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Verfahren zur Anreicherung oder Isolierung von 6-Aminopenicillansäure
aus ihren wässerigen Lösungen In der belgischen Patentschrift 569 728 ist zum ersten
Mal die Darstellung von 6-Aminopenicillansäure beschrieben, diese neue Verbindung
hinsichtlich ihrer chemischen Eigenschaften charakterisiert und ihre Acylierung
zu wertvollen Antibiotica vom Penicillintyp aufgezeigt worden. Die in der belgischen
Patentschrift beschriebenen Maßnahmen beruhen auf der Entdeckung, daß in Gärungsmaischen
bzw. Fermentationsmedien eine neuartige Aminosäure vorkommt, welche die Bezeichnung
6-Aminopenicillansäure erhalten hat.
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Um diese neue Verbindung aus dem Fermentationsmedium zu isolieren,
ist in der belgischen Patentschrift eine Arbeitsweise vorgesehen, welche darin besteht,
daß man die Flüssigkeit zunächst klärt und dann soweit als möglich im Vakuum einengt.
Durch Einstellen des pH-Wertes auf etwa 3 werden bei der Fermentation gebildete
säureunbeständige Penicilline zersetzt und die ausgefällten Bestandteile abgetrennt.
In der sauren Lösung dann noch vorhandene Reste an Penicillinen werden beispielsweise
mittels Butylacetat daraus extrahiert. Die wässerige Phase wird nach der Neutralisation
und nochmaligen Abtrennung ausgeschiedener fester Bestandteile schließlich mittels
fester Ionenaustauscher behandelt, wobei die 6-Aminopenicillansäure vom Ionenaustauschermaterial
absorbiert und durch Eluieren mittels einer 0,05n-Salzsäure wiedergewonnen wird.
Durch Aufkonzentrieren dieses Eluates und Zusetzen von konzentrierter Salzsäure
kann die 6-Aminopenicillansäure in kristallisierter Form erhalten werden. Wie die
praktische Erfahrung gezeigt hat, beträgt die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure
mit einem Reinheitsgrad von etwa 80 °/o aber höchstens 25 °/o. Ein weiterer Nachteil
besteht darin, daß dieses Verfahren zur Isolierung der gewünschten 6-Aminopenicillansäure
nur diskontinuierlich durchgeführt werden kann, wodurch sich Schwierigkeiten bei
der kommerziellen Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ergeben.
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Es wurde nun eine verbesserte Arbeitsweise zur Anreicherung oder Isolierung
von 6-Aminopenicillansäure aus ihren wässerigen Lösungen gefunden, welche es ermöglicht,
die Ausbeute an dieser Säure wesentlich zu erhöhen, wobei der weitere Vorteil besteht,
daß sie sich ohne weiteres auch kontinuierlich durchführen läßt und daher die kommerzielle
Verarbeitung von Gärungsmaischen sehr vereinfacht.
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Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine wässerige
Lösung von 6-Aminopenicillansäure bei einem pg-Wert von 1 bis 3 mit einem kleineren
Volumen eines im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels
extrahiert wird, in welchem 0,5 bis 100/" auf das Gewicht der wässerigen
Lösung bezogen, einer oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel (RS03)xM
gelöst sind, in welcher Formel R ein Kohlenwasserstoffrest mit einem Molekulargewicht
von etwa 340 bis 510, M ein Wasserstoffatom oder ein Alkali- oder Erdalkalimetallatom
und x die Wertigkeit von M oder eines M-Gemisches ist, wodurch die Phase des organischen
Lösungsmittels abgetrennt und mit einem geringeren Volumen Wasser bei einem pH-Wert
von etwa 5 bis 8 extrahiert wird, und daß gegebenenfalls der wässerige Extrakt entweder
eingeengt und die 6-Aminopenicillansäure durch Ansäuern ausgefällt oder nochmals
mit einem organischenLösungsmittel unter Zusatz der vorstehend definierten Verbindungen
xetrahiert wird, worauf aus der organischen Schicht entweder durch Einstellen auf
einen pH-Wert von 3,5 bis 5,5 direkt oder aus einem wässerigen Extrakt derselben
durch Ansäuern die 6-Aminopenicillansäure ausgefällt wird.
