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Verfahren zur Herstellung von Penicillinen und deren nichttoxischen
Salzen Bakterizide Mittel, beispielsweise Benzylpenicillin, haben sich in der Vergangenheit
als außerordentlich wirksam bei der Bekämpfung von Infektionen erwiesen, die von
grampositiven Bakterienarten herrühren. Derartige Therapeutika weisen jedoch den
schwerwiegenden Nachteil auf, daß sie in wäßrigen sauren Medien, beispielsweise
bei der oralen Verabreichung, nicht stabil sind. Außerdem haben sie sich gegenüber
zahlreichen Bakterienstämmen als unwirksam erwiesen, welche Penicillinase erzeugen.
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Es sind auch bereits Verfahren zur Herstellung synthetischer Peniciiline
und ihrer Salze unter Verwendung von 6-Aminopenicillansäure als Ausgangsmaterial
bekannt, wobei die Anfinosäure mit einem entsprechenden Säurehalogenid oder Säureanhydrid
umgesetzt wird. Die bisher zugänglichen synthetischen Penicilline sind aber hinsichtlich
ihrer antibakteriellen Wirksamkeit noch nicht voll befriedigend.
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Es wurde nun gefunden, daß sich Penicilline und deren nichttoxische
Salze mit hoher Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterienarten herstellen lassen,
welche außerdem gegenüber Säuren und Penicillinase beständig sind.
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Demgemäß betrifft die Erfindung die Herstellung von Penicillinen
der allgemeinen Formel
und deren nichttoxische Salze, wobei R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen
oder die Allylgruppe bedeutet und R2 und R3 gleiche oder verschiedene Alkylgruppen
darstellen.
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Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Aminopenicillansäure
oder deren neutrale Salze oder 6-Aminopenicillansäure enthaltende Fermentationsbrühen
in an sich bekannter Weise mit einem Säurechlorid, -bromid, -anhydrid oder einem
gemischten Anhydrid einer Säure der allgemeinen Formel
umsetzt.
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Als gemischtes Anhydrid kann im Rahmen der Erfindung auch das einer
Säure der allgemeinen Formel II mit einem Kohlensäurealkylester verwendet werden.
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Die nichttoxischen Salze der Penicilline können Natrium-, Kalium-,
Calcium- und Aluminiumsalze sowie Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze
sein. Beispielsweise können derartige Salze von nichttoxischen Aminen, wie Trialkylaminen,
abgeleitet sein, zu denen unter anderem die folgenden Vertreter gehören: Triäthylamin,
p-Aminobenzoyl-A-diäthylaminoäthanolester, Dibenzylamin, N-Benzyl-p-phenäthylamin,
l-N-Methyl- 1 ,2-diphenyl-2-hydroxyäthylamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydroabietylamin,
N,N'-Bis-dehydroabietyläthylendiamin. Auch andere Amine können verwendet werden,
welche schon bisher zur Salzbildung mit Benzylpenicillin eingesetzt worden sind.
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Im Rahmen des Verfahrens werden vorzugsweise solche Penicilline hergestellt,
in denen die Gruppen R2 und R3 in der angegebenen Strukturformel jeweils eine Methylgruppe
darstellen.
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Die als Ausgangsstoffe dienenden Säurechloride, -bromide oder -anhydride
einer Säure der allgemeinen Formel II können aus der entsprechend trisubstituierten
Essigsäure nach einer Arbeitsweise erhalten werden, wie sie in der Literatur beispielsweise
für die a-Äthoxyisobuttersäure beschrieben worden ist.
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Eine Möglichkeit zur verfahrensgemäßen Herstellung eines Penicillins
unter Verwendung eines gemischten Anhydrides eines Chlorkohlensäurealkylesters besteht
darin, daß man eine Säure der allgemeinen Formel 11 mit einem Chlorkohlensäurealkylester
und einem tertiären aliphatischen Amin, z. B.
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Triäthylamin, etwa 30 Minuten lang in der Kälte (wobei die Temperatur
etwa 4 C betragen kann) in einem wasserfreien, inerten und vorzugsweise mit Wasser
mischbaren Lösungsmittel, wie Dioxan, vermischt, dem man gewünschtenfalls noch einen
kleinen Anteil von reinem, wasserfreiem Aceton zusetzt. Zu dieser Lösung des gemischten
Anhydrides wird dann eine gekühlte Lösung von 6-Aminopenicillansäure und einem tertiären
aliphatischen Amin. z. B. Triäthylamin, in einem Lösungsmittel, wie Wasser, zugesetzt.
