Verfahren zur Herstellung von Penicillinderivaten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Penicillinderivaten.
Pentylpenicillin (Penicillin-dihydro-F), Heptylpenicillin (Penicillin K) und wahrscheinlich gewisse andere niedrigere Alkylpenicilline lassen sich im üblichen Penicillinfermentationsprozess in Abwesenheit eines Präcursors herstellen. Unter Verwendung eines geeigneten Präcursors haben sich die meisten anderen n-Alkylpenicilline bis hinauf zum Heptylpenicillin herstellen lassen. Offensichtlich aber ist die Präcursormethode ungeeignet zur Herstellung höherer Alkylpenicilline. (Brown, Thorn und Johnson, Intern. Congr. Biochem., Abstrs. of Communs. ist Congr. Cambridge. 1949, 561; Chem: Abs.
1953, 47, 2937; Thron und Johnson, J. Amer.
Chem. Soc., 1950, 72, 2052; Mortimer und Johnson J. Amer. Chem. Soc. 1952, 74, 4098).
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich nun höhere Alkylpenicilline aus 6-Aminopenicillansäure herstellen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind wertvolle antibakterielle Agentien. Sie können als Zusätze zu tierischem Futter, als Agentien zur Behandlung von Mastitis bei Hornvieh und als therapeutische Präparate zur Behandlung insbesondere von Infektionen, verursacht durch Gram-positive Bakterien beim Federvieh, bei Säugetieren und beim Menschen Verwendung finden.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Penicillinderivate haben die allgemeine Formel
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worin R eine Alkylgruppe ist. Die Erfindung richtet sich ebenfalls auf die Herstellung nichttoxischer Salze der Säuren der allgemeinen Formel (I).
Solche nichttoxische Salze sind die Salze des Natriums, Kaliums, Kalziums und Aluminiums, die Ammoniumsalze und die substituierten Ammoniumsalze, z. B. Salze solcher nichttoxischer Amine, wie der Trialkylamine, einschliesslich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-B enzyl-ss-phenethylamin, 1 Ephenamin, N, N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydro abietylarnin, N, N'bis-dehydroabietyläthylendliamin und andere Amine, wie sie bisher zur Verwendung von Salzen des Benzylpenicillins Verwendung gefunden haben. Das erfindungsgemässe Verfahren betrifft weiterhin die Herstellung leicht hydrolysierbarer Ester von Säuren der allgemeinen Formel (I), welche durch chemische oder enzymatische Hydrolyse in die freie Säure aufgespalten werden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass 6-Aminopenicillansäure oder eines ihrer Neutralsalze, wie das Natriumsalz oder das Triäthyiaminsalz oder eine Flüssigkeit, welche 6-Aminopenicillansäure enthält, mit einem Acylierungsmittel der allgemeinen Formel R.(CH2)7.CO.Z worin Z ein bei der Acylierung primärer Aminogruppen austretender Rest ist, umgesetzt wird. Acylie rungsmittel der genannten Art sind z. B. die Säurehalogenide, insbesondere das Säurechlorid und das Säurebromid, ferner die Säureanhydride und gemischten Säureanhydride mit anderen Carbonsäuren, einschliesslich Monoester anderer Carbonsäuren und insbesondere niedrigere aliphatische Ester der Kohlensäure.
Mischanhydride, wie sie als Acylierlmgsmittel im erfindungsgemässen Verfahren Verwendung finden, können z. B. hergestellt werden, indem man Säuren der allgemeinen Formel R. (CH.2)7. COOH mit einem Alkylchlorcarbonat mischt und in Gegenwart eines tertiären Kohlenwasserstoff- oder aliphatischen Amins in einem wasserfreien inerten und vorzugsweise mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. in Dioxan und gegebenenfalls in einer geringen Menge reinen trockenen Acetons, während ungefähr 30 Minuten in der Kälte, z.B. bei 40 C, umsetzt.