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Bevorzugte Verbindungen,welche in dem organischen Lösungsmittel gelöst
werden, sind die Petroleumsulfonate
und Gemische derselben von
der allgemeinen Formel (C.H2n-1oSOa)xM in welcher n eine ganze Zahl zwischen 25
und 32 ist und x sowie M die gleiche Bedeutung, wie vorstehen angegeben,- haben.
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Besonders bevorzugt sind weiterhin Verbindungen mit einem Molekulargewicht
von etwa: 490 bis 510 mit der allgemeinen Formel RSO,Na in welcher R einen einwertigen,
ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 28 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet.
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Die Menge der in der Lösungsmittel-Extraktionsstufe des erfindungsgemäßen
Verfahrens verwendeten Petroleumsulfonate beläuft sich auf 0,5 bis 10°/a, vorzugsweise
1 bis 501", bezogen auf das Gewicht der wässerigen Lösung, aus welcher die 6-Aminopenicillansäure
extrahiert werden soll. Petroleumsulfonte sind im Handel in der Form von Gemischen
erhältlich, die im wesentlichen aus etwa 62 °/o Petroleumnatriumsulfonat, 33 °/o
Mineralöl und 5 °/o Wasser bestehen.
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Geeignete organische Lösungsmittel für die Durchführung der Extraktionsbehandlung
sind Alkanole mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie n- und Isoamylalkohol, Alkylcarbonsäurealkylester
und Dialkylketone mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen; wie Butylacetat oder n-Amylacetat
bzw. Äthylisopropylketon oder Äthyltert-butylketon, und Dialkyläther mit 3 bis 6
Kohlenstoffatomen je Alkylgruppe, wie Diisopropyläther und Diamyläther. Besonders
geeignet für die Zwecke der Erfindung sind n-Butanol und Methylisobutylketon.
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Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die bei der Extraktion
erhaltene Phase des organischen Lösungsmittels mit einem geringeren Volumen, z.
B. 1/5 Volumen, Wasser bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6,5
bis 7,0 extrahiert, wodurch man eine konzentrierte wässerige Lösung von 6-Aminopenicillansäure
erhält, die dann aus dieser konzentrierten wässerigen Lösung nach an sich bekannten
Methoden, wie sie beispielsweise in dem nachstehenden Beispiel 2 beschrieben sind,
ausgefällt werden kann.
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Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung- wird 6-Aminopenicillansäure
direkt aus der Phase des organischen Lösungsmittels ausgefällt, und zwar durch Einstellen
dieser Phase auf einen pH-Wert von etwa 3,5 bis 5,5 vorzugsweise etwa 4,0 bis 4,5,
mittels eines Zusatzes von Kationen; welche sich an das Petroleumsulfonat binden.
Diese Einstellung des pH-Wertes erfolgt zweckmäßig durch den Zusatz eines geringeren
Anteils einer wässerigen Lösung eines Alkalimetallhydroxyds, oder Erdalkalimetallhydroxyds,
z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Bariumhydroxyd oder Calciumhydroxyd oder
aber eines Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzes einer niederen aliphatischen
Carbonsäure, z. B. Kalium-äthylhexoat.
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Die Menge der 6-Aminopenicillansäure, welche in der ungereinigten
Ausfällung oder in einer Rohlösung enthalten ist, kann indirekt gemessen werden,
und zwar durch ein Verfahren, bei welchem die in der Lösung oder der Ausfällung
enthaltene 6-Aminopenicillansäure unter genormten Bedingungen mit Phenoxyacetylchlorid
zu Phenoxymethylpenicillin (Penicillin V) umgesetzt wird. Die so erhaltene Verbindung
wird dann bezüglich ihrer Wirksamkeit als Antibioticum mit Penicillin V verglichen.