Die Reaktionsmischung wird dann etwa 1 Stunde lang gerührt, wobei sich das substituierte
Ammoniumsalz des gewünschten Endproduktes bildet. Die Mischung kann dann bei einem
alkalischen pH Wert mit einem Lösungsmittel extrahiert werden, welches mit Wasser
nicht mischbar ist, um so den nicht umgesetzten Anteil der Ausgangskomponenten zu
entfernen. Das in der wäßrigen Phase befindliche Produkt wird dann, vorzugsweise
in der Kälte, unter einer Schicht von Äther durch Zusatz einer verdünnten Mineralsäure
in die freie Säure umgewandelt, wobei man beispielsweise mit 5 n-Schwefelsäure bis
zu einem pH-Wert von 2 ansäuert. Die freie Säure wird anschließend mit einem neutralen
organischen Lösungsmittel, wie Äther. extrahiert, welches mit Wasser nicht mischbar
ist. Der Extrakt wird schnell mit kaltem Wasser gewaschen und anschließend getrocknet.
Das in dem Atherextrakt als freie Säure vorliegende Reaktionsprodukt wird durch
Behandlung mit einer geeigneten Base, z. B. einem freien Amin, wie p-Aminobenzoylp-diäthylaminoäthanolester,
oder mit einer Lösung von Kalium-2-äthylcapronat in wasserfreiem n -Butanol in das
gewünschte Metall- oder Aminsalz übergeführt. Derartige Salze sind im allgemeinen
in organischen Lösungsmitteln, wie Äther, unlöslich und können daraus durch einfaches
Abfiltrieren in reiner Form gewonnen werden.
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Eine andere Methode zur Herstellung einer ätherischen Lösung eines
Penicillins der allgemeinen Formel I in der freien Säureform besteht darin, daß
man zunächst eine wäßrige Lösung von 6-Aminopenicillansäure und Natriumbicarbonat
herstellt, dann das betreffende Säurechlorid zusetzt und das Ganze bei Zimmertemperatur
während eines Zeitraumes von beispielsweise 20 bis 60 Minuten kräftig schüttelt.
Die Reaktionsmischung wird anschließend mit Äther extrahiert, wodurch das nicht
umgesetzte oder hydrolysierte Ausgangsmaterial entfernt werden kann. Die Lösung
wird weiter bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert und die gebildete freie Säure
des Reaktionsproduktes mittels Äther extrahiert. Der
ätherische Extrakt wird z. B.
über wasserfreiem Natriumsulfat entwässert, und nach Entfernen des Trocknungsmittels
läßt sich das Reaktionsprodukt ziemlich leicht aus der Ätherlösung isolieren, vorzugsweise
in Form eines in Äther unlöslichen Salzes, wie des Kaliumsalzes. Die vorstehend
beschriebenen Maßnahmen werden angewendet, falls das Säurechlorid schneller mit
einem primären Amin als mit Wasser reagiert, was sich durch einen einfachen Vorversuch
feststellen läßt. Bei dieser Arbeitsweise kann das Säurechlorid auch durch äquimolare
Mengen des entsprechenden Säurebromides oder Säureanhydrides ersetzt werden.
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Da es sich bei einigen der Verfahrensprodukte um relativ unstabile
Verbindungen handelt, welche sich unter Verlust ihrer antibiotischen Wirksamkeit
chemisch leicht zersetzen, ist es wünschenswert, die Reaktionsbedingungen ausreichend
mild zu wählen, um eine solche Zersetzung zu vermeiden. Die tatsächlich verwendeten
Reaktionsbedingungen hängen jedoch weitgehend von der Reaktivität der betreffenden
Reaktionskomponenten ab. In den meisten Fällen wird man einen Kompromiß zwischen
der Verwendung sehr milder Bedingungen während eines längeren Zeitraumes und der
Anwendung schärferer Bedingungen während eines kürzeren Zeitraumes schließen müssen
und im letzteren Falle eine gewisse Zersetzung der antibiotisch wirksamen Substanz
in Kauf nehmen.