Zur Lösung eines derart hergestellten Mischanhydrides kann hierauf eine abgekühlte Lösung von 6-Aminopenicillansäure und ein tertiäres Kohlenwasserstoffamin, z.B. Triäthylamin, in einem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, hinzugegeben wer- den, wobei sich das substituierte Ammoniumsalz des Endproduktes bildet. Die Mischung kann hierauf gegebenenfalls bei alkalischem pH-Wert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. mit Äther, extrahiert werden, um nicht umgesetzte Ausgangsprodukte zu entfernen. Das in der wässrigen Phase enthaltene Produkt kann hiernach in die freie Säureform übergeführt werden, was vorzugsweise in der Kälte unter einer Deckschicht von Äther durch Zugabe einer verdünnten Mineralsäure geschieht.
Anschliessend kann die freie Säure mit einem mit Wasser nicht mischbaren, neutralen, organischen Lösungsmittel, wie mit Äther, extrahiert werden, wonach der Extrakt mit Wasser gewaschen und anschliessend getrocknet werden kann.
Das im ätherischen Extrakt in freier Säureform vorliegende Produkt kann hiernach in jedes gewünschte Metall-oder Aminsalz übergeführt werden, indem man es mit der geeigneten Base, z. B. mit einem freien Amin, wie mit der Procainbase oder mit einer Lösung von Kalium-2-äthylhexanoat in trockenem N-Butanol, behandelt. Diese Salze sind normalerweise in Lösungsmitteln, wie Äther, unlöslich und können in reiner Form durch blosses Filtrieren abgeschieden werden.
Eine andere Arbeitsweise zur Herstellung einer ätherischen Lösung der Säureform des Penicillinderivates nach dem erfindungsgemässen Verfahren besteht in der Herstellung einer wässrigen Lösung von 6-Aminopenicillansäure und von Natriumbikarbonat, worauf Zugabe des Säurechlorids erfolgt. Anschliessend kann das Gemisch mit Äther extrahiert werden, um nicht umgesetzte oder hydrolysierte Ausgangsprodukte zu entfernen. Hiernach wird die Lösung angesäuert und anschliessend das Endprodukt in freier Säureform mit Äther extrahiert.
Der ätherische Extrakt kann hiernach getrocknet werden, z. B. mit wasserfreiem Natriumsulfat, worauf nach Entfernung des Trocknungsmittels eine trockene ätherische Lösung verbleibt, aus welcher sich das Produkt leicht abscheiden lässt, vorzugsweise in Form eines in Äther nichtlöslichen Salzes, wie des Kaliumsalzes. Diese Arbeitsweise wird mit Vorteil dann angewandt, wenn das Säurechlorid mit einem primären Amin schneller reagiert, als es dies mit Wasser tut, was durch einen einfachen Versuch leicht feststellbar ist. Bei dieser Arbeitsweise kann das Säurechlorid ersetzt werden durch äquimolekulare Mengen des entsprechenden Säurebromids oder Säureanhydrids.
Da einige der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen verhältnismässig instabile Substanzen sind, welche leicht chemischen Änderungen unterliegen, die einen Verlust ihrer antibiotischen Aktivität herbeiführen, erscheint es wünschbar, genügend milde Reaktionsbedingungen zur Vermeidung der Zersetzung der Substanzen einzuhalten. Die anzuwendenden Reaktionsbedingungen hängen naturgemäss weitgehend von der Reaktionsbereitschaft der umzusetzenden chemischen Substanzen ab.
In den meisten Fällen ist es erforderlich, dass ein Kompromiss geschlossen wird zwischen der Verwendung milder Reaktionsbedingungen während einer längeren Reak tionszeit und der Anwendung kräftigerer Reaktions- bedingungen während kürzerer Zeit mit der t. Möglich- keit einer Zersetzung eines Anteils der antibiotischen Substanz.
Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Prozesses eingehaltene Temperatur sollte im allgemeinen 300 C nicht überschreiten. In manchen Fällen ist Raumtemperatur geeignet. Stark alkalische oder saure Reaktionsbedingungen sollten beim erfindungsgemässen Herstellungsverfahren vermieden werden. Es ist vorteilhaft, das Verfahren im pH Bereich zwischen 6 und 9 durchzuführen, was in üblicher Weise durch Verwendung eines Puffers erreicht werden kann, z. B. mittels einer Lösung von Natriumbikarbonat oder einem Natriumphosphatpuffer. Das Verfahren kann ausser in wässrigen Medien, einschliesslich gefilterter Fermentationsbrühe oder wässriger Lösungen roher 6-Aminopenicillansäure, auch unter Verwendung organischer Lösungsmittel durchgeführt werden, z. B. Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Chloroform, Aceton, Methyl-Isobutyl-Keton und Dioxan.
Häufig ist es sehr vorteilhaft, eine wässrige Lösung eines Salzes der 6-Aminopenicillansäure zu einer Lösung des Acylierungsmittels in einem inerten Lösungsmittel und vorzugsweise in einem inerten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Aceton oder Dimethylformamid, hinzuzugeben. Kräftiges Rühren ist naturgemäss dann von Vorteil, wenn mehr als eine Phase zugegen ist, z. B. feste und flüssige oder zwei flüssige Phasen.
Nach Vollendung der erfindungsgemässen Umsetzung lassen sich die Endprodukte gegebenenfalls nach denjenigen Techniken isolieren, wie sie bei Benzylpenicillin und Phenoxymethylpenicillin bekannt sind. So kann das Produkt mit Diäthyläther oder n-Butanol bei saurem pH-Wert extrahiert werden und hiernach in ein lösungsmittelunlösliches Salz, z. B. durch Neutralisation einer n-butanolischen Lö sung von Kalium-2-äthylhexanoat, übergeführt werden. Das Produkt kann ferner aus wässriger Lösung als wasserunlösliches Salz eines Amins ausgefällt oder es kann direkt durch Lyophilisation gewonnen werden. Letzteres geschieht vorzugsweise in Form eines Natrium- oder Kaliumsalzes.
Wenn das Triäthylaminsalz gebildet wurde, lässt sich dieses in die freie Säureform und hernach in ein anderes Salz überführen in der Weise, wie dies bei Benzylpenicillin und anderen Penicillinen bekannt ist. So führt die Behandlung einer solchen Triäthylaminverbindung in Wasser mit Natriumhydroxyd zur Bildung des Natriumsalzes, wonach das Triäthylamin durch Extraktion, z. B. mit Toluol, abgetrennt werden kann.
Behandlung des Natriumsalzes mit starken Säuren führt zur Umwandlung in die Säureform, welche ihrerseits in andere Aminsalze, z. B. Salze des Procains, durch Reaktion mit der entsprechenden Aminobase übergeführt werden kann. Derart hergestellte Salze können durch Lyophilisation abgeschieden werden oder, sofern sie unlöslich sind, durch Filtrieren. Eine Arbeitsweise zur Isolierung des Produktes als kristallines Kaliumsalz besteht in der Extraktion des Produktes aus saurer wässriger Lösung (z. B. pH-Wert 2) mit Diäthyläther, trocknen des Ätherextraktes und Zugabe von wenigstens einem äquivalent einer konzentrierten Lösung von Kalium2-äthylhexanoat in trockenem n-Butanol. Das Kaliumsalz fällt aus, normalerweise in kristalliner Form, und kann durch Filtrieren oder Dekantieren gewonnen werden.
Beispiel 1
Herstellung von Octylpenicillin
Eine Lösung von 238 mg Nonansäure (Pelargonsäure) und 0,21 ml Triäthylamin in 5 ml trockenem Aceton wurde unter Rühren auf 0 C gekühlt. Hierzu wurde 0,13 ml Äthylchlorkarbonat in 3 ml trockenem Aceton tropfenweise im Verlauf von 5 Minuten zugegeben, wonach das Gemenge 30 Minuten lang bei 0 C gerührt wurde. Das ausgefallene Triäthylaminhydrochlorid wurde abfiltriert und das kalte Filtrat, welches das Mischanhydnd enthielt, wurde im Verlauf von 3 Minuten unter Rühren zu einer Lösung von 300 mg 6-Aminopenicillansäure in 3 %- iger wässriger Lösung von 8 ml Natriumbikarbonat bei 0 C zugegeben.
