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La présente invention concerne un nouvel antibiotique soluble dans l'eau, présentant des propriétés basiques, qui sera désigné, dans ce qui va sui- vre, par la dénomination "lémacidine" ses composantes Bl, B2 et B3, leurs sels, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés ; concerne également un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" se forme lors de la culture d'un actinomycète de la famille du Streptomyces venezuelae, la souche A 9692. Cette sou- che a été isolée à partir d'une prise d'essai faite dans le sol à Roche, Canton de Waadt (Suisse) et elle est conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, Suisse),, Institut de Botanique Spé- ciale, sous cette désignation.
Le Streptomyces venezuelae A 9692 forme un mycélium aérien rose à brun-cannelle et porte des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typi- que de la famille des Streptomyces. Les chaînes de spores sont rigides, droites ou légèrement ondulées; on ne peut jamais observer la formation de spirales ou de verticilles. Les diverses spores, sont lisses. Il ne se forme pas d'exopigment apparent. Les milieux peptonés subissent une décoloration mélanodique en brun- noir. La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance de la souche A 9692 sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7, ainsi que 10, ont été préparés suivant W. Lindenbein, "Arch. Mikrobiol" 17, 361 (1952).
1) Gélose synthétique : Croissance grêle, voilée, jaune-clair.
Mycélium aérien, velouté, carmin pale.
2) Milieu synthétique liquide : Croissance peu abondante. Sédiment, flocons, jaune-clair.
3) Gélose-glucose Croissance grêle, voilée, brun-clair.
Le mycélium aérien fait défaut. Substratum brun-foncé.
4) Gélose-glucose à l'asparagine: Croissance grêle, voilée, brun-clair.
Mycélium aérien velouté, blanc-crayeux au début, plus tard brun-cannelle.
5) Gélose au malate de calcium : Croissance peu abondante, punctiforme, jaune- clair. Mycélium aérien d'un blanc neigeux.
6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C: Croissance superficielle, voilée, brun-clair.
Substratum brun-foncé. Liquéfaction sur
1,5 cm au bout de 14 jours.
7) Gélose à l'amidon : Croissance grêle, voilée, jaune-clair. Mycélium aérien d'un blanc neigeux au début, plus tard carmin pâle. Hydrolyse au bout de 10 jours
0,9 à 1,2 cm.
8) Pomme de terre : Croissance très abondante, voilée au début et jaune-clair, plus tard rugueuse et brun-clair.
Mycélium aérien brun-cannelle. Substratum brun fonc:é .
9) Carotte Croissance très peu abondante, punctiforme, jaune-clair. Le mycélium aérien fait défaut.
10) Lait de tournesol : Croissance bonne, pellicule jaune-clair.
Substratum bleu. Peptonisation lente. Coagula- tion bonne.
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de la souche A 9692 sont celles de la catégoriè du Streptomyces venezuelae d'Ehrlich et autres.
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On sait que le Streptomyces venezuelae produit un antibiotique, notamment la chlo- romyoétine (Ehrlich J.. Barth Q.R., Smith R.M., Joslyn D.A et Burkholder P. R., Science 106, 417 1947 Cet antibiotique se distingue du nouvel antibiotique dénommé "lémacidine" déjà par le fait qu'à l'encontre de celui-ci il peut être extrait du filtrat de culture à l'aide de solvants organiques et que, de plus, il ne possède pas de propriétés basiques.
La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la pré- paration de l'antibiotique dénommé "lémacidine", à l'utilisation du Streptomyces venezuelae A 9692 ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'a- zote.
Pour obtenir l'antibiotique dénommé "lémacidine", on cultive de ma- nière aérobie une souche de Streptomycètes présentant les propriétés du Strep- tomyces venezuelae A 9692, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibiotique notable, puis on isole ensuite l'antibiotique dénommé "lémacidine".
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière-immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, s'avère appropriée une température compri- se entre 18 et 40 . En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet an- tibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Comme sources de carbone assimilable, on envisage par exemple le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon, la mannite, ainsi que la glycérine.
Comme substances nutritives azotées et comme substances favorisant le cas échéant la croissance, on citera : des acides aminés, des peptides et des protéines, ainsi que leurs produits de dégradation comme les peptones ou les tryptones, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais et le froment, des résidus de distillation provenant de la préparation d'alcools, des levures, des fèves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, etc...,mais aussi des nitrates. Comme autres sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer, par exemple, des chloru- res, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux, du magné- sium, du fer, du zinc et du manganèse.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" que l'on peut préparer suivant la présente invention est une substance soluble dans l'eau qui, d'après des examens effectués par chromatographie sur papier, est constitué par trois compo- sés vraisemblablement très proches. Il est complètement insoluble dans les sol- vants organiques,.surtout dans les solvants lipoides. L'antibiotique est basique et forme des sels qui, comme par exemple le chlorhydrate, sont en partie solu- bles dans certains solvants organiques comme les alcools aliphatiques inférieurs.
Lorsqu'on effectue la culture dans des milieux aqueux, 7.:'antibiotique se trouve presque complètement dans la solution nutritive alors que le mycélium séparé de cette dernière ne présente pratiquement pas d'activité antibiotique.
