu'a- près la réaction avec le chlorure ss-naphtoxyacétyle, l'activité étant plus de cinq fois plus grande qu'avant la réaction.
EMI9.3
<tb>
Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 700
<tb>
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction
<tb> (volume <SEP> 66ml.) <SEP> 4.092
<tb>
Exemple 9.
On a répété l'exemple 6 en employant le chlorure [alpha]-chlorophénylacé- tyle à la place du chlorure de phénylacétyle.
Aussi bien la liqueur de fermentation extraite que la solution aqueuse du produit de réaction ont été soumis aux essais par la méthode décrite dans l'exemple 3, avec les résultats suivants:
EMI9.4
<tb> Activité <SEP> (en <SEP> unités <SEP> internationales)
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> extraite
<tb>
<tb> (volume <SEP> 50 <SEP> ml.) <SEP> 700
<tb> Produit <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> (volume <SEP> 62 <SEP> ml.) <SEP> 5. <SEP> 332
<tb>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Les résultats montrent que l'activité après la réaction avec le chlo- rure [alpha]-chlorophénylacétyle était plus de 7 fois plus grande qu'avant la réaction.
Exemple 10.
Cet exemple décrit la préparation de la phénoxyméthyl-pénicilline (Pénicilline V) et est typique de la réaction de l'acide 6-aminopénicillanique isolé avec les chlorures de l'acide monocarboxylique.
Une solution de chlorure de phénoxyacétyle (360 mgr. ) dans de l'acé- tone sèche (5 ml. ) fut ajoutée goutte-à-goutte pendant 10 minutes à une solution soumise à l'agitation d'acide 6-aminopénicillanique (450'mgr., pureté environ 75%), dans du bicarbonate sodique aqueux à 3% (18 ml.) et acétone (12 ml.).
Lorsque l'addition fut achevée, le mélange fut agité à la température ambiante pendant 30 minutes et ensuite extrait avec de l'éther (30 ml. en 3 portions), seulement la phase aqueuse étant retenue. Cette solution aqueuse fut recouverte de butanol (5 ml.) et réglée à un pH = 2 par l'addition d'acide chlorhydrique N.
Après séparation des couches, la phase aqueuse fut extraite avec deux portions de 2,5 ml. de butanol, en réglant chaque fois le pH à uné'valeur égale à 2. Les solutions de butanol réunies (qui à cette étape contenaient l'acide pénicillani- que libre) furent lavées avec de l'eau (3 x 2 ml. ) et ensuite agitées avec de l'eau (10 ml. ) à laquelle on a ajouté assez de solution de bicarbonate sodique à 3% pour ramener la phase aqueuse à un pH égal à 7. la solution de butanol fut de plus extraite avec deux portions d'eau de 5 ml., à chacune de ces portions on a ajouté assez de solution de bicarbonate pour produire une phase aqueuse ayant un pH = 7.
Les solutions aqueuses réunies furent lavées avec de l'éther (20 ml. ) et ensuite évaporées à une température et pression basses pour laisser le sel sodique brut de la phénoxyméthyl-pénicilline qui, après séchage dans un dessicateur à vide, fut obtenu sous la forme d'une poudre légèrement hygroscopi- que (591 mgr.).
La pureté du produit a été estimée par la méthode d'essai à la péni- cillinase comme étant de 73 % et, par essais biologiques, comme étant de 68 %.
Dans son comportement chromatographique et son spectre antibactériel, le produit ne montrait aucune différence appréciable avec la pénicilline phénoxyméthyle authentique. Il montrait également la stabilité relative à l'égard d'acides qui est caractéristique de cette pénicilline particulière. On n'a pu détecter aucu- ne perte d'activité après deux heures à un pH = 2.
Exemple 11.
Cet exemple décrit la préparation de #-carboxy-butylpénicilline et est typique de la réaction de l'acide 6-aminopénicillanique isolé avec un chlo- rure d'acide bicarboxylique. La proportion des réactifs et le mode d'addition étaient calculés pour favoriser la formation d'un dérivé mono- plutôt qu'un dé- rivé "bis" de l'acide adipique.