Das Gemenge wurde bis zur Erreichung von Zimmertemperatur gerührt, wonach das Rühren 2 weitere Stunden fortgesetzt wurde.
Anschliessend wurde es 2mal mit 10ml Äther gewaschen und die Waschlösungen verworfen. Die wässrige Phase wurde mit 5 ml Butanol überschichtet, auf 00 C abgekühlt und auf den pH-Wert 2 durch Zugabe von verdünnter Salzsäure eingestellt. Nach Schichtentrennung wurde die wässrige Phase 3mal mit 3-ml-Portionen Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte, welche in diesem Stadium die freie Penicillinsäure enthielten, wurden 2mal mit 8 ml Wasser gewaschen und hiernach mit 8 ml Wasser ausgeschüttet, welchem genügend 3 % ige Natriumbikarbonatlösung zugesetzt waren, um den pH Wert der wässrigen Phase auf 7 zu bringen. Die Butanollösung wurde weiter mit 4 ml Wasser extrahiert, dem ebenfalls genug Natriumbikarbonat zugesetzt worden war, um den pH-Wert der wässrigen Phase auf 7 zu halten.
Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 15 ml Ather gewaschen und hiernach bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck eingedampft, woraus das rohe Natriumsalz des Octylpenicillins zurückblieb. Nach dem Trocknen im Vakuumexsikkator erhielt man es in Form einer hygroskopischen, gelben, festen Substanz im Gewicht von 266 mg. Seine Reinheit ergab sich im Manometertest zu 63 %.
Das Produkt inhibierte Staph. aureus bei einer Konzentration von 0,006 mcg/ml.
Beispiel2
Herstellung von Nonylpenicillin
300 mg 6-Aminopenicillansäure wurden mit einem Mischanhydrid acyliert, das aus 263 mg Decansäure und 0,13 ml Äthylchlorkarbonat gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehen hergestellt worden war. Erhalten wurde das rohe Natriumsalz des Nonylpenicillins als leicht hygroskopische, gelbe, feste Substanz im Gewicht von 279 mg.
Seine Reinheit ergab sich im Manometertest zu 64 %.
Das Produkt inhibierte Staph. aureus bei einer Konzentration von 0,005 mcg/ml.
Beispiel 3
Herstellung von Pentadecylpenicillin
Eine Lösung von 302 mg Palmitoylchlorid in 4 ml trockenem Chloroform wurde tropfenweise unter Rührung zu einer Mischung von 216 mg 6-Aminopenicillansäure und 0,42 ml Triäthylamin in 8 ml trockenem Chloroform hinzugegeben. Das Gemenge wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gerührt, durch Filtrieren von einem geringen Anteil fester Substanz befreit und bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck eingedampft.
Der Rückstand wurde in einer Mischung von 15 ml Wasser und 10 ml Butanol gelöst und hiernach mit genügend normaler Salzsäure behandelt, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der wässrigen Phase nach kräftigem Schütteln ungefähr bei 2 lag. Hiernach wurden die Schichten getrennt und die wässrige Phase verworfen. Das Natriumsalz des Penicillins wurde abgeschieden aus der butanolischen Lösung durch Reextraktion mit verdünntem wässrigen Natriumbikarbonat, wie dies in den vorhergehenden Beispielen beschrieben worden ist. Eindampfen bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck hinterliess das rohe Natriumsalz des Pentadecylpenicillins als eine hellgelbe, feste Substanz im Gewicht von 214 mg. Im Manometertest ergab sich deren Reinheit zu 39 S.
Das Produkt inhibierte Staph. aureus bei einer Konzentration von 0,6 mcg/ml.