Die Genauigkeit des biologischen Testes wird verbessert, wenn vorher alle Penicilline,
die gleichzeitig mit der 6-Aminopenicillansäure bei der Fermentation gebildet wurden,
aus der ungereinigten Ausfällung oder der Rohlösung entfernt werden entweder durch
Extraktion der wässerigen Testlösung bei einem pH-Wert von 2 bis 3 mit 1/s Volumen
Butanol oder, zweckmäßiger, indem man die Testlösung etwa 1/2 Stunde lang auf einem
pH-Wert von 2 bis 2,5 hält, nach welcher Zeit alle säureunbeständigen Penicilline
zersetzt sind.
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Bei der Durchführung dieses »Biotestes« wird ein bestimmter aliquoter
Teil (10 ml) der Testlösung durch einen Zusatz von festem Natriumbicarbonat im Überschuß
alkalisch gemacht und dann in Eis gekühlt; worauf ein bestimmtes Volumen Phenoxyacetylchlorid
enthaltendes Aceton hinzugesetzt wird. Die Menge an Phenoxyacetylchlorid beläuft
sich gewöhnlich auf 0,2 ml je Reagenzglas. Das Reaktionsgemisch wird 15 bis 20 Minuten
lang in Eis geschüttelt und dann' finit 1/2 Volumen Äther extrahiert. Die so extrahierte
wässerige Lösung wird dann gegen eine Norm von Penicillin G oder Penicillin V getestet.
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1 mg 6-Aminopenicillansäure mit einem Reinheits,-grad von
1000/, entspricht dabei 2752 Penicillineiri-' heiten. Die antibiotische Wirksamkeit
der 6-Aminö-` penicillansäure wird daher in solchen Penicillineinheiheiten ausgedrückt,
und bei Kenntnis des Trockengewichtes einer Testflüssigkeit kann daraus der Gehalt
an 6-Aminopenicillansäure berechnet werden. Die im Biotest gemessene antibiotische
Wirksamkeit ist daher auch ein Maßstab für den Reinheitsgrad der hergestellten 6-Aminopenicillansäure.
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In den nachstehenden Beispielen ist das »Petroleumnatriumsulfonatgemisch
I« ein im Handel erhältliches Gemisch mit einer Furolviskosität von etwa 175, däs
sich aus 62 Gewichtsprozent Petroleumnatriumsulfonaten mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 490 bis 510 von der allgemeinen Formel RS03Na in welcher
R ein ungesättigter Kohlenwasserstoffrest mit etwa 28 bis 31 Kohlenstoffatomen ist,
33 Gewio'hts= Prozent Mineralöl und 5 Gewichtsprozent Wasser"tt# sammensetzt.
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»Petroleumnatriumsulfonatgemisch II« hat eine Ftirolviskosität von
etwa 125 und enthält 62 Gewichts-Prozent Petroleumnatriumsulfonate mit einem durch=
schnittlichen Molekulargewicht von 440 bis 47'0 vbi der allgemeinen Formel RS03Na
in welcher R ein ungesättigter Kohlenwasserstoffrest mit 25 bis 28 Kohlenstoffatomen
ist, sowie 3f'Grewichtsprozent Mineralöl und 5 Gewichtsprozent'yV'ässer. Beispiel
1 Eine Gärungsmaische wurde gekühlt, mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt,
mit 0,50[" aktiver Kohle gemischt und filtriert. Man erhielt 101 einer wässerigen
Lösung, welche 400 y/ml (durch Biotest bestimmt) 6-Aminopenicillansäure enthielt.