D'après ces propriétés, on ne peut pas, en vue d'obtenir l'antibioti- que dénommé "lémacidine", extraire celui-ci d'une solution de culture à l'aide de solvants organiques. On peut, par contre, dans les cas d'une réaction neutre ou faiblement alcaline, le soutirer à l'aide d'agents d'adsorptiôn et l'extraire des adsorbats à l'aide de liquides d'élution acides présentant avantageusement un pH inférieur à 4. Comme agents d'adsorption, on envisage, d'une part, du charbon actif, par exemple de la norite et, d'autre part, des échangeurs de ca- tions, notamment ceux renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple
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la résine échangeuse qu'on trouve dans le commerce sous la dénomination "Amberlite IRC-50".
Si l'on utilise du charbon actif comme agent d'adsorption, il est alors approprié d'utiliser comme liquides d'élution aussi bien des solutions acides aqueuses que des solvants miscibles à l'eau renfermant des acides, comme des al- cools aliphatiques inférieurs et des cétones. Un mélange à parties égales en vo- lume de méthanol et d'acide formique normal s'est avéré particulièrement avanta- geux.
Etant donné qu'en dehors de l'antibiotique le charbon actif adsorbe en- core de la solution de culture d'assez grandes quantités d'impuretés qui sont en partie colorées, on lave avantageusement la colonne d'adsorption, avant l'élution de l'antibiotique, les conditions restant quant au reste inchangées, avec de l'éthanol, ce qui fait qu'on élimine une grande partie des substances accompagna- trices, mais qu'on n'extrait toutefois pas l'antibiotique.
A partir de l'éluat acide, on peut obtenir sous la forme d'une poudre blanche une préparation forte- ment enrichie d'antibiotique, en concentrant l'éluat sous vide jusqu'à un petit volume, ce qui fait que le solvant organique ainsi que la majeure partie de 1' acide formique sont éliminés, et en ajoutant ensuite de 1' acétone au concentrât aqueux, avantageusement après avoir dilué avec 4 à 5 parties en volume de métha- nol, en lavant avec de l'acétone le précipité formé, puis finalement en séchant.
Etant donné que l'éluat obtenu au charbon, notamment à partir de cultures avec des solutions nutritives renfermant du carbonate de calcium, renferme des quanti- tés notables d'ions Ca, on sépare avantageusement le calcium à l'aide d'acide oxalique avant de précipiter l'antibiotique du concentrat.
Pour adsorber l'antibiotique avec un échangeur de cations, on utilise avantageusement ledit échangeur sous forme hydrogénée. L'élution a lieu avec une solution aqueuse diluée d'acide, le cas échéant après avoir préalablement lavé la colonne à l'eau distillée, ce qui fait qu'on élimine les substances accom- pagnatrices inactives. Comme agent d'élution, il est particulièrement approprié d'utiliser de l'acide chlorhydrique 0,2-normal. L'antibiotique est renfermé dans l'éluat sous la forme d'un sel. Les éluats obtenus avec des échangeurs de cations peuvent, en tant que tels, ou après concentration sous vide, le cas échéant après une neutralisation préliminaire, servir à l'obtention d'autres préparations en- richies en antibiotique.
Pour préparer à l'état pur l'antibiotique dénommé "lémacidine", à partir de préparations préalàblement purifiées par une adsorption effectuée avec du charbon ou des échangeurs d'ions, on ajoute, à leur solution aqueuse ajus- tée à un pH de 6,5 à 7,0, le volume, juste nécessaire pour une précipitation complète, d'une solution aqueuse du sel d'un colorant azolque renfermant des groupes sulfoniques, puis isole le sel de colorant de l'antibiotique difficile- ment soluble qui s'est formé.
Si l'on utilise comme sel de colorant azoïque le sel de sodium de l'acide 4'-diméthylamino-azobenzène -4-sulfonique qu'on trouve dans le commerce sous la dénomination Hélianthine ou Orange III, le sel de colorant "Hélianthate" se sépare alors totalement ou partiellement sous forme cristallisée en l'antibiotique dénommé "lémacidine". L'hélianthate de l'antibio- tique peut être recristallisé dans l'eau ou le méthanol ou dans des mélanges des deux, mais aussi dans du formamide et de l'eau. A l'état recristallisé, il constitue une poudre brun-rouge à l'oeil nu.
Examiné au microscope, il se pré- sente sous la forme de paillettes jaunes irrégulièrement formées qui sont dis- posées en couche, ou également sous la forme d'aiguilles, qui fondent à 202- 203 en se décomposant.,
Pour récupérer l'antibiotique du sel de colorant, on ajoute à celui- ci, en milieu aqueux ou alcoolique, le sel obtenu à partir d'un acide inorganique ou organique et d'une base organique, ce qui fait qu'il se forme le sel de 1' antibiotique avec l'acide correspondant et le sel de colorant de la base. Si 1' on utilise, pour cette réaction, du sulfate de triéthylamine, par exemple, et si l'on effectue ladite réaction avec une suspension aqueuse de l'hélianthate
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de l'antibiotique, on obtient alors le sulfate de l'antibiotique qui est soluble dans l'eau, ainsi que l'hélianthate de triéthylamine qui est insoluble.