Deux solutions séparées, l'une contenant de¯1!acide 6-amino-pénicil- lanique (500 mgr.) dans une solution aqueuse à 3% de bicarbonate sodique (6,4 ml. et l'autre du chlorure adipylique (420 mgr.) dans de l'acétone sèche (6 ml.), furent ajoutées à des taux égaux pendant 10 minutes à un mélange soumis à l'agi- tatiion d'une solution à 3% de bicarbonate sodique (25 ml.) et acétone (25 ml.).
Le mélange fut agité à la température ambiante pendant 30 minutes, ensuite ex- trait avec de l'éther (60 ml. en 3 portions) et les extraits furent rejetés. Le produit fut isolé en extrayant l'acide pénicillinique libre dans du butanol et en extrayant ensuite à nouveau dans l'eau à un pH = 7 comme décrit dans l'exemple 10. Le rendement en sel sodique sec de la #-carboxy-butyl-pénicilline était de 445 mgr., ce qui fut estimé par l'essai manométrique à la pénicillinase comme ayant une pureté de 52%. Lorsqu'on l'a soumis à la chromatographie au papier, le produit n'a donné qu'une seule zone d'activité antibiotique. Le pourcentage restant était après deux heures à un pH = 2, inférieur à 25%.
<Desc/Clms Page number 11>
Exemple 12.
Cet exemple décrit la préparation de l'éthyl pénicilline et est typi- que de la réaction de l'acide 6-aminopénicillanique isolé avec un simple anhydri- de de l'acide carboxylique.
L'acide 6-aminopénicillanique (400 mgr. ) fut acylé comme décrit dans l'exemple 10, excepté que le réactif employé était l'anhydride propionique (140 mgr. ). Après avoir opéré comme dans l'exemple 10, le rendement en sel sodique brut de l'éthyl pénicilline était de 260 mgr., ce qui fut estimé par l'essai ma- nométrique à la pénicilline comme représentant une pureté de 53%. Le pourcentage restant était après deux heures à un pH = 2 inférieur à 30.
Exemple 13.
Cet exemple décrit la préparation de carbobenzoxyaminométhyl pénicil- line et est typique de la réaction de l'acide 6-aminopénioillanique avec un an- hydride mixte instable.
Une solution de N-oarbobenzoxy glycine (450 mgr. ) et triéthylamine (0,3 ml.) dans l'acétone sèche (10 ml.) fut soumise à l'agitation et refroidie à -5 C. Une solution d'éthyl chlorocarbonate (0,2 ml.) dans de l'acétone sèche (2 ml.) fut ajoutée goutte-à-goutte avec refroidissement et agitation continus, et après dix minutes le mélange résultant (renfermant l'anhydride N-oarbobenzoxy glycine éthoxyformique et du chlorhydrate de triéthylamine en suspension) fut refroidi à -50 C et ajouté lentement à un mélange ayant la température de la gla- ce, soumis à l'agitation et préparé d'acide 6-aminopénicillanique (-430 mgr.),
3% d'une solution de 'bicarbonate sodique (17 ml.), et acétone (5 ml.).
Le mélan- ge fut laissé atteindre la température ambiante et maintenu ainsi pendant 30 mi- nutes avec agitation continue. Le produit fut ensuite isolé comme décrit dans l'exemple 10, pour donner le sel sodique brut de le carbobenzoxyaminométhylpéni- cilline (469 mgr.) (pureté 63%). Le pourcentage restant était après deux heures à un pH = 2, de 94%.
Exemple 14.
Cet exemple décrit la préparation de benzyloxypenicilline et est ty- pique de la réaction de l'acide 6-aminopenicillanique isolé avec un ester d'aci- de chloroformique (chlorocarbonique).