Diese Lösung (p$ = 2) wurde im Gegenstrom in zwei Stufen mit einem Lösungsmittelgemisch
(mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt), welches 51 feüchtes n-Butanol
und 800 g des »Petroleumnatriumsulfo= natgemisches I« enthielt, extrahiert. Der
Butanolcktrakt, welcher 700 y/ml 6-Aminopenicillansäure -eint=
hielt,
wurde mitNatronlauge auf einenpH-Wert von 6,5 eingestellt und im Gegenstrom in zwei
Stufen bei p$ = 6,5 mit 1000 ml Wasser extrahiert. Der dabei anfallende Extrakt
war eine konzentrierte wässerige Lösung, welche 3000 y/ml 6-Aminopenicillansäure
(durch Biotest bestimmt) enthielt. Die Butanolphase kann wiedergewonnen und bei
weiteren Extraktionsstufen wieder verwendet werden.
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Wenn das bei dem vorstehenden Verfahren als Lösungsmittel verwendete
n-Butanol durch Methylisobutylketon, Butylacetat oder Diisopropyläther ersetzt wurde,
erhielt man praktisch die gleiche Konzentration an 6-Aminopenicillansäure. Die Verwendung
von Ammoniumhydroxyd, Calciumhydroxyd oder Natriumbicarbonat an Stelle von Natriumhydroxyd
in dem vorbeschriebenen Verfahren ergab praktisch die gleichen Resultate. Beispiel
2 Feste, rohe 6-Aminopenicillansäure erhielt man aus ihren konzentrierten, wässerigen
Lösungen durch die folgenden Verfahren: A. 1 1 der konzentrierten wässerigen Lösung
mit einem Gehalt von 3 g 6-Aminopenicillansäure pro Liter aus dem Verfahren nach
Beispiel l wurde bei einem pH-Wert von 2 mit 300 ml n-Butanol, welches 50 g des
»Petroleumnatriumsulfonatgemisches I« enthielt (31g Petroleumnatriumsulfonat, entsprechend
3,1 Gewichtsprozent der wässerigen Lösung), extrahiert. Der dabei anfallende Butanolextrakt
wurde- auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und gerührt, wobei 1,5 g 6-Aminopenicillansäure
(800 y/mg, durch Biotest bestimmt) ausgefällt und abfiltriert wurden. Die Ausbeute
an 6-Aminopenicillansäure beträgt also 50 °/o.
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B. 1 1 der gleichen konzentrierten wässerigen Lösung aus dem Verfahren
des Beispiels 1 wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit einem Gemisch
(p$ = 2) aus 500 ml n-Butanol und 80 g des »Petroleumnatriumsulfonatgemisches I«
extrahiert. Der Butanolextrakt wurde dann auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und
mit 50 ml Wasser extrahiert. Der dabei erhaltene wässerige Extrakt wurde auf einen
pH-Wert von 4 eingestellt und 2 Stunden lang gerührt, wobei Kristalle von 6-Aminopenicillansäure
ausgefällt und durch Filtrieren aufgesammelt wurden. Es wurden so 1 g 6-Aminopenicillansäure
mit einer Aktivität entsprechend 700 y/mg (durch Biotest bestimmt) erhalten, was
eine Ausbeute von 33 °/o bedeutet.
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C. 1 1 der gleichen konzentrierten wässerigen Lösung aus dem Verfahren
des Beispiels 1 wurde unter Vakuum bei 30° C auf 100 ml konzentriert und mit Salzsäure
auf einen pH-Wert von 4 angesäuert, worauf 3,0 g 6-Aminopenicillansäure mit einer
Aktivität entsprechend 500 y/mg (durch Biotest bestimmt) ausgefällt und durch Abfiltrieren
aufgesammelt wurden. Die Ausbeute betrug demnach 100 %.