En ajou-: tant une quantité suffisante de méthanol, à la solution réactionnelle, cette dernière passe en solution, tandis qu'il se sépare le sulfate de l'antibiotique qui n'est soluble que dans l'eau, mais est par contre complètement insoluble dans les alcools inférieurs, ledit sulfate pouvant, par exemple, être isolé par fil- tration. La réaction peut cependant être également entreprise dans une solution alo.oolique ou dans une solution alcoolique aqueuse, le sulfate précipitant aussi- tôt et pouvant être séparé de la solution de colorant.
Le sulfate de l'antibioti- que dénommé "lémacidine" que l'on obtient constitue une poudre incolore d'une haute activité antibiotique, qui est facilement soluble dans l'eau et le forma- mide, mais est par contre insoluble dans les solvants organiques comme les al- cools et les cétones.
A partir du sulfate, on peut, par réaction en solution aqueuse sur du chlorure de baryum et par isolement à partir de la solution débarrassée du sul- fate de baryum, obtenir par exemple le chlorhydrate de l'antibiotique sous la forme d'une poudre à peine colorée qui est facilement soluble dans l'eau, ainsi que dans le méthanol, mais est plus difficilement soluble dans l'éthanol. Par ailleurs, il est également possible de préparer le chlorhydrate directement à partir de l'hélianthate de l'antibiotique, en ajoutant, à une solution ou sus- pension de ce dernier dans du méthanol, un excès d'acide chlorhydrique concentré ou d'une solution de gaz chlorhydrique dans le méthanol, en précipitant à l'éther le chlorhydrate formé et en isolant.
Pour débarrasser de minimes impuretées co- lorées le chlorhydrate préparé suivant ces méthodes, on filtre une solution mé- thanolique dudit chlorhydrate à travers une colonne de charbon actif, de préfé- rence de suie de gaz, ce qui fait qu'après évaporation du solvant le chlorhydra- te est obtenu à partir du filtrat sous la forme d'une poudre d'un blanc pur qui, lors d'une très lente évaporation, se sépare, en solution aqueuse ou méthanoli- que, en partie sous forme cristalline.
La préparation sous forme pure de l'antibiotique dénomme "lémacidine" peut aussi avoir lieu en précipitant celui-ci sous la forme d'un sel difficile- ment soluble à partir de solutions aqueuses, à l'aide d'un acide organique, par exemple du type de l'acide picrique, comme l'acide picrique proprement dit ou l'acide styphnique, ou bien à l'aide d'acide picrolonique. Le picrate et le styph- nate précipitent d'abord sous forme liquide, à l'état de gouttelettes huileuses qui se solidifient peu à peu par un repos à la température ambiante ; on n'a pu toutefois jusqu'à présent les amener à cristallisation. Par contre, on peut cristalliser le picrolonate. Les bâtonnets jaunes, irréguliers, rassemblés en druses fondent, après suintement préalable, à 202 C en se décomposant.
Ces sels difficilement solubles peuvent, par traitement avec des acides comme l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique par exemple, en milieu aqueux ou dans un sol- vant organique non-miscible à l'eau comme le méthanol ou l'acétone, être trans- formés en sels correspondants et être isolés comme tels. Suivant ce procédé d' enrichissement, on peut obtenir l'antibiotique, par exemple à partir du sulfa- te purifié en passant par l'hélianthate, mais aussi à partir des adsorbats ob- tenus au charbon ou avec des échangeurs de cations.
Un autre sel cristallisé, difficilement soluble dans l'eau, de l'antibiotique dénommé "lémacidine", est constitué par le Reineckate qui cristallise en paillettes irrégulières et présen- te un point de décomposition de 198-2000C.
La base libre de l'antibiotique dénommé "lémacidine" est facilement accessible à partir de ces sels, à partir du sulfate par exemple par réaction en milieu aqueux avec de l'hydroxyde de baryum, par neutralisation de la bary- te en excès avec du dioxyde de carbone ainsi que par séparation du précipité de carbonate de baryum et de sulfate de baryum, et par isolement de l'antibio- tique-base à l'aide d'un séchage par réfrigération.
La préparation à partir des sels a lieu plus simplement en utilisant un échangeur d'anions fortement basique, par exemple la forme hydrogénée du produit qu'on trouve dans le commerce sous la
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dénomination "Dowex -2". '
L'antibiotique dénomme "lémacidine" est une base amorphe, incolore, qui est facilement soluble dans l'eau et dans les milieux aqueux, mais est par contre insoluble dans les solvants organiques. La solution aqueuse de la base présente une réaction alcaline. Une solution à 1% d'une préparation obtenue à l'aide d'échangeurs d'ions présente un pH de 8,6.
Avec les acides, l'antibiotique dénommé "lémacidine" forme des sels parmi lesquels, par exemple, le sulfate incolore et le chlorhydrate sont très facilement solubles dans l'eau. Le chlorhydrate se dissout, en outre, dans les alcools aliphatiques inférieurs, notamment dans le méthanol.
Lors d'une évaporation très lente de solutions aqueuses ou méthano- liques, on peut obtenir le chlorhydrate de l'antibiotique sous forme cristalline.
Il présente la composition élémentaire suivant : C = 37,3 %, H = 7,0 %, N = 16,8 %, 0 = 20,8 % (calculé), Cl = 18,1 %; [a]20D = + 24,4 (o = 1,0 dans 1' eau).