L'acide 6-aminopénicillanique (500 mgr. ) fut traité comme décrit dans l'exemple 10, excepté que le réactif était le chloroformate de benzyle (430 mgr.) et le mélange fut soumis à l'agitation pendant 100 minutes à la température am- biante avant d'être travaillé de la manière usuelle. Le rendement en, sel sodique brut très hygroscopique de benzyloxypénioilline était de 445 mgr. (pureté 90%).
Le pourcentage restant après 2 heures à un pH = 2, était de 71%.
Exemple 15.
Cet exemple décrit la préparation de l'acide 6-p-toluène sulphonami- dopénicillanique et est typique de la réaction de l'acide 6-aminopénicillanique isolé avec un chlorure d'acide sulfonique.
L'acide 6-aminopénicillanique (400 mgr. ) fut traité comme décrit dans l'exemple 10, excepté que le réactif était le chlorure p-toluène-sulfonyle (350 'mgr.). Le rendement en 6-p-toluènesulfonamidopenicillanate sodique brut était de 402 mgr. (pureté 57%). Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 77 %.
.
Exemple 16.
Cet exemple décrit la préparation de oc-naphtylméthyl pénicilline et est typique de l'acylation d'un moût d'acide 6-aminopenicillanique concentré.
Le chlorure a-naphtylacétyle (13 gr.) dissous dans de l'acétone (90 ml.) fut ajouté pendant plusieurs minutes à un mélange soumis à l'agitation du
<Desc/Clms Page number 12>
concentré (400 ml., renfermant environ 400 mgr. de l'acide 6-aminopénioillanique) et bicarbonate sodique (10 gr. ). Le mélange fut soumis à l'agitation pendant 30 minutes à la température ambiante et ensuite extrait avec de l'éther, les ex- traits étant rejetés. La phase aqueuse fut refroidie à 0 C, recouverte de n- butanol (80 ml.) (on pouvait aussi employer l'acétate de butyle) et ramenée à un pH = 2, en ajoutant de l'acide chlorhydrique, avec agitation. Les couches fu- rent séparées et la phase aqueuse fut encore extraite avec du butanol (2 x
40 ml.).
Les extraits de butanol réunis furent alors agités avec de l'eau (80 ml. ) et avec assez! de bicarbonate sodique aqueux à 3% de telle sorte qu'après se- couage, la phase aqueuse avait un pH = 7. Les couches furent séparées, et la phase solvant fut extraite deux fois encore avec de l'eau (50 ml.) et avec assez de bicarbonate sodique à 3%, pour ramener la phase aqueuse à un pH = 7. Les solutions aqueuses combinées furent lavées avec de l'éther (100 ml. ) et ensuite évaporées à basses température et pression. Un séchage final dans un dessicateur sous vide a laissé le sel sosique très brut de [alpha]-naphtylméthylpénicilline sous la forme d'un solide jaune très déliquescent (4,8 gr.). On a estimé par des es- sais manométriques à la pénicilline que la pureté était de 9 %.
Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2 était de 31 %.
Exemple 17.
Le sel sodique de méthylpénicilline fut obtenu en répétant le procédé de l'exemple 10; mais en employant le chlorure d'acétyle à la place du chlorure de phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 32 %) était de 27 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-amino-pénicillanique.
Exemple 18.
Le sel sodique de 1-propénylpénicilline a été obtenu en répétant le procédé de l'exemple 1L, mais en employant du chlorure de crotonyle au lieu du chlorure phénoxyaoétyle. Le rendement en-sel sodique brut (pureté 29 %) était de 77 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 24%.
Exemple 19.
On a obtenu le sel sodique de la chlorométhylpénicilline en répétant le procédé de l'exemple 10, mais en utilisant le chlorure chloroacétyle au lieu du chlorure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 77 %) était de 79 mgr. par 100 mgr . d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 80 %.
Exemple 20. -
Le sel sodique de la dichlorométhylpénicilline a été obtenu-en répé- tant le procédé de l'exemple 10, mais en utilisant le chlorure dichloroacétyle au lieu du chlorure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 31 %) était de 80 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcenta- ge restant après deux heures à un pH = 2 était de 100 %.