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Die bei der Herstellung der neuen Derivate der 6-Aminopenicillansäure
angewandte Temperatur soll im allgemeinen 30- C nicht übersteigen, und in vielen
Fällen hat sich Zimmertemperatur als sehr geeignet erwiesen. Da ein stark saures
oder alkalisches Milieu bei dem Verfahren vermieden werden soll, hat es sich als
vorteilhaft erwiesen, das Verfahren in einem Bereich von pH-Werten zwischen 6 und
9 durchzuführen. Diesen Bedingungen kann gut durch Verwendung eines Pufferungsmittels
entsprochen werden, beispielsweise einer Lösung von Natriumbicarbonat oder eines
Natriumphosphatpuffers. Bei der Reaktion kommen im allgemeinen wäßrige Medien zur
Anwendung, zu denen auch filtrierte Fermentationsbrühen oder wäßrige Lösungen der
rohen 6-Aminopenicillansäure gehören, doch kann man auch organische Lösungsmittel
einsetzen, z. B. Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Chloroform, Aceton, Methylisobutylketon
und Dioxan. In vielen Fällen hat es sich als günstig erwiesen, eine wäßrige Lösung
eines Salzes der 6-Aminopenicillansäure zu einer Lösung des Acylierungsmittels in
einem inerten Lösungsmittel zuzusetzen, wobei vorzugsweise ein mit Wasser mischbares
inertes Lösungsmittel, wie Aceton oder Dimethylformamid, angewendet wird.
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Falls mehr als eine Phase in dem Reaktionsgemisch vorliegt, beispielsweise
eine feste und eine flüssige Phase oder zwei flüssige Phasen, so ist es ratsam,
sehr kräftig zu rühren.
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Nach Beendigung der Reaktion werden die erhaltenen Produkte gewünschtenfalls
mittels derjenigen Maßnahmen isoliert, welche auch bei der Darstellung von Benzylpenicillin
und Phenoxymethylpenicillin Anwendung finden. So kann das Reaktionsprodukt bei einem
sauren pH-Wert mit Diäthyläther oder n-Butanol extrahiert und daraus durch Lyophilisierung
oder Umwandlung in ein in dem betreffenden Lösungsmittel nicht lösliches Salz gewonnen
werden, wobei man für die Neutralisation
z. B. eine Lösung von Kalium-2-äthylcapronat
in n-Butanol verwendet. Das Produkt kann aber aus der wäßrigen Lösung auch in Form
eines wasserunlöslichen Salzes eines Amins ausgefällt oder direkt durch Lyophilisierung,
vorzugsweise in Form eines Natrium- oder Kaliumsalzes, abgetrennt werden.
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Wenn man zunächst ein Triäthylaminsalz hergestellt hat, so wird das
Reaktionsprodukt anschließend in die freie Säureform umgewandelt und erst dann in
andere Salze übergeführt, wie es auch bei Benzylpenicillin und anderen Penicillinarten
üblich ist.
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Wenn man beispielsweise ein Triäthylaminsalz des Penicillins in Wasser
mit Natriumhydroxyd behandelt, so bildet sich das entsprechende Natriumsalz, und
das frei werdende Triäthylamin kann durch Extraktion, z. B. mit Toluol, entfernt
werden. Bei der Behandlung des Natriumsalzes mit einer starken wäßrigen Säure wird
die Verbindung in ihre Säureform übergeführt, die dann durch Reaktion mit einem
freien Amin, wie p-Aminobenzoyl-p-diäthylaminoäthanolester, in andere Aminsalze
umgewandelt werden kann. Die so gebildeten Salze werden mittels Lyophilisierung
oder einfaches Abfiltrieren, falls das Produkt unlöslich ist, isoliert.
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Eine Arbeitsweise zur Isolierung des Reaktionsproduktes in Form eines
kristallinen Kaliumsalzes besteht darin, daß man die betreffende wäßrige Lösung,
deren pH-Wert etwa 2 beträgt, mittels Diäthyläther extrahiert, den Extrakt trocknet
und dann wenigstens 1 Äquivalent einer Lösung von Kalium-2-äthylcapronat in trockenem
n-Butanol zusetzt, deren Konzentration etwa 0,373 g des Salzes pro Milliliter des
Alkohols entspricht. Das sich bildende Kaliumsalz fällt im allgemeinen in kristalliner
Form aus und wird durch Abfiltrieren oder Abdekantieren isoliert.