Les valeurs correspondantes pour le sulfate de l'antibiotique sont les suivantes ; C = 35,0 %, H = 6,9 % N = 11,6 %, 0 = 38,2 % (calculé), S = 8,3 %; [a] 27D = + 56 (c = 0,95 dans l'eau).
Le sel coloré de la base avec l'acide 4'-diméthyl-amino-azobenzène- 4-sulfonique ( hélianthate) est difficilement soluble aussi bien dans les mi- lieux aqueux que dans les milieux alcooliques. A partir de solutions saturées chaudes de ce genre, il se sépare sous la forme de paillettes de couleur jaune irrégulièrement formées qui, vues au microscope, sont disposées en couches, et aussi sous la forme d'aiguilles, qui après recristallisation présentent un point de décomposition de 202-203 C.
D'autres sels de l'antibiotique dénommé "lémacidine" dérivent, par exemple, des acides acétique, palmitique, succinique, citrique, pantothénique, ascorbique, ou d'acides aminés comme la leucine ou la méthionine .
Le chlorhydrate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" donne une réaction positive à la ninhydrine, une réaction faiblement positive au biuret et une réaction d'Elson-Morgan faiblement positive, tandis que le test au maltol et le test de Sakaguohi sont négatifs. Comme le montre un examen comparatif effectué par chromatographie sur papier, il est différent des antibiotiques incolores, solubles dans l'eau, qui sont actifs contre les bactéries Gram-positives et Gram- négatives.
Le chlorhydrate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" peut, par une chromatographie sur papier, être scindé en trois composants Bl, B2 et B3 qui sont vraisemblablement très proches. Si l'on utilise, par exemple, comme système sol- vant un mélange de 3 parties d'éthanol et d'une partie d'eau renfermant 2 % de chlorure de sodium, et fait égale à l'unité la valeur de Rf ( = RB) de la compo- sante B3 migrant le plus rapidement (substance de référence), il en résulte .alors pour les deux autres composantes Bl et B2 des'valeurs de RB de 0,34 et 0,61, res- pectivement.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" possède une forte activité antibi- otique vis-à-vis de divers organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode-test in vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37 pendant 24 heures, on a les concentrations suivantes qui sont en- core inhibantes :
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L'antibiotique dénommé "lémacidine: est également actif in vivo. Cinq injections sous-cutanées de 1 mg/kg pratiquées sur des souris infectées au Micro- coccus pyognes, var. aureus donnent 100 % de survivantes.
Lorsqu'on administre de manière identique 5 mg/kg à des souris infectuées à l'Escherichia coli, on observe un effet analogue, de même qu'on observe un effet chez les souris infec- tées au Salmonella typhi murium.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" présente à vrai dire une certai- ne toxicité; toutefois, une administration sous-cutanée de 50 mg de chlorhydrate d'antibiotique par kg est relativement bien supportée par les souris. Le sulfate et le pantothénate sont un peu moins toxiques que le chlorhydrate et le sel de l'acide L(+)-ascorbique ainsi que les sels des acides aminés que sont la L(-)-leu- cine et la L(-)-méthionine sont notablement moins toxiques que le chlorhydrate.
L'antibiotique, ses composantes Bl, B2 et B3 et leurs sels peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques. Ces dernières renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale. Pour la formation de cette matiè- re de support, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux com- posés comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magné- sium, le talc, des huiles végétales, les alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline,'.la cholestérine ou autres excipients connus.
Les préparations peuvent se présenter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, de poudres , d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires, telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsi- fiants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutique- ment précieuses.
L'invention concerne également,à titre de produits industriels nou- veaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades.
EXEMPLE 1.
On cultive le Streptomyces A 9692 suivant le procédé de culture im- mergée. On utilise une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, les substances additionnelles suivantes :
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<tb> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
La solution nutritive est stérilisée pendant 20 à 30 minutes, sous une pression d'une atmosphère effective, dans le ballon d'ensemencement ou dans les fermenteurs. La solution nutritive stérilisée présente un pH de 7,0 à 7,5.
L'ensemencement a lieu avec jusqu'à 10 % d'une culture végétative, partiellement sporulente, de l'organisme. On incube à 21-27 , en secouant bien ou en agitant, les cultures étant aérées dans les fermenteurs avec environ un volume d'air sté- rile par volume de solution et par minute : après 30 à 50 heures d'incubation, la solution de culture atteint sa valeur inhibante maximum vis-à-vis des organismes- tests (Bacillus megatherkun, Escherichia coli, Candida vulgaris). On interrompt la culture et sépare pai filtration ou centrifugation de la solution renfermant l'antibiotique le mycélium qui n'est que faiblement actif, ainsi que d'autres composantes solides, en ajoutant le cas échéant à la solution de culture, avant
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la filtration, environ 1 % d'un auxiliaire de filtration, par exemple de l'Hy- flosupercel.
Le pH du filtrat de culture n'est, en général, pas modifié ou ne 1' est que peu, en comparaison de la solution nutritive stérilisée.