Exemple 21.
Le sel sodique de la bromométhylpénicilline a été obtenu par le pro- cédé de l'exemple 10, mais en employant du bromure bromoacétyle au lieu du chlo- rure phénoxyaoétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 69 la) était de 107 mgr. par 100 mgr. de l'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2 était de 95 %.
Exemple 22.
Le ,sel sodique de la cyolohexylpénicilline a été obtenu par le procé- dé de l'exemple 10, mais en employant du chlorure hexahydrobenzoyle au lieu du chlorure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 70 %) était de 76 mgr. par 100 mgr . de l'acide 6-aminopénicillanique.
<Desc/Clms Page number 13>
Exemple 23.
On a obtenu le sel sodique de la phénylpénicilline par le procédé de l'exemple 10, mais en employant du chlorure benzoyle au lieu du chlorure phéno- xyacétyle. Le rendement en sel sodique brut {pureté 69%) était de 109 mgr. par
100 mgr. de l'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était inférieur à 15%.
Exemple 24 .
Le sel sodique de la benzylpénicilline a été obtenu par le procédé de l'exemple 10, mais en employant le chlorure de phénylacétyle au lieu du chlorure de phénoxyaçétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 70 %) était de 81 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était inférieur à 5%.
Exemple25.
Le sel sodique de la benzhydrylpénicilline a été obtenu par le procé- dé de l'exemple 10, mais en employant le chlorure du diphénylacétyle au lieu du chlorure de phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 68 %) a été de 111 mgr. par 100 mgr. de l'acide 6-aminopénioillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 65%.
Exemple 26.
Le sel sodique de la styryl pénicilline a été obtenu par le procédé de l'exemple 10, en employant le chlorure de cinnamoyle au lieu du chlorure de phénoxyaoétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 24%) était de 106 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2 était inférieur à 4%.
Exemple27.
Le sel sodique de [alpha]-chlorobenzylpénicilline a été obtenu par le pro- cédé de l'exemple 10 en employant le .chlorure [alpha]-chlorophénylacétyle à la place du chlorure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut était de 121 mgr. par 100 mgr. de l'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 98 %.
Exemple 28.
Le sel sodique de la phénylthiométhylpénioilline a été obtenu par le procédé de l'exemple 10 en employant le chlorure phénylthioacétyle au lieu du chlorure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 72%) était de
150 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 82%.
.Exemple 29. Le sel sodique de m-sulphophénylpénicilline a été obtenu par le procé- dé de l'exemple 10 en employant le chlorure m-sulphobenzoyle à la place du chlo- rure phénoxyacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 42%) était de 62 mgr. par 100 mgr. d'acide 6-aminopénioillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 39 %.
, Exemple 30.
Le sel sodique de a-furylpénicilline-a été obtenu par le procédé de l'exemple 10, en employant un chlorure a-furoyle à la-place du chlorure phénoxy- acétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 51%) était de 101 mgr. par
100 mgr. d'acide 6-aminopénicillanique. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 35%.
Exemple 31.
Le sel sodique de ss-naphtoxyméthylpénicilline a été obtenu par le pro- cédé de l'exemple 16, en employant le chlorure [alpha]-naphtoxyacétyle à la place du
<Desc/Clms Page number 14>
chlorure a-naphtylacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 7%) était de 1,9 mgr. par 100 mgr. de moût concentré. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 94%.
Exemple 32.
Le sel sodique de p-nitrophénoxyméthylpenicilline a été obtenu par le procédé de l'exemple 16 en employant le chlorure de p-nitrophénoxyacétyle à la place du chlorure [alpha]-naphtylacétyle. Le rendement en sel sodique brut (pureté 6%) était de 1,5 gr par 100 ml. en moût concentré. Le pourcentage restant après deux heures à un pH = 2, était de 78 %.
On peut obtenir les pénicillines libres en partant dans chaque cas des sels sodiques par acidification.