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Beim Umkristallisieren von 6-Aminopenicillansäure wurden die noch
flüchtiges organisches Lösungsmittel enthaltenden Rohkristalle mit einer ausreichenden
Menge Wasser zu einer dicken Schlämme gemischt. Das Gemisch wurde mit konzentrierter
Natronlauge neutralisiert (pn = 6,8 bis 7,0). Das neutrale Gemisch wurde sodann
gerade mit so viel Wasser verdünnt, wie zum Auflösen der noch vorhandenen festen
Bestandteile notwendig war. Das Gesamtvolumen der Lösung wurde je 100 g geschätzten
Trockengewichts der 6-Aminopenicillansäure auf nicht mehr als 1 1 gehalten, um eine
maximale Ausbeute des Produktes zu erhalten. Zu der Lösung wurde aktivierte Knochenkohle
hinzugesetzt, und zwar 1,6 g/1, worauf das Gemisch 10 bis 20 Minuten lang gerührt
und dann filtriert wurde. Das klare Filtrat wurde mit konzentrierter Salzsäure langsam
bis zu eienm pH-Wert von 4,3 bis 4,5 angesäuert, wobei Kristalle ausgefällt wurden.
Das saure Gemisch wurde 1/z Stunde lang in der Kälte gerührt, worauf die Kristalle
der 6-Aminopenicillansäure abfiltriert wurden. Die Kristalle wurden zunächst mit
einer kleinen Menge leicht angesäuerten Wassers gewaschen, dann mit einer kleinen
Menge Aceton behandelt und schließlich bei Zimmerthemperatur unter Vakuum mehrere
Stunden lang getrocknet.
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Die so gereinigten Kristalle der 6-Aminopenicillansäure waren weiß
oder hell lohfarben, sie hatten eine Aktivität entsprechend 1000 y/mg (durch Biotest
bestimmt) und schmolzen bei 209 bis 210° C. Die Ausbeute an aktiver 6-Aminopenicillansäure
in der Form des unkristallisierten Niederschlages aus Rohkristallen belief sich
in der Regel über 90 %.
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Beispiel 3 Eine 6-Aminopenicillansäure enthaltende Gärungsmaische
wurde gekühlt und filtriert, wodurch man 101 gefilterte Maische erhielt. Diese Lösung
wurde mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und im Gegenstrom in
zwei Stufen mit einem mittels Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellten
Gemisch aus 51 feuchtem n-Butanol und 800 g des »PetroleumnatriumsulfonatgemischesINextrahiert.Der
Butanolextrakt wurde mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und im
Gegenstrom in zwei Stufen mit 1000 ml Wasser extrahiert. Der dabei anfallende Extrakt
war eine konzentrierte wässerige Lösung von 6-Aminopenicillansäure. Die das Sulfonat
enthaltende Butanolphase kann wiedergewonnen und bei den folgenden Extraktionsstufen
erneut verwendet werden.
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Wurde das in dem vorstehenden Verfahren als Lösungsmittel verwendeten
n-Butanol durch Methylisobutylketon, Butylacetat, Chloroform oder Diisopropyläther
ersetzt, dann erhielt man praktisch die gleiche Konzentration an 6-Aminopenicillansäure.
Die Verwendung von Ammoniumhydroxyd oder Natriumbicarbonat an Stelle von Natriumhydroxyd
ergab im wesentlichen die gleichen Resultate. Beispiel 4 500 ml einer filtrierten
Maische mir einer Aktivität, entsprechend 290 y 6-Aminopenicillansäure je ml (durch
Biotest festgestellt), wurden auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit einem
Gemisch aus 125 ml n-Butanol und 25 g des »Petroleumnatriumsulfonatgemisches II«
(15,5 g Petroleumnatriumsulfonat, entsprechend 3,1 Gewichtsprozent der Maische)
extrahiert, wobei die Extraktionsflüssigkeit mit Schwefelsäure vorher auf einen
pH-Wert von 2 eingestellt worden war. Man fand, daß die extrahierte wässerige Maische
nur noch eine Aktivität entsprechend 160y/mg hatte. Der Butanolextrakt (110 ml mit
einer Aktivität entsprechend 800 y/ml) wurde mit Natronlauge auf einen pn-Wert von
6,8 eingestellt und dann mit 25 ml Wasser extrahiert. Der wässerige Extrakt hatte
eine Aktivität entsprechend 2300 y/ml 6-Aminopenicillansäure.