Si l'on utilise, à la place de la solution nutritive indiquée ci- dessus, une solution renfermant, par litre d'eau du robinet, les mélanges de sub- stances nutritives qui sont indiqués sous a) à g), on obtient alors, après une culture et un traitement analogues, des filtrats de culture d'une activité anti- biotique aussi forte. Au lieu d'obtenir une filtration rapide de la solution de culture en y ajoutant de l'Hyflo Supercel ou un autre auxiliaire de filtration, on peut aussi l'obtenir en ajustant la solution de culture, avant filtration, à un pH de 5 à l'aide d'acide chlorhydrique, puis ensuite en l'ajustant, par ad- dition d'une solution aqueuse de sulfate d'aluminium, à une concentration de 0,5 % en ce sel.
Les mélanges de substances nutritives renfermant, par litre d'eau, les substances additionnelles suivantes, sont également appropriés :
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<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 40 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Distillers <SEP> Solubles <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> dE;
<SEP> sodium <SEP> 20 <SEP> g
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<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> b) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> (eau <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> gonflement <SEP> du <SEP> mais)
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<tb>
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Un filtrat ou un centrifugeât (obtenu suivant les indications ci- dessus) d'une culture de Streptomyces A 9692 présente, en général, un pH de 7,0 à 7,5.
Si ce n'est pas le cas, on ajuste, pour l'enrichissement suivant du nouvel
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antibiotique, le pH à cette valeur à l'aide d'une solution décanormale d'hydroxyde de sodium. Le filtrat faiblement alcalin est ensuite, en vue de l'adsorption de l'antibiotique, additionné de l% de charbon actif (norite) et la masse est agi- tée mécaniquement pendant une heure, la totalité de la substance actice du point de vue antibiotique étant adsorbée par le charbon. Ce dernier est séparé par fil- tration , avantageusement avec addition d'un peu d'un auxiliaire de filtration, comme par exemple de l'HyfloSupercel, de la solution complètement insctive qui est presque limpide comme de l'eau.
Outre l'antibiotique, le charbon adsorbe encore de grandes quanti- tés d'autres substances organiques inactives du point de vue antibiotique, sur- tout des produits de dégradation fortement colorés qui proviennent de la solu- tion nutritive, mais également des sels inorganiques. Ces substances accompagna- trices sont, avant l'élution de l'antibiotique, avantageusement éliminées du char- bon. A cet effet, la masse de charbon filtrée, encore humide, est introduite dans une quantité quintuple d'éthanol à 95% et la suspension est agitée pendant une demi-heure. Le charbon ainsi préalablement lavé peut, par filtration, être facilement séparé du liquide de lavage. Le filtrat de couleur brune ne présente pas d'activité antibiotique.
L'élution du nouvel antibiotique a lieu avec une solution acide- aqueuse de méthanol, avantageusement avec un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'acide formique normal, en utilisant 2 cm3 du liquide d'élution par gramme de l'agent d'adsorption. La suspension est bien agitée mécaniquement pendant une demi-heure, puis filtrée, après quoi le résidu de charbon est à nou- veau extrait à trois reprises de la même manière. Les éluats, parmi lesquels seul le premier est de couleur faiblement jaunâtre alors que les autres sont incolores, présentent la totalité de l'activité antibiotique. On les réunit et les concentre sous vide, à une basse température de bain, par exemple à 40-60 , jusqu'au centième du volume initial, ce qui fait qu'en dehors du méthanol et de beaucoup d'eau on élimine également la majeure partie de l'acide formique.
Le pH du concentrât de couleur jaunâtre, mais fluide, est en général de 4.
Le concentrat renferme, notamment lorsque la culture a été effectuée suivant le premier paragraphe ou suivant a) à d), d'assez grandes quantités de calcium. On élimine celui-ci sous la forme de l'oxalate difficilement soluble, en ajoutant au concentrât, tout en agitant, une solution aqueuse à 10 % d'acide oxalique. La quantité de la solution d'acide oxalique qui est nécessaire pour une précipitation complète est exactement déterminée dans une partie aliquote.
Pour des concentrats de cultures avec du carbonate de calcium, on a besoin, en général, de 300 à 500 em3 de solution d'acide oxalique par litre de concentrât, ce qui correspond à 3-5 cm3 par litre du filtrat de culture initial, tandis que les concentrats obtenus à partir de solutions de culture, sans addition de car- bonate de calcium, nécessitent des quantités moindres.
A partir du concentrat débarrassé du calcium, on obtient l'antibio- tique sous la forme d'une poudre blanche, fortement enrichie, en diluant le concen- trat aqueux d'abord avec 4 à 5 volumes de méthanol, puis en précipitant ensuite la matière active avec 20 volumes d'acétone. On sépare le précipité par filtra- tion, le lave à deux reprises avec de l'acétone et finalement le débarrasse sous vide des restes de solvant. On obtient une poudre d'un blanc pur qui présente à peu près la totalité de l'activité antibiotique du filtrat de culture. Le ren- dement est d'environ 300 mg par litre de filtrat de culture.
EXEMPLE 2.