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Unter Verwendung eines Stammes von Streptococcus pyogenes durchgeführte
Versuche bestätigten, daß das nach Beispiel 2 erhaltene Kaliumsalz der 6 - (a -
Allyloxyisobutyramido) - penicillansäure schon in einer minimalen Inhibitorkonzentration
von 0,25 mg/ml wirksam ist, während ein bekanntes synthetisches Penicillin ähnlicher
Struktur, nämlich das Natriumsalz des l-Propenylpenicillins, unter den gleichen
Bedingungen nur eine minimale Inhibitorkonzentration von 7 mg/ml aufweist.
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Weitere Angaben über die Wirksamkeit der Verfahrensprodukte finden
sich am Ende des jeweiligen Herstellungsbeispiels.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung noch näher.
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Beispiel 1 Kaliumsalz der 6-( a-Methoxyisobutyramido )-penicillansäure
11,8 g (0,1 Mol) a-Methoxyisobuttersäure werden in einer Mischung aus 20 ml Aceton
und 80 mol Dioxan aufgelöst. Während man die Lösung kräftig rührt und kühlt, werden
15 ml Triäthylamin zugesetzt. Die so erhaltene Lösung, deren Temperatur bei etwa
-5"C liegt, wird langsam mit einer Lösung von 13,6 g (0,1 Mol) Chlorkohlensäureisobutylester
in 15 ml Dioxan behandelt, wobei die Temperatur der Reaktionsmischung während des
Zusatzes unter 5"C gehalten wird. Anschließend mischt man dieser Acylierungsmischung
sehr schnell eine Lösung von 21,6 g (0,1 Mol) 6-Aminopenicillansäure in 100 mol
Wasser
und 15 ml Triäthylamin zu, wobei die Temperatur unterhalb 10"C gehalten wird. Die
so erhaltene klare Lösung wird 30 Minuten lang in der Kälte und dann noch weitere
2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird die Reaktionsmischung
mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und zweimal mit Äther extrahiert, um nicht
umgesetzte Reaktionskomponenten zu entfernen, wobei die Ätherextrakte verworfen
werden.
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Die wäßrige Schicht wird anschließend abgetrennt, mit 300 ml Äther
überschichtet, gekühlt und mit verdünnter Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von
2 angesäuert. Die das Reaktionsprodukt enthaltende Atherschicht wird anschließend
abgetrennt, zweimal mit kaltem Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat
entwässert, von dem Trockenmittel abfiltriert und mit 50 ml einer 400/oigen Lösung
von Kalium-2-äthylcapronat in n-Butanol behandelt. Das ausfallende Kaliumsalz der
6-(a-Methoxyisobutyramido)-penicillansäure wird durch Filtration von der Ätherphase
abgetrennt. Nach Anreiben mit Äther wird das Kaliumsalz bei Zimmertemperatur im
Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet, wodurch man 24,5 g eines wasserlöslichen
weißen Kristallpulvers erhält, das sich zwischen 234 und 236"C zersetzt. Die Ultrarotanalyse
erbringt den Nachweis, daß in dem Endprodukt die A-Lactam-Struktur vorliegt. Die
neue Verbindung verhindert das Wachstum von Staph. aureus Smith bei einer Konzentration
von 1,6 mcglml, und sie zeigt bei intramuskulärer Einspritzung an Mäusen gegenüber
derselben Bakterienart einen CDso-Wert von 1,8 mcg/kg.
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Beispiel 2 Kalium salz der 6-(a-Allyloxyisobutyramido)-penicillansäure
Unter Einsatz von 14,4 g (0,1 Mol) <i-Allyloxyisobuttersäure an Stelle von a-Methoxyisobuttersäure
wird, wie im Beispiel 1 erläutert wurde, verfahren.
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Das sich bildende Kaliumsalz der 6-(a-Allyloxyisobutyramido)-penicillansäure
fällt aus und wird durch Abfiltrieren isoliert. Nach Anreiben mit Äther wird das
Kaliumsalz bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet, und
es werden so 21,0 g eines wasserlöslichen weißen Kristallpulvers gewonnen, das sich
zwischen 232 und 234°C zersetzt. Aus der Ultrarotanalyse ergibt sich, daß in der
betreffenden Verbindung die p-Lactam-Struktur vorliegt. Die neue Verbindung verhindert
das Wachstum von Staph. aureus Smith bei einer Konzentration von 1,6 mcg/ml, und
sie zeigt gegenüber der gleichen Bakterienart bei intramuskulärer Einspritzung an
Mäusen einen Dso-Wert von 0,5 mcg/kg.