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Bei ähnlichen Versuchen wurden in der Ansäuerungsstufe andere Mineralsäuren
und in der zweiten px-Einstellungsstufe andere Basen, z. B. Calciumhydroxyd,
Natriumbicarbonat,
Kaliumhydroxyd und Ammoniumhydroxyd, verwendet, wobei man gleiche Resultate erhielt.
In gleicher Weise haben Versuche dargelegt, daß bei dem vorstehend beschriebenen
Verfahren auch andere Lösungsmittel, z. B. Methylisobutylketon, Butylacetat und
Diisopropyläther, mit praktisch den gleichen Ergebnissen verwendet werden können.
Beispiel 5 1135,51 einer filtrierten Maische mit einer Aktivität entsprechend 375
y/ml (durch Biotest festgestellt) wurden mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von
2 eingestellt und dami im Gegenstrom mit einem Gemisch aus 33,81 feuchtem n-Butanol
und 23 kg des »Petroleumnatriumsulfonatgemisches I« (1,25 0/0 Petroleumnatriumsulfonat,
auf das Gewicht der Maische bezogen) extrahiert, welches vorher mit Schwefelsäure
auf einen pH-Wert von 2 eingestellt worden war. Die extrahierte wässerige Maische
enthielt nur noch 130 y/ml 6-Aminopenicillansäure (durch Biotest bestimmt), während
der Butanolextrakt eine Aktivität entsprechend 640 y/ml hatte. Der letztere (270,91)
wurde mit 39,21 Wasser gemischt, und das Gemisch wurde mit 1250 ml einer 500/0igen
Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Das resulrierende Gemisch wurde
in eine Butanolphase mit einer Aktivität entsprechend 230 y/ml und eine angereicherte
wässerige Phase (41,61) mit einer Aktivität entsprechend 2600 y/ml aufgetrennt.
Die angereicherte wässerigeLösung der 6-Aminopenicillansäure kann nach den in Beispiel
2 erläuterten Methoden zwecks Gewinnung von kristallisierter 6-Aminopenicillansäure
weiterverarbeitet werden, oder sie kann direkt zur Erzeugung von Phenoxymethylpenicillin
verwendet werden. Beispiel 6 Ein 500-ml-Anteil einer filtrierten Maische mit einer
Aktivität entsprechend 300 y/ml (durch Biotest bestimmt) 6-Aminopenicillansäure
wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und im Gegenstrom in drei
Stufen mit einem Gemisch aus 125 ml Methylisobutylketon und 18 g des Petroleumnatriumsulfonatgemisches
I (11,2 g Petroleumnatriumsulfonat, entsprechend 2,20/0. auf das Gewicht der Maische
bezogen) extrahiert, wobei die Lösung vorher mit Salzsäure auf einen pH-Wert von
2 eingestellt worden war. Der Lösungsmittelextrakt (etwa 120 ml) wurde mit einer
wässerigen Lösung von Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und
mit 25 ml Wasser extrahiert. Dieser wässerige Extrakt hatte eine Aktivität entsprechend
über 2000 y/ml 6-Aminopenicillansäure. Beispiel 7 Ein 500-ml-Anteil einer filtrierten
Maische mit einer Aktivität entsprechend 290 y/ml (durch Biotest festgestellt) 6-Aminopenicillansäure
wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit einem Gemisch aus 125 ml n-Butanol
und 10 g des »Petroleumnatriumsulfonatgemisches I« (6,2 g Petroleumnatriumsulfonat,
entsprechend 1,2°/0, auf das Gewicht der Maische bezogen) extrahiert, wobei die
Lösung vorher mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt worden war.
Die extrahierte wässerige Maische hatte nur noch eine Aktivität entsprechend 190
y/ml. Der Butanolextrakt (107 ml mit einer Aktivität entsprechend 800 y/ml) wurde
mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und dann mit 25 ml Wasser
extrahiert. Der so erhaltene wässerige Extrakt hatte eine Aktivität entsprechend
2000 y/ml 6-Aminopenicillan säure.