On peut obtenir un enrichissement de l'antibiotique dénommé "lémaci- dine" notablement plus fort que suivant la précipitation à l'acétone qui est décrite dans l'exemple 1, en préparant son sel d'hélianthine cristallisé. A cet effet, on dilue avec 2 volumes d'eau le concentrat exempt de calcium que l'on
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obtient suivant l'exemple 1, ajuste le pH de la solution à une valeur de 6,7 à 7,0 à l'aide d'une solution décanormale d'hydroxyde de sodium, puis, tout en agitant vigoureusement, on ajoute en un fin jet le volume, nécessaire pour une précipita- tion complète, d'une solution aqueuse presque saturée d'hélianthine, renfermant par litre 3,5 g d'hélianthine (orange III, sel de sodium de l'acide 4'-diméthyla- mino-azobenzène-4-sulfonique),
la solution de précipitation étant avantageuse- ment introduite directement dans la solution d'antibiotique. Le volume de la solution d'hélianthine qui est nécessaire pour une précipitation complète est déterminé dans un essai préalable avec une partie aliquote. Ce volume varie, suivant la teneur en antibiotique, en général entre une quantité vingtuple à centuple du concentrat non-dilué qui est utilisé. L'hélianthate qui se forme (sel d'hélianthine de l'antibiotique) précipite en majeure partie à l'état cris- tallisé, sous la forme de minces paillettes et également d'aiguilles. On laisse la solution de précipitation reposer pendant quelques heures à basse température, à 0 , ce qui fait que le précipité se dépose complètement.
On sépare ensuite du précipité la majeure partie de la solution limpide qui surnage, par décantation, et le reste par centrifugation. En vue de son lavage, le précipité est agité une fois avec environ la même quantité d'eau glacée, puis il est ensuite isolé à l'aide d'un entonnoir-séparateur. Le lavage est répété à deux reprises de la même manière, mais à 1 acétone. L'hélianthate ainsi lavé du nouvel antibiotique est séché sous vide. Le rendement est compris entre 100 et 180 mg d'hélianthate par cm3 de concentrat. Le produit sec constitue une poudre d'un brun-rouge ; cet- te poudre est assez difficilement soluble dans l'eau et dans le méthanol, plus facilement soluble, par contre, dans le formamide, mais insoluble ou très peu soluble dans les solvants lipoïdes comme l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme et autres.
On peut la recristalliser aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, mais également dans des mélanges de ces solvants, ce qui fait qu' elle se présente au microscope en paillettes jaunes, irrégulièrement formées, qui sont disposées en couches et fondant à 202-203 en se décomposant.
Pour préparer le sulfate du nouvel antibiotique à partir de l'hélian- thate, on met par exemple 30 g de la poudre sèche d'hélianthate en suspension dans 150 cm3 d'eau, ajoute à la suspension 33 cm3 d'une solution aqueuse à 80 % de sulfate de triéthylamine, puis agite la masse pendant une heure, ce qui fait qu'elle prend peu à peu une teinte rouge-brun par suite de la formatio n du sel triéthylaminique de l'hélianthine qui est difficilement soluble. La réaction peut être notablement accélérée par chauffage. A cet effet, on ajoute au mélange ré- actionnel 20 volumes de méthanol, ce qui fait que le sulfate de l'antibiotique se forme à l'état d'un précipité blanc, tandis que l'hélianthate de triéthylamine passe en solution.
On débarrasse du colorant adhérant le sulfate d'antibiotique obtenu par centrifugation ou filtration, en le précipitant à deux reprises dans de l'eau avec du méthanol, le lave finalement encore avec du méthanol pur, puis ensuite le sèche. Il constitue une poudre amorphe, d'un blanc pur, qui est inso- luble dans les solvants organiques, mais est par contre facilement soluble dans l'eau. Le rendement est de 5,6 g.
EXEMPLE 3.
En vue de transformer le sulfate, du nouvel antibiotique, en un chlorhydrate facilement soluble aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, on dissout ledit sulfate dans une quantité décuple d'eau puis traite la solution aqueuse jusqu'à précipitation complète par une solution à 20 % de chlorure de baryum, 4 cm3 environ étant nécessaire par gramme de sulfate. On élimine par centrifugation le précipité de sulfate de baryum et, à partir de la solution incolore qui surnage, on isole le chlorhydrate à l'aide d'un séchage par réfri- gération. On obtient ainsi un peu plus d'un gramme de chlorhydrate par gramme de sulfate.
Pour obtenir une autre purification du chlorhydrate, on dissout celui-ci dans peu de méthanol, verse la solution concentrée sur une colonne de chromatographie remplie de suie de gaz et lavée au méthanol, puis élue avec le
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même solvant. Le résidu d'évaporation de l'éluat constitue une poudre d'un blanc pur facilement soluble dans le méthanol et dans l'eau qui, à partir de ces sol- vants et lors d'une très lente évaporation, se sépare en partie sous forme cris- talline.
Au lieu de préparer le chlorhydrate en passant par le sulfate, on peut aussi l'obtenir directement à partir de l'hélianthate. A cet effet, on met ce dernier, à l'état sec et finement divisé, en suspension dans une quantité à peu près décuple de méthanol absolu, ajoute encore à la suspension 2 volumes d'une solution méthanolique déoanormale d'acide chlorhydrique, puis fait ensuite bouillir 'brièvement. Après avoir décoloré avec un peu de norite, on filtre, con- centre ensuite sous vide le filtrat limpide comme de l'eau jusqu'au quart environ de son volume initial, puis, à partir du concentrat, précipite le chlorhydrate avec 10 à 20 volumes d'éther ou d'acétone.
EXEMPLE 4.