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Beispiel 3 Kaliumsalz der 6-(a-Isopropoxyisobutyramido)-penicillansäure
Unter Einsatz von 14,6 g (0,1 Mol) a-Isopropoxyisobuttersäure an Stelle von a-Methoxyisobutter
säure wird, wie im Beispiel 1 erläutert wurde, verfahren. Das sich ausscheidende
Kaliumsalz der 6-(a-Isopropoxyisobutyramido)-penicillansäure wird durch Abfiltrieren
isoliert. Nach Anreiben mit Äther wird dieses Kaliumsalz bei Zimmertemperatur
im
Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet, wodurch 29,3 g eines wasserlöslichen weißen
Kristallpulvers erhalten werden, welches sich zwischen 243 und 2440 C zersetzt.
Die Ultrarotanalyse bestätigt, daß in der neuen Verbindung die fl-Lactam-Struktur
vorliegt. Das Salz verhindert das Wachstum von Staph. aureus Smith bei einer Konzentration
von 3,125 mcgjml und zeigt gegenüber der gleichen Bakterienart bei intramuskulärer
Einspritzung an Mäusen einen Dso-Wert von 1,25 mcglkg.
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Beispiel 4 Kaliumsalz der 6-(a-Äthoxyisobutyramido)-penicillansäure
Unter Einsatz von 13,2 g (0,1 Mol) a-Äthoxyisobuttersäure an Stelle von a-Methoxyisobuttersäure
wird, wie im Beispiel 1 erläutert, verfahren. Das sich abscheidende Kaliumsalz der
6-(a-Äthoxyisobutyramido)-penicillansäure wird durch Abfiltrieren isoliert. Nach
Anreiben mit Äther wird dieses Kaliumsalz bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd
getrocknet, wobei 25,0 g eines wasserlöslichen weißen Kristallpulvers anfallen,
das sich zwischen 240 und 2430 C zersetzt. Eine Ultrarotanalyse bestätigt, daß die
Verbindung die ß-Lactam-Struktur aufweist. Das Salz verhindert das Wachstum von
Staph. aureus Smith bei einer Konzentration von 0,8 mcg/ml und zeigt gegenüber der
gleichen Bakterienart bei intramuskulärer Einspritzung an Mäusen einen Dso-Wert
von 5,6 mcg/kg.
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Beispiel 5 Kaliumsalz der 6-(a-Isobutoxyisobutyramido)-penicillansäure
Unter Einsatz von 16,0 g (0,1 Mol) a-Isobutoxyisobuttersäure an Stelle von a-Methoxyisobutter-
säure
wird, wie im Beispiel 1 erläutert wurde, verfahren. Das sich abscheidende Kaliumsalz
der 6 - (a - Isobutoxyisobutyramido) - penicillansäure wird von der überstehenden
Lösung abfiltriert. Nach Anreiben mit Äther wird dieses Kaliumsalz im Vakuum bei
Zimmertemperatur über Phosphorpentoxyd getrocknet, und es werden als Endprodukt
29,0 g eines wasserlöslichen weißen Kristallpulvers erhalten, das sich zwischen
237 und 239"C zersetzt.
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Die Ultrarotanalyse bestätigt, daß die neue Verbindung die ß-Lactam-Struktur
aufweist. Das Salz verhindert das Wachstum von Staph. aureus Smith bei einer Konzentration
von 0,8 mcglml.
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Beispiel 6 Kaliumsalz der 6-( a-n-Butoxyisobutyramido)-penicillansäure
Unter Einsatz von 16,0 g (0,1 Mol) a-n-Butoxyisobuttersäure an Stelle von a-Methoxyisobuttersäure
wird, wie im Beispiel 1 erläutert wurde, verfahren.
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Das sich abscheidende Kaliumsalz der 6-(a-n-Butoxyisobutyramido)-penicillansäure
wird durch Abfiltrieren isoliert. Nach Anreiben mit Äther wird dieses Kaliumsalz
im Vakuum bei Zimmertemperatur über Phosphorpentoxyd getrocknet, wodurch 26,0 g
eines wasserlöslichen weißen Kristallpulvers erhalten werden, das sich zwischen
233 und 235"C zersetzt. Eine Ultrarotanalyse bestätigt, daß die neue Verbindung
die ß-Lactam-Struktur aufweist.
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Das Salz verhindert das Wachstum von Staph. aureus Smith bei einer
Konzentration von 3,125 mcglml.