Dans les exemples qui précèdent on a préparé le sel sodique, mais il est bien entendu que, si on le désire, on peut obtenir par des moyens similaires d'autres sels, par exemple les sels de potassium et de calcium.
Les propriétés inhibitrices de la croissance de certains des produits des exemples sont montrées dans le tableau qui suit.
<Desc/Clms Page number 15>
Dilutions de limitation pour l'inhibition de,croissance bacté- rielle * (1 partie dans :)
EMI15.1
<tb> Exemple <SEP> E. <SEP> P. <SEP> S. <SEP> Staph. <SEP> B.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> coli <SEP> vulgaris <SEP> typhi <SEP> aureus <SEP> subt.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
10 <SEP> 8.000 <SEP> 20.000 <SEP> 16.000 <SEP> 80 <SEP> M <SEP> 20 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11 <SEP> 4.000 <SEP> 8.000 <SEP> 160.000 <SEP> 800 <SEP> .000 <SEP> 800.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12 <SEP> 40.000 <SEP> 20.000 <SEP> 80.000 <SEP> 4 <SEP> M <SEP> 2 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13 <SEP> 4.000 <SEP> 8.000 <SEP> 16 <SEP> .000 <SEP> 8 <SEP> M <SEP> 4 <SEP> M <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14 <SEP> 8.000 <SEP> 16.000 <SEP> 20.000 <SEP> 20 <SEP> M <SEP> 400.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> 4.000 <SEP> 8.000 <SEP> 4.000 <SEP> 800.000 <SEP> 400.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16 <SEP> 2,
000 <SEP> 2.000 <SEP> 2.000 <SEP> 40 <SEP> M <SEP> 40 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17 <SEP> 20.000 <SEP> 8.000 <SEP> 40.000 <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 800.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 18 <SEP> 16.000 <SEP> 8.000 <SEP> 40.000 <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 1.600.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> 20.000 <SEP> 4.000 <SEP> 80.000 <SEP> 4 <SEP> M <SEP> 800 <SEP> .000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> 16.000 <SEP> 4.000 <SEP> 80.000 <SEP> 8 <SEP> M <SEP> 1.600.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> 1 <SEP> .600 <SEP> 1 <SEP> .600 <SEP> 40.000 <SEP> 2 <SEP> M <SEP> 1.600.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 22 <SEP> <4.000 <SEP> 4.000 <SEP> 20 <SEP> .000 <SEP> 16 <SEP> M <SEP> 2 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 23 <SEP> <4.000 <SEP> 20.000 <SEP> 4.000 <SEP> 8 <SEP> M <SEP> 800.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 24 <SEP> 200.000 <SEP> 200.000 <SEP> 400.000 <SEP> 40 <SEP> M <SEP> 40
<SEP> M <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 25 <SEP> 8.000 <SEP> 4.000 <SEP> 8.000 <SEP> 40 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 26 <SEP> <4.000 <SEP> <4.000 <SEP> <4.000 <SEP> 1 <SEP> .600 <SEP> .000 <SEP> 800.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 27 <SEP> 16.000 <SEP> 8.000 <SEP> 80.000 <SEP> 40 <SEP> M <SEP> 8 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28 <SEP> 16.000 <SEP> 20.000 <SEP> 160.000 <SEP> 160 <SEP> M <SEP> 20.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 29 <SEP> 8.000 <SEP> <8.000 <SEP> 8.000 <SEP> 320.000 <SEP> 32.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> 4.000 <SEP> 20.000 <SEP> 8.000 <SEP> 1.600.000 <SEP> 40.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 31 <SEP> 200 <SEP> 2.000 <SEP> 200 <SEP> 10 <SEP> M <SEP> 2 <SEP> M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 32 <SEP> 2.000 <SEP> 2.000 <SEP> 2.000 <SEP> 4 <SEP> M <SEP> 4 <SEP> M <SEP>
<tb>
* Non corrigé pour la pureté.
Les pénicillines décrites dans les exemples 7, 8, 9, 11 à 22, 25, 27, 29 et 30 sont de nouvelles substances.