L'antibiotique obtenu suivant l'exemple 2 à l'état de sulfate brut est, en passant par le picrate, purifié davantage comme suit : A une solution bien agitée d'un gramme de sulfate dans 20 cm3 d'eau, on ajoute lentement 130 cm d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, quantité qui est juste suffisante pour une précipitation complète. Il se forme un précipité huileux qu'on sépare par centrifugation, qu'on' lave à une reprise avec un peu d'une solution saturée d'acide picrique et à l'eau, puis sèche en- suite sous vide dans un exsiccateur, ce qui fait que le picrate se transforme en une masse solide qui n'est toutefois pas cristallisée. Le rendement est de 1,2 g.
Pour transformer le picrate de l'antibiotique en son chlorhydrate, on dissout le premier dans du méthanol chaud acidifié avec de l'acide chlorhydrique concentré et verse la solution dans 10 volumes d'éther, ce qui fait que le chlor- hydrate insoluble précipite sous la forme d'une masse blanche. On débarrasse cette dernière des restes d'acide picrique qui adhérent encore, en la dissolvant dans une quantité de méthanol bouillant qui est nécessaire pour la dissolution et en répétant la précipitation à l'éther. On obtient ainsi environ 0,6 g de chlorhydrate pulvérulent d'un blanc pur.
EXEMPLE 5.
Au lieu d'obtenir l'antibiotique à l'état pur, par exemple sous la for- me de son chlorhydrate, en passant par le picrate qu'on n'a pas pu cristalliser jusqu'à présent, on peut l'obtenir en passant par le picrolonate cristallisé, au- quel cas on procède comme suit :
A une solution, dans 100 cm3 d'eau, de 1,0 g du sulfate obtenu sui- vant l'exemple 2, on ajoute goutte-à-goutte au cours d'une heure, en agitant, 700 cm3 d'une solution aqueuse concentrée d'acide picrolonique, renfermant 2,4 g par litre. On essore le précipité amorphe de picrolonate qui s'est formé et, en vue de le cristalliser, le dissout dans 150 cm3 d'eau bouillante et filtre la solution à chaud. Par un lent refroidissement à la température ambiante, le pi- crolonate se sépare du filtrat sous une forme partiellement cristallisée.
On rassemble le précipité sur l'entonnoir filtrant, le lave avec peu d'eau glacée et, en vue de le recristalliser, le dissout dans 100 cm3 d'eau bouillante. A par- tir de la solution filtrée à chaud, le picrolonate précipite alors complètement sous la forme de fins bâtonnets jaunes disposés en druses qui, après avoir été lavés avec peu d'eau glacée et avcir été séchés so-qs vide sur du pentoxyde de phos- phore, présentent, après suintement, un point de décomposition net à 202 . Le rendement en picrolonate recristallisé à deux reprises est de 0,64 g.
A partir du picrolonate obtenu précédemment, on obtient le chlorhydra- te pur lorsque tout en agitant vigoureusement, on ajoute, par portions, à une sus- pension finement divisée de 0,6 g de picrolonate dans 10 cm3 de méthanol glacé,
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0,6 cm3 d'une solution décanormale de gaz chlorhydrique dans le méthanol absolu et, après réaction complète, précipite complètement le chlorhydrate partiellement séparé qui s'est formé, en ajoutant au mélange réactionnel 20 volumes d'éther absolu. On essore le chlorhydrate, le lave une fois avec un peu d'éther sur l'en- tonnoir filtrant et ensuite, en vue d'éliminer les restes d'acide picrolonique qui adhérent encore, dissout dans 2 cm3 de méthanol, puis sépare à nouveau à 1' éther et lave.
Le chlorhydrate maintenant pur de l'antibiotique constitue, après séchage sous vide, une poudre amorphe d'un blanc pur. Le rendement est de 0,25 g.
D'après des examens effectués par chromatographie sur papier, le chlorhydrate ainsi obtenu de l'antibiotique dénommé "lémacidine" est formé par un mélange de trois composés vraisemblablement très proches (B1, B2 et B3). Si l'on utilise, par exemple, comme système solvant un mélange de 3 parties d'éthanol et d'une partie d'eau renfermant 2 % de chlorure de sodium, et fait égale à 1' unité la valeur de Rf ( = RB) du composant B3 (substance de référence) migrant le plus rapidement, on a alors pour les deux autres composantes Bl et B2 des va- leurs de RB qui sont respectivement de 0,34 et de 0,61.
EXEMPLE 6.
La préparation de la base libre du nouvel antibiotique peut avoir lieu aussi bien à partir de son sulfate avec de l'hydroxyde de baryum, qu'en utilisant également un échangeur d'ions faiblement basique. Dans le premier cas on ajoute par exemple à une solution, dans 5 cm3 d'eau, d'un gramme du sulfate d'antibio- tique obtenu suivant l'exemple 2, un léger excès d'une solution saturée chaude d'hydroxyde de baryum, c'est-à-dire jusqu'à ce que le mélange réactionnel pré- sente un pH de 9 environ. On neutralise ensuite aussit8t l'hydroxyde de baryum en excès en faisant passer dans la solution du dioxyde de carbone.
Ensuite, en vue de transformer le bicarbonate de baryum formé, on maintient le mélange réac-' tionnel pendant quelques minutes dans un bain-marie à 60 , après quoi le car- bonate de baryum précipité est séparé par centrifugation conjointement avec le sulfate de baryum. A partir de la solution alcaline de centrifugation, limpide comme de l'eau, qui surnage, on isole la base libre du nouvel antibiotique à l'aide d'un séchage par réfrigération. Elle constitue une poudre blanche qui est soluble dans l'eau en donnant une réaction fortement alcaline et qui est insolu- ble dans les solvants organiques. Le rendement est de 0,5 g.
Pour obtenir la base libre à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement basique, on procède comme suit :
A travers une colonne remplie de l'échangeur d'ions faiblement basi- que qu'est le "Dowex-2", on percole une solution aqueuse, à 20 % environ, de 0,2 g du sulfate brut du nouvel antibiotique obtenu suivant l'exemple 2, en utilisant à peu près une quantité trentuple de la résine échangeuse d'ions, lavée à plu- sieurs reprises dans l'ordre d'abord avec de l'acide chlorhydrique dilué, avec de l'eau, avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium et à nouveau à l'eau.
La colonne chargée avec la solution de sulfate est ensuite lavée à l'eau, ce qui fait que la base est facilement éluée. En vue d'obtenir la base l'éluat est, comme précédemment, avantageusement lyophilisé. Le rendement est de 0,65 g. La base constitue une poudre blanche amorphe.
EXEMPLE 7.
A travers une colonne d'une résine échangeuse d'ions faiblement acide et renfermant des groupes carboxyliques, telle par exemple de l'Amberlite IRC-50, on filtre une solution de culture de l'antibiotique dénommé "lémacidine" solu- tion qui est obtenue suivant l'exemple 1 et est débarrassée du mycélium, en utili- sant par litre de la solution d'antibiotique 100 g de la fomme hydrogénée de 1' échangeur et en ajustant à 5 litres environ par heure la vitesse de traversée.
L'antibiotique dénommé "lémacidine" est adsorbé, conjointement avec des substan- ces accompagnatrices inactives qui sont en partie fortement colorées en brun;
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la solution qui s'écoule et qui présente un pH de 3 à 3,5 ne possède qu'une très, faible activité antibiotique. On lave ensuite la colonne d'Amberlite avec un volu- me d'eau distillée correspondant au cinquième du volume de la solution de cultu- re filtrée, ce qui fait qu'on élimine une partie des substances accompagnatrices inactives colorées, mais qu'on n'élue toutefois pas l'antibiotique proprement dit.
Pour obtenir ce dernier à partir de l'adsorbat, on fait passer, à travers la co- lonne préalablement lavée, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,2-normal et à savoir au total le quart du volume de la solution de culture utilisée.
L'éluat fortement acide est neutralisé, soit avec une solution concentrée d'hy- droxyde de sodium, soit à l'aide d'un échangeur d'ions basique. La solution ainsi obtenue peut, comme telle ou après concentration sous vide à basse température, être utilisée comme solution de départ pour l'obtention d'autres préparations enrichies de l'antibiotique dénommé "lémacidine", par exemple suivant les procé- dés décrits dans les exemples 2 - 3 ou 4.
EXEMPLE 8.
Le pantothénate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" peut être ob- tenu, par exemple, à partir du sulfate préparé suivant l'exemple 2. A cet effet, on ajoute à une solution de 1,0 g du sulfate dans 10 cm3 d'eau, 8,0 cm3 d'une solution aqueuse à 10 % de pantothénate de calcium, débarrasse le précipité for- mé du sulfate de calcium par filtration ou centrifugation, puis lyophilise le filtrat ou le centrifugeât, ou l'évapore à sec sous vide. Le résidu sec du pan- tothénate de l'antibiotique dénommé "lémacidine" constitue une poudre blanche amorphe qui est très facilement soluble dans l'eau.
D'une manière analogue, on peut préparer d'autres sels de l'anti- biotique dénommé "lémacidine" avec des acides organiques, comme par exemple l' acide L(+)-ascorbique, ou avec des acides ,aminés comme la L(-)-leucine ou la L(-)-méthionine. Dans ce cas, on part avantageusement de la base de l'antibioti- que obtenue à l'état libre suivant l'exemple 6, en ajoutant à sa solution aqueuse concentrée une solution saturée chaude de l'acide organique, auquel cas on utili- se par exemple, pour un gramme de la base, 1,2 g d'acide ascorbique ou 0,9 g de leucine ou 1,05 g de méthionine.
REVENDICATIONS.
I. Un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique., caractérisé par le fait qu'on cultive dans des conditions aérobies du Streptomyces venezuelae A 9692, ou une variété de cette souche, dans une solution nutritive aqueuse ren- fermant une source de carbone et d'azote ainsi que des substances inorganiques, jusqu'à ce que ladite solution présente une forte activité antibiotique, qu'on isole ensuite de la solution nutritive l'antibiotique dénommé "lémacidine" et qu' on prépare éventuellement ses sels.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants
1) La croissance a lieu en culture immergée.
2) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température com- prise entre 18 et 40 , de préférence à 21-27
3) L'antibiotique est isolé du filtrat de culture par adsorption à un pH faiblement alcalin, avantageusement à un pH de 7,5 à 8, de préférence à l'aide de charbon actif.
4) L'antibiotique est extrait de l'adsorbat à l'aide d'un agent d' élution acide, de préférence à l'aide d'un agent d'élution renfermant de l'acide formique.
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